Articolo di ricerca
Il gate poligonale (PGG) e il gating cruciforme (CFG) sono metodi di citometria a flusso per rilevare l'integrità del DNA degli spermatozoi. Il PGG misura l'indice di frammentazione del DNA (DFI) e l'alto indice di colorazione del DNA (HDS). Il CFG riporta DFI grave, DFI lieve e DFI complessivo. Questo studio mira a confrontare i risultati e le correlazioni tra di essi.
L'integrità del DNA spermatozoo è un fattore chiave per garantire una fecondazione di successo, lo sviluppo dell'embrione e la gravidanza continua. La valutazione della struttura della cromatina spermatozoica (SCSA) utilizzando citometria a flusso dopo la denaturazione del DNA e la colorazione con acridina arancione è considerata il metodo standard per valutare il DNA degli spermatozoi. In letteratura sono state riportate due strategie di gating per la valutazione basata sulla citometria a flusso dell'indice di frammentazione del DNA dello spermatozoo (DFI): la via poligonale (PGG) e la cancellazione cruciforme (CFG). L'obiettivo del presente studio era confrontare le relazioni tra i risultati del saggio tra PGG e CFG, e analizzare le loro correlazioni con i parametri dell'analisi seminale di base. I dati ottenuti indipendentemente dai due metodi sono stati confrontati utilizzando analisi statistiche, inclusi grafici Bland-Altman e analisi di regressione. Un totale di 121 pazienti ambulatoriali maschi sottoposti a valutazione della fertilità presso il centro riproduttivo del nostro ospedale sono stati selezionati tramite un metodo di campionamento completamente casuale. Il DFI degli spermatozoi e gli indicatori correlati sono stati rilevati tramite citometria di flusso utilizzando rispettivamente PGG e CFG. I risultati hanno dimostrato che i valori DFI ottenuti dai due metodi mostravano una buona concordanza. I coefficienti di correlazione tra DFIp del metodo PGG e DFIm, DFI e DFIc del metodo CFG erano rispettivamente 0,6497, 0,9404 e 0,9667 (tutti p < 0,01). Un alto indice di colorazione del DNA (HDS) ha mostrato una leggera correlazione negativa con le DFI (r = -0,3042, p < 0,05). La percentuale di spermatozoi progressivamente mobili era negativamente correlata con DFIp, DFI e DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, rispettivamente, tutti p < 0,05). Non è stata osservata alcuna correlazione significativa tra HDS e volume di sperma, concentrazione di spermatozoi, numero totale di spermatozoi o PR (%). Questi risultati indicano che i DFI sono più strettamente associati alla fertilità maschile, suggerendo che il metodo CFG, che fornisce questo parametro, potrebbe essere più adatto per la valutazione clinica del danno al DNA spermatozoo.
L'integrità del DNA dello spermatozoo si riferisce all'integrità e alla stabilità funzionale della struttura molecolare del DNA nel nucleo dello spermatozoo. In particolare, è caratterizzata dalla conformazione normale della cromatina, sequenze di basi intatte senza rotture o danni ossidativi e la capacità di trasmettere con precisione informazioni genetiche alla prole. Durante la spermatogenesi, quando lo stress ossidativo aumenta1, il rimodellamento della cromatina èanomalo 2, oppure lo spermatozoo è influenzato da tossineambientali 3, l'integrità del DNA spermatozoo viene danneggiata, causando disadattamento delle basi, perdita, modifiche, aggiunta e reticolazione del DNA, rotture a singolo filamento e doppio filamento, ecc. Inoltre, il DNA degli spermatozoi danneggiato può compromettere la fertilità maschile e influire negativamente sugli esiti della gravidanza nella tecnologia di riproduzione assistita (ART)4, aumentando al contempo il rischio di perdita gestacionalericorrente 5. Nel 2021, l'Associazione Europea di Urologia (EAU) ha raccomandato l'inclusione dei test DFI nel sistema di valutazione della fertilitàmaschile 6.
Attualmente, l'integrità del DNA spermatozoo viene valutata principalmente rilevando l'indice di frammentazione del DNA (DFI) dello spermatozoo. Il saggio sulla struttura della cromatina spermatozoida (SCSA) tramite citometria di flusso è il metodo principale per valutare ilDFI 7. In letteratura sono stati riportati due metodi di gating per la citometria a flusso per la rilevazione del DFI spermatozoide. Uno è il metodo del gating poligonale (PGG), che può segnalare simultaneamente due indicatori chiave, come il DFI dello spermatozoo el'HDS 8. PGG è un approccio classico SCSA caratterizzato da un coefficiente di variazione di rilevamento più basso e una ripetibilitàsuperiore 9. Tuttavia, non può distinguere la gravità del danno al DNA. Un altro tipo è il metodo di cancellazione crociforme (CFG), che può riportare un marcatore di danno grave del DNA spermatozoo (DFI), un marcatore di danno lieve del DNA spermatozoide (DFIm) e il DFI totale del metodo di cancellazione crociforme (DFIc). DFIc è uguale alla somma delle DFI e delle DFIm. Rispetto alle tecnologie attuali per la valutazione dell'integrità del DNA degli spermatozoi, il metodo CFG può riflettere la gravità del danno al DNAspermatozoide 10.
Per determinare quale metodo sia più adatto alla valutazione della qualità degli spermatozoi, questo studio ha utilizzato sia il metodo PGG che il metodo CFG per misurare il DFI e i parametri correlati negli spermatozoi. È stata confrontata la correlazione tra i risultati di questi due metodi e i parametri convenzionali di analisi del seme. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio ad analizzare la correlazione dei risultati di rilevamento tra le due metodologie, PGG e CFG.
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Questo studio è stato approvato dal Medical Ethics Committee dell'Ospedale Affiliato Huai'an First People's Hospital dell'Università Medica di Nanchino (Numero di approvazione: KY-2024-181-01). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni sono stati utilizzati in questo studio. Diagramma schematico complessivo del flusso di lavoro presentato nella Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono descritti nella Tabella dei Materiali.
Impostazioni del CFG per il citometro a flusso
Dopo il trattamento acido, la cromatina nucleare degli spermatozoi con DNA danneggiato mostra DNA a singolo filamento, mentre la cromatina nucleare degli spermatozoi con DNA non danneggiato mantiene la sua struttura intatta a doppio filamento. Il colorante fluorescente acridina arancione (AO) si lega al DNA a singolo filamento ed emette fluorescenza rossa quando eccitata da un laser a 488 nm. Quando è legato al DNA doppio filamento, emette fluorescenza verde quando è eccitato da un laser da 488 nm. In base al numero di segnali fluorescenti rossi e verdi catturati dal citometro di flusso, si calcola il rapporto tra fluorescenza rossa e fluorescenza totale di rosso e verde, che rappresenta il DFI dello spermatozoo.
Le impostazioni CFG sono state implementate secondo la panoramica fornita da Yang et al.10. Il citometro di flusso dovrebbe essere configurato usando la fluorescenza verde più bassa e la fluorescenza rossa più alta misurata negli spermatozoi normali colorati in O come riferimenti al confine (Figura 2). Di seguito è riportato un elenco delle caratteristiche cellulari di ciascun quadrante nel CFG:
Il quadrante Q1 indica spermatozoi normali. È stato osservato che il DNA dello spermatozoo era intatto e la quantità di legame di AO era minima, con conseguente fluorescenza verde.
Gli spermatozoi nel quadrante Q2 hanno DNA parzialmente frammentato e appaiono arancioni sotto microscopia a fluorescenza. Tale DNA può essere riparabile, ma questi spermatozoi sono classificati come dotati di una frammentazione del DNA lieve (DFIm)10.
Il quadrante Q3 è definito come la fluorescenza non specifica che ha subito sottrazione.
Gli spermatozoi nel quadrante Q4 hanno DNA frammentato e appaiono rossi sotto microscopia a fluorescenza, indicando una grave frammentazione del DNA (DFI).
Si propone che gli spermatozoi nei quadranti Q2 e Q4 contengano entrambi DNA frammentato, e la loro somma sia definita come DFIc.
Impostazioni del PGG per il citometro a flusso
Il gate poligonale per l'analisi citometrica a flusso è stato stabilito seguendo il metodo descritto da Evenson et al.8. Come mostrato nella Figura 3, le caratteristiche cellulari associate a ciascun gate sono le seguenti:
P3 indica la percentuale di cellule con DNA denaturato.
P4 rappresenta lo spermatozoo con alta colorabilità del DNA (HDS). Questo gruppo di spermatozoi manca del normale scambio tra istones e protamine.
Le popolazioni cellulari predominanti situate al di fuori delle porte P3 e P4 sono composte da spermatozoi normali, che mostrano una fluorescenza rossa ridotta e prevalentemente emittente fluorescenza verde.
Raccolta e analisi dei campioni di sperma
Tutti i 121 campioni di sperma provenivano dagli uomini che hanno visitato il Centro Riproduttivo del Primo Ospedale di Huai'an affiliato all'Università Medica di Nanchino. I campioni di sperma sono stati raccolti masturbandosi dopo un periodo di astinenza di 2-7 giorni. L'analisi di routine dello sperma è stata condotta rigorosamente in conformità con i requisiti del Manuale di Laboratorio OMS per l'Esame e la Lavorazione dello Sperma Umano11,12. Le analisi della concentrazione e motilità degli spermatozoi sono state effettuate utilizzando un sistema di analisi degli spermatozoi assistito da computer (CASA). Ogni campione è stato analizzato due volte. I risultati venivano riportati come media solo quando la differenza tra i due risultati rientrava nell'intervallo di confidenza del 95%; altrimenti sono stati effettuati ricampionamenti e analisi.
Analisi DFI
Calcola il volume di campione richiesto per il campione di sperma in modo che la concentrazione finale di spermatozoi nel reagente A del kit di citometria a flusso sia 2–3 x 106/mL. Metodo di calcolo: Assumendo che la concentrazione di spermatozoi nel campione originale sia M x 106/mL, allora il volume di sperma richiesto (μL) = 150/M. Aggiungere il volume di sperma calcolato a un tubo del citometro a flusso, poi aggiungere 50 μL di reagente A e mescolare delicatamente. Aggiungi 100 μL di reagente B, mescola delicatamente e incuba per 30 secondi a temperatura ambiente. Aggiungi immediatamente 300 μL di reagente C e mescola delicatamente. Rilevare il campione usando CFG e PGG sul citometro di flusso e analizzare almeno 5000 spermatozoi.
Analisi statistica
I dati sono stati sottoposti ad analisi statistiche utilizzando GraphPad Prism 6.0. I grafici Bland-Altman sono stati costruiti per valutare il livello di concordanza tra PGG e CFG calcolando la media e le differenze. Le differenze tra i due metodi sono state rappresentate in relazione ai loro valori medi. Inoltre, il metodo Pearson è stato utilizzato per analizzare la correlazione tra PGG e CFG. È stato stabilito che un valore p inferiore a 0,05 era statisticamente significativo.
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Tra i 121 partecipanti allo studio (età media: 32,5 ± 4,9 anni; intervallo: 26–44 anni), 28 sono stati diagnosticati con astenozoospermia e 4 con oligozoospermia. Le caratteristiche demografiche di base e i parametri dell'analisi del seme sono riassunti nella Tabella 1.
Come dimostrato nella Figura 4, il grafico di Bland-Altman ha rivelato che i risultati DFI degli spermatozoi ottenuti con i metodi PGG e CFG mostr...
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La 6ª edizione del Manuale di Laboratorio OMS per l'Esame e l'Elaborazione dello SpermaUmano 12 raccomanda quattro metodi per valutare l'integrità del DNA degli spermatozoi: marcatura terminale della deossinucleotiltransferasi (dUTP) con targhetta terminale (TUNEL), saggi di elettroforesi in gel a singola cellula (Comet), SCSA e test di dispersione della cromatina spermatozoica (SCD). Tra questi, SCSA è stato ampiamente adottato nei laboratori andrologici grazie a...
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di analisi dello sperma assistito da computer | Beijing Suijia Software Co., Ltd | SA-II | |
| Citometria a flusso | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd | Cyto E6 | |
| Kit per citometria a flusso | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | ||
| Camera di conteggio Makler | Sefi Medical Instruments | ||
| Kit per l'integrità del DNA del nucleo spermatico | Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD | - |
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