Valutazione degli effetti del triptolide su Gefirina, Collybistina e Autofagia ippocampali in un modello murino Aβ1-42

Sommario

Questo protocollo descrive l'istituzione di un modello murino aggregato simile al morbo di Alzheimer indotto da Aβ1-42 e la valutazione degli effetti del triptolide sulle proteine associate alla sinapsi inibitorie dell'ippocampo, sulla segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β e sui marcatori correlati all'autofagia.

Abstract

Il morbo di Alzheimer è associato a disfunzioni sinaptiche, ma le procedure standardizzate per valutare come la patologia indotta da Aβ influenzi le proteine inibitorie associate alla sinapsi e la segnalazione correlata all'autofagia dopo un intervento candidato rimangono limitate. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro per stabilire un modello murino simile all'Alzheimer indotto da Aβ1-42 e valutare gli effetti del triptolide sulla Gefirina ippocampale, sulla collibistina, sulla segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β e sui marcatori correlati all'autofagia. I topi adulti C57BL/6J ricevono iniezione bilaterale intracerebroventricolare di Aβ1-42 preparata in condizioni di aggregazione, seguita dalla somministrazione giornaliera intraperitoneale di triptolide con o senza l'inibitore PI3K LY294002. L'apprendimento spaziale e la memoria vengono valutati tramite il Morris water maze testing. La lesione neuronale dell'ippocampo e la deposizione di Aβ vengono valutate tramite colorazione di ematossilina ed eosina e immunoistochimica Aβ, mentre i lisati ippocampali vengono analizzati tramite Western blotting per quantificare Gefirina, Gefirina fosforilata, Collybistina, proteine di segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β, LC3-II/I e p62. Le considerazioni procedurali chiave includono la preparazione standardizzata di Aβ1-42, l'iniezione stereotassica accurata, condizioni di test comportamentali coerenti, la selezione cieca della regione di interesse e l'analisi standardizzata di immagini e densitometria. Utilizzando questo flusso di lavoro, la somministrazione di Aβ1-42 ha prodotto deficit di apprendimento spaziale e memoria, lesioni neuronali dell'ippocampo, deposizione di Aβ, riduzione dell'espressione di Gefirina e Collybistina, alterazione della segnalazione di PI3K/Akt/GSK-3β e aumento dell'accumulo di LC3-II/I e p62. Il triptolide ha parzialmente invertito questi cambiamenti comportamentali, istologici e molecolari, mentre LY294002 ne ha attenuato gli effetti. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le alterazioni molecolari ippocampali indotte da Aβ e gli interventi candidati, riconoscendo però che questo modello non riproduce la progressione cronica e multifattoriale del morbo di Alzheimer umano.

Introduzione

Il morbo di Alzheimer (DA) è un disturbo neurodegenerativo progressivo caratterizzato da declino cognitivo, deficit di memoria e disturbi comportamentali, e rappresenta una delle principali cause di demenza negli anziani. Sebbene la deposizione di amiloide-β (Aβ), la patologia della tau, la disfunzione sinaptica, la neuroinfiammazione e l'omeostasi proteica compromessa siano stati ampiamente implicati nella patogenesi dell'AD, i meccanismi molecolari che collegano la tossicità associata ad Aβ alla perturbazione delle proteine sinaptiche inibitorie restano incompletamente^compresi 1,2,3,4 . La disfunzione sinaptica inibitoria può alterare l'equilibrio tra eccitazione e inibizione nei circuiti neuronali, contribuendo così all'instabilità della rete e al compromisso cognitivo. Tuttavia, gli eventi di segnalazione intracellulare che regolano le proteine di impalcatura associate alle sinapsi inibitorie in condizioni patologiche simili alla DA indotte da Aβ richiedono ulteriori^{chiarimenti 5}.

La Gefirina è una delle principali proteine di imbarcatura postsinaptica che ancora e stabilizza i recettori dei neurotrasmettitori inibitori, inclusi i recettori della glicina e i recettori dell'acido γ-aminobutirico di tipo A, nei siti^{postsinaptici 6}. La collibistina, codificata da ARHGEF9, è un fattore di scambio di nucleotidi di guanina che interagisce con la Gefirina e favorisce il clustering e la localizzazione della membrana dei componenti sinaptici^{inibitori 7}. L'interazione funzionale tra Gefirina e Collybistina è quindi essenziale per l'organizzazione, il mantenimento e la plasticità delle sinapsi inibitorie. La disgregazione di questo complesso proteico può compromettere la neurotrasmissione inibitoria e contribuire a deficit cognitivi. In particolare, la stabilità della Gefirina e il clustering sinaptico possono essere regolati da meccanismi dipendenti dalla fosforilazione. È stato segnalato che la segnalazione associata agli oligomeri Aβ influenza chinesi come la glicogeno-sintasi-3β (GSK-3β), che possono favorire la fosforilazione della Gefirina nella serina 270 e quindi influenzare il clustering e la degradazione della Gefirina. Questi risultati suggeriscono che la regolazione mediata dalla chinasi della Gefirina possa rappresentare un importante legame molecolare tra la patologia associata ad Aβ e la disfunzione sinaptica^{inibitoria 8,9}.

La via PI3K/Akt è una via chiave di segnalazione intracellulare coinvolta nella sopravvivenza neuronale, nella plasticità sinaptica, nell'omeostasi proteica e nella regolazione dell'autofagia. L'attività di Akt può sopprimere il GSK-3β tramite fosforilazione inibitoria, modulando così i substrati a valle coinvolti nella funzione neuronale e nella stabilità sinaptica. La disregolazione della segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β è stata implicata in lesioni neuronali legate all'AD e può contribuire sia a compromissione sinaptica sia a una degradazione anomala delle^{proteine 10,11}. Parallelamente, l'autofagia è una via essenziale di degradazione intracellulare che rimuove organelli danneggiati e proteine mal ripiegate. La disfunzione autofagia-lisosomica è stata strettamente associata all'accumulo di Aβ, alla patologia della tau e al danno neuronale^{nell'AD 12}. Tuttavia, i cambiamenti di LC3-II/I da soli non possono distinguere l'aumento della formazione di autofagosomi dalla degradazione autofagica compromessa; Pertanto, sono necessari ulteriori marcatori come il P62 per valutare meglio i cambiamenti di flusso correlati all'autofagia. Insieme, queste osservazioni supportano la necessità di esaminare l'attività PI3K/Akt, la regolazione della Gefirina mediata da GSK-3β e i marcatori correlati all'autofagia all'interno dello stesso quadro sperimentale.

Il triptolide, un triepossido diterpenico bioattivo isolato da Tripterygium wilfordii, è stato segnalato per aver effetti antinfiammatori, immunomodulatori e^{neuroprotettivi 13}. Studi precedenti hanno suggerito che il triptolide può migliorare le prestazioni cognitive e preservare proteine inibitorie associate alle sinapsi in modelli simili all'AD. Tuttavia, la relazione meccanicistica tra il trattamento con triptolide, l'attivazione della via PI3K/Akt, la fosforilazione della Gefirina mediata da GSK-3β, l'espressione della collybitina e le modifiche nelle proteine correlate all'autofagia non è stata completamente definita. Resta incerto se il triptolide regoli l'espressione ippocampale di Gefirina e Collybistina tramite un meccanismo associato a PI3K/Akt/GSK-3β in un modello murino simile AD indotto da Aβ1-42^14,15.

Rispetto ai modelli transgenici cronici di AD, come i topi APP/PS1 o 5xFAD, e ai modelli basati sulla tauopatia, l'iniezione intracerebroventricolare di Aβ1-42 aggregato fornisce un approccio relativamente rapido e tecnicamente accessibile per indurre lesioni ippocampali associate ad Aβ e compromettenti cognitivi. Questo protocollo è appropriato quando l'obiettivo sperimentale è valutare la neurotossicità indotta da Aβ a breve termine, i cambiamenti molecolari dell'ippocampo e gli effetti legati all'intervento su vie di segnalazione definite. Tuttavia, questo modello non riproduce la produzione cronica di amiloide, la patologia della tau, le alterazioni vascolari, la complessità neuroimmune o la progressione dipendente dall'età dell'AD umana. Pertanto, i risultati ottenuti con questo protocollo dovrebbero essere interpretati come patologie simili all'AD indotte da Aβ e idealmente validati in modelli transgenici cronici, modelli correlati alla tau o sistemi neuronali di origine umana. Nonostante le evidenze precedenti che collegano la patologia Aβ, la segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β, le proteine associate alle sinapsi inibitorie e le anomalie legate all'autofagia a patologie simili all'AD, pochi protocolli integrano test comportamentali, valutazione istologica dell'ippocampo, immunoistochimica Aβ, analisi delle proteine inibitorie associate alle sinapsi, valutazione della segnalazione delle chinasi e rilevamento di marcatori correlati all'autofagia all'interno di un singolo modello di intervento indotto da Aβ1-42. Questa lacuna metodologica limita la valutazione riproducibile del fatto che i composti candidati modulino i cambiamenti nelle proteine inibitorie associate alle sinapsi attraverso vie di segnalazione intracellulari definite.

L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro riproducibile per valutare l'espressione di Gefirina e Collybitina ippocampali e i loro meccanismi regolatori associati in un modello murino simile AD indotto da Aβ1-42, trattato con triptolide, con o senza l'inibitore di PI3K LY294002. Il contributo originale di questo lavoro è l'integrazione dell'amministrazione stereotassica di Aβ1-42, la modulazione farmacologica delle vie di segnalazione, i test del labirinto d'acqua di Morris, la valutazione istologica e immunoistochimica, e l'analisi Western blot di proteine inibitorie associate alle sinapsi, la segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β e i marcatori correlati all'autofagia. L'ipotesi di lavoro era che una patologia simile all'AD indotta da Aβ1-42 sarebbe stata associata a una segnalazione compromessa di PI3K/Akt, alterazione della fosforilazione della Gefirina associata a GSK-3β, riduzione dell'espressione di Gefirina e Collybistina nell'ippocampo e accumulo anomalo di proteine correlate all'autofagia, mentre il trattamento con triptolide inverterebbe parzialmente queste anomalie comportamentali e molecolari.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Etico Medico dell'Università di Medicina di Hubei e sono state eseguite secondo le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali (n. SYXK2019-0031.). Tutte le procedure che coinvolgono animali, Aβ1-42, triptolide, LY294002, paraformaldeide, xilene, etanolo e reagenti chemiluminescenti devono essere eseguite con dispositivi di protezione individuale appropriati, inclusi camice da laboratorio, guanti e occhiali protettivi. Le carcasse animali, i tessuti cerebrali, i consumabili contaminati da Aβ, i rifiuti di paraformaldeide, i rifiuti di xilene e i materiali contaminati dall'ECL devono essere raccolti separatamente e smaltiti in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza e lo smaltimento dei rifiuti chimici. L'analisi delle immagini è stata eseguita utilizzando ImageJ. Per l'analisi immunoistochimica, le immagini sono state convertite in scala di grigi a 8 bit o sottoposte a deconvoluzione del colore per isolare la colorazione DAB-positiva. La stessa soglia è stata applicata a tutte le immagini all'interno dello stesso esperimento. Sono state misurate l'area di colorazione positiva, l'area totale della regione di interesse e la densità integrata. Per il Western blotting, le intensità delle bande sono state misurate utilizzando lo strumento di analisi gel dopo la sottrazione di fondo. I livelli di proteine target sono stati normalizzati a β-actina, mentre le proteine fosforilate sono state normalizzate ai corrispondenti livelli proteici totali.

I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali, inclusi nomi dei prodotti, produttori, numeri di catalogo o modello e descrizioni generiche.

Animali e raggruppamento sperimentale
Quarantotto topi adulti C57BL/6J, inclusi 24 maschi e 24 femmine, di età compresa tra 10 e 12 settimane e con un peso di 22-28 g, sono stati acquistati presso il Centro Sperimentale Animale dell'Università di Medicina dell'Hubei. I topi sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di patogeni a 22 ± 2 °C, con libero accesso all'acqua autoclavata e al cibo standard per roditori. Dopo 1 settimana di acclimatazione, i topi sono stati assegnati casualmente a quattro gruppi: il gruppo di controllo, il gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42, il gruppo trattato con triptolide e il gruppo co-trattamento LY294002 più triptolide, con 12 topi per gruppo. Maschi e femmine di topi sono stati bilanciati nel modo più uniforme possibile tra i gruppi.

Il peptide Aβ1-42 è stato disciolto in soluzione salina normale sterile fino a una concentrazione finale di 10 μg/μL. Per preparare Aβ1-42 in condizioni di aggregazione, la soluzione veniva incubata a 37 °C per 7 giorni in un bagno d'acqua circolante, miscelata delicatamente prima dell'uso e conservata sul ghiaccio durante l'iniezione. Questa condizione di preparazione è stata adattata dalle procedure di aggregazione Aβ42 precedentemente pubblicate. Nel presente studio, lo stato di aggregazione del lotto esatto iniettato di Aβ1-42 non è stato caratterizzato indipendentemente dalla fluorescenza della Tioflavina T, SDS-PAGE/Western blotting o microscopia elettronica a trasmissione. Pertanto, il termine "Aβ1-42 aggregato" in questo protocollo si riferisce ad Aβ1-42 preparato in condizioni di incubazione che inducono aggregazione.

Per l'istituzione del modello, i topi sono stati anestetizzati con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 10% a una dose di 0,04 mL/10 g di peso corporeo. Un'anestesia adeguata è stata confermata dall'assenza di ritiro dei pedali e riflessi corneali. Ogni topo veniva poi fissato su un apparato stereotassico, e il cuoio capelluto veniva rasato e disinfettato con iodoforo o etanolo al 75%. Fu effettuata un'incisione mediana per esporre il cranio e il bregma fu identificato sotto uno stereomicroscopio. Il cranio fu regolato in modo che bregma e lambda fossero posizionati sullo stesso piano orizzontale.

Le iniezioni bilaterali dei ventricoli laterali sono state eseguite utilizzando le seguenti coordinate relative al bregma: anteroposteriore, −0,50 mm; mediolaterale, ±1,00 mm; e dorsoventrale, a −3,00 mm dalla superficie cranica. Un volume totale di 2 μL di soluzione aggregata di Aβ1-42 è stato iniettato lentamente (2 μL/min) in ciascun ventricolo laterale utilizzando una microsiringa. L'iniezione è stata eseguita a una velocità costante e bassa per ridurre i danni ai tessuti e il reflusso. Dopo l'iniezione, l'ago veniva lasciato in posizione per circa 5 minuti, poi veniva ritirato lentamente. I topi di controllo hanno ricevuto un volume uguale di soluzione salina normale sterile alle stesse coordinate e utilizzando la stessa procedura chirurgica. Dopo l'iniezione, l'incisione del cuoio capelluto veniva chiusa con punti di sutura o clip per ferite, e i topi venivano posti in una gabbia di recupero riscaldata fino a quando non riprendevano conoscenza. Il recupero post-operatorio, il peso corporeo, la guarigione delle ferite, il comportamento di cura personale, l'attività locomotoria e i segni di dolore o disagio venivano monitorati quotidianamente.

L'intervento farmacologico è stato avviato 2 settimane dopo l'iniezione stereotassica, dopo che il modello era stato considerato stabile. Il triptolide è stato disciolto in soluzione salina normale contenente il 4% di glicole propilenico e somministrato intraperitonealmente una volta al giorno per 30 giorni consecutivi. Il gruppo trattato con triptolide ha ricevuto triptolide a 0,2 mg/kg al giorno, mentre il gruppo LY294002 più triptolide ha ricevuto triptolide insieme all'inibitore PI3K LY294002 a 0,3 mg/kg una volta al giorno per 30 giorni consecutivi. Il gruppo di controllo e il gruppo modello AD-like indotto da Aβ1-42 hanno ricevuto volumi uguali di soluzione del veicolo utilizzando lo stesso schema^{di iniezione 16}.

Test del labirinto acquatico di Morris
L'apprendimento spaziale e la memoria sono stati valutati utilizzando il labirinto d'acqua di Morris 24 ore dopo l'amministrazione finale dei farmaci. Il labirinto d'acqua consisteva in una piscina circolare piena d'acqua mantenuta a 22 °C ± 1 °C. Segnali visivi sono stati posizionati intorno alla piscina e mantenuti invariati durante tutto l'esperimento. Durante la fase di navigazione del luogo, la piattaforma nascosta era fissata nel quadrante target. Prima di ogni test giornaliero, i topi sono stati lasciati ad ambientarsi nella sala di test per circa 30 minuti.

Il test di navigazione è stato eseguito per 6 giorni consecutivi. In ogni prova, il topo veniva delicatamente posizionato nell'acqua, rivolto verso il muro della piscina da uno dei quadranti iniziali, e poteva cercare la piattaforma nascosta per un massimo di 60 secondi. Se il topo trovava la piattaforma entro 60 s, poteva rimanere sulla piattaforma per 15 s. Se il mouse non riusciva a localizzare la piattaforma entro 60 secondi, veniva guidato verso la piattaforma e lasciato rimanere lì per 20 secondi per facilitare la consolidazione della memoria spaziale. Ogni topo ha affrontato 4 prove al giorno, e la latenza di fuga, la distanza di nuoto e la velocità di nuoto sono state registrate tramite un sistema automatizzato di video-tracking.

Il settimo giorno, la piattaforma è stata rimossa per il processo di sonda. Il topo veniva inserito in acqua dal quadrante opposto alla posizione originale della piattaforma e lasciato nuotare liberamente per 60 secondi. Sono stati registrati il numero di attraversamenti dei binari e la percentuale di tempo trascorso nel quadrante target. Dopo ogni prova, il topo veniva asciugato e riportato in una gabbia riscaldata per prevenire l'ipotermia^17,18.

Raccolta di tessuti
Dopo i test comportamentali, i topi sono stati profondamente anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 10% a una dose di 0,04 mL/10 g di peso corporeo. Otto topi di ciascun gruppo sono stati selezionati casualmente per l'estrazione proteica dell'ippocampo. I loro cervelli furono rapidamente rimossi sul ghiaccio e i tessuti ippocampali bilaterali furono dissezionati su una superficie gelida. I campioni dell'ippocampo venivano inseriti in cryovial pre-marcati, congelati subito in azoto liquido e conservati a −80 °C fino all'estrazione proteica.

I restanti quattro topi di ciascun gruppo sono stati utilizzati per analisi istologiche e immunoistochimiche. In anestesia profonda, i topi sono stati perfusi transcardicamente con soluzione salina tamponata con fosfato fino a diventare pallido, seguiti dal 4% di paraformaldeide. I cervelli sono stati accuratamente rimossi e post-fissati con paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore. Dopo la fissazione, i tessuti cerebrali sono stati sottoposti alla piattaforma sperimentale di patologia, dove sono stati eseguiti l'inserimento della paraffina e la successiva sezione. Il paraformaldeide veniva gestito in una cappa chimica, mentre i rifiuti contenenti paraformaldeide venivano raccolti separatamente in conformità con i requisiti istituzionali per lo smaltimento dei rifiuti chimici.

Colorazione di ematossilina ed eosina
I tessuti cerebrali incorporati nella paraffina sono stati tagliati in sezioni coronali da 4 μm contenenti l'ippocampo. Le sezioni sono state cotte a 60 °C per 1 ora, deparafinizzate due volte in xilene per 10 minuti ciascuna e reidratate tramite soluzioni di etanolo classificate (100%, 95%, 85% e 75%) seguite da acqua distillata (5 min per ogni passaggio). Dopo la reidratazione, le sezioni venivano macchiate con ematossilina per 10 minuti, risciacquate con acqua corrente del rubinetto, differenziate brevemente con alcol acido (2 seconde), quando necessario, e bluate con acqua del rubinetto corrente. Le sezioni sono state poi controcolorate con eosina per 5 minuti, disidratate tramite etanolo classificato, eliminate nello xilene due volte per 5 minuti ciascuna e montate con resina neutra.

La morfologia dell'ippocampo è stata osservata al microscopio ottico. Le immagini sono state acquisite dalla stessa sottoregione ippocampale in tutti i gruppi, utilizzando i parametri di ingrandimento e imaging del 20×. Il danno neuronale è stato valutato sulla base della densità neuronale, della pignosi nucleare e della disposizione disordinata utilizzando software di analisi delle immagini da un ricercatore cieco sull'assegnazione del gruppo¹⁹.

Immunoistochimica Aβ
Per l'immunoistochimica Aβ, le sezioni di paraffina sono state deparaffinizzate e reidratate come descritto per la colorazione di ematossilina ed eosina. Il recupero dell'antigene è stato eseguito in un buffer EDTA di recupero antigenico a pH 8,0 riscaldando le sezioni in un forno a microonde ad alta potenza per 3 minuti due volte. Le sezioni sono state lasciate raffreddare a temperatura ambiente e poi lavate tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata con perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente, seguita da un lavaggio PBS tre volte per 5 minuti ciascuno. Il legame aspecifico è stato bloccato con il siero normale di capra al 5% per 30 minuti a temperatura ambiente. I sezioni sono state incubate durante la notte a 4 °C con un anticorpo primario contro Aβ diluito 1:200 in PBS. Dopo l'incubazione, le sezioni sono state lavate tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna, poi incubate con un anticorpo secondario coniugato con HRP per 60 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS, è stato applicato il substrato DAB e lo sviluppo del colore è stato monitorato al microscopio. La reazione veniva interrotta con acqua distillata una volta che la colorazione marrone-positiva divenne visibile. Le sezioni venivano controcolorate con ematossilina, disidratate tramite etanolo classificato, ripulite con xilene e montate con resina neutra. Le immagini sono state catturate dalla stessa sottoregione ippocampale in tutti i gruppi utilizzando le stesse impostazioni del microscopio a ingrandimento del 20×. L'immunocolorazione Aβ è stata quantificata tramite software di analisi delle immagini. La soglia di colorazione positiva è stata mantenuta coerente su tutte le immagini e la deposizione Aβ è stata calcolata come l'area di colorazione positiva divisa per il numero totale di cellule in ogni campo microscopico.

Estrazione proteica dell'ippocampo e analisi del western blot
I tessuti ippocampali congelati sono stati mantenuti sul ghiaccio e omogeneizzati in un tampone di lisi RIPA ghiacciato contenente inibitori di proteasi e fosfatasi. Gli omogeneati sono stati incubati sul ghiaccio per 30 minuti e hanno fatto vortici intermittenti per garantire una lisi sufficiente. I lisati sono stati poi centrifugati a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C, e i soprantativi sono stati raccolti per l'analisi delle proteine. Le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit di analisi proteica BCA secondo le istruzioni del produttore. In breve, standard BSA e campioni proteici sono stati preparati in duplicata, miscelati con reagente di lavoro BCA, incubati a 37 °C per 30 minuti e misurati a 562 nm utilizzando un lettore di microplacche. Le concentrazioni proteiche sono state calcolate secondo la curva standard e tutti i campioni sono stati regolati alla stessa concentrazione finale prima^{dell'elettroforesi 20}.

20 μg di proteina totale da ciascun campione ippocampo sono stati separati dal 12% di SDS-PAGE e trasferiti sulle membrane PVDF. L'elettroforesi veniva eseguita a 80 V per l'impilamento e a 120 V per la separazione. Le proteine sono state trasferite alle membrane PVDF attivate nel metanolo tramite trasferimento umido a 100 V per 90 minuti a 4 °C. Dopo il trasferimento, le membrane sono state bloccate con il 5% di BSA per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari contro la Gefirina (diluizione 1:1000), la Gefirina fosforilata (diluizione 1:500), la collibistina (diluizione 1:1000), PI3K (diluizione 1:1000), Akt (diluizione 1:1000), Akt fosforilato (diluizione 1:1000), GSK-3β (diluizione 1:1000), GSK-3β fosforilato (diluizione 1:1000), LC3 (diluizione 1:1000), p62 (diluizione 1:1000) e β-actin (diluizione 1:5000). Dopo il lavaggio con TBST, le membrane sono state incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente (diluizione 1:5000). Le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando substrato chemiluminescente ECL e catturate con un sistema di imaging chemiluminescenze. Le intensità delle bande sono state quantificate utilizzando software di analisi delle immagini. I livelli totali di espressione proteica sono stati normalizzati in β-actina. Immagini Western blot ad alta risoluzione non ritagliate furono incluse nei materiali supplementari.

Dati statistici
L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando software di analisi statistica e generazione di grafi. I dati erano espressi come media ± SD, come indicato nelle leggende delle figure. Test comportamentali e quantificazione dell'immagine sono stati eseguiti da investigatori accecato all'allocazione dei gruppi. La latenza di fuga durante la fase di addestramento del labirinto d'acqua di Morris è stata analizzata utilizzando ANOVA a due misure ripetute, con fattori di gruppo e giorno di addestramento. I dati delle prove con sonda, la quantificazione istologica, la quantificazione immunoistochimica e la densitometria Western blot sono stati analizzati utilizzando un test ANOVA unidirezionale. La significatività statistica è stata definita come p < 0,05. La notazione standard di significato veniva utilizzata come segue: *p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001. Le dimensioni esatte dei campioni sono state riportate nelle relative legende delle cifre. Maschi e femmine di topi erano distribuiti equamente tra i gruppi sperimentali. Tuttavia, non è stata effettuata un'analisi statistica stratificata per sesso perché lo studio non era progettato né fornito per rilevare effetti specifici per sesso. Questa limitazione è riconosciuta nella sezione Discussione.

Risultati

Apprendimento e memoria compromessa nei topi simili all'AD indotti da Aβ1-42 e miglioramento parziale dopo il trattamento con triplolide

Per stabilire un modello murino simile all'AD indotto da Aβ1-42, l'Aβ1-42 aggregato è stato iniettato stereotassicamente nei ventricoli laterali bilaterali dei topi C57BL/6J. Dopo la creazione del modello, i topi sono stati trattati con veicoli, triptolide o triptolide combinati con l'inibitore PI3K LY294002. L'apprendimento spaziale e la memoria sono stati poi valutati utilizzando il labirinto acquatico Morris.

Durante la fase di navigazione di 6 giorni, la latenza di fuga è diminuita gradualmente in tutti i gruppi, indicando che i topi hanno acquisito il compito di apprendimento spaziale con un addestramento ripetuto (Figura 1A). Tuttavia, i topi simili AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato latenze di fuga costantemente più lunghe rispetto ai topi controllo, soprattutto nei giorni di addestramento più avanzati, suggerendo un apprendimento spaziale compromesso. Il trattamento con triptolide ha accorciato la latenza di fuga rispetto al gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42, mentre il co-trattamento con LY294002 ha indebolito questo miglioramento. Questi risultati indicano che il triptolide ha parzialmente migliorato il deficit di apprendimento spaziale indotto da Aβ1-42, e questo effetto è stato attenuato dall'inibizione di PI3K.

I percorsi rappresentativi di nuoto hanno ulteriormente supportato questi cambiamenti comportamentali (Figura 1B). I topi di controllo hanno mostrato un pattern di ricerca più diretto e orientato al bersaglio attorno alla posizione della piattaforma, mentre i topi simili AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato una traiettoria di nuoto dispersa e inefficiente. I topi trattati con triptolide hanno mostrato un miglioramento nel comportamento di ricerca, con traiettorie più concentrate intorno all'area bersaglio. Al contrario, i topi trattati con LY294002 e triptolide hanno mostrato una ricerca meno efficiente rispetto a quelli trattati solo con triptolide. Nella prova con la sonda condotta dopo la rimozione della piattaforma, i topi simili AD indotti da Aβ1-42 attraversarono la posizione originale della piattaforma meno volte rispetto ai topi controllo, indicando una ritenuta della memoria spaziale compromessa (Figura 1C). Il trattamento con triptolide aumentò il numero di attraversamenti a livello di binari, mentre LY294002 co-trattamento ridusse questo effetto. Analogamente, la percentuale di tempo trascorso nel quadrante target è stata ridotta nei topi simili alla DA indotti da Aβ1-42 rispetto ai topi controllo, aumentata dopo il trattamento con triptolida e nuovamente diminuita dopo LY294002 co-trattamento (Figura 1D).

Insieme, questi risultati comportamentali dimostrano che l'iniezione bilaterale intracerebroventricolare di Aβ1-42 aggregato ha indotto deficit di apprendimento spaziale e memoria nei topi. Il triptolide ha parzialmente invertito questi deficit comportamentali, mentre LY294002 attenuato l'effetto protettivo del triptolide, suggerendo che la segnalazione PI3K/Akt possa contribuire agli effetti comportamentali osservati in questo modello.

L'iniezione di Aβ1-42 ha indotto lesioni neuronali ippocampali e deposizione di Aβ, attenuate dal triptolide

Per verificare ulteriormente l'instaurazione di cambiamenti patologici simili all'AD indotti da Aβ1-42 e valutare l'effetto del triptolide sulla lesione dell'ippocampo, sono state eseguite colorazioni di ematossilina ed eosina e immunoistochimica di Aβ su sezioni cerebrali di ciascun gruppo.

La colorazione con HE ha mostrato che i neuroni del gruppo di controllo erano densamente e regolarmente disposti, con morfologia cellulare e struttura nucleare relativamente chiare (Figura 2A). Al contrario, i topi simili all'AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato evidenti danni neuronali ippocampali, caratterizzati da disordine cellulare, riduzione della densità neuronale e aumento della condensazione nucleare. Il trattamento con triptolidi ha parzialmente migliorato la morfologia neuronale dell'ippocampo, con una disposizione cellulare più conservata e una piknosi nucleare meno evidente rispetto al gruppo modello indotto da Aβ1-42. Tuttavia, il cotrattamento con LY294002 ha attenuato l'effetto protettivo del triptolide, come riflette in una disorganizzazione e lesioni neuronali più marcate rispetto al gruppo trattato con il triptolide.

Successivamente è stata eseguita un'immunoistochimica Aβ per valutare la deposizione di Aβ nell'ippocampo (Figura 2B). Una colorazione minima per Aβ positiva è stata osservata nel gruppo di controllo, mentre il gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42 ha mostrato segnali marroni Aβ-positivi in modo marcato aumentato. Il trattamento con triptolideo ha ridotto la colorazione Aβ-positiva rispetto al gruppo modello, indicando che il triptolideo attenuava la deposizione di Aβ in questo modello. Al contrario, i topi trattati con LY294002 più triplolide hanno mostrato un aumento della colorazione Aβ-positiva rispetto a quelli trattati solo con triptolide. L'analisi quantitativa ha ulteriormente confermato queste osservazioni istologiche. L'area del segnale Aβ-positivo normalizzata al numero totale di cellule in ciascun campo microscopico è aumentata nel gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42 rispetto al gruppo di controllo, ridotta dopo il trattamento con triptolide e parzialmente aumentata nuovamente dopo LY294002 co-trattamento (Figura 2B).

Questi risultati indicano che l'iniezione di Aβ1-42 ha indotto lesioni neuronali ippocampali e accumulo di Aβ, mentre il triptolide ha parzialmente alleviato questi cambiamenti patologici. L'inversione osservata dopo LY294002 co-trattamento suggerisce che la segnalazione PI3K/Akt possa contribuire all'effetto protettivo del triptolide.

Il triptolideo ha ripristinato l'espressione ippocampale di Gefirina e Collybistina e ha modulato la segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β

Per determinare se i cambiamenti comportamentali e istologici fossero accompagnati da alterazioni nelle proteine inibitorie associate alla sinapsi e nella loro segnalazione regolatoria a monte, sono stati analizzati lisati ippocampali di ciascun gruppo tramite Western blotting. Rispetto al gruppo di controllo, i topi simili AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato una netta riduzione dell'espressione della Gefirina ippocampale, mentre i livelli di Gefirina fosforilata sono aumentati (Figura 3A). Il trattamento con triptolide ha parzialmente ripristinato l'espressione totale della Gefirina e ridotto i livelli fosforilati di Gefirina. Al contrario, LY294002 co-trattamento ha indebolito l'effetto del triptolide, come dimostrato dalla riduzione dell'espressione della Gefirina e dall'aumento della Gefirina fosforilata rispetto al gruppo trattato con triptolide. Questi risultati suggeriscono che la patologia indotta da Aβ1-42 era associata non solo a una riduzione dell'abbondanza di Gefirina ippocampale, ma anche a un aumento della fosforilazione della Gefirina, mentre il triptolide ha parzialmente invertito queste alterazioni.

La collibistina ha mostrato un modello di espressione simile a quello della Gefirina totale. I topi simili AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato una diminuzione dell'espressione di collibistina ippocampica rispetto ai topi controllo, mentre il trattamento con tripolide ha ripristinato l'espressione della collibistina. LY294002 co-trattamento ha parzialmente invertito questo effetto (Figura 3B). Questi risultati indicano che il triptolideo ha preservato l'espressione delle proteine impalcature associate alle sinapsi inibitorie nell'ippocampo, e questo effetto è stato attenuato dall'inibizione di PI3K. La via di segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β è stata poi esaminata per chiarire ulteriormente i cambiamenti molecolari alla base della fosforilazione della Gefirina. Nel gruppo modello AD-like indotto da Aβ1-42, l'espressione di PI3K e il rapporto p-Akt/Akt sono stati ridotti rispetto al gruppo di controllo, indicando un'attività di segnalazione PI3K/Akt compromessa (Figura 3B). Anche il rapporto p-GSK-3β/GSK-3β fu ridotto nel gruppo modello. Poiché la fosforilazione di GSK-3β nel sito inibitorio riflette la soppressione dell'attività di GSK-3β, questa riduzione suggerisce un aumento relativamente maggiore dell'attività di GSK-3β nell'ippocampo simile AD indotto da Aβ1-42. Il trattamento con triptolide ha aumentato l'espressione di PI3K, ripristinato il rapporto p-Akt/Akt e aumentato il rapporto p-GSK-3β/GSK-3β. Questi effetti sono stati indeboliti dal LY294002 co-trattamento.

Insieme, questi risultati suggeriscono che la patologia simile AD indotta da Aβ1-42 era associata a una riduzione dell'espressione ippocampale di Gefirina e Collybistin, un aumento della fosforilazione della Gefirina e una fosforilazione inibitoria compromessa da PI3K/Akt di GSK-3β. Il triptolide ha parzialmente invertito questi cambiamenti molecolari, mentre LY294002 attenuato gli effetti del triptolide, supportando il coinvolgimento della segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β nella regolazione della Gefirina e della Collybitina ippocampali in questo modello.

Il triptolideo attenuò anomalie proteiche legate all'autofagia nell'ippocampo di topi simili alla DA indotti da Aβ1-42

Per determinare se la patologia simile all'AD indotta da Aβ1-42 e il trattamento con triptolide fossero associati a cambiamenti nelle proteine correlate all'autofagia, l'espressione di LC3 e p62 è stata esaminata nei lisati ippocampali tramite Western blotting. Rispetto al gruppo di controllo, i topi simili all'AD indotti da Aβ1-42 hanno mostrato un aumento del rapporto LC3-II/I, indicando un aumento dell'accumulo di LC3-II associato agli autofagosomi. Parallelamente, l'espressione di p62 è stata elevata anche nel gruppo modello, suggerendo l'accumulo di substrati correlati all'autofagia nell'ippocampo. Il trattamento con triptolide ha ridotto sia il rapporto LC3-II/I sia l'espressione di p62 rispetto al gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42. Questi risultati indicano che il triptolideo ha attenuato l'accumulo anomalo di proteine correlate all'autofagia indotto da Aβ1-42. Al contrario, LY294002 cotrattamento ha aumentato il rapporto LC3-II/I e l'espressione di p62 rispetto al trattamento da solo con triptolide, suggerendo che l'inibizione di PI3K attenuasse l'effetto del triptolide sulle modifiche proteiche correlate all'autofagia (Figura 4).

Nel complesso, il gruppo di controllo ha fornito il profilo comportamentale, istologico e molecolare di base, mentre il gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42 ha confermato che l'amministrazione intracerebroventricolare di Aβ1-42 ha prodotto compromissione cognitiva, lesioni neuronali dell'ippocampo, deposizione di Aβ, riduzione delle proteine associate alle sinapsi inibitorie, cambiamenti nella segnalazione PI3K/Akt/GSK-3β e accumulo di proteine correlate all'autofagia. Il confronto tra il gruppo modello indotto da Aβ1-42 e quello trattato con triptolide ha mostrato che il triptolide invertiva parzialmente queste anomalie. Il confronto tra il gruppo trattato con triptolide e il gruppo co-trattamento LY294002 più triptolide ha ulteriormente mostrato che l'inibizione di PI3K attenuava gli effetti del triptolide. Questi risultati supportano l'ipotesi operativa secondo cui il triptolide modula le modifiche nella Gefirina, nella Collybistina e nelle proteine correlate all'autofagia ippocampali in un modello simile AD indotto da Aβ1-42 attraverso un meccanismo associato a PI3K/Akt/GSK-3β.

DISPONIBILITÀ DEI DATI:

Tutti i dati grezzi necessari per riprodurre i risultati di questo studio sono forniti come File Supplementare 1 e File Supplementare 2. Questi includono le immagini originali del western blot e del gel, i dati dei blot non ritagliati, i valori numerici grezzi utilizzati per le analisi statistiche e i grafici generati. (File Supplementare 1 e File Supplementare 2) Questi file forniscono i dati grezzi a supporto dei risultati quantitativi riportati nella Figura 1–4.

Figura 1: Il triptolide ha parzialmente migliorato l'apprendimento spaziale e i deficit di memoria nei topi simili all'AD indotti da Aβ1-42. (A) Latenza di fuga durante la fase di navigazione di 6 giorni del labirinto acquatico Morris. (B) Traiettorie rappresentative di nuoto durante la prova con la sonda. (C) Numero di attraversamenti sulla posizione originale della banchina dopo la rimozione della banchina. (D) Percentuale di tempo trascorso nel quadrante bersaglio durante la prova con la sonda. I dati sono presentati come media ± SD. La latenza di fuga è stata analizzata tramite ANOVA a due vie di misure ripetute, e i dati delle prove con la sonda sono stati analizzati tramite test ANOVA unidirezionale. Ctr, gruppo di controllo; AD, gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42; TP, gruppo trattato con triptolide; LY, LY294002 gruppo di co-trattamento con tripolide. n = 6 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Triptolide attenuata lesione neuronale dell'ippocampo e deposizione di Aβ in topi simili alla DA indotti da Aβ1-42. (A) Immagini rappresentative di colorazione con ematossilina ed eosina di sezioni ippocampali di ciascun gruppo. Barra di scala = 50μm. (B) Immagini rappresentative di colorazione immunoistochimica Aβ e analisi quantitativa della deposizione Aβ-positiva nell'ippocampo. Barra della scala = 50μm. I dati sono presentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un test ANOVA unidirezionale. Ctr, gruppo di controllo; AD, gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42; TP, gruppo trattato con triptolide; LY, LY294002 gruppo di co-trattamento con tripolide. n = 3 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Il triptolideo ha ripristinato l'espressione di Gefirina e Collybistina ippocampali e ha modulato la segnalazione associata a PI3K/Akt/GSK-3β nei topi simili AD indotti da Aβ1-42. (A) Immagini rappresentative del Western blot e analisi quantitativa dell'espressione totale di Gefirina e Gefirina fosforilata nei lisati ippocampali di ciascun gruppo. (B) Immagini rappresentative Western blot e analisi quantitativa di collybistina, PI3K, Akt, Akt fosforilato, GSK-3β e GSK-3β fosforilato nei lisati ippocampali. Collybistina e PI3K sono state normalizzate a β-actina. Gli Akt fosforilati e GSK-3β fosforilati sono stati quantificati rispettivamente come rapporti p-Akt/Akt e p-GSK-3β/GSK-3β. I dati sono presentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un test ANOVA unidirezionale. Ctr, gruppo di controllo; AD, gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42; TP, gruppo trattato con triptolide; LY, LY294002 gruppo di co-trattamento con tripolide. n = 3 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Il triptolideo attenuò anomalie proteiche legate all'autofagia nell'ippocampo di topi simili alla DA indotti da Aβ1-42. Immagini rappresentative del Western blot e analisi quantitativa dell'espressione di LC3-I/II e p62 nei lisati ippocampali di ciascun gruppo. Il rapporto LC3-II/I è stato calcolato dividendo l'intensità della banda LC3-II per l'intensità della banda LC3-I, e l'espressione di p62 è stata normalizzata in β-actina. I dati sono presentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un test ANOVA unidirezionale. Ctr, gruppo di controllo; AD, gruppo modello simile AD indotto da Aβ1-42; TP, gruppo trattato con triptolide; LY, LY294002 gruppo di co-trattamento con tripolide. n = 3 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Fascicolo supplementare 1: Immagini di Western blot non ritagliate. Le bande utilizzate per la quantificazione sono indicate e i marcatori di peso molecolare sono mostrati dove disponibili. Clicca qui per scaricare questo file.

Fascicolo supplementare 2: Valori numerici grezzi utilizzati per le analisi statistiche in questo articolo. Questo file contiene i dataset numerici grezzi utilizzati per generare i grafici quantitativi nella Figura 1–4, inclusi i misuramenti comportamentali del labirinto d'acqua di Morris, la quantificazione immunoistochimica Aβ e i valori della densitometria Western blot. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

La proposta meccanicistica centrale di questo studio è che la patologia indotta da Aβ1-42 sopprime la segnalazione PI3K/Akt, riduce la fosforilazione inibitoria di GSK-3β, promuove la fosforilazione della Gefirina, diminuisce l'espressione di Gefirina e Collybitina dell'ippocampo e contribuisce all'accumulo di proteine correlate all'autofagia, mentre il triptolide contrasta parzialmente questi cambiamenti attraverso una via associata a PI3K/Akt/GSK-3β. Questo studio mostra che la patologia simile all'AD indotta da Aβ1-42 è accompagnata da apprendimento spaziale e memoria compromessibile, lesioni neuronali dell'ippocampo, aumento della deposizione di Aβ, riduzione dell'espressione di Gefirina e Collybistin, aumento della fosforilazione della Gefirina, segnalazione alterata di PI3K/Akt/GSK-3β e accumulo di proteine correlate all'autofagia. Il triptolide ha parzialmente invertito queste anomalie comportamentali, istologiche e molecolari, mentre LY294002 attenuato i suoi effetti. Questi risultati supportano un modello in cui il triptolide protegge le proteine associate alle sinapsi inibitorie dell'ippocampo, almeno in parte, attraverso la regolazione della fosforilazione della Gefirina mediata da PI3K/Akt/GSK-3β e le modifiche nelle proteine correlate all'autofagia. Va notato che il modello di iniezione intracerebroventricolare con Aβ1-42 riflette principalmente la neurotossicità indotta da Aβ e una patologia simile all'AD, piuttosto che la progressione cronica e multifattoriale completa dell'AD²¹ umano.

Gefirina e Collybistina sono componenti centrali dell'organizzazione sinaptica inibitoria. La Gefirina ancorano i recettori dei neurotrasmettitori inibitori nei siti postsinaptici, mentre la Collibitina favorisce il clustering della Gefirina e la localizzazione della membrana. La riduzione dell'espressione di queste proteine può quindi disturbare la stabilità sinaptica inibitoria e contribuire a una funzione compromessa della rete^{ippocampale 8}. In questo studio, Aβ1-42 ha ridotto l'espressione di Gefirina e Collybistina ippocampali, mentre il triptolide ha ripristinato entrambe le proteine. L'aumento della Gefirina fosforilata fornisce un meccanismo plausibile per la perdita di Gefirina, poiché la fosforilazione a Ser270 è stata collegata alla dispersione della Gefirina, alla riduzione del clustering e alla destabilizzazione delle proteine. La riduzione parallela dell'espressione di PI3K, della fosforilazione di Akt e della fosforilazione inibitoria di GSK-3β suggerisce che Aβ1-42 indebolisce la segnalazione PI3K/Akt e possa aumentare l'attività di GSK-3β, il che è coerente con una fosforilazione aumentata della Gefirina. Al contrario, il triptolide ha ripristinato la fosforilazione di Akt, aumentato la fosforilazione inibitoria del GSK-3β e ridotto la fosforilazione della Gefirina, mentre LY294002 indebolito questi effetti. Questi risultati suggeriscono che il triptolide possa preservare l'espressione di Gefirina e Collybitina attraverso la regolazione della fosforilazione della Gefirina associata a PI3K/Akt/GSK-3β. Tuttavia, poiché sono stati utilizzati lisati interi dell'ippocampo, questi risultati riflettono cambiamenti nell'abbondanza e nella fosforilazione delle proteine ippocampali piuttosto che evidenze dirette di localizzazione^{sinaptica 22,23}.

Anche le anomalie legate all'autofagia possono contribuire ai cambiamenti molecolari osservati in questo modello. L'autofagia è importante per la proteostasi neuronale, ma una degradazione autofagica compromessa nell'AD può portare all'accumulo di autofagosomi e substrati proteici^{patologici 24,25}. Nel presente studio, Aβ1-42 ha aumentato sia il rapporto LC3-II/I sia l'espressione di p62, suggerendo l'accumulo di substrati LC3-II associati all'autofagosoma e di substrati correlati all'autofagia. Il triptolide ha ridotto entrambi i marcatori, mentre LY294002 ha parzialmente invertito questo effetto, suggerendo che il triptolide possa alleviare l'accumulo di proteine correlate all'autofagia tramite un meccanismo dipendente da PI3K/Akt. Insieme ai cambiamenti nella segnalazione di Gefirina, Collybistina e PI3K/Akt/GSK-3β, questi risultati estendono la comprensione degli effetti neuroprotettivi del triptolide oltre le azioni antinfiammatorie o neuroprotettive generali, suggerendo che il triptolide possa anche influenzare le proteine impalcature associate alle sinapsi inibitorie, la segnalazione delle chinasi e le vie correlate alla proteostasi nella patologia simile AD^{associata ad Aβ 26}.

Diversi passaggi critici determinano il successo e la riproducibilità di questo protocollo. Innanzitutto, lo stato di aggregazione di Aβ1-42 dovrebbe essere controllato e verificato con attenzione prima dell'iniezione, poiché la preparazione peptidica può influenzare fortemente gli esiti patologici. In secondo luogo, è essenziale un'iniezione stereotassica accurata nei ventricoli laterali; il reflusso, una posizione errata dell'ago o una velocità di iniezione eccessiva possono causare un'esposizione variabile ad Aβ e risultati comportamentali o istologici incoerenti. In terzo luogo, i test nel labirinto d'acqua Morris richiedono segnali visivi stabili, temperatura dell'acqua costante e monitoraggio della velocità di nuoto per escludere un deficit motorio come fattore di confusione. In quarto luogo, la quantificazione istologica e immunoistochimica dovrebbe essere effettuata utilizzando regioni di interesse ippocampali predefinite e analisi cieca. Infine, i risultati del Western blot dipendono da un carico proteico uguale, una concentrazione adeguata in gel, un trasferimento efficiente e l'uso di immagini di blot non ritagliate per confermare la specificità della banda.

Dovrebbero essere considerate diverse limitazioni. Innanzitutto, il modello di iniezione Aβ1-42 non riproduce la progressione cronica, la patologia tau, i cambiamenti vascolari o la complessità neuroimmune dell'AD umana. In secondo luogo, sebbene maschi e femmine fossero distribuiti equamente tra i gruppi, lo studio non era fornito per un'analisi stratificata^{sessualmente 27}. In terzo luogo, i lisati interi dell'ippocampo non possono determinare se cambiamenti in Gefirina e Collybistina si verifichino specificamente nelle sinapsi inibitorie. In quarto luogo, il meccanismo proposto PI3K/Akt/GSK-3β–Gefirina rimane associativo, poiché l'attività di GSK-3β e la fosforilazione di Gefirina Ser270 non sono state manipolate direttamente. Infine, LC3-II/I e p62 sono letture statiche di Western blot e non possono definire completamente il flusso autofagico dinamico. Gli studi futuri dovrebbero utilizzare frazionamento sinaptosomico, co-localizzazione immunofluorescente con marcatori postsinaptici inibitori, approcci GSK-3β a guadagno o perdita di funzione, costrutti mutanti Gephyrin Ser270 e saggi di flusso basati su inibitori lisosomiali. Sarà inoltre necessaria la validazione in modelli cronici di AD transgenica, modelli correlati alla tau e sistemi neuronali di origine umana per determinare se questa via sia ampiamente rilevante per la patologia dell'AD¹⁴. Un'ulteriore limitazione è che lo stato di aggregazione della preparazione esatta Aβ1-42 utilizzata per l'iniezione stereotassica non è stato convalidato indipendentemente dalla fluorescenza della Tioflavina T, dalla SDS-PAGE/Western blotting o dalla microscopia elettronica a trasmissione. Sebbene il peptide sia stato preparato utilizzando una procedura di incubazione prolungata a 37 °C comunemente utilizzata per promuovere l'aggregazione di Aβ1-42, la variazione da batch a lotto nello stato di aggregazione può influenzare gli esiti patologici. Studi futuri dovrebbero convalidare questo flusso di lavoro in modelli cronici di AD transgenico, modelli correlati alla tau e sistemi neuronali di origine umana. Ulteriori esperimenti dovrebbero includere la validazione diretta dello stato di aggregazione di Aβ1-42, la valutazione della precisione dell'iniezione stereotassica tramite verifica con colorante o anatomica, frazionamento sinaptosomico, co-localizzazione immunofluorescente con marcatori postsinaptici inibitori, approcci di guadagno o perdita di funzione GSK-3β, esperimenti mutanti Gephyrin Ser270 e saggi di flusso autofagico basati su inibitori lisosomiali. Sono inoltre necessari studi di dose-risposta e di sicurezza del triptolideo prima di poter essere considerata le applicazioni traslazionali

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-Gephyrin antibody	12681	Peoteintech	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di Gephyrin totale.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  antibody	147011	Synaptic Systems	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di Gephyrin fosforilato.
Anti-Collybistin antibody	ab316963	abcam	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di Collybistin.
Anti-PI3K antibody	27921	Peoteintech	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di PI3K.
Anti-Akt antibody	9272	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di Akt totale.
Anti-phosphorylated Akt antibody	4060	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di Akt fosforilato.
Anti-GSK-3β antibody	12456	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di GSK-3β totale.
Anti-phosphorylated GSK-3β antibody	5558	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di GSK-3β fosforilato.
Anti-β actin antibody	66009	Peoteintech	Anticorpo di controllo del carico per la normalizzazione del Western blot.
Anti-LC3 antibody	11972	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di LC3-I e LC3-II.
Anti-p62 antibody	5114	Cell Signaling Technology	Anticorpo primario per la rilevazione mediante Western blot di p62/SQSTM1.
Anti-Aβ1-42 antibody	ab150155	abcam	Anticorpo primario per la rilevazione di Aβ1-42.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	Anticorpo secondario per anticorpi primari di topo nel Western blotting.
HRP-conjugated secondary antibody (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	Anticorpo secondario per anticorpi primari di coniglio nel Western blotting.
Anti-Aβ antibody	GT622,	Invitrogen,	Anticorpo primario per immunoistochimica di Aβ.
Aβ1-42	9001	Shanghai Duma Technology Co., Ltd.	Peptide amiloide-β utilizzato per preparare la soluzione di iniezione induttrice di aggregazione.
triptolide	BD9097	Shanghai Bide Pharmaceutical.	Composito di prova somministrato per via intraperitoneale.
LY294002	ab120243	abcam	Inibitore PI3K utilizzato per il gruppo di co-trattamento.
paraformaldeide	P0099	Beyotime	Fissativo per perfusione transcardica e post-fissazione dei tessuti.
xilene	108298	Merck	Reattivo per la deparaffinizzazione e la chiarificazione dei tessuti.
etanolo	100983	Merck	Reattivo per la reidratazione e disidratazione delle sezioni paraffinate.
propilenglicole	294004	Merck	Componente del veicolo per la preparazione della soluzione farmacologica.
inibitori di proteasi e fosfatasi	P1045	Beyotime	Additivo del buffer di lisi utilizzato per preservare le proteine e gli stati di fosforilazione.
buffer di lisi RIPA	P0013	Beyotime	Buffer di lisi per l'estrazione di proteine totali dal tessuto ippocampale.
buffer di recupero dell'antigene EDTA	ab93680	abcam	Buffer di recupero dell'antigene mediato dal calore per immunoistochimica.
pentobarbital sodico	P3761	Sigma	Anestetico utilizzato per la chirurgia e la raccolta di tessuti.
Siero di capra	ZLI-9056	ZSGB-BIO	Reattivo di blocco per immunoistochimica.
membrana PVDF	ISEQ00010	Merck Millipore	Membrana utilizzata per il trasferimento Western blot.
Labirinto acquatico di Morris	VX80	Shanghai Xinruan Information Technology Co., Ltd.	Apparato comportamentale e sistema di tracciamento video per la valutazione dell'apprendimento e della memoria spaziale.
sistema di imaging a chemiluminescenza	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	Sistema di imaging per l'acquisizione del segnale Western blot chemiluminescente.
apparato stereotassico	/	Stoelting Technology Co., Ltd	Apparato utilizzato per l'iniezione intraventricolare stereotassica.
kit di dosaggio delle proteine BCA	P0006	Beyotime	Kit di dosaggio colorimetrico per la misurazione della concentrazione proteica totale.
lettore di micropiastre	Synergy2	Biotek	Lettore di assorbanza utilizzato per la misurazione del dosaggio BCA.
ImageJ	versione 9.0.1	National Institutes of Health	Software di analisi delle immagini per istologia, immunoistochimica e densitometria del Western blot.
GraphPad Prism	versione 8.5	GraphPad Software	Software di analisi statistica e generazione di grafici.