Articolo metodologico

Dissezione del cervello e dell'intestino nelle popolazioni di pesci superficiali e pesci delle caverne di Astyanax mexicanus

DOI:

10.3791/70412

⸱

24 febbraio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Neurobiology, UPR- Medical Sciences Campus, 2Molecular Sciences Research Center

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per dissezionare ed estrarre componenti interi del cervello e dell'intestino dei morfotipi adattati alla superficie e alle grotte di Astyanax mexicanus. Questo protocollo può essere adattato per applicazioni a valle, inclusi trascrittomica, metabolomica e analisi del microbiota intestinale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I pesci teleostici sono utilizzati per rispondere a una vasta gamma di domande di ricerca che spaziano dallo sviluppo alla genetica e alle neuroscienze, e più recentemente, per comprendere le complessità dell'asse intestino-cervello e, in un contesto più ampio, dell'asse intestino-cervello-fegato. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, è stato sempre più utilizzato in ambiti evolutivi comparativi e di sviluppo a causa della disponibilità di morfotipi morfologicamente e fisiologicamente distinti, tra cui pesci superficiali che vivono nei fiumi e pesci cavernicoli ciechi adattati alle grotte. L'adattamento agli habitat delle grotte è associato a cambiamenti nei tratti morfologici, comportamentali e nella diversità del microbiota intestinale, che si riscontrano anche in condizioni di laboratorio. Questo ha aperto la possibilità di porsi domande sulle interazioni tra il microbioma, l'attività metabolica, l'adattamento neurale e i complessi output comportamentali. Queste interazioni possono ora essere affrontate attraverso studi di mappatura dell'intero cervello con cervelli liberati e sequenziamento del microbiota intestinale per rilevare la diversità batterica associata a fenotipi adattati alla superficie e alle grotte. Tuttavia, la maggior parte di questi studi trarrebbe beneficio da organi e tessuti interi intatti, accuratamente dissezionati e preservati, che permettono la post-elaborazione in applicazioni a valle. Questo protocollo descrive un metodo passo dopo passo per la dissezione di cervello e intestino, in cui l'intero cervello e gli organi addominali vengono rimossi e isolati sia per i morfotipi di pesci superficiali che quelli dei pesci delle caverne.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I modelli animali, inclusi i pesci vertebrati, sono strumenti fondamentali per modellare fenomeni biologici e patologie complesse in sistemi relativamente semplici e accessibili. Ad esempio, il pesce zebra, Danio rerio, è uno dei modelli di pesci teleostiei più utilizzati, con una moltitudine di metodi applicati per studiarne lo sviluppo, la genetica, la fisiologia e il comportamento, con un impatto significativo nelle scienze biomediche eneurocomportamentali 1,2,3,4,5,6,7,8 . Un enorme vantaggio nell'uso del pesce zebra al presente è la disponibilità di diversi metodi per studiare l'istologia e la patologia di organi e tessuti nelle linee mutanti con perdita di funzione, per i quali esistono protocolli di dissezione passodopo passo 3,9,10.

Tuttavia, negli ultimi decenni sono cresciuti diversi altri modelli di pesci teleostetici, adatti a porre altri tipi di domande, inclusi quelli nei campi della biologiaevolutiva 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21, meccanismi biologici alla base dell'invecchiamento 2,22, tossicologia23,24 ealtri 25,26. Un esempio è il caso del tetra messicano, Astyanax mexicanus, un pesce teleosteo originario del nord-est del Messico, con popolazioni ancestrali di pesci superficiali fluviali e oltre 30 popolazioni di pesci cavernicoli ciechi che vivono nelle caverne (Figura 1)12.

I pesci delle caverne hanno adottato una serie di caratteristiche morfologiche, tra cui la perditaoculare 12,27, la perdita dipigmentazione 28, l'espansione dei sistemisensoriali 17,29,30 e l'aumento dell'accumulo digrasso 12,31, che hanno permesso loro di sopravvivere in habitat grotteri ostili. Questi pesci hanno anche adottato una serie di tratti comportamentali, tra cui riduzioni delsonno 19,20,ansia 32, banchi33 eaggressività 13,18,19,20,29,34,35,36,37 , rispetto ai loro pesci di superficie ancestrali. L'adattamento della maggior parte di questi tratti è probabilmente stato il risultato di una combinazione di variazione genetica e pressioniambientali 35,36,28, che includono le differenze di habitat tra i fiumi e le grotte. Un modello sempre più utile per porre domande sull'impatto della variazione genetica sull'adattamento morfologico e comportamentaledei tratti 16,18,19,20,35,38,39 e più recentemente, sulla diversità del microbiota intestinale 14,15, domande che potrebbero richiedere la raccolta di organi come cervello, intestino, fegato e altri, è necessario un protocollo standardizzato per la dissezione anatomica grossolana che possa essere utilizzato dalla comunità in generale. Sebbene le dissezione dell'intero cervello e le dissezione degli organi in A. mexicanus siano già state effettuate in passato, manca un metodo completo e completo che permetta di comprendere come eseguire questi tipi di dissezioni in modo efficiente in termini di tempo, cosa fondamentale per molti tipi di progetti, inclusi quelli che richiedono la raccolta di campioni per metabolomica40, metagenomica41, o imaging dell'interoorgano 16,38. Il nostro obiettivo è rimuovere la barriera nella risoluzione dei problemi all'accesso agli organi in questo modello per il post-processing, permettendo agli utenti della comunità di concentrarsi senza soluzione di continuità sulla loro ricerca.

In questo protocollo, delineiamo un metodo passo dopo passo per la dissezione cerebrale e gastrointestinale nei pesci adulti della superficie e nei pesci delle caverne Pachón della specie Astyanax mexicanus. Questa metodologia può essere adattata a una varietà di protocolli a valle, inclusi quelli associati al microbioma intestinale, alla metabolomica tissutale e al brain clearing per l'imaging dell'intero cervello su microscopio a foglio luminoso. Questa tecnica è anche adattabile per l'applicazione simultanea allo stesso campione.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è condotto in conformità con i protocolli approvati dall'IACUC 2024-0004 e A790125 presso il Molecular Sciences Center e il Campus di Scienze Mediche dell'Università di Porto Rico.

1. Preparazione pre-dissezione

  1. Se usi una piastra di Petri Sylgard (SP) per sezionare, assicurati che siano preparate prima della procedura, tenendo conto che potrebbero richiedere alcuni giorni per fissare.
  2. Per preparare un piatto SP, usa Sylgard 184 ed Elastomer 184 in un rapporto 10:1. Mescola 200 g di base Sylgard 184 con 20 g di elastomero in un bicchiere usa e getta. Versa in piastre di Petri fino a circa un terzo o metà profondità. Tocca la piastra per rimuovere le bolle e tappucciare. Assicurati che i piatti siano pieni e lasciati su una superficie piana. Lascia asciugare per almeno 1 settimanae 42.
    NOTA: Se raccogli campioni per il sequenziamento di rRNA a 16s o per la metagenomica, evita di utilizzare piatti SP. Invece, utilizza piastre di Petri sterilizzate e monouso e segue la tecnica asettica sotto una cappa a flusso laminare. Se si segue la tecnica asettica, si consiglia di pulire la cappa a flusso laminare con etanolo al 70%, un detersivo germicida e, idealmente, di esporre la cappa a una lampada C a ultravioletto germicida per 15 minuti. Questo dovrebbe essere fatto prima di inserire materiali/strumenti disinfettati e autoclavati all'interno della cappa a flusso laminare.
  3. Installa un microscopio per la dissezione con tovaglioli di carta su entrambi i lati. Designa un lato per lo stoccaggio dei rifiuti (ad esempio, tessuto d'organo in eccesso) e l'altro lato per posizionare strumenti di dissezione sterilizzati. Taglia piccoli pezzi di carta assorbente per pulire gli attrezzi tra una dissezione e l'altra.
  4. Prepara 1 PBS e tienilo in una miscela di gelo freddo e a portata di mano nel caso sia necessario per pulire aree o campioni per una migliore visibilità. A seconda del protocollo, scegli di non usare 1PBS.
    NOTA: Ad esempio, si consiglia di non usarlo durante la raccolta di campioni per il sequenziamento metagenomico43. Se si utilizza 1 PBS in questo tipo di approccio, si consiglia di raccogliere un campione di 1PBS per il sequenziamento per verificare eventuali contaminazioni.
  5. Metti la SP (o una piastra di Petri sterilizzata monouso) sotto il microscopio e assicurati di avere a portata di mano tutti gli strumenti (kit per sezionare, tubi per microcentrifughe per la raccolta dei tessuti sul ghiaccio, ecc.).
  6. Metti 1 PBS e tubi microcentrifughe etichettati in un secchio del ghiaccio vicino. Tieni un contagocce di plastica in mano per 1 PBS.
  7. Allesti una stazione di eutanasia per i pesci qui vicino. Prepara un bagno di ghiaccio mettendo la pasta di ghiaccio in un acquario con una griglia di plastica all'interno, poi riempilo con acqua del sistema per i pesci (dal loro sistema o acquario domestico).
    NOTA: Può essere utilizzato anche MS-222, a seconda dei protocolli a valle (esempi di post-elaborazione).

2. Dissezione cerebrale in pesci adulti di superficie e pesci delle caverne

  1. Eutanasia i pesci in una miscela di ghiaccio. Assicurati che non ci sia movimento e che il pesce affondi sul fondo, senza alcun movimento opercolare. Il tempo dipende dalla dimensione. I pesci più grandi impiegano più tempo a fermare il movimento opercolare.
    NOTA: I pesci giovani impiegano circa 2-5 minuti per cessare il movimento opercolare (eutanasia), mentre i pesci adulti e grandi possono richiedere circa 10-15 minuti. Esistono differenze basate sul morfotipo. Alcune popolazioni di pesci cavernicoli possono impiegare più tempo rispetto ai pesci di superficie per l'anestesia/eutanasia. I protocolli di allevamento e sperimentali raccomandano la validazione delle procedure di anestesia ed eutanasia tra popolazioni, poiché le risposte possono variare tra morfi epopolazioni 11.
  2. Trasferire il pesce in una SP (o una piastra di Petri sterilizzata monouso all'interno della cappa) e, con un contagocce, bagnarli con un PBS 1x freddo (Figura 1).
  3. Distoglie la testa dal corpo tagliando con un bisturi circa 2 mm dietro le branchie (Figura 2). Questo proteggerà parte del mesencefalo e permetterà la manipolazione del cervello una volta dissezionato, senza causare danni. Sposta il corpo verso l'area dei rifiuti usando un tovagliolo di carta, poi mettilo in una busta per i rifiuti biologici nel contenitore per lo smaltimento.
  4. Con pinze fini o un emostato, tieni una buona presa sulla parte posteriore della testa del pesce. Con una micro-forbice, taglia i bordi della bocca verso la parte posteriore della testa e delle branchie (Figura 3).
  5. Ripeti dall'altra parte. Rimuovi la mandibola e poi pulisci bene la parte inferiore con una seconda pinza fine o ultra-fine.
    NOTA: Segui il contorno interno delle branchie.
  6. A questo punto, continua a tenere saldamente la testa del pesce con un emostato o fissalo con un perno a T al SP (se usato), con attenzione dalla punta della bocca.
  7. Stacca entrambi gli occhi usando pinze o forbici ultra-fine. Inserisci la punta nel bordo dell'occhio e poi tira o taglia delicatamente l'occhio (Figura 4).
    NOTA: Non applicabile ai pesci cavernicoli (raschiare la pelle dall'area degli occhi).
  8. Graffia una linea sagittale sulla parte superiore della testa che corre tra gli occhi da davanti a dietro e divide la testa in sinistra e destra. Successivamente, usa le microforbici per tagliare la linea in modo superficiale (Figura 5).
  9. Con le pinze sottili, inizia con attenzione a tirare i due lati della testa, facendo particolare attenzione a non rompere il cervello sottostante, incastonato sotto il tessuto connettivo. Una volta visibile il cervello, con la punta di pinze superfine, stacca il cervello dal cranio (Figura 6).
    1. Evita di schiacciare il cervello tirando fuori con la pinza. Invece, tienilo per il cervello o il midollo spinale se ne è ancora un residuo per preservare l'integrità.
    2. Se il cervello è ancora su un lato della testa, usa le pinze ultra-fine per staccarlo con cura dal cranio del letto inserendo delicatamente le punte dietro il cervello e sollevandolo delicatamente. Evita di tirare in ogni momento, perché potrebbe romperlo.
  10. Una volta estratto il cervello, pulisci delicatamente con una pinza ultra-fine, eliminando qualsiasi grasso o tessuti circostanti. Inserite in un tubo microcentrifuga o in un deposito appropriato per il protocollo a valle. A questo punto, preservare l'intero cervello o raccogliere sotto-regioni del cervello (ad esempio, telencefalo, tetto ottico, bulbi olfattivi) (Figura 7).
  11. Isolamento del telencefalo: Per estrarre il telencefalo, si pizzica la base tra il telencefalo e il tetto ottico con una pinza ultra-fine e separare il telencefalo dal resto del cervello. Trasferisci nel tubo di stoccaggio appropriato.
  12. Se utilizzato per metagenomica, si congelano rapidamente i campioni raccolti in azoto liquido e si conservano a -80 °C. Fallo immergendo il tubo della microcentrifuga in azoto liquido per 5 secondi.

Figura 1
Figura 1: Morfotipi di Astyanax mexicanus . (A) Pesci di superficie. (B) Pesce cavernicolo Pachón. Barra in scala: 10 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Distacco della testa. (A) Pesce di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Rimozione della mascella da una testa di pesce staccata. (A) Pesce di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Rimozione dell'occhio da una testa di pesce staccata. Nei pesci delle caverne, si può eseguire il raschiamento dell'area per assottigliare il tessuto. (A) Pesci di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5: Taglio sagittale attraverso la parte superiore della testa di pesce. (A) Pesce superficiale. (B) Pesce cavernicolo Pachón. Barra in scala: 5 mm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6: Separazione delle porzioni laterali della testa ed esposizione del cervello all'interno della cavità cranica. (A) Pesce di superficie. (B) Pesce cavernicolo Pachón. (C,D) Rimozione del cervello dal letto cranico. Barra in scala: 5 mm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7: Anatomia cerebrale regionale di A. mexicanus . (A) Pesci di superficie. (B) Pesce cavernicolo Pachón. Barra in scala: 5 mm Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Dissezione intestinale negli adulti di pesci superficiali e pesci delle caverne

  1. Segui il metodo per l'eutanasia descritto sopra.
  2. Asciuga il pesce con una salvietta senza pelucchi prima di metterlo su una SP pulita e coprirlo con un PBS freddo (o acqua di sistema, a seconda dell'applicazione a valle) con il contagocce per mantenere il tessuto umido.
  3. Fissa il pesce sulla SP (se usa) con perni a T.
    1. Se non si usa un paralisia del son, un emostato da stringere con forza anteriormente dalla bocca durante i tagli va bene. Posiziona il perno anteriormente all'interno dell'orbita oculare (valere anche per i pesci delle caverne), assicurandoti che raggiunga la SP.
    2. Puntino posteriore attraverso la coda fino alla placca. Assicurati che il pesce rimanga fermo durante la procedura.
      NOTA: Se si effettua una dissezione gastrointestinale sullo stesso campione della dissezione cerebrale, decapitare rapidamente con un bisturi prima di iniziare la dissezione e fissare il pesce sulla superficie della placca. Fai un taglio diagonale anteriore dietro l'opercolo che preservi la parte superiore della testa ed eviti l'intestino. Idealmente, dividere testa e corpo e far lavorare due dissecatori esperti su ciascuno per efficienza temporale. La spilla anteriore può essere posizionata nella parte superiore anteriore del corpo dopo la decapitazione, mentre la spilla posteriore rimane nella stessa posizione (Figura 8).
  4. Utilizzando micro-forbici dissecanti, taglia la pelle e il muscolo sottostante lungo la linea mediana ventrale dalla pinna anale/ano verso l'opercolo (la copertura dura sulle branchie) in una linea semicircolare seguendo la curva inferiore del pesce (Figura 9).
  5. Rimuovere l'opercolo e la pinna pettorale con le microforbici e le pinze sottili.
    NOTA: Questo passaggio aiuta a rendere la rimozione della pelle più efficiente, ma può rallentare la dissezione e può essere saltato a seconda delle necessità.
  6. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante superiormente dalla pinna anale e poi tagliare anteriormente verso le branchie, estendendo l'incisione ventrale se necessario (Figura 10). Questo crea alla fine una finestra.
  7. Apri l'incisione con l'aiuto di pinze sottili per esporre la cavità corporea. Usa le pinze sottili per afferrare la pelle e sollevala delicatamente per rimuoverla (Figura 11).
  8. Taglia sia gli attacchi anteriori che posteriori dell'intestino e rimuovi con cura tutti gli organi interni: rimuovi il sistema gastrointestinale dal corpo e posizionalo su un'area pulita della SP (o della piastra di Petri sterilizzata e monouso) (Figura 12 e Figura 13).
  9. Per prima cosa, separare il fegato dagli altri organi addominali con la pinza ultra-fine. Se si isola il fegato, inseriscilo in un tubo microcentrifuga o utilizza un metodo di stoccaggio appropriato secondo il protocollo o la necessità a valle. Allunga con attenzione l'intestino e identifica le parti dello stomaco e del ventre/intestino posteriore (Figura 14).
  10. Stacca lo stomaco dal intestino medio/posteriore.
  11. Tieni le estremità anteriore e posteriore dell'intestino medio/posteriore con una pinza fine e allunga delicatamente per estenderla fino alla lunghezza totale.
  12. Raccogli tessuto in un tubo microcentrifuga e conserva correttamente.
  13. Se utilizzato per metagenomica, si congelano rapidamente i campioni raccolti in azoto liquido e si conservano a -80 °C. Questo avviene immergendo il tubo della microcentrifuga nell'azoto liquido per 5 secondi.

Figura 8
Figura 8: Posizionamento del perno per la dissezione gastrointestinale. (A) Pesci di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9
Figura 9: taglio inferiore alla pre-dissezione. (A) Pesci di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10
Figura 10: Rimozione dell'opercolo e creazione di una finestra. (A) Pesci di superficie. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11
Figura 11: Rimozione della pelle laterale superficiale e dei muscoli. (A) Pesci superficiali. (B) Pesce delle caverne Pachón Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12
Figura 12: Organi in situ nella cavità corporea del pesce adulto dopo la rimozione di muscoli e pelle. (A) Femmina di Pesce di Superficie con cavità addominale esposta e uova rimosse per esporre gli organi. (B) Maschio di Pesce di Superficie con cavità addominale e organi esposti. (C) Femmina di pesce cavernicolo Pachón con cavità addominale esposta e uova rimosse per esporre gli organi. (D) Maschio di pesce delle caverne Pachón con cavità addominale e organi. Le frecce nere indicano la regione in cui si trova il fascio gastrointestinale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13
Figura 13: Fascio gastrointestinale rimosso dalla cavità corporea del pesce. (A) Pesce superficiale. (B) Pesce cavernicolo Pachón. Barra in scala: 10 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 14
Figura 14: Organi gastrointestinali isolati di pesci di superficie e pesci delle caverne. (A) Pesci di superficie. (B) Pesce cavernicolo Pachón. Barra in scala: 10 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Seguendo questo protocollo, sono stati estratti i contenuti cerebrali e intestinali, e sono state effettuate misurazioni della lunghezza dell'intestino completo, del telencefalo e del tetto ottico, che sono state confrontate tra i morfotipi di pesci superficiali e quelli dei pesci delle caverne di Pachón (Figura 15). Abbiamo utilizzato i test t di Welch a campione indipendente per confronti statistici, con un campione di n = 6 pesci superficiali e n = 6 pesci delle caverne di Pachón...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La crescente rilevanza di A. mexicanus come modello di ricerca in diversi campi, che vanno dall'evoluzione alle neuroscienze biomediche e alla microbiologia, richiede un metodo standardizzato di dissezione e raccolta degli organi. Sebbene strutture isolate siano state studiate e documentate in precedenza, tra cui il tectumottico 16,38, il cuoreadulto 11 ealtri 11,44

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non c'è conflitto di interessi. Tutte le procedure seguono il protocollo approvato dall'IACUC 2024-0004.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è finanziato dalla sovvenzione NIH 5R16EY037336-02, dalla sovvenzione RCMI U54 MD007600 e dalla borsa NIH 1P20GM156713-01 (COBRE Puerto Rico Center for Microbiome Sciences).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vasca di riproduzione per pesci zebra da 1,0 litroTecniplasthttps://shop.tecniplastusa.com/products/1-0-liter-zebrafish-breeding-tankPer preparare la miscela di ghiaccio per l'eutanasia. Il serbatoio è riempito a metà di ghiaccio e poi il serbatoio interno perforato viene posizionato sopra. Poi viene riempito d'acqua fino alla superficie.
Vaso di ghiaccio in poliuretano da 4LUSA ScientificPunto #2328-7242
Sacchi di rifiuti per pericoli biologiciFisherbrand14-828-244
Calbiochem OmniPur PBS 10x Concentrato Liquido, Grado Biologia Molecolare, SterileMilliporeSigma65074L
Microscopio dissezionale Olympus SZ51Olympus OLSZ51NPS-LED/R
Pinze tessutili dissezionaliFisherbrand08-953G
Perni per la dissezione, confezione da 100Strumenti per la Scienza Domesticahttps://www.homesciencetools.com/product/dissection-pins-100-pack/?srsltid=AfmBOoofk8r6_hd4nx_7bjjP2
GzkNBlnOJ3vUKor5
rFCJvVxPN9xRlpc
Pinzeps, Delicate, Punte Extra Fine e Affilate  MOPECAB132
Pinza, tessuto, punta delicata super fineMOPECAB047
Emostato, 12,5 cm, drittoStrumenti di precisione mondialehttps://wpiinc.com/products/var-15920-halsted-mosquito-hemostatic-forceps
Pinzate dei gioiellieri, Dumont n. 5MilliporeSigmahttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/f6521
Kimwipes EX-LKimberly-Clark34155
Azoto liquidoFornito dall'Istituzione
Noyes Micro Forbici, 12 cmStrumenti di precisione mondiale500228
Carta assorbenteFornito dall'Istituzione
Piastre di Petri con coperchio trasparente, 95 mm, 15 mm, rotondoFisherbrandFB0875714G
Scalpell Blades, #22, confezione da 10Strumenti Scientifici per la Casahttps://www.homesciencetools.com/product/scalpel-blades-22-10-pack/
Manico del bisturi #4Surtexhttps://surtex-instruments.com/product/scalpel-handle-no-4/
Forbici, dissezione dell'irideMOPECAA146
Forbici, Micro SuperfineMOPECAA152
Pipette di trasferimento usa e getta standardThermo Scientific13-711-9D
Microcentrifuga Eppendorf sterile 1.5 & micro; Tubi LEppendorf05-402-25
Sylgard 184Scienze della microscopia elettronica24236-10
Thermo-FlaskLab-Line Instruments Inc.2119
Forbici Ultra FineNEWMED InstrumentsNM-DI-206023
Acqua adatta per l'elettroforesi, PCRSigma-AldrichW4502-1L

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ji, J., Thwaite, R., Roher, N. Oral intubation of adult zebrafish: a model for evaluating intestinal uptake of bioactive compounds. J Vis Exp. (139), e58366(2018).
  2. Örling, J., Kosonen, K., Villman, J., Reichard, M., Paatero, I. Impaired fin regeneration and angiogenesis in aged zebrafish and turquoise killifish. Biol Open. 12 (4), bio059622(2023).
  3. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Dev Methods Protoc. 1082, 197-214 (2014).
  4. Barbosa, A., et al. Western Blotting Assay for egr-1 Immediate Early Gene in Brain Tissue of Zebrafish Applied to Neuroethological Study. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
  5. Corradi, L., Zaupa, M., Sawamiphak, S., Filosa, A. Using perk immunostaining to quantify neuronal activity induced by stress in zebrafish larvae. STAR Protoc. 3 (4), 101731(2022).
  6. Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax transgenesis and husbandry: how cavefish enters the laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
  7. Leigh, S. C., Nguyen-Phuc, B. -Q., German, D. P. The effects of protein and fiber content on gut structure and function in zebrafish (danio rerio). J Comp Physiol B. 188 (2), 237-253 (2018).
  8. Sassen, W. A., et al. Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging. Dev Biol. 430 (1), 18-31 (2017).
  9. Jie, J., et al. Adult zebrafish intestine dissection: a technique to analyze compound absorption. J Vis Exp. (10), e20199(2023).
  10. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), e1717(2010).
  11. Baumann, D. P., Ingalls, A. Mexican Tetra (astyanax mexicanus): Biology, Husbandry, and Experimental Protocols. Laboratory Fish in Biomedical Research. , Academic Press. (2022).
  12. Gross, J. B., Meyer, B., Perkins, M. The rise of Astyanax cavefish. Dev Dyn. 244 (9), 1031-1038 (2015).
  13. Carlson, B. M., Gross, J. B. Characterization and comparison of activity profiles exhibited by the cave and surface morphotypes of the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 208, 114-129 (2018).
  14. Riddle, M., et al. Evolution of the Mexican cavefish gut microbiome. Curr Biol. 23, 01307(2023).
  15. Riddle, M. R., et al. Host evolution shapes gut microbiome composition in Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11192(2024).
  16. Jaggard, J. B., et al. Cavefish brain atlases reveal functional and anatomical convergence across independently evolved populations. Sci Adv. 6 (38), eaba3126(2020).
  17. Rodríguez-Morales, R. Sensing in the dark: constructive evolution of the lateral line system in blind populations of Astyanax mexicanus. Ecol Evol. 14 (4), e11286(2024).
  18. Rodriguez-Morales, R., et al. Convergence on reduced aggression through shared behavioral traits in multiple populations of Astyanax mexicanus. BMC Ecol Evol. 22 (1), 116(2022).
  19. Duboué, E. R., Borowsky, R. L., Keene, A. C. β-adrenergic signaling regulates evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Brain Behav Evol. 80 (4), 233-243 (2012).
  20. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biol. 13, 15(2015).
  21. Forberg, J. Temperature effects on the development of the axial skeleton and body shape in Astyanax mexicanus (teleostei: characidae) [Master's Thesis]. , College of Science and Health Theses and Dissertations. https://via.library.depaul.edu/csh_etd/514 (2022).
  22. Platzer, M., Englert, C. Nothobranchius furzeri: a model for aging research and more. Trends Genet. 32 (9), 543-552 (2016).
  23. Blackwell, B. R., et al. Effects of metformin and its metabolite guanylurea on fathead minnow (Pimephales promelas) reproduction. Environ Toxicol Chem. 41 (11), 2708-2720 (2022).
  24. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquat Toxicol. 78 (1), 91-102 (2006).
  25. Butler, J. M., Whitlow, S. M., Roberts, D. A., Maruska, K. P. Neural and behavioural correlates of repeated social defeat. Sci Rep. 8 (1), 6818(2018).
  26. Norton, W. H. J., Gutiérrez, H. C. The three-spined stickleback as a model for behavioural neuroscience. PLoS ONE. 14 (3), e0213320(2019).
  27. Espinasa, L., Jeffery, W. R. Conservation of retinal circadian rhythms during cavefish eye degeneration. Evol Dev. 8 (1), (2006).
  28. Jeffery, W., Ma, L., Parkhurst, A., Bilandzija, H. Pigment Regression and Albinism in Astyanax Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , Academic Press, Elsevier. (2015).
  29. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). J Exp Biol. 217 (Pt 6), 886-895 (2014).
  30. Lloyd, E., et al. Evolutionary shift towards lateral line-dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Dev Biol. 441 (2), 328-337 (2018).
  31. Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Dev Biol. 441 (2), 297-304 (2018).
  32. Chin, J. S. R., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Dev Biol. 441 (2), 319-327 (2018).
  33. Kowalko, J. E., et al. Loss of schooling behavior in cavefish through sight-dependent and sight-independent mechanisms. Curr Biol. 23 (19), 1874-1883 (2013).
  34. Espinasa, L., et al. Divergent evolutionary pathways for aggression and territoriality in Astyanax cavefish. Subterr Biol. 43, 169-183 (2022).
  35. Kowalko, J. Utilizing the blind cavefish Astyanax mexicanus to understand the genetic basis of behavioral evolution. J Exp Biol. 223 (Suppl_1), jeb208835(2020).
  36. Sekulovski, B., Miller, N. Mechanisms of social behaviour in the anti-social blind cavefish (Astyanax mexicanus). Proc Biol Sci. 292 (2043), 20250052(2025).
  37. Chin, J. S. R., et al. Analysis of stress responses in Astyanax larvae reveals heterogeneity among different populations. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 334 (7-8), 486-496 (2020).
  38. Kozol, R. A., et al. A brain-wide analysis maps structural evolution to distinct anatomical module. eLife. 12, e80777(2023).
  39. Ra, K., et al. Evolution of a central dopamine circuit underlies adaptation of light-evoked sensorimotor response in the blind cavefish, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2024).
  40. Medley, J. K., et al. The metabolome of Mexican cavefish shows a convergent signature highlighting sugar, antioxidant, and ageing-related metabolites. eLife. 11, e74539(2022).
  41. Yen, S., Johnson, J. S. Metagenomics: a path to understanding the gut microbiome. Mamm Genome. 32 (4), 282-296 (2021).
  42. Marder, E. Marder lab website - Sylgard dishes. , https://sites.google.com/brandeis.edu/marder-lab/experimental-resources/sylgard-dishes (2026).
  43. Hallmaier-Wacker, L. K., Lueert, S., Roos, C., Knauf, S. The impact of storage buffer, DNA extraction method, and polymerase on microbial analysis. Sci Rep. 8, 6292(2018).
  44. Riddle, M. R., et al. Evolution of gastrointestinal tract morphology and plasticity in cave-adapted Mexican tetra, Astyanax mexicanus. bioRxiv. , (2020).
  45. Garduño-Sánchez, M., et al. Phylogeographic relationships and morphological evolution between cave and surface Astyanax mexicanus populations (de Filippi 1853) (actinopterygii, characidae). Mol Ecol. 32 (20), 5626-5644 (2023).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Dissezione del cervelloasse intestino cervellomicrobiota intestinaleadattamento neuralemappatura dell intero cervelloevoluzione comparata
Video in arrivo

Articoli correlati