Confronto dei risultati dell'analisi del DNA degli spermatozoi utilizzando diverse strategie di selezione nella citometria a flusso

Summary

Il gating poligonale (PGG) e il gating a croce (CFG) sono metodi di citometria a flusso per la rilevazione dell'integrità del DNA spermatico. Il PGG misura l'indice di frammentazione del DNA (DFI) e l'indice di colorazione del DNA ad alta densità (HDS). Il CFG riporta DFI grave, DFI lieve e DFI complessivo. Questo studio mira a confrontare i risultati e le correlazioni tra di essi.

Abstract

L'integrità del DNA spermatico è un fattore chiave per garantire una fecondazione di successo, lo sviluppo dell'embrione e la prosecuzione della gravidanza. La valutazione della struttura del cromatina spermatica (SCSA) mediante citometria a flusso dopo la denaturazione del DNA e la colorazione con acridina arancione è considerata il metodo di riferimento per valutare il DNA spermatico. Due strategie di gate per la valutazione basata sulla citometria a flusso dell'indice di frammentazione del DNA spermatico (DFI) sono state riportate in letteratura: gate poligonali (PGG) e gate a croce (CFG). Lo scopo del presente studio era confrontare le relazioni tra i risultati dei test tra PGG e CFG e analizzare le loro correlazioni con i parametri dell'analisi di base dello sperma. I dati ottenuti indipendentemente con i due metodi sono stati confrontati utilizzando un'analisi statistica, inclusi i grafici di Bland-Altman e l'analisi di regressione. Un totale di 121 pazienti maschi in visita ambulatoriale sottoposti a valutazione della fertilità presso il centro riproduttivo del nostro ospedale sono stati selezionati mediante un metodo di campionamento completamente casuale. L'DFI spermatico e gli indicatori correlati sono stati rilevati mediante citometria a flusso utilizzando rispettivamente PGG e CFG. I risultati hanno dimostrato che i valori DFI ottenuti con i due metodi hanno mostrato una buona concordanza. I coefficienti di correlazione tra DFIp dal metodo PGG e DFIm, DFIs e DFIc dal metodo CFG erano rispettivamente 0,6497, 0,9404 e 0,9667 (tutti p < 0,01). Un alto indice di colorazione del DNA (HDS) ha mostrato una leggera correlazione negativa con DFIs (r = -0,3042, p < 0,05). La percentuale di spermatozoi progressivamente mobili era negativamente correlata con DFIp, DFIs e DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, rispettivamente, tutti p < 0,05). Non è stata osservata alcuna correlazione significativa tra HDS e volume dello sperma, concentrazione degli spermatozoi, conteggio totale degli spermatozoi o PR (%). Questi risultati indicano che DFIs è più strettamente associato alla fertilità maschile, suggerendo che il metodo CFG, che fornisce questo parametro, possa essere più adatto per la valutazione clinica del danno al DNA spermatico.

Introduction

L'integrità del DNA spermatico si riferisce all'integrità e alla stabilità funzionale della struttura molecolare del DNA nel nucleo degli spermatozoi. Specificamente, è caratterizzata da una normale conformazione della cromatina, sequenze di basi intatte senza rotture o danni ossidativi e la capacità di trasmettere accuratamente le informazioni genetiche alla prole. Durante la spermatogenesi, quando lo stress ossidativo aumenta¹, il rimodellamento della cromatina è anormale², o lo sperma è influenzato da tossine ambientali³, l'integrità del DNA spermatico sarà danneggiata, risultando in incompatibilità di base, perdita, modifica, addizione di DNA e cross-linking, rotture a singolo e doppio filamento, ecc. Inoltre, il DNA spermatico danneggiato può compromettere la fertilità maschile e influenzare negativamente gli esiti delle gravidanze nella tecnologia di riproduzione assistita (ART)⁴, aumentando anche il rischio di perdita ricorrente della gravidanza⁵. Nel 2021, l'Associazione Europea di Urologia (EAU) ha raccomandato l'inclusione del test DFI nel sistema di valutazione della fertilità maschile⁶.

Attualmente, l'integrità del DNA spermatico viene valutata principalmente rilevando l'indice di frammentazione del DNA spermatico (DFI). Il test di struttura della cromatina degli spermatozoi (SCSA) mediante citometria a flusso è il metodo principale per valutare il DFI⁷. Nella letteratura sono stati riportati due metodi di citometria a flusso per il rilevamento del DFI negli spermatozoi. Uno è il metodo di gating poligonale (PGG), che può riportare simultaneamente due indicatori chiave, come il DFI degli spermatozoi e l'HDS⁸. PGG è un approccio classico SCSA caratterizzato da un coefficiente di variazione del rilevamento minore e una ripetibilità superiore⁹. Tuttavia, non è in grado di distinguere la gravità del danno al DNA. Un altro tipo è il metodo di gating a croce (CFG), che può riportare il marcatore di danno grave del DNA degli spermatozoi (DFIs), il marcatore di danno lieve del DNA degli spermatozoi (DFIm) e il DFI totale del metodo di gating a croce (DFIc). DFIc è uguale alla somma di DFIs e DFIm. Rispetto alle tecnologie attuali per valutare l'integrità del DNA spermatico, il metodo CFG può riflettere la gravità del danno al DNA degli spermatozoi¹⁰.

Per determinare quale metodo sia più adatto per valutare la qualità degli spermatozoi, questo studio ha impiegato sia il metodo PGG che il metodo CFG per misurare il DFI e i parametri correlati negli spermatozoi. La correlazione tra i risultati di questi due metodi e i parametri convenzionali dell'analisi dello sperma è stata confrontata. Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio ad analizzare la correlazione dei risultati di rilevamento tra le due metodologie, PGG e CFG.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico dell'Ospedale Huai'an First People's Hospital affiliato alla Nanjing Medical University (Numero di approvazione: KY-2024-181-01). Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti i cui campioni sono stati utilizzati in questo studio. Schema complessivo del flusso di lavoro presentato in Figura 1. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono delineati nella Tabella dei Materiali.

Impostazioni CFG per il citometro a flusso
Dopo il trattamento acido, la cromatina nucleare degli spermatozoi con DNA danneggiato mostra DNA a singolo filamento, mentre la cromatina nucleare degli spermatozoi con DNA intatto mantiene la sua struttura a doppio filamento intatta. Il colorante fluorescente acridina arancione (AO) si lega al DNA a singolo filamento ed emette fluorescenza rossa quando eccitato da un laser a 488 nm. Quando si lega al DNA a doppio filamento, emette fluorescenza verde quando eccitato da un laser a 488 nm. In base al numero di segnali fluorescenti rossi e verdi catturati dal citometro a flusso, si calcola il rapporto tra la fluorescenza rossa e il totale della fluorescenza rossa e verde, che rappresenta il DFI degli spermatozoi.

Le impostazioni CFG sono state implementate secondo la panoramica fornita da Yang et al.¹⁰. Il citometro a flusso dovrebbe essere configurato utilizzando la più bassa fluorescenza verde e la più alta fluorescenza rossa misurata negli spermatozoi normali colorati con AO come riferimenti di confine (Figura 2). Di seguito è riportato un elenco delle caratteristiche cellulari di ciascun quadrante nel CFG:
Il quadrante Q1 è indicativo di spermatozoi normali. Si è osservato che il DNA degli spermatozoi era intatto e la quantità di legame di AO era minima, risultando in fluorescenza verde.
Gli spermatozoi nel quadrante Q2 hanno DNA parzialmente frammentato e appaiono arancioni sotto la microscopia a fluorescenza. Tale DNA può essere riparabile, questi spermatozoi sono classificati come aventi una leggera frammentazione del DNA (DFIm)¹⁰.
Il quadrante Q3 è definito come la fluorescenza non specifica che ha subito una sottrazione.
Gli spermatozoi nel quadrante Q4 hanno DNA frammentato e appaiono rossi sotto la microscopia a fluorescenza, indicando una grave frammentazione del DNA (DFIs).

Si propone che gli spermatozoi nei quadranti Q2 e Q4 contengano entrambi DNA frammentato e la loro somma è definita come DFIc.

Impostazioni del PGG per il citometro a flusso
Il gate poligonale per l'analisi citometrica a flusso è stato stabilito seguendo il metodo descritto da Evenson et al.⁸. Come mostrato in Figura 3, le caratteristiche cellulari associate a ciascun gate sono le seguenti:
P3 è indicativo della percentuale di cellule con DNA denaturato.
P4 rappresenta spermatozoi con alta colorabilità del DNA (HDS). Questo gruppo di spermatozoi manca del normale scambio istone-promatina.
Le popolazioni cellulari predominanti situate al di fuori dei gate P3 e P4 consistono in spermatozoi normali, che mostrano ridotta fluorescenza rossa ed emettono principalmente fluorescenza verde.

Raccolta e analisi del campione di sperma
Tutti i 121 campioni di sperma provenivano dagli uomini che hanno visitato il Centro Riproduttivo dell'Ospedale Huai'an First affiliato alla Nanjing Medical University. I campioni di sperma sono stati raccolti masturbando dopo un periodo di astinenza di 2-7 giorni. L'analisi di routine del seme è stata rigorosamente condotta in conformità con i requisiti del Manuale di Laboratorio dell'OMS per l'Esame e l'Elaborazione del Seme Umano^11,12. L'analisi della concentrazione e della motilità degli spermatozoi è stata eseguita utilizzando un sistema di analisi computerizzata degli spermatozoi (CASA). Ogni campione è stato analizzato due volte. I risultati sono stati riportati come media solo quando la differenza tra i due risultati era entro l'intervallo di confidenza del 95%; in caso contrario, è stata eseguita una nuova campionatura e analisi.

Analisi DFI
Calcolare il volume di campione richiesto per il campione di sperma in modo che la concentrazione finale di spermatozoi nel reagente A dal kit di citometria a flusso sia 2–3 x 10⁶/mL. Metodo di calcolo: Supponendo che la concentrazione di spermatozoi nel campione di seme originale sia M x 10⁶/mL, il volume di seme richiesto (µL) = 150/M. Aggiungere il volume di seme calcolato in un tubo del citometro a flusso, quindi aggiungere 50 µL di reagente A e mescolare delicatamente. Aggiungere 100 µL di reagente B, mescolare delicatamente e incubare per 30 s a temperatura ambiente. Aggiungere immediatamente 300 µL di reagente C e mescolare delicatamente. Rilevare il campione utilizzando CFG e PGG sul citometro a flusso e analizzare almeno 5000 spermatozoi.

Analisi statistica
I dati sono stati sottoposti ad analisi statistica utilizzando GraphPad Prism 6.0. I grafici di Bland-Altman sono stati costruiti per valutare il livello di accordo tra PGG e CFG calcolando la media e le differenze. Le differenze tra i due metodi sono state rappresentate graficamente rispetto ai loro valori medi. Inoltre, il metodo di Pearson è stato utilizzato per analizzare la correlazione tra PGG e CFG. È stato determinato che un valore p inferiore a 0,05 era statisticamente significativo.

Results

Tra i 121 partecipanti allo studio (età media: 32,5 ± 4,9 anni; intervallo: 26–44 anni), 28 sono stati diagnosticati con asthenozoospermia e 4 con oligozoospermia. Le caratteristiche demografiche di base e i parametri dell'analisi dello sperma sono riassunti in Tabella 1.

Come dimostrato in Figura 4, il grafico Bland-Altman ha rivelato che i risultati del DFI dello sperma ottenuti con i metodi PGG e CFG mostravano un'eccellente coerenza (r = 0,9667, p = 0,0000). Solo due campioni mostravano discrepanze superiori al +10% e tre campioni mostravano discrepanze inferiori al -10%, con proporzioni rispettivamente dell'1,7% e del 2,5%.

Tabella 2 mostra una forte correlazione positiva tra DFIp da PGG e ciascuno dei tre parametri derivati da CFG: DFIm, DFIs e DFIc. I coefficienti di correlazione erano 0,6497, 0,9404 e 0,9667, rispettivamente, e i valori p erano tutti inferiori a 0,05. I risultati HDS rilevati dal metodo PGG mostravano una significativa correlazione negativa con DFIs e DFIc rilevati dal metodo CFG. I coefficienti di correlazione erano -0,3042 e -0,2120, rispettivamente, e i valori p erano tutti inferiori a 0,05. L'indagine non ha rivelato alcuna correlazione tra HDS e DFIm (il valore p era superiore a 0,05).

Come mostrato in Tabella 3, la percentuale di spermatozoi progressivamente mobili era significativamente negativamente correlata con DFIp, DFIm, DFIs e DFIc (tutti i valori p erano inferiori a 0,05), ma non correlata con HDS (il valore p era maggiore di 0,05). Il volume dello sperma mostrava una significativa correlazione positiva con DFIp, DFIs e DFIc (tutti i valori p erano inferiori a 0,05), ma non con HDS (il valore p era maggiore di 0,05). La concentrazione degli spermatozoi e il conteggio totale degli spermatozoi non sono risultati correlati con i risultati dell'analisi di PGG e CFG (il valore p era maggiore di 0,05).

Il metodo CFG dimostra un'eccellente coerenza con PGG per la valutazione del DFI. CFG consente la discriminazione del grado di danno al DNA e i suoi parametri DFI sono significativamente correlati con la motilità degli spermatozoi. Gli indicatori di grave danno al DNA degli spermatozoi, noti come DFIs, sono più adatti per un uso diffuso nella pratica clinica di routine.

Disponibilità dei dati:
I dataset prodotti e/o analizzati nel corso di questa ricerca incorporano dati clinici a livello del paziente e non vengono divulgati al pubblico a causa di considerazioni istituzionali sulla privacy e l'etica. Dopo aver presentato una richiesta ragionevole e ottenuto l'approvazione dal Comitato Etico dell'Ospedale Affiliato Huai'an No. 1 People's Hospital della Nanjing Medical University, l'autore corrispondente è autorizzato a fornire dati anonimi e risultati analitici. Questo studio non ha comportato lo sviluppo di codice personalizzato.

Figura 1: Diagramma schematico generale del flusso di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Gating a croce (CFG) della citometria a flusso per la rilevazione del DFI. Q1 – Spermatozoi normali. Q2 – Frammentazione del DNA lieve (DFIm). Q3 – Fluorescenza non specifica che è stata sottratta. Q4 – Frammentazione del DNA grave (DFIs). Gli spermatozoi con danno al DNA rientrano sia in Q2 che in Q4. La loro somma rappresenta la popolazione totale di spermatozoi con DNA frammentato (DFIc). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Gating poligonale (PGG) della citometria a flusso per la rilevazione del DFI. P3: spermatozoi con DNA denaturizzato. P4: Elevata tinzione del DNA (HDS) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Grafici Bland-Altman dei risultati degli assay PGG e CFG per il DFI. X - asse: Media dei risultati di misurazione ottenuti con il metodo PGG e il metodo CFG. Y - asse: Differenza nei risultati di misurazione tra il metodo PGG e il metodo CFG Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Elemento	Media±SD	Intervallo
Età (anni)	32,5±4,9	26-44
Giorni di astinenza (Giorno)	4,1±1,3	3-7
Volume dello sperma (mL)	3,8±1,6	0,5-6,8
Concentrazione degli spermatozoi (x106/mL)	52,0±35,5	1

Discussion

La sesta edizione del Manuale di laboratorio dell'OMS per l'esame e il trattamento del seme umano¹² raccomanda quattro metodi per valutare l'integrità del DNA degli spermatozoi: l'etichettatura terminale dei nick (dUTP) con la terminal deoxynucleotidyl transferase (TUNEL), gli assay di elettroforesi su gel monocellulare (Comet), lo SCSA e il test di dispersione della cromatina degli spermatozoi (SCD). Tra questi, lo SCSA è stato ampiamente adottato nei laboratori di andrologia grazie all'uso della citometria a flusso per l'analisi, che offre alta produttività, efficienza e oggettività, nonché la capacità di riportare contemporaneamente parametri come DFI e HDS⁷. Secondo un sondaggio globale⁷, quasi un quarto (24,1%) dei clinici riproduttivi in tutto il mondo ha selezionato lo SCSA come metodo per valutare l'integrità del DNA degli spermatozoi.

Il passo più critico nella procedura SCSA è stabilire l'appropriatezza delle porte citometriche a flusso. Il metodo PGG tradizionale può rilevare sia i frammenti spezzati (DFI) dei filamenti di DNA che gli spermatozoi con colorazione anormalmente alta del DNA (HDS), caratterizzati dalla mancanza di normale scambio di istone e protamina¹³. Tuttavia, non può distinguere tra rotture a singolo e doppio filamento nel DNA degli spermatozoi. Negli ultimi anni, Yang et al.¹⁰ hanno stabilito un metodo CFG per analizzare il DFI degli spermatozoi mediante citometria a flusso, che può distinguere la gravità del danno al DNA degli spermatozoi. Il passo chiave di questo metodo è impostare un gate a croce per il citometro a flusso. Il metodo CFG mostra un'eccellente ripetibilità (il coefficiente di variazione era inferiore al 5%) e un intervallo lineare per la rilevazione del DFI dall'8,93% al 53,90%. Questo metodo riporta tre indicatori—DFIm, DFIs e DFIc—ma non fornisce risultati HDS¹⁰.

Questo studio ha rilevato che il DFI totale del metodo CFG (DFIc) era in buon accordo con quello del metodo PGG (DFIp). L'analisi di correlazione ha rivelato che i coefficienti di correlazione di DFIs e DFIp erano significativamente più alti rispetto a quelli di DFIm. Né la concentrazione degli spermatozoi né il conteggio totale degli spermatozoi erano correlati con i risultati del metodo CFG o PGG. PR (%) e i quattro tipi di DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp) erano tutti significativamente correlati negativamente. PR (%) era significativamente correlato negativamente con tutti e quattro i tipi di DFI (DFIm, DFIs, DFIc, DFIp). La correlazione con DFIm (r = -0,1975) era significativamente più debole rispetto a quella di DFIs, DFIc e DFIp (r = -0,3794, -0,3574, -0,3824, rispettivamente). Questi risultati sono coerenti con quelli riportati da Yang et al.¹⁰. Inoltre, DFIs e DFIc hanno mostrato una buona correlazione con il volume seminale, mentre DFIm non l'ha fatto. Sebbene l'utilità clinica di un indicatore che si allinea strettamente con i parametri seminali di base possa essere limitata, questo risultato suggerisce che l'indice di danno grave al DNA degli spermatozoi (DFIs) potrebbe riflettere aspetti patologici distinti della spermatogenesi. Più importante, come mostrato nella nostra analisi di correlazione, DFIs ha dimostrato un'associazione significativamente più forte con la percentuale di spermatozoi con motilità progressiva rispetto a DFIm, supportando ulteriormente il suo potenziale come indicatore complementare nelle valutazioni della fertilità maschile oltre l'analisi convenzionale del seme.

HDS rappresenta la proporzione di spermatozoi immaturi privi di normale scambio di istone e protamina. Il precursore della protamina 1 negli spermatozoi HDS conserva gli aminoacidi terminali che vengono tipicamente scomposti⁸, potenzialmente impedendo la corretta condensazione della cromatina e risultando in una maggiore colorazione arancio acridina del dsDNA. Studi precedenti hanno enfatizzato l'importanza di HDS nella descrizione dei difetti della cromatina negli spermatozoi. La ricerca di Lin et al.¹⁴ e Virro et al.¹⁵ indica che il tasso di aborto in vitro (IVF) è significativamente più alto negli uomini con HDS > 15%. Tuttavia, recenti scoperte suggeriscono che HDS potrebbe non indicare in modo affidabile l'immaturità nucleare a causa della sua debole correlazione con i risultati di colorazione CMA3, AB e TB¹⁶. Quindi, HDS potrebbe non essere adatto come indicatore di fertilità maschile¹⁷. Questo studio mostra anche nessuna correlazione significativa tra HDS e parametri seminali di base, inclusi volume seminale, concentrazione degli spermatozoi e motilità. Pertanto, HDS non è raccomandato come marcatore per l'integrità del DNA degli spermatozoi¹⁸.

Durante il processo di rilevazione del DFI, possono sorgere incongruenze nei confini della fluorescenza. Questo fenomeno è principalmente attribuito a significative variazioni nella concentrazione e motilità degli spermatozoi tra diversi campioni. Per affrontare questo problema, si raccomanda l'uso di porte appropriate per escludere spermatozoi morti, detriti e altri segnali non specifici. Questo approccio migliora l'accuratezza dei dati e mitiga il problema dei confini di fluorescenza incoerenti.

Per quanto ne sappiamo, questo è il primo studio a confrontare i risultati dell'analisi dei metodi PGG e CFG. Un limite di questo studio è il suo design a singolo centro e a campione ridotto, e le sue conclusioni richiedono ulteriori validazioni attraverso studi multicentrici e campioni più ampi. Le direzioni future della ricerca includono garantire la coerenza nei risultati del test DFI degli spermatozoi tra diversi citometri a flusso e determinare se il DFI degli spermatozoi può prevedere gli esiti delle tecnologie di riproduzione assistita.

In conclusione, il metodo CFG fornisce più parametri per l'integrità del DNA degli spermatozoi. In particolare, DFIm e DFIs riflettono le proporzioni di spermatozoi con danni lievi e gravi al DNA, rispettivamente. I risultati di DFIc e DFIp mostrano una buona coerenza. Il metodo CFG è adatto per l'applicazione clinica e la promozione.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema di analisi dello sperma assistito da computer	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Citometria a flusso	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Kit per citometria a flusso	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Camera di conteggio Makler	Sefi Medical Instruments
Kit per l'integrità del DNA del nucleo dello sperma	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-