Questo protocollo dettaglia l'imaging in vivo del calcio dei neuroni ipotalamici utilizzando un microscopio miniaturizzato (miniscopio) in topi che si comportano liberamente durante la manipolazione dello stato sociale (isolamento sociale e riunione sociale). Questo metodo consente l'imaging a risoluzione neuronale singola dell'attività ipotalamica che rappresenta il bisogno sociale e la sazietà sociale, consentendo studi meccanicistici sull'omeostasi sociale.
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Articolo metodologico
In vivo Imaging del calcio con microscopio miniaturizzato nell'ipotalamo per comprendere i comportamenti sociali nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il comportamento sociale nei vertebrati è strettamente regolato tramite circuiti ipotalamici. Recentemente sono stati identificati tipi di neuroni ipotalamici definiti molecolarmente come codificando il bisogno sociale in modo omeostatico. Qui descriviamo un protocollo passo dopo passo per eseguire l'imaging in vivo del calcio nel nucleo preottico mediale ipotalamico (MPN) utilizzando un microscopio miniaturizzato montato sulla testa (miniscopio) in topi che si comportano liberamente. Questo metodo consente registrazioni longitudinali della dinamica delle popolazioni neuronali durante l'isolamento sociale e la riunione, consentendo così studi meccanicistici sul bisogno sociale e sulla sazietà sociale a risoluzione a singolo neurone. In particolare, i topi adulti ricevono iniezioni stereotassiche di un virus adeno-associato (AAV) che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato nel MPN, seguite dall'impianto di una lente a gradiente (GRIN) e di una piastra base del miniscopio. Dopo il recupero, i topi si abituano all'impianto di imaging del miniscopio e vengono sottoposti a un isolamento sociale programmato e a una riunione, durante i quali vengono visualizzate le attività neuronali. I segnali di calcio sono sincronizzati con i comportamenti degli animali per ulteriori analisi. Questo protocollo fornisce indicazioni complete per l'imaging in vivo del calcio con miniscopio nell'ipotalamo del topo durante i comportamenti sociali. Può essere facilmente adattato per l'imaging in altre regioni cerebrali profonde e in diversi contesti comportamentali. Questo approccio collega l'attività neurale a livello cellulare e il comportamento sociale, facendo avanzare la nostra comprensione della base neurale del comportamento complesso negli animali in movimento libero.
Introduzione
La capacità di mantenere legami sociali è fondamentale per la sopravvivenza animale 1,2,3. L'isolamento sociale prolungato induce ansia, deficit cognitivi e cambiamenti metabolici, mentre la riunione ripristina l'impegno sociale e i bisogni sociali 4,5,6. Il rimbalzo osservato nel comportamento sociale dopo un isolamento sociale a breve termine suggerisce la presenza di un meccanismoomeostatico 7, analogo alla regolazione della fame 8,9 o della sete 10,11,12. Tuttavia, i substrati neurali che mediano l'omeostasi sociale rimangono poco compresi.
Studi recenti hanno rivelato che popolazioni neuronali ipotalamiche distinte codificano rispettivamente il bisogno sociale e la sazietàsociale. L'imaging calcio in vivo ha dimostrato che una popolazione di neuroni glutamatergici definiti geneticamente nel nucleo preottico mediale (MPN) diventa attiva durante l'isolamento (neuroni diisolamento MPN), mentre un'altra popolazione di neuroni GABAergici diventa attiva al momento della riunione (neuroniMPN Reunion ). L'attivazione optogeneticadei neuroni di isolamento MPN imita uno stato di isolamento sociale, e l'attivazione optogenetica dei neuroni diriunione MPN attenua il rimbalzo sociale, suggerendo i loro ruoli opposti nella regolazione del bisogno sociale. Queste popolazioni interagiscono reciprocamente e si collegano con circuiti neurali a livello cerebrale, formando un circolo di feedback che modula dinamicamente il bisogno sociale.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato con l'obiettivo generale di permettere ai ricercatori di registrare la dinamica del calcio nel cervello profondo a risoluzione di un singolo neurone in topi in movimento libero durante comportamenti sociali etologicamente rilevanti come l'isolamento sociale e lariunione 13. La combinazione di questa tecnica di imaging con paradigmi sociali etologicamente rilevanti offre un'opportunità senza precedenti per indagare la rappresentazione neurale di stati sociali distinti. La motivazione per lo sviluppo di questo metodo adattato deriva dalla necessità di visualizzare come il bisogno sociale e la sazietà siano rappresentati dinamicamente nelle strutture cerebrali profonde come la MPN. Sebbene l'uso del miniscopio sia stato precedentementedescritto 14,15,16, il suo impiego durante interazioni sociali senza restrizioni, in particolare quelle che coinvolgono transizioni tra isolamento e riunione, richiede adattamenti tecnici e comportamentali specifici per mantenere la stabilità ottica, minimizzare gli artefatti di movimento e garantire un'espressione comportamentale naturalistica.
Rispetto alla fotometria a fibre, l'approccio basato su miniscopio offre risoluzione cellulare, permettendo la discriminazione di distinti tipi di neuroni funzionali all'interno della stessa regione. Permette registrazioni a lungo termine di animali che interagiscono liberamente, essenziale per studiare le dinamiche neurali socialmente guidate. Studi precedenti che utilizzano microendoscopia a un fotone si sono concentrati principalmente sulla corteccia o sull'ippocampo dorsale durante attività spaziali osensoriali 14,15,16. Il nostro protocollo estende questi progressi a regioni sottocorticali più profonde durante comportamenti sociali complessi, fornendo un modello per indagare circuiti di stato affettivo in condizioni naturalistiche.
Il protocollo è ottimizzato per regioni cerebrali fino a ~5 mm di profondità, utilizzando l'impianto di lenti GRIN e indicatori di calcio codificati geneticamente. Le considerazioni chiave includono la precisione chirurgica, il posizionamento delle lenti, la progettazione del paradigma comportamentale e l'analisi dei dati correlata. Questo metodo può essere adattato ad altre aree cerebrali profonde e contesti comportamentali. Questo protocollo guida gli utenti attraverso tutte le fasi critiche: preparazione chirurgica, somministrazione virale, impianto di lente, progettazione comportamentale, attacco di miniscopio, imaging e analisi dei dati (Figura 1A-E). Prevediamo che questo flusso di lavoro accessibile e dettagliato favorirà lo studio delle popolazioni neurali profonde del cervello attraverso un'ampia gamma di comportamenti naturalistici.
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico degli animali della Westlake University con il protocollo sugli animali #25-076-LD-9. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida delle Risorse Animali di Laboratorio della Westlake University. Tutte le attrezzature e i materiali utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Chirurgia per iniezione virale
- Inserire il topo in una camera di induzione anestesica con isoflurano al 2-3%.
NOTA: Un'induzione riuscita dell'anestesia è confermata dall'assenza del riflesso del pizzichio delle dita e dalla presenza di una respirazione costante e profonda. - Dopo 2-3 minuti, o una volta perso il riflesso di raddrizzazione, trasferisci rapidamente l'animale allo strumento stereotastico. Fissare il naso nel cono nasale dell'anestesia e mantenere l'anestesia con isoflurano all'1-1,5% per tutta la durata dell'intervento (Figura 1B). La portata di ossigeno è tipicamente impostata tra 0,8 e 1,2 L/min.
NOTA: Monitorare la frequenza respiratoria dell'animale e altri segni fisiologici. Se la frequenza respiratoria dell'animale aumenta e mostra baffi e altri segni di risveglio, aumentare la concentrazione di isoflurano al 2-3%. - Fissa i denti incisivi del topo attraverso la barra incisiva dello strumento stereotassico. Stringi la pinza anteriore per fissare la testa.
- Inserire con cura due barre auricolari nei canali uditivi esterni finché non si fermano saldamente, assicurando una fissazione stabile e rigida della testa (Figura 1B).
NOTA: (1) Una posizione impropria che comprime i tessuti del collo potrebbe causare difficoltà respiratoria o fissazione instabile. (2) Se l'animale mostra segni di respirazione affannosa o difficoltà durante la fissazione, liberare e riposizionare immediatamente le barre auricolari, poiché ciò indica una possibile compressione delle vie aeree. (3) Assicurarsi che entrambi i barretti per le orecchie siano alla stessa altezza. Questo è essenziale per un successivo livellamento preciso del cranio. - Applica una pomata oftalmica su entrambi gli occhi del topo per evitare che gli occhi si secchino.
- Rimuovi il pelo della testa usando una crema depilatoria. Pulisci accuratamente l'area con salviette a base di etanolo al 75% per rimuovere residui di crema e peli.
- Disinfetta la pelle esposta con salviette etanoliche al 75% e betadine. Utilizzare forbici chirurgiche fini per realizzare un'incisione sagittale mediana attraverso il cuoio capelluto. Ritira la pelle per esporre completamente il cranio sulla regione cerebrale bersaglio. Pulisci delicatamente la superficie del cranio con un cotton fioc per rimuovere il periostio.
NOTA: È necessario esporre un'area sufficientemente ampia del cranio per fornire un ancoraggio robusto al cemento dentale, garantendo la stabilità a lungo termine dell'impianto. - Monta una pipetta di vetro sul porta-tasso stereotassico per la misurazione della superficie del cranio. Al microscopio stereoscopico, localizza la punta della pipetta al bregma (l'intersezione delle suture sagittale e coronale) e la definisci come origine (X = 0, Y = 0, Z = 0, Figura 1C).
- Sposta la punta della pipetta in posizioni laterali ±2 mm rispetto al bregma e regola il livello del cranio finché la differenza di altezza tra questi due punti non è entro ±0,03 mm.
- Successivamente, sposta la pipetta sulla lambda (l'intersezione delle suture sagittale e lambdoide) e regola l'inclinazione anteroposteriore finché la differenza di altezza tra bregma e lambda è entro ±0,03 mm (Figura 1C).
NOTA: (1) Una valutazione visiva e un aggiustamento pregressivi del cranio potrebbero semplificare significativamente il processo di livellamento fine. (2) Asciugare la superficie del cranio con aria compressa prima del livellamento migliora la visibilità delle suture craniche. - Usa un trapano portatile con una testa da 0,8 mm per eseguire una craniotomia sulla regione cerebrale bersaglio (ad esempio, per topi C57BL6/J). Le coordinate sono a 0 mm anteriore-posteriore (AP), mediale-laterale (ML) 0,3 mm e dorso-ventrale (DV) -4,8 mm per colpire la regione MPN; per i topi FVB/NJ, la craniotomia viene eseguita a AP +0,4 mm-+0,5 mm, ML 0,3 mm e DV -4,8 mm) (Figura 1C).
NOTA: In caso di sanguinamento, aumentare temporaneamente la concentrazione di isoflurano al 2-2,5%. Usa una punta di cotone sterile o una spugna emostatica per assorbire il sangue, poi applica immediatamente soluzione salina sterile. Riportare l'isoflurano al livello di mantenimento (1-1,5%) dopo l'emostasi e rimuovere il liquido in eccesso. - Dopo la craniotomia, eseguire l'iniezione stereotassica del virus che esprime l'indicatore di calcio nella regione cerebrale mirata.
- Diluire l'AAV-hSyn-jGCaMP7f, un virus associato ad adeno-adéno, utilizzato per esprimere un indicatore di calcio codificato geneticamente nei neuroni e per consentire l'imaging dell'attività neuronale tramite segnali di calcio, fino a un titolo finale di circa 5 × 10¹² genomi virali per millilitro prima dell'iniezione.
- Riempi prima una pipetta di vetro con olio minerale, poi con la soluzione virale, assicurandoti di non avere bolle d'aria. Posiziona la pipetta alle coordinate del bersaglio sulla superficie del cranio e abbassala lentamente alla profondità del bersaglio.
- Iniettare il virus unilateralmente a velocità lenta e costante (ad esempio, 30 nL/min), con un volume totale di 400 nL7, per garantire l'infezione di un numero sufficiente di neuroni nella regione MPN. Questa quantità può essere regolata in base alle dimensioni specifiche delle regioni cerebrali e alla presenza di ulteriori vincoli, come il sistema Cre-loxP.
- Al completamento, lasciare la pipetta in posizione per 10-15 minuti per facilitare un'adeguata diffusione virale e minimizzare il reflusso lungo il percorso di iniezione, prima di essere ritirato lentamente.
NOTA: (1) Le aliquote virali con titoli appropriati e coerenti sono fondamentali per un'espressione efficace e costante tra gli animali. Un titolo eccessivamente alto può causare neurotossicità, mentre un titolo insufficiente porta a espressione debole e a un rapporto segnale-rumore scarso per l'imaging. (2) Velocità di iniezione lente e tempi di attesa sufficienti prima di ritirare la pipetta sono fondamentali per minimizzare i danni ai tessuti e prevenire il reflusso virale, garantendo un'espressione virale precisa e robusta nell'area bersaglio. - Dopo l'iniezione del virus, cuci la pelle sopra il cranio con punti assorbibili.
- Iniettare sottocutaneamente carprofene (5 mg/kg) immediatamente dopo l'intervento per l'analgesia, con monitoraggio continuo e somministrazione aggiuntiva secondo necessità nei 3 giorni successivi.
- Alogi il topo individualmente dopo l'intervento di iniezione virale per almeno 2-3 settimane per consentire un recupero e un'espressione virale sufficienti.
NOTA: L'impianto della lente GRIN (Sezione 2) può essere eseguito lo stesso giorno dell'iniezione virale o 2-3 settimane dopo l'iniezione virale. In questo protocollo, descriviamo il metodo in due fasi, che permette all'espertore di valutare l'espressione virale durante l'impianto della lente GRIN.
2. Impianto di lenti GRIN
- Ripeti i passaggi 1.1-1.10 per riaprire la craniotomia. Gratta la superficie del cranio con un bisturi per una migliore presa del cemento dentale nel passo 2.8. Per la nuova craniotomia, il diametro dovrebbe essere leggermente maggiore rispetto alla lente GRIN (tipicamente ~1 mm) per consentire un'impianto fluido. Rimuovere meticolosamente tutti i detriti ossei dopo la perforazione.
- Per mitigare la compressione dei tessuti durante l'impianto della lente GRIN, inserisci una pipetta di vetro nella regione cerebrale bersaglio e sposta lentamente la pipetta in modo mediolaterale per creare un'incisione. Questo micro-taglio è lungo ~1 mm per creare spazio per l'impianto della lente GRIN (Figura 2A).
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per il successo dell'intero protocollo. - Prima di impiantare la lente GRIN, disinfetta la lente con etanolo al 75%, poi lavala con soluzione salina sterile e puliscila delicatamente con tessuto per lenti.
- Tieni l'obiettivo GRIN con un portalenti e fissa il miniscopio sulla parte superiore dell'obiettivo.
- Posiziona l'intero insieme sulla bregma e imposta tutte le coordinate a zero (cioè X = 0, Y = 0, Z = 0). Poi, posizionala alle coordinate X-Y del bersaglio sopra la craniotomia.
- Inumidisce la superficie del cranio con soluzione salina sterile. Abbassare molto lentamente la lente GRIN nel tessuto cerebrale a una velocità di circa 100 μm/min fino a raggiungere il bersaglio (Figura 2B).
NOTA: (1) Se l'impianto della lente GRIN viene eseguito 2-3 settimane dopo l'iniezione virale, durante l'inserimento della lente, accendi il miniscopio per osservare i cambiamenti di fluorescenza in tempo reale. Man mano che la lente si avvicina alla regione target, il segnale fluorescente complessivo nel campo visivo diventa più luminoso, e questo cambiamento può essere letto direttamente dall'istogramma del segnale in tempo reale utilizzando il software di imaging (Figura 2C, D). (2) Fare attenzione a evitare sanguinamenti durante l'impianto, poiché i coaguli di sangue degradano significativamente la qualità del segnale. (3) Se il sanguinamento è inevitabile e grave, rimuovere la lente GRIN, pulire la lente e riimpiantare la lente dopo che il sanguinamento si è fermato. - Dopo l'impianto del cristallino, asciugare accuratamente la superficie cranica assorbendo il liquido residuo e soffiando con aria compressa.
- Applicare con cura il cemento dentale per ancorare la base della lente GRIN al cranio e costruire un cappuccio completo che copra il cranio esposto (Figura 2B). Fai attenzione a evitare che il cemento entri in contatto con i tessuti muscolari circostanti. Poi allenta con attenzione il portalente e rimuovi il portaoggetti insieme al miniscopio.
NOTA: (1) Mescola il cemento dentale in una lastra raffreddata su ghiaccio per rallentare il processo di solidificazione e garantire un tempo di lavoro più lungo. (2) Si consiglia di aggiungere una barra della testa dietro l'obiettivo per tenere il mouse durante la connessione del miniscopio. (3) Fai molta attenzione a non applicare il cemento al portalenti o al miniscopio. - Prepara l'adesivo in silicone a due parti mescolando insieme i suoi due liquidi. Applicalo sulla parte superiore dell'obiettivo GRIN per formare una tenuta protettiva contro polvere e graffi durante il periodo di recupero.
- Dopo l'impianto della lente GRIN, ospita il topo singolarmente per evitare potenziali danni alla lente da parte dei compagni di gabbia durante il recupero.
3. Installazione della piastra di base
- Due o tre settimane dopo l'impianto della lente GRIN, viene eseguita l'installazione della base plate. Anestesiare e fissare il topo nello strumento stereotastico come descritto sopra.
- Rimuovi la tenuta in silicone dalla parte superiore dell'obiettivo GRIN e pulisci delicatamente la superficie con un pezzo di tessuto per lenti.
- Attacca la piastra di base al miniscopio. Montare l'intero assemblaggio della base del microscopio e della piastra sul braccio manipolatore stereotassico tramite un supporto.
- Collega il miniscopio alla scatola di acquisizione dati e attiva l'imaging in tempo reale.
- Allinea l'obiettivo del miniscopio e l'obiettivo GRIN impiantato regolando finemente il manipolatore per ottenere un preciso allineamento coassiale ottico tra il miniscopio e l'obiettivo GRIN.
- Posiziona l'obiettivo del miniscopio in modo parallelo alla superficie superiore dell'obiettivo GRIN e assicurati che il bordo dell'intera lente GRIN sia incluso nella finestra di imaging con un aspetto circolare perfetto, e che il centro dell'obiettivo sia al centro della finestra di immagini.
- Abbassare il miniscopio a una distanza di lavoro ottimale per acquisire immagini chiare dei neuroni nel piano focale bersaglio.
- Utilizzare il cemento dentale per collegare e incapsulare la piastra di base sul tappo di cemento esistente (Figura 2B).
NOTA: (1) Un passaggio critico è sollevare il miniscopio di una piccola distanza empiricamente determinata (circa 50-100 μm) prima della fissazione finale per compensare il potenziale spostamento del piano focale causato dal ritiro del cemento durante la solidificazione. (2) Essere estremamente cauti nel prevenire che il cemento dentale entri in contatto con eventuali parti del miniscopio che devono essere staccate dopo l'installazione della piastra di base. - Dopo che il cemento dentale è completamente solidificato, allenta il supporto, scollega con cura il microscopio dalla piastra di base e avvita immediatamente un tappo sulla piastra di base per proteggere l'interfaccia ottica.
- Ospita individualmente il topo per 3-5 giorni dopo l'installazione della base e poi riuniscilo con i compagni di gabbia per almeno 1 settimana prima di manipolare lo stato sociale (ad esempio, isolamento sociale).
4. Impostazione dei parametri di abituazione e imaging
- Abituare i topi impiantati a un appoggio temporaneo per la testa per l'attacco del miniscopio e all'impianto di imaging per 2-3 volte prima delle sessioni formali di imaging di esperienza.
- Per montare il miniscopio sulla piastra di base, blocca la testa dei topi impiantati, rimuovi il tappo della piastra di base e agganci il miniscopio alla piastra tramite un'interfaccia magnetica. Poi, stringi la vite laterale per fissare il miniscopio. Esegui l'imaging del calcio per 10 minuti, durante i quali l'animale si muove liberamente nell'arena di registrazione o nella gabbia.
- Introdurre stimoli, come un tocco delicato e un nuovo topo, durante questa sessione pilota di imaging. Analizza i dati (vedi dettagli nella Sezione 6) per verificare se sia possibile estrarre segnali a singolo neurone. Durante l'abituazione, determinare le impostazioni ottimali di imaging regolando il piano focale del miniscopio sulla distanza di lavoro per massimizzare il numero di neuroni osservati e la nitidezza dell'immagine.
- Imposta la potenza di illuminazione a ~10% del valore massimo e il guadagno del sensore al ~10-20% del valore massimo per ottenere segnali chiari senza saturazione. Immagine alla risoluzione spaziale 1280 x 800 con una frequenza di campionamento di 20 Hz. Salva queste impostazioni per ogni animale e riutilizzale durante le sessioni di imaging successive.
5. Saghi comportamentali sociali per l'imaging del calcio in miniscopio
- Saggio di riunione sociale (Figura 3A)
- Isolare il topo impiantato nel miniscopio per 1, 3 o 5 giorni prima dell'esame. Eseguire immagini del calcio durante la fase basale, la riunione e il riisolamento.
- Baseline: collega il mouse al miniscopio e registra per 10 minuti, durante i quali il mouse resta isolato.
- Riunione: Aggiungi un ex compagno di carcere alla camera di registrazione e registra per 10 minuti.
- Riisolamento: Rimuovere il compagno di cagema dopo la riunione di 10 minuti e fare l'immagine per altri 10 minuti durante il riisolamento.
- Test di isolamento sociale (Figura 3B)
- Isola il topo impiantato nel miniscopio per 6 ore e registra i segnali di calcio all'inizio di ogni ora per 15 minuti.
- Aggiungere un ex cagemato alla camera di registrazione e registrare per 10 minuti alla fine dell'intera sessione di imaging per identificare i neuroni significativamente modulati dalla riunione sociale (vedi dettagli nelle Sezioni 6 e 7).
NOTA: (1) Questo programma specifico di imaging viene utilizzato per minimizzare il fotosbiancamento del segnale e permettere il monitoraggio dell'attività neuronale durante le prime 6 ore di isolamento sociale. (2) Il miniscopio è collegato per tutta la procedura. (3) Questo approccio consente il tracciamento dello stesso insieme neuronale durante l'intera sessione di imaging. (4) Durante l'imaging vengono forniti cibo e idrogel.
6. Preprocessing dei dati
- Importa i video di imaging grezzi nel software di elaborazione dati.
- Ridimensionare spazialmente e temporalmente il video originale quando necessario per ridurre il carico computazionale necessario per l'analisi dei dati.
NOTA: Per questa analisi, i dati di imaging grezzo vengono catturati a risoluzione spaziale di 1280 x 800 a 20 Hz; Ridimensiona spazialmente il video di un fattore 4 e lo ricampiona temporalmente di un fattore 2. - Applicare un filtro passa-banda spaziale con la sottrazione media globale per ridurre il rumore ad alta frequenza e la deriva di fondo a bassa frequenza.
- Correggere gli artefatti di movimento utilizzando l'algoritmo di correzione del movimento nel software di elaborazione dati. Ispeziona visivamente il film corretto per il movimento per assicurarti che la somata neuronale sia stabile e che i residui minimi siano presenti.
- Clicca sul pulsante "Identifica cellule" e scegli "CNMFe" nell'elenco per estrarre tracce di attività calciale dei singoli neuroni con l'algoritmo CNMF-E17 (Consttrained Non-negative Matrix Factorization for microEndoscopic data).
- Clicca sul pulsante del righello nel software di elaborazione dati e misura i diametri dei soma (in pixel) dai neuroni rappresentativi. Inserisci la dimensione media nella casella "Diametro medio della cella (pixel)". Poi clicca sul pulsante Applica per eseguire CNMF-E.
- Regolare le impostazioni di inizializzazione del CNMF-E quando il rilevamento delle celle è insufficiente, compaiono componenti non cellulari eccessive o si verifica un'eccessiva segmentazione.
- Ispezionare tutti i componenti estratti e accettarli/rifiutarli in base alla morfologia cellulare e alla dinamica biologicamente plausibile del calcio. Escludere i componenti con forme irregolari e spinose. Escludere tracce dominate da rumore o artefatti di movimento.
NOTA: (1) Le Figure 2E e 2F mostrano due neuroni accettati con una morfologia chiara dei neuroni così come i tipici transitori di calcio. (2) Le Figure 2G e 2H mostrano due neuroni rifiutati con marcate fluttuazioni basali e privi di tipici transitori calciici. - Esportare tracce di fluorescenza dei neuroni accettati dal software di elaborazione dati per l'identificazione a valle dei neuroni modulati dallo stato sociale (Sezione 7).
7. Identificare neuroni modulati dallo stato sociale
- Usa MATLAB o Python per analizzare ulteriormente i dati preelaborati.
- Allinea le tracce di attività calciale dei neuroni accettati ai timestamp comportamentali.
- Trova il momento della riunione sociale dal video del comportamento. Per ogni neurone, l'attività dei segmenti si estende in un periodo di isolamento sociale pre-riunione di 300 secondi e in un periodo di riunione sociale di 300 secondi.
- Per ogni neurone, quantificare la distribuzione dell'attività calciale durante i periodi di isolamento e riunione.
- Eseguire l'analisi della Receiver Operating Characteristic (ROC)18 per valutare la capacità dell'attività neuronale di discriminare tra stati di isolamento e di riunione, ottenendo un valore AUC che calcola l'area sotto la curva ROC.
- Valuta la significatività statistica utilizzando un test di permutazione. Per ogni neurone, i valori dell'attività calcica vengono circolarmente spostati tra stati comportamentali in box temporali di 1 s per 1.000 volte per generare una distribuzione nulla dei valori AUC. I neuroni con valori AUC osservati superiori al 95° percentile della loro distribuzione nullo mescolata sono considerati significativamente modulati dallo stato sociale.
- Classifica i neuroni significativamente modulati in base alla direzione di modulazione. Classificare i neuroni inibiti dalla riunione come Neuroni di Isolamento e attivati dalla riunione come Neuroni della Riunione (Figura 4).
8. Verifica post-esperimento
- Fai una perfusione nei topi e esegui un'istologia standard per verificare la traccia della lente GRIN e l'espressione virale (vedi un esempio di imaging istologico nella Figura 2I).
- Usa il PFA al 4% per fissare tutta la testa del topo insieme all'impianto, poi rimuovi la lente GRIN per visualizzare una traccia chiara della lente.
NOTA: Includere solo i dati degli animali con il targeting corretto.
9. Risoluzione dei problemi e consigli pratici
- Fissa una barra frontale con cemento dentale dietro il miniscopio per facilitare il montaggio e la rimozione del miniscopio.
NOTA: La barra della testa non dovrebbe essere troppo lunga e potrebbe essere posizionata in un angolo leggermente inclinato per evitare interferenze con il comportamento sociale. - Ospita individualmente i topi impiantati durante il periodo di recupero successivo all'intervento per almeno una settimana. Questo fornisce tempo sufficiente ai topi per recuperare e previene i danni all'impianto da parte di altri topi.
- Riunire i topi impiantati ai loro precedenti compagni di cagema una volta che si sono completamente ripresi. Controlla e stringi regolarmente i tappi di copertura. Prepara dei tappi extra e sostituiscili quando vengono persi durante la manutenzione degli animali.
- Controlla i segnali di calcio 3-4 settimane dopo l'iniezione del virus GCaMP. Se i segnali sono troppo deboli o poco chiari, un periodo di recupero più lungo a volte migliora la qualità dei segnali.
- Fai attenzione alle superfici dell'obiettivo sia dal lato GRIN che dal lato miniscope. Tieni le lenti pulite e senza graffi. Copri l'obiettivo quando non lo usi.
- Prima dell'immagini, regola la lunghezza del cavo del segnale in modo che l'animale raggiunga gli angoli dell'area di imaging e abbastanza corta da permettere interazioni sociali fluide.
- Proteggi il cavo con uno strato di materiale resistente quando necessario per evitare che altri topi mordono durante le interazioni sociali. Controlla regolarmente il cavo del segnale per monitorare se è intorto da interazioni sociali intense.
- Per identificare lo stesso insieme neuronale da sessioni di imaging consecutive (ad esempio, nella Figura 3B), i video di imaging grezzi potrebbero essere concatenati per estrarre tracce di calcio.
- Per sincronizzare più segnali, ad esempio i video comportamentali e i segnali di calcio, di solito vengono utilizzati input TTL comuni e torce sincronizzate per allineare diversi file di registrazione.
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Risultati
Identificazione delle popolazioni neuronali
Abbiamo espresso il virus GCaMP e impiantato una lente GRIN nel MPN di un topo C57BL/6J. Dopo l'intervento, il topo si è ripreso individualmente ed è stato riunito con i suoi compagni di gabbia per almeno una settimana. Il topo è stato poi ospitato da solo per 3 giorni prima della sessione di imaging del calcio. Durante l'imaging è stato registrato per la prima volta un punto di isolamento di 10 minuti, seguito da una riunio...
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Discussione
Questo protocollo descrive un approccio integrato che combina imaging in vivo in miniscope del calcio con paradigmi comportamentali sociali per valutare il profilo di attività dei neuroni ipotalamici. Consente l'imaging a lungo termine con risoluzione cellulare del calcio proveniente da strutture cerebrali profonde durante interazioni sociali naturali. Le sezioni seguenti discutono i passaggi critici, il significato metodologico, i limiti e il potenziale futuro di questo approcc...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti o conflitti di interesse. ChatGPT è stato utilizzato nel processo di revisione dei manoscritti, con una revisione accurata e dettagliata da parte di tutti gli autori.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare la professoressa Catherine Dulac per il suo supporto all'addestramento iniziale degli esperimenti con miniscopi e Yang Sun per il suo aiuto nell'esecuzione dell'intervento. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento iniziale della Westlake University e dalla NOMIS Foundation, dal Tan-Yang Center for Autism Research dell'Università di Harvard, dal Jane Coffin Childs Medical Research Award a D.L. e dalla Charles A. King Trust Postdoctoral Fellowship to D.L. Ringraziamo tutti i membri del Liu Lab per i loro commenti sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA | Taitool | S0587-9 | Vettori virali, chirurgia |
| Spugna Gelatina Emostatica Assimabile | FUKANGSEN | FKS-A | Chirurgia |
| Soluzione di betadine (10% iodatoPovidone) 500mL | HYNAUT | Q13702855HNW002 | Chirurgia |
| Telecamera per video comportamentali | DAHENG | MER2-160-227-U3C | Comportamento |
| Carprofen | MCE | HY-B1227 | Chirurgia |
| Strumenti stereotassici digitali | RWD | 68803 | Chirurgia |
| Etanolo (75%) | Reagente chimico Sinopharm Co., Ld | 801769610 | Chirurgia |
| Unguento per gli occhi | FODU | H37022025 | Chirurgia |
| Software di elaborazione dati Inscopix (IDPS) | Inscopix | 1000-006551 | Analisi dei Dati |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | Chirurgia |
| Confezione adesiva Kwik-Sil da 2 | Strumenti di Precisione Mondiale | KWIK-SIL | Chirurgia |
| Microtrapano | RWD | 78001 | Chirurgia |
| Estrattore micropipette MP-1000 | RWD | MP-1000 | Chirurgia |
| Soluzioni multifunzione per anestesia animale | RWD | TAIJI-IE | Chirurgia |
| Pompa di microiniezione a nanolitri | RWD | R-480 | Chirurgia |
| Miniscopio nVista 3.0 | Inscopix | 1000-004323 | Imaging |
| Forcep optalmica | RWD | F12006-10 | Chirurgia |
| Forbici operative | RWD | S14001-15 | Chirurgia |
| Kit ProView per impianti | Inscopix | 1000-004238 | Chirurgia e Imaging |
| Cemento in resina (Super-bond) | Sun Medical | Super bond C & B | Chirurgia |
| Set di 5 copripiastre di base | Inscopix | 1050-004639 | Imaging |
| Set di 5 piastre di base | Inscopix | 1050-004638 | Imaging |
| Set di 5 obiettivi GRIN, diametro 0,6mm, lunghezza 7,3mm | Inscopix | 1050-004626 | Chirurgia e Imaging |
| Microscopio Stereotassi | Murzider | MSD205A | Chirurgia |
| Soluzione salina sterile | QIDUKELIN | R1B25071902 | Chirurgia |
Riferimenti
- Beery, A. K. Frank Beach award winner: Neuroendocrinology of group living. Horm Behav. 107, 67-75 (2019).
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