Articolo metodologico

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

DOI:

10.3791/70414

⸱

3 aprile 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for BioNanoengineering, Houston Methodist Research Institute, 2School of Medicine and Health Sciences, Tecnologico de Monterrey, 3Department of Applied Science and Technology, Politecnico di Torino, 4Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Surgery, Houston Methodist Hospital, 6Department of Radiation Oncology, Houston Methodist Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Abstract

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Le isole pancreatiche sono essenziali sia per il trapianto clinico delle isole sia per gli studi preclinici volti a comprendere i meccanismi e la progressione del diabete. Tuttavia, i progressi in questi settori sono spesso limitati dalla disponibilità di isolotti di alta qualità, poiché le strategie terapeutiche emergenti richiedono preparazioni più grandi, pulite e standardizzate. Questo articolo presenta un protocollo ad alta produttività e standardizzato per la raccolta chirurgica, la digestione enzimatica e la purificazione a gradiente di densità degli isolotti pancreatici provenienti dai ratti Lewis. Il metodo combina la perfusione intraductale del pancreas con una miscela enzimatica definita, la digestione in pool di più pancreasi e la separazione basata sulla densità per massimizzare la resa minimizzando la frammentazione ed eliminando la necessità di una selezione manuale di routine. La resa delle isole viene quantificata utilizzando due approcci complementari: un metodo tradizionale di conteggio basato su aliquote, comunemente usato in contesti clinici, e un metodo semi-automatizzato basato su immagini di preparazione completa. In un isolamento rappresentativo da 12 pancreasi, il conteggio manuale ha prodotto circa 3.300 equivalenti isolotti (IEQ) e 2.700 isolotti assoluti per pancreas (~39.600 IEQ totali), con una distribuzione delle dimensioni del 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm) e 6% (>250 μm). In confronto, l'analisi automatizzata dell'intera preparazione ha riportato 16.350 IEQ totali (1.362 IEQ/pancreas), evidenziando una variabilità intrinseca nella quantificazione basata su aliquote. I preparati avevano una purezza del 98% tramite colorazione con ditizone, e la vitalità degli isolotti è stata mantenuta al 98% in vitro nei giorni 3 e 7 dopo l'isolamento. La valutazione funzionale tramite secrezione di insulina stimolata da glucosio statico ha dimostrato un aumento di 10 volte del rilascio di insulina dopo una stimolazione di 1 ora con 16,7 mM di glucosio. Nel complesso, questo protocollo fornisce un approccio riproducibile ed efficiente per generare preparati di isolotti ad alta purezza e funzionalmente intatti che possono essere utilizzati immediatamente senza ulteriori pulizie. Gli isolotti mantengono una funzione robusta in coltura fino a sette giorni, consentendo flessibilità sia per saghi in vitro su larga scala sia per studi di trapianto in vivo .

Introduzione

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Il trapianto di isoli pancreatici rappresenta una strategia valida per ripristinare la produzione endogena di insulina negli individui con diabete di tipo 1 (T1D)1. Oltre al diabete di tipo 1, la biologia degli isoli è sempre più rilevante per il diabete di tipo 2 (T2D), una condizione caratterizzata da una progressiva disfunzione e perdita delle cellule β, così come per i pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale o totale per pancreatite cronica, tumori pancreatici o lesioni traumatiche. In questi contesti, l'accesso a isolotti di alta qualità è essenziale per far avanzare le terapie cellulari, modellare il fallimento β-cellulare, studiare le interazioni immuni e isolot-stromi, e sviluppare approcci rigeneratoriemergenti 2. Di conseguenza, procedure robuste e riproducibili di isolamento degli isolotti sono fondamentali per supportare sia la ricerca meccanicistica sia lo sviluppo traslazionale in un'ampia gamma di disturbi endocrini pancreatici.

Sebbene gli isolotti costituiscano meno del 2% della massa pancreatica, esercitano un ruolo sproporzionatamente significativo nell'omeostasi del glucosio. La loro vulnerabilità intrinseca all'ipossia, alla sovradigestione enzimatica, allo stress ossidativo e alla tecnica meccanica li rende particolarmente sensibili a lesioni legate all'isolamento 3,4,5. Anche sottili deviazioni nella temperatura, ossigenazione o nella manipolazione dei tessuti possono compromettere l'accoppiamento stimolo-secrezione β-cellula o innescare l'apoptosi, a causa delle difese antiossidanti limitate e dell'elevata domandametabolica 6,7. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli convenzionali enfatizza un rapido utilizzo a valle, tipicamente entro 24-48 ore dalla raccolta sia in contesti clinici che sperimentali 8,9,10,11,12. Sebbene questo quadro di "uso immediato" minimizzi il deterioramento, limita la flessibilità sperimentale, ostacola gli studi longitudinali e complica gli sforzi per accumulare un numero sufficiente di isolotti per grandi saghi in vitro o esperimenti di trapianti in vivo.

Tra i modelli di roditori, i ratti Lewis sono ampiamente utilizzati per la ricerca sugli isolotti grazie al loro background genetico consanguineo, al profilo immunitario stabile e alle caratteristiche fisiologicheriproducibili 14. Le differenze dipendenti dallo sforzo nella ressa, nella reattività e nella resilienza degli isolotti sono ben documentate. De Groot et al. hanno dimostrato che gli isolotti di ratto Lewis presentano una secrezione di insulina stimolata dal glucosio superiore rispetto ad altri ceppi, sottolineandone l'idoneità per studi funzionali, metabolici e ditrapianto 15. Ulteriori studi hanno confermato la loro affidabilità per la ricerca immunologica e allo-/xenotrapiante 14,15,16. Tuttavia, in tutti i laboratori, la variabilità nella ressa, nella purezza e nella funzione degli isolotti rimane un ostacolo significativo. Gran parte di questa variabilità deriva da incongruenze nella miscela enzimatica, nelle tecniche di perfusione intraduttale, nella gestione del pancreas, nel tempismo della digestione e nella strategiadi purificazione 17.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un protocollo riproducibile e passo dopo passo per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione a gradiente di densità degli isolotti pancreatici provenienti dai ratti Lewis. Questo flusso di lavoro è ottimizzato per massimizzare la ressa, minimizzare la frammentazione e preservare la vitalità funzionale. È importante sottolineare che stabilisce parametri chiari, inclusi equivalenti degli isolotti (IEQ), la vitalità nel tempo, la purezza e la secrezione di insulina stimolata dal glucosio, che permettono ai ricercatori di distinguere in modo affidabile isolamenti successivi da quellisubottimali 18,19,20. Migliorando sia la resa che la longevità, il protocollo aumenta la flessibilità sperimentale e può ridurre il numero di animali donatori necessari, supportando un disegno sperimentale più etico e scalabile.

Diverso da molti approcci tradizionali, il metodo attuale dimostra che gli isolotti di ratti di Lewis possono essere mantenuti in coltura fino a 7 giorni con vitalità e funzione preservate, ampliandone l'utilità per studi in vitro prolungati. Il protocollo incorpora inoltre una strategia di elaborazione snella, a raccolta di prodotti, in grado di gestire fino a 30 pancreas in un singolo lotto, consentendo una digestione uniforme e riducendo la variabilità tra campioni. Con una purezza endocrina che raggiunge il 98%, la procedura elimina la necessità di selezione manuale laboriosa e riduce le possibilità di contaminazione microbica. Rispetto ai metodi di digestione a singolo passaggio o a massa che producono frequentemente preparati impuri o meccanicamentecompromessi, questo flusso di lavoro ad alta produttività produce in modo affidabile un gran numero di isolotti puliti, di qualità trapianto, adatti a sagaggi in vitro , profilazione metabolica e studi di trapianto in vivo .

Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal Houston Methodist Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocollo #IS00007362) e condotte in conformità con la Guida dei National Institutes of Health per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e con l'Animal Welfare Act.
NOTA: I materiali e gli strumenti utilizzati durante tutto il protocollo si trovano nella Tabella dei Materiali.

1. Preparazione prima del giorno della raccolta e dell'isolamento

  1. Preparare le seguenti soluzioni in condizioni asettiche all'interno di un armadietto di biosicurezza ( vedi Tabella 1) e conservare tutte le soluzioni a 4 °C fino all'uso.
    Soluzione di risciacquo penicillina-streptomicina (Pen-Strep).
    Materiale per lavaggio.
    Isolamento del buffer.
    Media della cultura degli isolotti.
    Buffer di Krebs.
  2. Sterilizza utensili e attrezzature tramite autoclaving.
    1. Pacchetto chirurgico per il prelievo del pancreas in autoclave: drape chirurgiche, garza, pinzeps di tessuto a dente di ratto, pinze piatte, pinze curve fine, una forbice per la pelle, forbici micro-dissezionanti, due piccoli emostatici e un emostato curvo.
      NOTA: Autoclave per il prelievo di due pacchetti chirurgici per il pancreas se ci saranno due operatori chirurgici.
    2. Pacchetto chirurgico per la pulizia del pancreas autoclave: pinze fini curve e forbici micro-dissezionanti.
    3. Autoclave una lastra di carta stagnola da 30 cm x 30 cm.
    4. Autoclave 1-6 becher da 600 mL e 1 L, in base al numero di pancreasi da lavorare (vedi Tabella 2).
    5. Autoclave un setaccio da 500 μm.
    6. Autoclave due aghi spinali da 14 G, nel caso in cui uno si ostruisca con tessuto pancreasico non digerito.
    7. Autoclave un tubo di siringa per ogni siringa da 50 mL necessaria (vedi Tabella 3).
  3. Prepara il bagno d'acqua per la digestione.
    1. Riempi il bagno d'acqua dotato di uno shaker orbitale con acqua ultrapura autoclavata fino a che non sia a 3/4 di pollice sopra il livello della piattaforma.
    2. Aggiungi 3 mL di soluzione antimicrobica e tieni il coperchio chiuso per minimizzare la contaminazione.

2. Preparativi per il giorno della raccolta e dell'isolamento

  1. Prepara siringhe a gradiente.
    1. Rimuovere le soluzioni di gradiente degli isoli 1,108 g/cm³, 1,096 g/cm³ e 1,069 g/cm³ preparate e utilizzate nei passaggi successivi e il passo 5.2 di "Purificazione dell'isolotto" da 4 °C di stoccaggio, lasciandole equilibrarsi alla temperatura ambiente (circa 1 ora).
      NOTA: Il volume di gradiente richiesto varierà in base al numero di pancreasi da lavorare; si veda la Tabella 3 per garantire volumi adeguati di scongelamento di gradienti selezionati.
    2. Precarica e etichetta le siringhe da 50 mL con gradienti di 1,096 g/cm³ e 1,069 g/cm³.
      1. Mescolare vigorosamente le soluzioni di gradiente di densità da 1,069 e 1,096 g/cm³.
      2. Carica i volumi appropriati, a seconda della Tabella 3, in siringhe da 50 mL dotate di tubi chirurgici e ago da 16 G.
      3. Dopo l'impasto, tappa gli aghi per mantenere la sterilità e metti da parte le siringhe per un uso successivo nel passo 5.5 della "Purificazione degli isolini".
    3. Mantenere un gradiente3 di 1,108 g/cm a temperatura ambiente fino a un uso successivo.
  2. Prepara una soluzione enzimatica Working Dissociation Media (WDM), carica nelle siringhe per la perfusione e becher autoclavi.
    1. Lavora in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza e tieni tutte le soluzioni sul ghiaccio.
    2. Scongelare aliquote di collagenasi, termolisina e DNasi I su ghiaccio.
    3. Diluire reagenti enzimatici, in un becher sterile da 1 L, utilizzando WDM per ottenere le seguenti concentrazioni finali: collagenasi 0,15 mg/mL, termolisina 5 μg/mL e DNasi I 0,1 mg/mL (Tabella 2).
    4. Mescola delicatamente il WDM usando un movimento vorticoso 10 volte. Non mescolare con una pipetta; Preservare l'attività enzimatica facendo un leggero roteamento.
    5. Uno alla volta, carica 10 mL della soluzione enzimatica WDM in ciascuna siringa da 10 mL usando un ago da 16 G per un riempimento rapido, poi sostituisci con un ago tappato da 25 G x 1/2" pollici per la successiva perfusione pancreasica.
    6. Avvolgi le siringhe cariche con carta di alluminio autoclaviata e mettila sul ghiaccio fino all'uso.
    7. Distribuire l'eccesso di WDM in modo uguale in becher sterili da 600 mL per contenere il pancreas raccolto secondo la Tabella 2. Copri ogni becher con carta stagnola sterile e lascialo sul ghiaccio (Tabella 2).
  3. Prepara lo spazio di lavoro per la coltura cellulare.
    1. Accendi lo shaker a bagno d'acqua orbitale, impostato a 130 giri/min e 37 °C. Lascia questo durante il prelievo del pancreas.
    2. Posiziona i seguenti oggetti sotto luce UV nell'armadietto di biosicurezza per 1 ora per ulteriori sterilizzazioni.
      Setaccio sterile da 500 μm.
      Becher sterile da 1 L.
      Pompa per siringa.
    3. Assicurati che l'incubatore di colture cellulari sia impostato a 25 °C 5% CO2.
    4. Imposta la centrifuga a 4 °C, con accelerazione e decelerazione a 9.
  4. Raccogli materiali per il prelievo e procedi in sala operatoria.
    1. Detergente designato per il pancreas:
      1. Raccogli un grande secchio di ghiaccio per contenere il numero richiesto di becher WDM da 600 mL e la soluzione per il risciacquo per il pancreas (vedi Tabella 1 e Tabella 2).
      2. Raccogli 1 piastra di Petri sterile per ogni 6 pancreas da lavorare.
      3. Raccogli 1 forbice micro-dissezionante sterile e 2 pinze piccole curve e delicate.
    2. Raccoglitore designato di pancreas:
      1. Raccogli una confezione chirurgica sterile per il prelievo.
      2. Raccogli guanti chirurgici sterili.
      3. Raccogli una vaschetta per ghiaccio con siringhe WDM da 10 mL già caricate sigillate in alluminio autoclavato.
  5. Nella sala operatoria, prepara la stazione di prelievo del pancreas.
    1. Accendi lo sterilizzatore a perline di vetro per sterilizzare gli strumenti chirurgici immergendoli per 1 minuto nello sterilizzatore tra ogni animale. Gli strumenti possono essere raffreddati rapidamente tramite immersione in un PBS sterile 1x.
    2. Posizionare un assorbente sotto il campo visivo del microscopio per eventuali perdite di sangue o soluzione enzimatica WDM.
    3. Imposta il microscopio su un ingrandimento totale di 6,3x tra lenti oculari e oggettive.
    4. Apri la confezione chirurgica e indossa i guanti chirurgici sterili usando la tecnica asettica.
    5. Procedete con il prelievo chirurgico.
  6. In sala operatoria, prepara la postazione di pulizia del pancreas.
    1. Versare abbastanza soluzione di Pen-Strep da riempire metà di una piastra di Petri da 100 mm (circa 6 mL) per immergere il pancreas isolato e metterlo sul ghiaccio.
    2. Apri la confezione chirurgica e indossa i guanti chirurgici sterili usando la tecnica asettica.
  7. Nella sala operatoria, preparare la camera di eutanasia.
    1. Metti i vassoi dei serbatoi in una gabbia per ratti vuota, pulita e richiudibile.
    2. Riempi le vassoie a metà con isoflurano.
    3. Posiziona la vaschetta perforata sopra i serbatoi per evitare che si rovescino mentre i ratti sono inseriti all'interno.
    4. Sigilla la parte superiore della camera con il coperchio della gabbia.
  8. Procedi al prelievo del pancreas.

3. Raccolta del pancreas

  1. Posizionare i ratti uno alla volta nella camera di eutanasia sopra il vassoio per un rapido overdose di isoflurano.
    NOTA: Il tempo di eutanasia richiesto per il ratto varia, specialmente man mano che l'isoflurano evapora.
  2. Confermare l'assenza di polso e respirazione per ogni ratto.
  3. Confermare l'eutanasia con un metodo secondario che non disturbi la cavità addominale (ad esempio, puntura cardiaca).
    NOTA: Altri metodi primari di eutanasia sono accettabili; Tuttavia, si preferisce il sovradosaggio di isoflurano, poiché l'eutanasia rapida minimizza l'ipossia degli isoliotti.
  4. Spruzzare il pelo addominale di ogni ratto con il 70% di etanolo per incrociare e prevenire peli sciolti nel campo chirurgico.
  5. Posizionare il ratto eutanasiato supino al microscopio con la testa distale rispetto all'operatore. Assicurati che la cavità addominale superiore sia sotto il campo visivo del microscopio.

Figura 1
Figura 1: Esposizione chirurgica e perfusione intraductale del pancreas del ratto. Illustrazione dei passaggi chiave nell'esposizione e perfusione del pancreas attraverso lo Sfintere di Oddi. (A) Eutanasia di un ratto Lewis con la cavità addominale aperta. (Aa) Posizione della pinza del dotto biliare comune e della vena epatica. (B) Vista ingrandita del duodeno che mostra emostati che segnano la regione dello Sfintere di Oddi. (Bb) Ago di perfusione posizionato all'interno del dotto pancreatico principale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Raccogliere il pancreas (ruolo del mietitore del pancreas):
    1. Effettuare un'incisione a forma di "V", usando forbici per la pelle, partendo dalla simfisi pubica verso ciascuna gabbia toracica laterale per accedere alla cavità addominale (vedi Figura 1A).
    2. Ritrae l'intestino tenue e crasso sul lato sinistro dell'animale usando pinze piatte per liberare lo spazio di lavoro della cavità addominale.
    3. Spiega il duodeno usando le pinze piatte e gli emostrati curvi. Assicurati che il dotto biliare comune e la vena porta epatica siano nel campo visivo del microscopio.
    4. Ritrai il fegato cefalade e clampa il dotto biliare comune e la vena epatica usando gli emostrati curvi. Clampare 1-2 mm dal fegato (vedi Figura 1Aa).
      NOTA: I passaggi 3.6.1-3.6.4 e 3.6.8 possono essere eseguiti tramite visualizzazione diretta. Usa il microscopio per tutte le altre fasi per garantire una manipolazione delicata dei tessuti.
    5. Sotto la visuale del microscopio, usando la pinza piatta e gli emostati piatti, mobilita delicatamente il contenuto del duodeno per eliminare lo sfintere di Oddi.
      NOTA: Assicurarsi che il contenuto del duodeno venga spostato dal sito previsto di inserimento dell'ago.
    6. Isolare la regione circostante dello Sfintere di Oddi clampando delicatamente il duodeno con gli emostati piatti a circa 5 mm da ciascun lato dello sfintere. Garantire una compressione minima per preservare l'integrità dei tessuti ( vedi Figura 1B).
    7. Utilizzando una siringa sterile di WDM, inserisci l'ago con cura attraverso la parete duodenale, passalo attraverso lo Sfintere di Oddi e avanza nel dotto pancreatico principale per la perfusione (vedi Figura 1Bb).
      1. Non appena l'ago attraversa lo Sfintere di Oddi, mantenendo una pressione costante, si perfondono 7-10 mL di WDM nel pancreas a una velocità di circa 500 μL/s finché il pancreas non si distesa completamente.
        NOTA: Assicurati che la smussatura sia sollevata e che l'ago sia parallelo al dotto pancreatico per minimizzare i traumi. Inizia a iniettare immediatamente dopo l'inserimento. Questo aiuterà a dilatare lo sfintere e il dotto, facilitando l'avanzamento dell'ago. Il pancreas è considerato completamente disteso quando la coda del pancreas, situata vicino alla milza, diventa visibilmente perfusa.
    8. Espelle il pancreas dissezionandolo delicatamente e liberandolo dalle strutture circostanti nel seguente ordine: milza, stomaco, intestino crasso, duodeno e mesenterio.
      NOTA: Usa la dissezione contundente per minimizzare i danni ai tessuti. Procedere in sequenza per mantenere l'orientamento anatomico e ridurre la tensione sulle connessioni vascolari e duttali.
      1. Rimuovi entrambi gli emostati piatti dal duodeno.
      2. Usa la pinza piatta per bloccare il legamento splenopancreatico (che collega pancreas e milza) e applica una trazione delicata.
      3. Utilizzando le pinze sottili curve e dissezionanti, mobilita e separa con attenzione il pancreas dagli attacchi splenici adiacenti.
      4. Distogliere il pancreas dallo stomaco sollevando il tessuto pancreatico con una pinza fine e curva e applicando una delicata controtrazione con una pinza piatta.
      5. Poi, usando la pinza piatta, applica una trazione ferma per avulsare l'intestino crasso dal pancreas.
      6. Solleva l'intestino tenue usando la pinza piatta e seziona il mesenterio dal pancreas usando le pinze curve fine.
      7. Solleva delicatamente il pancreas perfuso con la pinza piatta e usa le forbici fine per sezionare eventuali attacchi residui al tessuto connettivo.
    9. Trasferire immediatamente il pancreas espulso in una piastra di Petri contenente soluzione di risciacquo ghiacciata e procedere immediatamente a prelevare il pancreas successivo, mentre il detergente inizia la pulizia del pancreas.
  2. Pulire il pancreas (ruolo del pulitore del pancreas):

Figura 2
Figura 2: Pulizia del pancreas perfuso del ratto. Visualizzazione sequenziale del pancreas prima e dopo la rimozione di tessuto non essenziale. (A) Pancreas perfuso immediatamente dopo la dissezione, con tessuto adiposo adiacente, linfonodi e strutture connettive visibili. (B) Pancreas perfuso con i principali punti di riferimento anatomici etichettati. (C) Pancreas pulito dopo la rimozione del tessuto in eccesso, mostrando l'aspetto finale prima della digestione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Utilizzare le pinze curve fine e le forbici fine per sezionare per tagliare con cura linfonodi, tessuto adiposo, mesenterio e grandi vasi dal pancreas perfuso, se presenti (vedi Figura 2).
  2. Trasferire il pancreas pulito in un becher sterile da 600 mL contenente 25 mL di WDM freddo. Copri il becher con carta stagnola sterile per mantenere la pulizia tra il trasferimento dall'area di lavoro chirurgica a quella di coltura cellulare.
    1. Sostituisci la soluzione per risciacquo nella piastra di Petri ogni 6 volte per prevenire contaminazioni.
    2. Annota il momento in cui il primo pancreas viene messo sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per documentare il tempo di ischemia fredda.
  1. Una volta che tutti i pancreasi sono stati prelevati e puliti, si procede rapidamente alla fase di digestione nell'area di coltivazione cellulare.

4. Digestione del pancreas

  1. Mettere in pausa le rivoluzioni degli shaker orbitali e fissare il/i becher coperto/i, contenenti il pancreas, nei contenitori designati del bagno d'acqua.
  2. Rapidamente, riavvia lo shaker orbitale impostato a 130 giri/min e avvia un timer di 10 minuti per il tempo di digestione (vedi Figura 3A).
    NOTA: Annota questo punto come la fine del periodo dell'ischemia fredda. Registra ogni raccolta di isolotti con il corrispondente tempo totale di ischemia fredda in un registro di laboratorio.
  3. Al minuto 5, fai roteare manualmente il becher in senso orario, poi in senso antiorario per favorire la dissociazione dei tessuti.
  4. Al minuto 8, prelevare la soluzione di tempra dal deposito a freddo e trasferirla nell'armadietto di biosicurezza per un uso immediato successivo (vedi Tabella 1).
  5. Al minuto 10, trasferire rapidamente e immergere i becher nel ghiaccio per rallentare l'attività enzimatica (vedi Figura 3B).
    NOTA: Da questo momento in poi, maneggiare tutti i tessuti, cellule e soluzioni sul ghiaccio per preservarli fino al passo 4.20 utilizzando gradienti di densità a temperatura ambiente.
  6. Trasferire l'esterno del becher e il vassoio in un armadietto di biosicurezza.
  7. Aggiungi il tampone di tempra in un rapporto 1:1 con la soluzione nel becher per fermare la digestione (circa 75-100 mL per becher).
  8. Aspirare ed espellere la sospensione tissutale in modo delicato ed ripetuto utilizzando una siringa da 50 mL dotata di un ago spinale da 14 g per dissociare i grandi frammenti di tessuto ( vedi Figura 3C).
  9. Trasferire la sospensione a tubi conici da 200 mL.
  10. Sciacquare il vaso con 5 mL di materiale per lavaggio e decantare nel tubo conico da 200 mL contenente la digestione dell'isolotta per raccogliere eventuali residui di digerizione.
  11. La centrifuga digerisce a 200 × g per 5 minuti a 4 °C. Assicurati l'uso di adattatori e cuscini per bottiglie centrifughe adeguati per la sicurezza.
  12. Decanta con attenzione il sovrantantante e risospendi il pellet in 100 mL di materiale di lavaggio usando lo stesso ago spinale da 14 g di prima.
  13. Filtrare la sospensione attraverso un setaccio sterile da 500 μm posto su un becher sterile da 600 mL per rimuovere qualsiasi tessuto grande e non digerito.
    NOTA: Se la perfusione e la pulizia del pancreas sono state eseguite in modo ottimale, il tessuto adiposo minimo e nessun pancreas non perfuso rimarranno sopra il setaccio.
  14. Risciacqua il setaccio con 10 mL di materiale per lavaggio per recuperare il tessuto intrappolato.
  15. Trasferire il filtrato in nuovi tubi conici da 200 mL.
  16. Centrifuga a 200 × g per 5 minuti a 4 °C.
  17. Escantare il sovrantato e risospendere il pellet in un mezzo di lavaggio da 100 mL usando una pipetta sierologica da 10 mL.
    NOTA: Assicurarsi una perdita cellulare minima bagnando le punte della pipetta con un tampone contenente FBS prima dell'esposizione agli isolotti.
  18. Centrifugare a 600 × g per 5 minuti a 4 °C.
  19. Aspira con cura il soprantantante per ottenere un pellet secco.
  20. Imposta la temperatura della centrifuga a 22 °C in preparazione alla separazione del gradiente.
    NOTA: Questo può essere accelerato facendo funzionare la centrifuga a 2000 x g per 15 minuti a 22 °C, senza campioni.

5. Purificazione degli isolotti

  1. Consulta la Tabella 3 per determinare il numero di tubi conici da 50 mL richiesti.
    NOTA: Consultare la Tabella 3 per distribuire uniformemente il volume totale dei pellet, assicurandosi che circa 2-3 mL di digestione del pellet siano divisi in ciascun tubo gradiente. Se in seguito si osserva una debole separazione delle bande degli isolotti, si utilizzano tubi a gradiente aggiuntivi per migliorare la risoluzione della separazione.
  2. Pre-bagna una punta sierologica di pipetta da 10 mL con la soluzione a gradiente di densità di 1,108 g/cm³ per evitare che gli isolotti si attacchino alla superficie interna della punta.
  3. Risospendere ogni pellet tissutale in 15 mL di soluzione gradiente di 1,108 g/cm³ per 2 mL di volume di pellet utilizzando la pipetta sierologica pre-bagnata da 10 mL. Nonostante il volume totale superi i 10 mL, la larghezza più piccola della pipetta facilita una miscelazione più controllata e una dissociazione efficiente dei pellet. Mescola delicatamente fino a renderlo uniforme.
  4. Distribuire con attenzione 15 mL della sospensione della cella nel fondo di ogni tubo conico da 50 mL, evitando il contatto con le pareti del tubo per garantire livelli di gradiente puliti.
  5. Utilizzando le siringhe a gradiente precaricate, sovrappongi sequenzialmente 10 mL di gradiente di 1,096 g/cm³, seguiti da 10 mL di gradiente di 1,069 g/cm³.
  6. Erogare ogni gradiente a una velocità di 5 mL/min utilizzando una pompa a siringa, posizionando la punta dell'ago da 16 G contro la parete interna del tubo per evitare la miscelazione del gradiente.
  7. Centrifugare i tubi a 700 × g per 15 minuti a 22 °C, con l'accelerazione della centrifuga impostata a 3 e la decelerazione a 0 per evitare la miscelazione gradiente.
    NOTA: Dato il tempo di decelerazione esteso, l'intero ciclo di centrifugazione dura circa 45 minuti. Monitorare attentamente il tempo, poiché gli isolotti devono essere raccolti tempestivamente per prevenire la miscelazione del gradiente e potenziali danni cellulari. Se necessario, prepara i tubi di contrappeso in base al peso, non al volume, per tenere conto delle differenze di densità. Dopo aver rimosso i tubi, si resetta la centrifuga a 4 °C, e accelerazione e decelerazione a 9 per i passaggi successivi.
  8. Dopo la centrifugazione, si identifica lo strato di isolotti situato alle interfacce tra gli strati gradienti 1,069-1,096 g/cm³ e 1,096-1,108 g/cm³ (vedi Figura 3D).
  9. Aspirare e scartare con attenzione qualsiasi tessuto raccolto nello strato superiore utilizzando una pipetta Pasteur pre-bagnata con materiale di lavaggio.
  10. Bagna un'altra pipetta Pasteur, raccogli lo strato di isolotti e trasferiscilo in un tubo conico pre-raffreddato da 200 mL contenente 5 mL di materiale di lavaggio.
  11. Alza il volume del tubo conico pre-raffreddato da 200 mL con il materiale di lavaggio.
  12. Centrifuga a 600 × g per 5 minuti e decanta il surnaante.
  13. Risospendere il pellet in 30 mL di materiale di lavaggio utilizzando una punta sierologica pre-bagnata da 10 mL.
  14. Trasferire la ressuspension su un nuovo tubo conico da 50 mL utilizzando una punta sierologica pre-bagnata da 10 mL per una migliore pellettizzazione degli isolini.
  15. Risciacquare lo stesso tubo conico da 200 mL con 20 mL di materiale di lavaggio e trasferire nel tubo conico da 50 mL contenente gli isolotti rimanenti.
  16. Centrifuga la conica da 50 mL con isolotti e substrato di lavaggio a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
  17. Esantire il sovrantantante e risospendere il pellet dell'isolotto in 50 mL di substrato di coltivazione degli isolotti (vedi Tabella 1).
    NOTA: Rimuovere aliquote da 100 μL durante questo passaggio se si contano isolotti con il metodo di quantificazione manuale.
  18. Placcare uniformemente isole in piastre di Petri da 100 mm non trattate con coltura tissutale, utilizzando una piastra ogni cinque pancreas di ratto Lewis lavorati.
    1. Calcola il volume totale del mezzo degli isolotti richiesto usando la formula (numero di pancreas ÷ 5 × 10 mL).
    2. Sospendere il pellet dell'isolotta a metà del volume calcolato del substrato, poi distribuire uniformemente la sospensione sul numero determinato di piatti.
    3. Risciacquare il tubo conico da 50 mL contenente isolotti residui con la metà restante del mezzo calcolato e pipettare questo lavaggio sulle stesse piastre per raggiungere un volume finale di 10 mL per piatto (vedi Figura 3E).
  19. Incubare durante la notte a 25 °C con il 5% di CO₂. Aggiungi 3 mL di substrato per la coltura degli isolotti ogni 24 ore ai lati di ogni piastra di Petri e poi fai ruotare delicatamente per rifornire il substrato.
  20. Procedi al conteggio degli isolotti (passo 6).

Figura 3
Figura 3: Digestione del pancreas e purificazione degli isolotti isolati. Immagini rappresentative dei passaggi sequenziali dalla digestione del pancreas in pool alla purificazione degli isoli. (A) Raccolta di pancreasi perfusi prima della digestione enzimatica. (B) Pancreas frammentati dopo digestione enzimatica. (C) Sospensione uniforme dei tessuti, post-meccanica. (D) Tubi a gradiente di densità prima della centrifugazione (a sinistra) e dopo la centrifugazione (a destra), con la banda visibile dell'isolotto all'interfaccia del gradiente cerchiata. (E) Immagine in campo luminoso degli isolotti del Giorno 0 immediatamente dopo la raccolta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Conteggio degli isolotti

  1. Raccogli la quantificazione manuale degli isolotti.
    1. Durante il passo 5.16, preleva tre aliquote da 100 μL della sospensione dell'isolotto usando una pipetta da 200 μL e punte normali da 200 μL.
      NOTA: Assicurarsi che gli isolotti siano sospesi in modo uniforme nel mezzo tramite la miscelazione di pipette, quando vengono prelevati gli aliquoti per la misurazione.
    2. Trasferire ogni aliquota nella propria piastra di Petri grigliata da 2 mm × 2 mm contenente 1 mL di 1× PBS.
    3. Contare gli isolotti sotto un microscopio rovesciato, catalogandoli per diametro con un inserto di lente a reticolo oculare.
      NOTA: Non tutti gli isolotti saranno circolari; Rispetta le misurazioni orizzontali o verticali durante il conteggio.
    4. Calcola il numero totale di isolotti equivalenti da 150 μm utilizzando la tabella di conversione standardizzata (vedi Tabella 4).
      NOTA: Confronta la IEQ di ogni campione. Se il QI delle aliquote differisce di più del 30%, procedere con la media delle aliquote più simili.

7. Precauzioni di sicurezza

  1. Esegui tutte le procedure chirurgiche e di gestione dei tessuti in condizioni asettiche all'interno di un armadietto di biosicurezza quando opportuno. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI), inclusi occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, guanti e maschere chirurgiche, durante la manipolazione di reagenti e tessuti.
  2. Eseguire il prelievo del pancreas in condizioni sterili con strumenti chirurgici adeguati e DPI. Maneggiare l'isoflurano e altri anestetici secondo le linee guida istitutive per prevenire l'esposizione all'inalazione.
  3. Smaltire tessuti animali, oggetti pungenti e rifiuti biologici in conformità con i protocolli di biosicurezza istituzionale. Mantenere reagenti enzimatici e materiali biologici sul ghiaccio, salvo diversa specificazione per preservare attività e vitalità.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I seguenti risultati rappresentano un tipico isolamento di isolotti eseguito con il metodo descritto, con dodici pancreas di ratto Lewis processati in parallelo.

Distribuzione di resa e dimensione

Conteggio manuale delle aliquote e conversione IEQ

Due aliquote indipendenti da 100 μL sono state ottenute dalla sospensione mista degli isolotti, come descritto nella sezione "Conteggio degli isolotti", Passo 6.1, e conteggiate per contenitori di diametro (50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm, 250-300 μm). I conteggi venivano convertiti in equivalenti degli isolotti (IEQ; riferimento di 150 μm) utilizzando tabelle di equivalenza standard ed estrapolati al volume totale di sospensione (vedi Figura 4A). Nell'isolamento di prova (n = 12), la resa era di 3330 IEQ/pancreas con un diametro mediano dell'isolotto nel contenitore da 50-100 μm. Replicare le aliquote concordate con un 18,8% per bin (coefficiente di variazione), indicando una variazione moderata ma attesa con l'uso di metodi di conteggio manuale. Nelle precedenti 14 isolazioni di isolotti, questo metodo ha prodotto una media di 1353 IEQ/pancreas (SD 607).

Quantificazione automatica dell'intera piastra

Per confrontare l'IEQ manuale, le immagini in campo chiaro sono state acquisite a D1 usando un microscopio e cucite per generare compositi a intero piatto (obiettivo 4×; esposizione 1/100 s). La dimensionamento automatizzato e la quantificazione degli oggetti venivano eseguiti utilizzando Fiji e codificando con una soglia di dimensione predefinita di 50-600 μm. Le immagini sono state inizialmente preprocessate per ridurre la variazione dello sfondo e migliorare l'uniformità del contrasto. Le strutture degli isolotti sono state identificate in base alle differenze di intensità rispetto ai tessuti circostanti, generando maschere binarie per oggetti. Isolotti adiacenti o parzialmente toccanti venivano separati per evitare una sottostima del numero di oggetti. Gli oggetti al di fuori dell'intervallo di dimensioni specificati sono stati esclusi per rimuovere detriti e tessuto non isolato. Per ogni oggetto trattenuto, sono stati estratti parametri morfometrici tra cui area e diametri degli assi x e y. Gli isolotti venivano poi assegnati per diametro, e l'IEQ veniva calcolato moltiplicando il numero di isolotti in ogni contenitore di dimensioni per il fattore di conversione corrispondente. La dimensionamento automatica ha prodotto un totale di 98.832 oggetti, con diametri medi sugli assi x e y rispettivamente di 117 μm e 116 μm, e un totale stimato di 16.350 IEQ, fortemente correlato con l'IEQ manuale misurato a D0 (Spearman r = 0,937, p = 0,0048; vedi Figura 4A-C).

Perdita cellulare degli isolotti

Le immagini dell'intera piastra sono state acquisite 2 ore dopo la purificazione e di nuovo al Giorno 1 (D1), utilizzando la stessa metodologia nella "Quantificazione automatica dell'intera placca" per valutare la stabilizzazione precoce degli isoli ("shedding"). Il numero di oggetti è cambiato dello 0,9% e l'IEQ del -6,11% da 2 ore a D1 (vedi Figura 4D). Il confronto accoppiato dei diametri degli isolotti tra D0 e D1 ha mostrato una diminuzione mediana statisticamente significativa di 2 μm (test Wilcoxon signed-rank, p = 0,0136, n = 2820). Tuttavia, la piccola entità di questo cambiamento difficilmente sarà biologicamente o clinicamente significativa.

Figura 4
Figura 4: Valutazione quantitativa della distribuzione delle dimensioni degli isoli, correlazione e precoce perdita di iotti. Riepilogo grafico delle misurazioni degli isolotti ottenute tramite analisi manuali e automatizzate. (A) Giorno 0 (D0) distribuzione delle dimensioni degli isolotti basata sulla quantificazione manuale tra contenitori IEQ equivalenti agli isolotti standardizzati. (B) Giorno 1 (D1) distribuzione delle dimensioni degli isolotti determinata da misurazioni automatizzate basate su immagini sugli stessi contenitori standardizzati delle dimensioni IEQ. (C) Correlazione dei conteggi tra la quantificazione manuale del D0 e la quantificazione automatica del D1 tra i contenitori della dimensione IEQ. (D) Diagramma a scatola della distribuzione dei diametri degli isolotti tra D0 e D1 per misurazioni automatizzate della stessa placca. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Purezza (contenuto endocrino vs. esocrino)

Colorazione con ditizone (DTZ)

Su D1, un'aliquota di isolotti (n = 451) è stata colorata con DTZ per 30 secondi a temperatura ambiente e immediatamente fotografiata con microscopia a campo chiaro (obiettivo 4×; esposizione 1/20 s). Alle Fiji, i pixel di sfondo furono rimossi in modo che l'area residua dei pixel corrispondesse all'area totale dell'isolotta. Le regioni esocrine DTZ-negative, identificate da un contrasto di colore più scuro, venivano selezionate manualmente tramite uno strumento lasso, e l'area di ciascuna regione di interesse veniva automaticamente registrata in pixel. La purezza endocrina è stata calcolata come la percentuale di pixel DTZ positivi rispetto al totale dei pixel dell'isolotto, ottenendo una purezza di 98,56 ± 0,38% (Figura 5A).

Fattibilità e prestazioni funzionali

Secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS)

Ad ogni punto temporale (D1, D3, D7), 15 isolotti di dimensioni abbinate venivano selezionati a mano e posizionati in singoli pozzi di una piastra a 24 pozzi, preparati in quadruplicate. Gli isolotti sono stati incubati a 37 °C 5% CO2 nel tampone di Krebs sotto un protocollo di stimolazione del glucosio basso-alto-basso: prima in glucosio basso (2,8 mM, 60 min), seguito da un glucosio alto (16,7 mM, 60 min, vedi Tabella 1). Le frazioni di effluente sono state raccolte alla fine di ogni periodo di incubazione e le concentrazioni di insulina sono state quantificate utilizzando un saggio ELISA sull'insulina di ratto. Gli indici di stimolazione sono stati calcolati come il rapporto di secrezione di insulina durante condizioni di glucosio alto a basso. Gli indici di stimolazione erano 9,37, 8,34 e 6,7, rispettivamente nei giorni 1, 3 e 7, senza differenze significative (Figura 5B).

Macchiatura viva/morta

A D1, D3 e D7, 15 isolotti furono selezionati a mano e colorati con il kit di vitalità Live/Dead secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, gli isolotti sono stati incubati nella soluzione di colorazione Live/Dead per 30 minuti a 25 °C, poi fotografiati sotto impostazioni coerenti al microscopio per garantire la comparabilità tra i punti temporali (obiettivo 4X; esposizione 1/30 s, filtri Texas Red e GFP). La vitalità è stata quantificata utilizzando uno script Python che impiegava scikit-image per la segmentazione degli isolotti e la misurazione della fluorescenza. Gli isolotti sono stati identificati combinando i canali di fluorescenza verde e rosso, applicando il metodo di soglia di Li per generare una maschera binaria e utilizzando la segmentazione del bacino idrografico per separare gli isolotti che si toccano. Gli oggetti venivano filtrati per area per escludere detriti e reperti. Per ogni isolot, la fattibilità è stata calcolata come la percentuale di densità integrata viva (pixel verdi) rispetto alla densità integrata totale (pixel verdi più rossi). I risultati hanno mostrato una vitalità del 68 ± 9% a D1, 98,2 ± 0,6% a D3 e 100% a D7. Un campione di controllo positivo trattato con etanolo al 70% per 10 minuti ha mostrato una vitalità del 2,7 ± 7,2% (vedi Figura 5C-F).

Figura 5
Figura 5: Valutazione della purezza, della vitalità e della reattività funzionale degli isolini. Immagini rappresentative e riassunti quantitativi delle caratteristiche degli isolotti isolati nel tempo. (A) Immagine rappresentativa del 10× campo chiaro degli isolotti colorati con ditizone (DTZ), mostrando isolotti endocrini colorati di rosso e tessuto esocrino non colorato. (B) Valori di secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) dell'indice di stimolazione ad alto glucosio/basso glucosio (HG/LG) per i giorni 1, 3 e 7. (C-E) Immagini fluorescenti vive e morte degli isolotti al Giorno 1 (C), Giorno 3 (D) e Giorno 7 (E). (F) Immagine fluorescente viva/morta di isolotti a controllo positivo trattati con etanolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

(A) Materiale per lavaggio
ComponenteConcentrazione finaleImporto (mL)
RPMI 1640-500 mL
Siero bovino fetale10%50 mL
Pen-Streptococco (10.000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES25 mM12,5 mL da 1M stock
L-glutamina2 mM5 mL da calcio da 200 mM
(B) Media della cultura degli isoli
ComponenteConcentrazione finaleQuantità (mL o g)
RPMI 1640, nessun glucosio-500 mL
Siero bovino fetale10%50 mL
Pen-Streptococco (10.000 U/mL)1%5,5 mL
HEPES20 mM11 mL da stock 1M
Piruvato di sodio1 mM5,5 mL da materiale da 100 mM
Glucosio5,5 mM2,75 mL da calcio da 200 g/L
(C) Soluzione per risciacquo con penicillina e streptomicina
ComponenteConcentrazione finaleQuantità (mL o g)
Soluzione salina, 0,9%-500 mL
Sreptomicina penicillina (10.000 U/mL)2%10 mL
(D) Tamponamento di Estinzione
ComponenteConcentrazione finaleQuantità (mL o g)
HBSS-500 mL
Siero bovino fetale20%100 mL
HEPES (1 M)2.50%2,5 mL
(E) Buffer di Krebs
ComponenteConcentrazione finaleQuantità (mL o g)
dH 2O-975 mL
NaCl115 mM6,72 g
NaHCO324 mM2,02 g
KCl5 mM0,3728 g
HEPES (1 M)25 mM25 mL
MgCl21 mM0,0952 g
BSA0.10%1 g
CaCl22,5 mM0,2775 g

Tabella 1: Lista delle soluzioni. Composizione e preparazione dettagli per tutte le soluzioni utilizzate durante il protocollo di isolamento e purificazione dell'isoletto. Ogni sottosezione elenca i componenti, le concentrazioni finali, i volumi di preparazione e i numeri di catalogo. (A) Substrato per lavaggio, usato per risciacquare e lavare il tessuto durante la digestione e la purificazione. (B) Mezzi di Coltivazione degli Isolotti, utilizzati per la manutenzione e la vitalità post-isolamento. (C)Soluzione di risciacquo penicillina-streptomicina, usata per sterilizzare e risciacquare il pancreas raccolto. (D) Tampone di tempra, utilizzato per interrompere la digestione enzimatica e preservare la vitalità cellulare. (E) Krebs Buffer, utilizzato durante i saggi GSIS (Glucos-stimulated Insulin) Secretion Buffer.

Numero di pancreasCollagenasi (15,38 mg/mL)Termolisina (1 mg/mL)DNAse (100 mg/mL)Buffer funzionante600 mL Bechers da usareVolume/Becher
304,5 mL2,25 mL450 μL450 mL525 mL
243,6 mL1,8 mL360 μL360 mL425 mL
203 mL1,5 mL300 μL300 mL325 mL
162,4 mL1,2 mL240 μL240 mL225 mL
121,8 mL0,9 mL180 μL180 mL225 mL
101,5 mL0,75 mL150 μL150 mL225 mL
Conc. finale0,15 mg/mL5 mg/mL0,1 mg/mL

Tabella 2: Soluzione enzimatica digestiva per quantità di pancreas. Volumi di collagenase, termolisina e DNasi necessari per preparare il Mezzo di Dissociazione Operativo (WDM) per diversi numeri di pancreas di ratto. Le concentrazioni finali di ciascun enzima sono elencate in fondo alla tabella.

Numero di pancreasTubi numero 50 mLVolume/siringaNumero di 1.096 siringheNumero di 1.068 siringhe
3010 valvole50 mL22
248 tubi40 mL22
206 valvole30 mL22
164 tubi40 mL11
124 tubi40 mL11
102 valvole20 mL11

Tabella 3: Carico gradiente per quantità del pancreas. Numero di tubi conici da 50 mL e volumi gradienti corrispondenti richiesti per la purificazione degli isolini, in base al numero di pancreas lavorati.

Intervallo del diametro dell'isolotto (μm)Numero di particelle dell'isolotto (AI)Fattore di conversione IEQIEQ per intervallo
50-100a* 0.167a * 0.167
101-150b* 0.648b * 0,648
151-200c* 1.685c * 1.685
201-250d* 3.500d * 3.500
251-300e* 6.315e * 6.315
301-350f* 10.352f * 10.352
> 350g* 15.833g * 15.833

Tabella 4: Conversione di equivalenza degli isolini. La conversione dei diametri degli isolotti varia in equivalenti standardizzati degli isolotti (IEQ). La tabella elenca i contenitori osservati nel diametro degli isolini, il numero di particelle di isolotti per intervallo, il corrispondente fattore di conversione IEQ per ogni intervallo di dimensioni e il contributo IEQ risultante per intervallo.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea un approccio ad alto rendimento per isolare e purificare isolotti pancreatici dai ratti Lewis. Il successo del metodo dipende da diversi passaggi critici che preservano collettivamente l'integrità e la funzione degli isolotti. Tra questi vi sono la perfusione intraduttale precisa e completa del pancreas, la pulizia attenta del pancreas perfuso e il tempo esatto di digestione enzimatica. Una perfusione costante dell'organo intero è fondamentale per ottenere una distensione uniforme del pancreas e garantire una distribuzione uniforme della miscela collagenase-termolisina-DNasi, che agisce rispettivamente digerendo la matrice extracellulare, migliorando la penetrazione degli enzimi e riducendo la viscosità mediata dal DNA21,22. La sotto-perfusione può causare una digestione tessutale incompleta e la perdita di una parte significativa degli isolotti, poiché il tessuto sottodigerito viene filtrato con il setaccio. Allo stesso modo, una rimozione inadeguata del tessuto adiposo o vascolare prima della digestione può introdurre impurità non endocrine che riducono la purezza. Infine, una digestione prolungata porta alla desegregazione degli isolotti a causa di eccessivo rottura della matrice extracellulare, mentre una digestione subottimale produce tessuto non digerito resistente alla digestione meccanica tramite ago spinale. Questi passaggi rappresentano le trappole tecniche più frequenti e dovrebbero essere monitorati attentamente durante l'addestramento e l'ottimizzazione.

Sebbene questo metodo sia stato progettato specificamente per i ratti Lewis, probabilmente può essere adattato ad altri ceppi o specie attraverso una piccola riottimizzazione del tempo di digestione e del rapportoenzimatico 23,24,25,26. Alcuni laboratori possono scegliere di modificare il rapporto tra collagenasi, termolisina e DNasi I nel Mezzo di Dissociazione di Lavoro (WDM) per ottimizzare la resa in base alle caratteristiche specifiche del lotto enzimatico o del tessuto. Per farlo, i laboratori possono seguire attentamente la guida passo dopo passo del produttore per l'ottimizzazione di enzimi e tessuti e, in ogni caso, evitare di aggiungere componenti come 0,1 M EDTA, cisteina, mercaptoetanolo, inibitori della proteasi, siero o albumina, poiché questi potrebbero inibire collagenasi, termolisina e l'attività enzimaticaDNasi 1 27. Sebbene non sia stato pubblicato un tempo di lavoro definitivo per la miscela enzimatica prima della dissociazione, dati precedenti mostrano che la conservazione a freddo prolungata del pancreas influisce negativamente sulla resa e la funzione degliisoli 28. Empiricamente, abbiamo riscontrato che, nel nostro protocollo, gli isolamenti riusciti venivano costantemente ottenuti quando il tempo totale di ischemia fredda, definito come l'intervallo tra la posazione del primo pancreas sul ghiaccio per la pulizia e il trasferimento nel bagno d'acqua a 37 °C, veniva mantenuto sotto 1,5 ore. Un'ulteriore ottimizzazione di questo parametro può essere giustificata a seconda dell'applicazione dell'utente finale.

Nonostante la sua robustezza, questo protocollo presenta diverse limitazioni pratiche e tecniche. Innanzitutto, la miscela enzimatica (collagenasi, termolisina e DNasi I) e i gradienti di densità sono essenziali per una dissociazione tissutale efficiente e per l'isolamento degli isolini, ma comportano costi significativi. La nostra selezione della combinazione enzimatica è stata influenzata dalle caratteristiche strutturali della matrice extracellulare pancreatica e dalla necessità di bilanciare una dissociazione tessutale efficace con la conservazione dell'integrità degli isoli. Ogni componente enzimatico svolge un ruolo distinto: la collagenasi prende di mira i collageni fibrillari e della membrana basale per liberare gli isoletti; la termolisina, una proteasi neutra, taglia le proteine della matrice non collagena e le molecole di adesione cellula-cellula, riducendo l'esposizione necessaria alla collagenasi; e DNasi I minimizza la viscosità causata dal DNA rilasciato dalle cellulelisate 29,30,31. Sebbene formulazioni di enzimi digestivi a basso costo siano disponibili in commercio, la loro purezza è variabile e può compromettere le prestazionienzimatiche 13,23. Dato che la collagenasi è isolata dalle colture batteriche, ulteriori passaggi di purificazione riducono la contaminazione da endotossine ma aumentano sostanzialmente icosti.

Per la collagenase, raccomandiamo preparazioni con un'attività di circa 2.000-4.000 unità Wünsch per bottiglia, che favoriscono una dissociazione efficiente a dosaggio moderato evitando una digestione prolungata. In particolare, la miscela dovrebbe includere un rapporto equilibrato tra collagenasi classe I e classe II, corrispondente a una frazione di collagenasi II/collagenasi totale di circa 0,3-0,5. Questo rapporto garantisce una forte attività collagenolitica limitando al contempo l'eccessiva degradazione della matrice extracellulare non collagena. Inoltre, la miscela di collagenasi dovrebbe essere integrata da un livello moderato di attività proteasi neutra (circa 150.000-250.000 unità) e DNasi, per le ragioni già espresse.

Dal punto di vista del controllo qualità, ogni lotto dovrebbe includere documentazione di basso carico di endotossine (≤50 EU/mg di proteina), alta purezza enzimatica (≥85% secondo HPLC) e attività verificata da lotto a lotto, poiché la purezza e la composizione degli enzimi possono variare notevolmente a seconda del produttore. Infine, variazioni nella composizione dei lotti possono influire sulla consistenza della digestione e sul rendimento degli isolotti, rendendo necessaria la validazione interna specifica per lotto. Tale validazione può essere ottenuta seguendo le condizioni di digestione standardizzate descritte in questo protocollo e successivamente valutando l'efficienza digestionale e la morfologia degli isolini. Gli indicatori di prestazioni enzimatiche subottimali includono dissociazione tissutale incompleta, isolotti con bordi irregolari o ruvidi, o la necessità di una tecnica meccanica eccessiva per ottenere la separazione, nel qual caso può essere necessaria la titolazione del tempo di digestione.

Considerazioni simili si applicano ai gradienti di densità. Abbiamo selezionato un gradiente a base di polisaccarosio, un copolimero saccarosio-epicloridrina non ionico, altamente idrofilo, che forma gradienti stabili fino a 1,2 g/mL e ha un lungo curriculum nell'isolamentodelle isole 32,33. Lo iodixanolo è un'alternativa ben validata, e studi sugli isolotti umani dimostrano che i gradienti basati sull'iodisxanolo possono migliorare il recupero degli isolotti mantenendo al contempo la vitalità e la funzione 34,35,36,37. Tuttavia, i dati sui roditori sono inconcludenti, con alcuni studi che riportano risultati superiori utilizzando lo iodixanolo e altri che dimostrano una migliore vitalità e funzionalità con gradienti basati sullapolisaccarosio 32,35. In modo cruciale, si raccomanda l'uso di soluzioni di gradiente prodotte commercialmente e controllate dalla qualità per migliorare la riproducibilità nei laboratori. I gradienti a base di polisaccarosio sono ampiamente disponibili a densità ottimali per l'isolamento degli isolini, mentre i gradienti di iodixanolo sono tipicamente preparati tramite diluizione interna, introducendo ulteriore variabilità. Una seconda limitazione è che il prelievo chirurgico richiede un alto livello di competenza tecnica, in particolare per la perfusione intraductale tramite lo sfintere di Oddi e l'escissione rapida del pancreas. Anche piccoli ritardi o disallineamenti possono causare danni ai tessuti, perdite, perfusioni disomogenee o ischemia calda prolungata, che possono compromettere la resa e la vitalità degli isolini. Per mitigare questa limitazione, il protocollo include descrizioni procedurali dettagliate e ausili grafici originali con punti di riferimento anatomici codificati a colori per facilitare la comprensione. Si incoraggia i nuovi operatori a familiarizzare con la tecnica di perfusione prima di eseguire isolamenti completi, e si consiglia pratica sulle carcasse prima di tentare la raccolta viva.

In terzo luogo, per la massima efficienza, questo protocollo richiede un lavoro di squadra coordinato. Durante il prelievo del pancreas e la digestione enzimatica, sono tipicamente necessari tre operatori formati: uno che esegue la chirurgia sterile, uno che pulisce il pancreas in condizioni sterili e uno che fa circolazione ed eutanasia gli animali in condizioni non sterili. Dopo la digestione, i passaggi di purificazione a valle possono generalmente essere eseguiti da meno operatori una volta raggiunta la competenza. Sebbene questo coordinamento rappresenti una domanda logistica iniziale, consente l'isolamento di molti isolotti da più animali in un arco di tempo relativamente breve, migliorando la capacità complessiva rispetto a flussi di lavoro meno coordinati. Sebbene questo protocollo sia tecnicamente impegnativo e richieda molte risorse, queste limitazioni sono comuni a tutti i metodi di isolamento degli isolini. Enfatizzando condizioni di digestione standardizzate, formazione strutturata e esecuzione coordinata, questo approccio ad alta produttività può ridurre il tempo e il lavoro per isolamento e ottenere risultati coerenti e riproducibili quando eseguito da un team formato.

Rispetto ai protocolli convenzionali di isolamento degli isoli di roditori, questo metodo offre notevoli vantaggi in termini di debito, riproducibilità e coerenza. Le digestioni tradizionali a organo singolo si basano fortemente sulla selezione manuale e spesso producono purezzavariabile 13. Al contrario, il nostro protocollo utilizza digestione aggregata e purificazione con gradiente di densità, riducendo sostanzialmente i tempi di preparazione e la variabilità tra campioni, mantenendo al contempo un'elevata vitalità e reattività funzionale degli isoli. Gli isolotti isolati sono stati caratterizzati in modo completo per morfologia (colorazione con ditizone), vitalità (analisi viva/morta) e funzione (secrezione di insulina stimolata dal glucosio), confermando la robustezza del metodo. Collettivamente, questo flusso di lavoro standardizzato consente la generazione di abbondanti, pulite e funzionali preparazioni di isolotti adatte per applicazioni a valle, inclusi incapsulamento, trapianto e modellazionemicrofisiologica 38,39,40. È importante sottolineare che isolotti di ratti di Lewis isolati con questa tecnica hanno invertito il diabete nei modelli preclinici, sottolineando la rilevanza traslazionale di questo approccio riproducibilee scalabile 41.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.G. è cofondatore e principale consulente scientifico di Continuity Biosciences, LLC. A.G., J.P-M. e C.Y.X.C. sono inventori di proprietà intellettuali concesse in licenza da continuity Biosciences, LLC. Tutti gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dai National Institutes of Health (NIH) R01DK133610-01 (A.G., N.K.) e NIH NIDDK R01DK132104 (A.G.), Breakthrough T1D SRA-2021-1078-S-B (AG) e SRA-2022-1224-S-B (A.G., N.K.), e dalla Vivian L. Smith Foundation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
21 G x 2 in. Ago BD PrecisionGlideBD305129
500 & micro; m Telaio in ottone e schermo in acciaio inox 304, diametro 3" x 1" di profondità (setaccio numero 35)McMaster-Carr34735K525
Siringhe Air-Tite sterili, serratura LuerFisher Scientific14-817-178
Biogel PI UltraTouch MMö Inlycke42665
Forbici di Bonn; Straight; Punte affilate; Lunghezza della lama di 15 mm; 3 1/2" di lunghezza totaleRobozRS-5840
Braintree Scientific GERMINATOR 500 DRY STERILFisher ScientificNC9956482
Serie Cell-IQ 5,8 piedi cubi. Incubatore di laboratorio CO2PHCBIMCO-170AICUVHL-PA
Piatto di coltura Corning 100 mm Non trattato con TCCorning430591
Siero fetale bovino Corning, 500 mL, normale, test USDA per la sicurezza (inattivato dal calore)Corning35011CV
Gradiente dell'isolotto di Corning 1,069 (densità 1,069 g/cm3)Corning99-815-CISRichiede una richiesta speciale da parte dell'azienda
Gradiente dell'isole di Corning 1,096 (densità 1,096 g/cm3)Corning99-691-CISRichiede una richiesta speciale da parte dell'azienda
Gradiente dell'isola di Corning 1,108 (densità 1,108 g/cm3)Corning99-692-CISRichiede una richiesta speciale da parte dell'azienda
Sottocuscinetti Covidien TendersorbFisher Scientific22-225-102
DNasi I Grado IIRoche10104159001
Falcon  Tubi centrifughe conici ad alta chiarezza da 50 mLFisher Scientific14-432-22
Lamina di alluminio Fisherbrand, rotolo a scartamento standardFisher Scientific01-213-100
Fisherbrand  Spugne di garza non tessuteFisher Scientific22-028-559
Bechers Fisherbrand in vetro riutilizzabile, resistenti e a bassa formaFisher ScientificFB101600
Mircoscopio a fluorescenza  BZ-X810KeyenceBZ-X810
Soluzione di glucosioGibcoA2494001
Portaago micro HalseyStrumenti scientifici di qualità12500-12
HBSS, calcio, magnesio, niente fenolo rossoGibco14025092
HEPES (1 M)Gibco15630080
Pinza Emostatica Classic Crile Lunghezza 5-1/2 PolliceMcKesson1231217
Pinza Hudson (Ewald)RobozRS-5238
Agolo ipodermico monoject lunga 1-1/2 pollice Parete regolare calibro 16 senza sicuraMcKesson43481
L-Glutamina (200 mM)Gibco25030081
Liberase T-Flex, Grado di RicercaRoche5989132001
Kit di VITALITÀ/MORTO/Citotossicità, per cellule di mammiferiInvitrogen  L3224
Pacchetto software MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
Pompa a siringa programmabile NE-4000 a due canaliPompa a siringaNE-4000-US
AGO, IPOTIRO FORZA DISP 27GX1/2" (100/BX) EXLINTMcKesson408877
Nunc coltura cellulare/piastre di PetriTermo-Scientifico174926
Microscopio a contrasto di fase invertito Olympus CKX41OlympusCKX41-B
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicilina' Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
RPMI 1640Gibco11875093
RPMI 1640, nessun glucosioGibco11879020
Piruvato di sodio (100 mM)Gibco11360070
Piruvato di sodio (stock da 100 mM)Gibco11360070
Sorval ST 16RTermo-Scientifico75004381
Ago per siringa 304 in acciaio inoxMilipore SigmaZ117013-1EA
PANNO CHIRURGICO, USA E GETTA, 36 IN X 100 YDCovetrus10408
Forbici chirurgiche - ToughCutStrumenti scientifici di qualità14054-13
Pinza per fasciatura per il pollice da 4,5" con una larghezza delicata della punta di 1,3 mmRobozRS-8120
Tubo centrifuga Thermo Scientific Nunc da 200 mLTermo-Scientifico14-962-17
Adattatori e cuscini per bottiglie centrifughe Thermo Scientific NuncTermo-Scientifico12-565-283B
TSDUB15 15L Dubnoff Bagno d'acqua scuotendoFisher Scientific300610298
TX-400 Rotore a secchio oscillante 4 x 400 mLTermo-Scientifico75003181
Tygon S-50-HLTygonAAXoooo3
Kit ELISA per insulina ultrasensibile per rattiChimica a Cristallo90060

Riferimenti

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