Articolo metodologico

Mappatura della morfologia delle cellule stellate epatiche nei modelli murini di fibrosi epatica

DOI:

10.3791/70396

⸱

13 febbraio 2026

 , 
1Division of Liver Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta una pipeline di imaging completa per visualizzare e modellare la morfologia delle cellule stellate epatiche nel tessuto epatico intatto. Questo approccio combina la marcatura fluorescente dei fibroblasti tramite genetica del topo, la preparazione tissutale in situ basata su perfusione epatica e un metodo modificato di pulizia dei tessuti iDISCO per ottenere trasparenza ottica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I fibroblasti residenti nei tessuti sono i motori cellulari della fibrosi attraverso i tessuti. All'interno del fegato, le cellule stellate epatiche (HSC), i periciti residenti con la loro morfologia unica "simile a una stella", si attivano in miofibroblasti fibrogenici durante la lesione per produrre la cicatrice epatica. Sebbene decenni di lavoro abbiano chiarito le principali vie di segnalazione alla base dell'attivazione dell'HSC, il significato funzionale della loro morfologia dendritica distinta rimane sfuggente a causa delle limitazioni tecniche nell'imaging e nell'analisi. Questo protocollo presenta una pipeline di imaging completa per visualizzare e modellare la morfologia degli HSC nel tessuto epatico intatto. Questo approccio combina la marcatura fluorescente degli HSC tramite genetica del topo, la preparazione tissutale in situ basata su perfusione epatica e un metodo modificato di pulizia dei tessuti iDISCO per ottenere trasparenza ottica in campioni di tessuto che possono essere spessi diversi centimetri. I campioni approvati vengono acquisiti utilizzando piattaforme di microscopia confocale ottimizzate, e i dataset di immagini vengono elaborati tramite un flusso di lavoro di analisi personalizzato per la ricostruzione tridimensionale di singoli HSC a risoluzione di singola cella. Insieme, questa pipeline consente la mappatura riproducibile della morfologia dell'HSC all'interno del complesso microambiente epatico, inclusi i loro processi dendritici e le relazioni spaziali con le cellule vicine. Oltre al fegato, il flusso di lavoro è adattabile ai fibroblasti in altri organi, come polmone, rene, intestino e cuore, dove le cellule mesenchimali residenti mostrano ruoli fibrogenici simili nelle malattie. Il quadro proposto, quindi, stabilisce una base metodologica per studi comparativi tra organi al fine di indagare le relazioni struttura-funzione dei fibroblasti e le vulnerabilità terapeutiche nelle malattie fibrotiche.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fibrosi, ovvero la cicatrizzazione patologica dei tessuti, è l'ultima via comune per quasi tutte le malattie croniche degli organi e contribuisce a circa il 40% dei decessi nei paesiindustrializzati 1. Nel fegato, la fibrosi nasce da insulti cronici come l'epatite virale, l'uso di alcol o, in modo sempre più crescente, la malattia steatotica epatica associata a disfunzioni metaboliche (MASLD), che attualmente colpisce il 30-40% degli adulti negli Stati Uniti. Gli insulti cronici al fegato e la conseguente fibrosi progressiva aumentano drasticamente il rischio di malattie epatiche terminali come cirrosi, insufficienza epatica e carcinomaepatocellulare 2. 3,4,5.

Le cellule stellate epatiche (HSC) sono centrali per l'omeostasi epatica e la fibrogenesi. Nel fegato sano, gli HSC si trovano in uno stato di quiescenza, con accumulo di vitamina A, e contribuiscono all'omeostasi degli epatociti e, in generale, dell'interofegato 6,7. Questo è chiaramente dimostrato dagli studi di deplezione degli HSC, in cui la rimozione di quasi tutti gli HSC nel fegato sano diminuisce la massa epatica e limita gravemente la rigenerazioneepatica 7,8. Al momento della lesione, gli HSC si attivano in cellule simili a miofibroblasti che proliferano, migrano nelle aree danneggiate e producono una matrice extracellulare eccessiva (ECM), formando cicatrici fibrotiche. Le HSC attivate nel fegato fibrotico sono anche la fonte di fibroblasti associati al cancro e svolgono ruoli promoventi tumorali nel carcinomaepatocellulare 9,10,11,12. Gli HSC quiescenti possiedono una morfologia unica simile a quella dei neuroni con piccoli corpi cellulari da cui si estendono proiezioni a lungo raggio. Le HSC assumono una forma piatta e simile a un foglio di miofibroblasti quando attivate nella fibrosi13. Sebbene decenni di lavoro abbiano chiarito le vie di segnalazione che controllano la produzione di ECM da parte degli HSC, il significato funzionale della loro morfologia neuronale distinta, come viene regolata, se possa facilitare interazioni all'interno del nicchio degli HSC e contribuire alla fibrogenicità e alla malattia degli HSC restano sfuggenti14,15.

I metodi attuali per visualizzare la morfologia degli HSC sono limitati a immagini bidimensionali (2D) di cellule coltivate in vitro o di sezioni di tessuto in vivo , e raramente catturano l'intera morfologia degli HSC con proiezioni che estendono diverse lunghezze cellulari in tutte le direzioni. Inoltre, il marcatore HSC più comunemente utilizzato, la desmina, non può catturare completamente la morfologia unica simile a quella neuronale degli HSC nella colorazione immunofluorescenza, poiché la desmina è una proteina citoscheletro che marca solo filamenti intermedi all'interno degli HSC16. Queste sfide metodologiche finora hanno ostacolato la capacità di catturare pienamente la morfologia dell'HSC e le loro interazioni cellulari in modo tridimensionale (3D) nel loro contesto naturale a risoluzione a singola cellula. Di conseguenza, questioni fondamentali su come la morfologia degli HSC si relazioni al loro stato funzionale e alle interazioni con i tipi cellulari vicini sono rimaste irrisolte.

Questo articolo presenta una pipeline innovativa e completa di imaging e analisi per visualizzare e modellare la morfologia degli HSC in tessuto epatico intatto. Questo metodo integra diverse innovazioni chiave: (1) marcatura fluorescente degli HSC utilizzando modelli genetici di topo reporter, (2) perfusione e fissazione epatica ottimizzata in situ per preservare l'architettura tissutale intatta e le relazioni cellulari, (3) un protocollo modificato di pulizia dei tessuti basato su iDISCO per ottenere trasparenzaottica 17, (4) microscopia confocale ad alta risoluzione per la cattura di immagini in profondità, e (5) un flusso di lavoro computazionale personalizzato per la ricostruzione delle immagini 3D e la quantità quantitativa analisi di singoli HSC. Il protocollo impone alcuni vincoli sulla dimensione del tessuto e sull'impegno temporale che devono essere considerati. Insieme, questo protocollo fornisce un quadro robusto e riproducibile per catturare la complessa struttura 3D degli HSC e per mappare le loro relazioni spaziali con le cellule vascolari, immunitarie e parenchimantiche vicine. Le strategie e le pipeline presentate qui per il fegato sono facilmente adattabili anche ad altriorgani 17,18,19.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutti gli esperimenti con topi utilizzati in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali Istituzionali della Icahn School of Medicine del Mount Sinai. I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Generazione di topi con HSC etichettati con tdTomato (TdT)

  1. Creare allevatori Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) (Jackson Laboratories ceppo #007914 20 e Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC) #06959521-JAX, rispettivamente).
    NOTA: Aspettatevi la lettiera dopo 3 settimane. Utilizzare femmine di LratCre per la riproduzione, poiché è stata rilevata una certa espressione di Cre nella linea germinale maschile.
  2. Raccogliere code e cucciolate di genotipo F1 per identificare Tg(Lrat:Cre); Topolini Tg(LSL-TdT) che esprimono selettivamente il fluoroforo TdTomato nelle cellule stellate epatiche.

2. Perfusione epatica in situ e fissazione

  1. Configurazione pre-operatoria
    1. Prepara una miscela ketamina/xilazina per anestesia topo mescolando 2 mL di ketamina, 1 mL di xilazina e 7 mL d'acqua.
      NOTA: La ketamina è una sostanza controllata e richiede una corretta licenza e regolamentazione per l'uso in laboratorio.
    2. Prepara la soluzione di perfusione di paraformaldeide (PFA) al 4% in 1x Fosfato Salino Tamponato (PBS).
    3. Installa la pompa peristaltica lasciando che 1x PBS scorra attraverso il tubo e imposta la portata a 2 mL/min.
      NOTA: Assicurati che non ci siano bolle d'aria nel tubo.
  2. Pesa il topo per determinare la quantità della miscela di ketamina/xilazina da iniettare.
  3. Iniettare intraperitonealmente la miscela ketamina/xilazina nel topo.
    NOTA: Iniettare 200 μL della miscela ogni 20 g di peso del topo.
  4. Metti il topo in un contenitore con coperchio e attendi circa 20 minuti che venga completamente anestetizzato.
    NOTA: Pizzica il dito del topo per verificare l'assenza di riflessi. Assicurati che il topo sia ancora vivo quando inizia la perfusione.
  5. Trasferire il topo dal contenitore di vetro alla piattaforma chirurgica in posizione supina.
    ATTENZIONE: Il PFA è tossico e volatile; Pertanto, esegui la procedura di perfusione in un cappuccio chimico. Raccogliere e smaltire correttamente il flusso di PFA secondo le linee guida istituzionali per la biosicurezza.
  6. Pizzica i palmi del piede del topo con una pinza per assicurarti che il topo non abbia movimenti di riflessi o spasmi.
  7. Pungi 4 palmi con aghi per allargare l'addome del topo.
  8. Spruzza l'addome con etanolo al 70% per bagnare il pelo.
  9. Usa le pinze per sollevare la pelle al centro dell'addome, allinearti con le zampe posteriori e iniziare a tagliare la pelle (entrambi gli strati) per rivelare l'addome.
  10. Usa cotton bab bagnati con PBS per spostare intestini e altri organi lateralmente e sollevare il lobo sinistro.
  11. Taglia con attenzione la membrana attaccata tra il lobo sinistro e il lobo caudata.
  12. Usa una sutura per legare alla base superiore del lobo sinistro.
  13. Tagliare il lobo sinistro sotto il nodo di sutura e mettere da parte il lobo sinistro per la raccolta e l'elaborazione del campione di tessuto, a seconda delle esigenze sperimentali (come il congelamento diretto in azoto liquido, l'inserimento in composto a temperatura ottica di taglio (OCT) o la fissazione di formalina).
  14. Usa cotton bab bagnati con PBS per muovere il fegato e rivelare la vena porta.
  15. Inserire con attenzione l'ago del catetere nella vena porta circa a metà lungo la lunghezza della vena porta.
    NOTA: Per facilitare l'inserimento del catetere, sollevare il corpo del topo posizionando una pinza sotto il corpo per garantire una superficie più pianeggiante. Allinea con cura l'ago del catetere il più parallelo possibile alla vena porta prima dell'inserimento.
  16. Rimuovi l'ago del catetere.
    NOTA: Assicurarsi un riflusso di sangue attraverso il catetere per indicare l'inserimento riuscito.
  17. Avvia la pompa di perfusione a una portata di 2 mL/min, collega il tubo al catetere e perfondi il fegato con 20 mL di 1x PBS.
    NOTA: Assicurati che il catetere sia completamente pieno di sangue e che il tubo sia completamente riempito con il buffer di perfusione, prima di collegarli per evitare che vengano introdotte bolle d'aria nel sistema.
  18. Pinza l'arteria polmonare sopra il fegato con un emostato per impedire al PBS 1x di passare attraverso il cuore.
  19. Taglia la vena cava inferiore per liberare l'accumulo di pressione.
  20. Regola la velocità della pompa a 5 mL/min.
    NOTA: Lascia circa 15 minuti per finire la perfusione.
  21. Ferma la pompa per cambiare il serbatoio al 4% di PFA.
    NOTA: Assicurati di non introdurre bolle d'aria nel tubo fermando la pompa quando c'è ancora liquido nel serbatoio.
  22. Perfondi il fegato con 25 mL di PFA al 4%.
  23. Una volta completata la perfusione, si rimuove il fegato dagli organi circostanti tagliando i tessuti connessi.
  24. Inserire il fegato in un tubo conico da 50 mL, riempito con 25 mL di PFA al 4%.
  25. Metti il tubo orizzontalmente su una piattaforma a dondolo per 1 ora a temperatura ambiente a 1,5 giri/min, per garantire il movimento della soluzione.
  26. Lava il fegato 3 volte in 1x PBS su una piattaforma da dondolo per 30 minuti ciascuna a temperatura ambiente a 1,5 giri al minuto.
  27. Conserva il fegato in 20 mL 1x PBS con 0,02% diNaN 3 a 4 °C.
    NOTA: Conserva il fegato a lungo termine in questa fase, fino ad almeno un anno.

3. Pulizia dei tessuti basata su iDISCO+

NOTA: La descrizione originale del protocollo iDISCO+ è accessibile al numero 17

Giorno 1: Disidratazione del campione

  1. Taglia i campioni di fegato in pezzi di dimensioni approssimative 0,5-1cm 3.
    NOTA: Taglia campioni diversi in forme diverse per facilitare la rilevazione durante le fasi di imaging.
  2. Prepara diluizioni del 20% (vol/vol), 40%, 60% e 80% di metanolo in acqua in bottiglie di vetro separate.
  3. Posizionare campioni di fegato in fiale di vetro con tappi a vite (ad esempio, 4-7 mL).
    NOTA: Posizionare fino a 6 pezzi di campione di fegato in una fiala di vetro da 7 mL.
  4. Disidratare il campione utilizzando la diluizione del metanolo in serieH2O, 20% (vol/vol), 40%, 60% e 80% per 1 ora ciascuno a temperatura ambiente su un rotatore a ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  5. Lavare il campione con un altro metanolo al 100% su un rotatore di ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Raffredda il campione a 4 °C per 30 minuti a 1 ora.
  7. Prepara diluizioni DCM al 66% (vol/vol) in metanolo in una bottiglia di vetro.
    NOTA: Prepara nuove diluizioni ogni volta. Utilizzare cilindri di vetro per preparare la soluzione, poiché il DCM può dissolvere la plastica, come il polistirene.
  8. Incubare i campioni in soluzione al 66% di DCM/metanolo durante la notte su un rotatore a ruota a 8 giri/min a temperatura ambiente, senza centrifugazione.
    NOTA: Attenzione ai campioni che fluttuano in superficie una volta aggiunta la soluzione.

Giorno 2: Campione di sbiancamento

  1. Lava il campione due volte con metanolo al 100% su un rotatore di ruota a 8 giri/min, senza centrifugare per 1 ora ogni volta a temperatura ambiente.
  2. Raffredda il campione a 4 °C per 30 minuti a 1 ora.
  3. Sbiancare il campione in raffreddamento al 5% di H2O2 in metanolo (1 volume del 30% diH 2O2 a 5 volumi di metanolo), su un rotatore di ruota a 8 giri al minuto, senza centrifugazione, a 4 °C durante la notte.
    NOTA: Prepara una nuova soluzione ogni volta.

Giorno 3-5: Permeabilizzazione del campione

  1. Reidratare con metanolo/H2serie O: 80%, 60%, 40%, 20%, 1x PBS per 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore a ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  2. Lavare il campione due volte in PTx.2 (Tabella 1) per 1 ora ciascuno a temperatura ambiente su un rotatore ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  3. Incubare i campioni in soluzione di permeabilizzazione (Tabella 1) a 37 °C per 2 giorni.

Giorno 5-17: Immunomarcatura

  1. Bloccare i campioni nella soluzione di blocco (Tabella 1) per 2 giorni a 37 °C.
    NOTA: Prepara sempre una nuova soluzione bloccante a causa dell'instabilità del siero d'asino. Conserva la soluzione bloccante avanzata a 4°C per un massimo di 1 mese.
  2. Incubare i campioni in anticorpi primari diluiti in PTwH (Tabella 1) con 5% di DMSO e 3% di Siero d'Asino a 37 °C su un rotatore a ruota a 5 giri/min, senza centrifugazione per 4 giorni.
    NOTA: Inizia con una diluizione primaria di anticorpi 1:500.
  3. Lavare i campioni in PTwH 4-5 volte per 1 ora ciascuna a temperatura ambiente su un rotatore ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
    NOTA: Opzionalmente, lascia lavare i campioni tutta la notte.
  4. Incubare i campioni in anticorpi secondari e iodio di propidio diluito in PTwH con siero d'asino al 3% a 37 °C su un rotatore di ruota a 5 giri al minuto, senza centrifugazione per 4 giorni.
    NOTA: Inizia con una diluizione secondaria di anticorpi 1:500. Utilizzare una diluizione 1:250 di iodio di propidio da una soluzione di iodio di propidio da 5 mg/mL.
  5. Lavare i campioni in PTwH 4-5 volte per 1 ora ciascuna a temperatura ambiente su un rotatore ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  6. Lasciare il campione lavare in PTwH tutta la notte, a temperatura ambiente su un rotatore di ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.

Giorno 18: Pulizia

  1. Disidratare il campione utilizzando la diluizione del metanolo nella serie H2O, 20% (vol/vol), 40%, 60%, 80% per 1 ora ciascuno a temperatura ambiente su un rotatore ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  2. Lavare il campione due volte con metanolo al 100% in rotazione per 1 ora a temperatura ambiente su un rotatore di ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  3. Incubare il campione in diluizioni DCM al 66% (vol/vol) in metanolo per 3 ore a temperatura ambiente su un rotatore a ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  4. Lavare il campione due volte in DCM al 100% per 15 minuti a temperatura ambiente su un rotatore ruota a 8 giri/min, senza centrifugazione.
  5. Incubare il campione nella DBE durante la notte a temperatura ambiente prima dell'imaging (imagining).
  6. Conservare i campioni a lungo termine in DBE fino a 1 anno senza impatti sul segnale di colorazione.

4. Microscopia confocale per imaging

  1. Posiziona il campione trasparente in una ciotola da 35 mm con fondo di vetro #1.5.
  2. Riempi la ciotola con etil-cinamato per immergere completamente il campione.
  3. Posiziona l'antenna sul confocale e regola la messa a fuoco per identificare il piano migliore che fornisce il segnale più luminoso.
  4. Acquisire un'immagine tile sul piano più luminoso per catturare un'ampia area del campione, utilizzando il formato 1024 x 1024 e velocità 600.
    NOTA: Usa un obiettivo più basso (10x o 20x) per l'immagine delle piastrelle per ridurre i tempi di imaging e la dimensione del file.
  5. In base all'immagine tile, seleziona le regioni di interesse per raccogliere una z-scan.
  6. Cattura una z-scan attraverso il tessuto purificato, coprendo tutta la profondità del tessuto con la migliore risoluzione del microscopio, utilizzando il formato 1024 x 1024 e la velocità 600.
    NOTA: Usa un obiettivo 40x in immersione in olio per ottenere la migliore risoluzione per HSC.
  7. Salva i file immagine in formato LIF e visualizza i file usando Fiji o ImarisViewer 11.0.0.

5. Analisi delle immagini per la ricostruzione 3D e analisi quantitativa di singoli HSC

  1. Converti file immagine in formato IMS utilizzando ImarisFileConverter 10.2.0.
  2. Usa il modello Surface su Imaris 10.2.0 per rilevare l'oggetto nelle immagini.
  3. Usa la Creazione di Wizard per eseguire un'analisi su una regione 3D selezionata di interesse, poi applicala all'intera immagine.
    NOTA: Usa questo per velocizzare il processo di analisi.
  4. Seleziona il canale sorgente, l'intensità assoluta e deseleziona il pulsante liscia per definire la soglia di intensità per l'intera immagine.
  5. Modifica la soglia per catturare tutti gli oggetti nell'immagine.
  6. Usa il numero di voxel per filtrare gli oggetti detriti.
  7. Finalizza la wizard, premi il pulsante statistico per ottenere tutte le misurazioni statistiche.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La perfusione e il fissaggio riusciti del fegato del topo sono rappresentati da un colore uniforme pallido, beige-giallo, che riflette un'efficace rimozione del sangue e la penetrazione del fissativo (Figura 1A,B). Una perfusione impropria provoca regioni di coaguli di sangue rosso scuro o marrone, che riducono la chiarezza ottica e portano a un segnale di fondo elevato in queste regioni campionarie (Figura 1C)....

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive una pipeline riproducibile e adattabile per la preparazione del campione che porta alla visualizzazione tridimensionale e all'analisi quantitativa della morfologia dell'HSC nel tessuto epatico intatto. L'integrazione della marcatura genetica delle cellule fluorescenti, della perfusione epatica in situ e di un metodo modificato di clearing iDISCO+ consente l'imaging di grandi volumi tissutali a risoluzione monocellulare preservando l'architettura spazia...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è supportato da 1R01 DK136016-01 e 5P30CA196521 (finanziamento del centro NCI). Microscopia e/o analisi di immagini sono state effettuate presso il Microscopy and Advanced Bioimaging CoRE presso la Icahn School of Medicine al Mount Sinai. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Tisch Cancer Institute di Mount Sinai, P30 CA196521 - Cancer Center Support Grant.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anticorpi anti-RFP, coniglio, pre-adsorbitoRockland600-401-379
Sottovaso di vetro da 35mm a 4 camere con micropozzo da 20 mm, vetro di copertura #1.5CellvisD35C4201.5N
Iniezione di AnaSed (iniezione di xilazina)Akorn, Inc.NDC 593990110-2020 mg/mL
Tubi centrifughe conici: 50ml Falcon352098
Cotton bobMedlineMDS202000
Bloccaggio curvo  EmostatiFisher Scientific16-100-117
AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) coniugato con Cy3Jackson ImmunoResearch712-165-153
Forbici da Funzionamento Delicato 4,75" Curbate Affilate/SmussateStrumento chirurgico Roboz
728501
Dibenzyl Ether (DBE), 98%Sigma Aldrich108014
Diclorometano (DCM),  ≥ 99.8%Sigma Aldrich270997
Dimetilsolfossido (DMSO), ≥ 99.9%Sigma AldrichD8418
Anticorpo secondario ad alta adsorbimento incrociato per l'anticorpo anti-coniglio IgG (H+L), Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA31573
Siero dell'AsinoEMD MilliporeS30
Etil-cinnamato, 99%Sigma Aldrich112372
Forbici micro-dissezionali extra fine; Lama da 24 mmFisher ScientificNC9232515
Ratti con anticorpi monoclonali F4/80ThermoFisher Scientific14-4801-82
FigiNIH
PinzaFisher ScientificNC9214139
GlicinaBio-Rad1610718
Sale Sodio di EparinaChem-Impex29984
Forno di ibridazione a hibaidiTriad ScientificMaxi 14
Perossido di idrogeno, 30 %Sigma Aldrich31642
Software Imaris 10.2.0Oxford Instruments
Software ImarisFileConverter 10.2.0Oxford Instruments
ImarisViewer 11.0.0Oxford Instruments
Catetere IVExel International Inc.EXE 26751
Ketamina, iniezione di cloridratoDechraB8U4100 mg/mL
Software LAS X 4.4.0.24861Leica
Microscopio confocale Leica Stellaris 8Leica
Metanolo, grado HPLCFisherA452-2
Rotatore polifunzionaleScientific Industries, Inc.Modello 151
Aghi (27G x 1/2'')BD305109
Paraformadeildo, polvere, 95%Sigma Aldrich158127
Pompa peristalticaGilsonModello Minipuls 3
Tubo della pompa peristaltica, MasterFlexThermo Scientific96400-16Tubo di pompa di precisione in silicone polimerizzato con perossido 3,1 mm di diametro diametrale x 7,6 m L/S, dimensione L/S 16, Spina per tubo da 1/8 di pollice
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)CytivaSH30256.01Sterile, pH 7,0 - 7,2, senza calcio, magnesio
Propidio ioduro, ≥ 94,0% (HPLC)Sigma AldrichP4170
Lame di rasoioAmerican Line66-0362
Piattaforma a dondoloVWRModello 200
Azida di sodio, ≥ 99.5%Sigma AldrichS2002
SuturaEthiconJ109T
Siringa (1 mL)BD309628
TritonX-100SigmaT9284
Preadolescente-20Thermo ScientificJ20605-AP
Fiale, tappo a vite con tappo solido e rivestimento in alluminio, preassemblatiSigma Aldrich27470-Uvolume 7 mL, fiala di vetro ambrato, O.D. & times; H 17 mm e tempi; 60 mm, filettatura per 15-425

Riferimenti

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