Misurazione della struttura di uscita e della compliance oculare in occhi topi ex vivo utilizzando un sistema a pompa a siringa

Sommario

Integrando approcci analitici provenienti da metodi consolidati di perfusione a pressione controllata, ha ottimizzato un sistema semplice e a basso costo per la valutazione della capacità di uscita e della compliance oculare negli occhi del topo.

Abstract

Mantenere la pressione intraoculare (IOP) a un livello adeguato e stabile è essenziale per la salute oculare. Le proprietà biomeccaniche della rete trabecolare (TM), del canale di Schlemm (SC) e dell'intero guscio corneosclerale svolgono un ruolo cruciale nell'omeostasi della IOP. La struttura di deflusso (C) è un parametro chiave per valutare l'efficacia della TM e della SC nel drenaggio dell'umore acquoso, mentre la compliance oculare (φ) riflette l'elasticità del guscio corneosclerale e il flusso transitorio attraverso TM e SC. In precedenza, era stato sviluppato un sistema semplice e conveniente di pompa a siringa per valutare C. Tuttavia, l'uso di una semplice regressione lineare per l'analisi dei dati in vivo presenta limitazioni nella caratterizzazione della funzione TM e SC. In questo studio, il sistema siringa-pompa è stato ottimizzato applicando approcci analitici sviluppati per sistemi di perfusione oculare a pressione controllati consolidati. I valori misurati di C e φ negli occhi ex vivo sono stati confrontati con i valori del sistema di perfusione precedentemente pubblicati e sono stati coerenti con quegli intervalli riportati. In sintesi, questo sistema semplice e a basso costo facilita la valutazione delle proprietà biomeccaniche della TM e della SC.

Introduzione

Mantenere un livello adeguato e stabile di pressione intraoculare (IOP) è essenziale per la salute^{oculare 1}. L'elevazione sostenuta della PIO è il principale fattore di rischio per il^{glaucoma 2,3}. Le fluttuazioni a lungo termine dell'IOP nel corso di mesi o anni contribuiscono anch'esse alla perdita della vista ^4,5. Studi recenti hanno identificato un'altra forma di fluttuazione della IOP, fluttuazioni transitorie causate dalle attività quotidiane, che possono anche accelerare la progressione del glaucoma ^6,7. Ad esempio, un uomo di 46 anni con una storia di sfregamento delle palpebre da 20 anni e un uomo di 52 anni che si era strofinato gli occhi per 10 anni hanno entrambi mostrato danni accelerati al disco^{ottico 8,9}. Questi risultati evidenziano l'importanza di risposte tempestive e appropriate ai cambiamenti della IOP per minimizzare il rischio di perdita visiva.

La PIO è regolata dall'equilibrio tra la produzione dell'umore acquoso (AH) e il suo^{drenaggio 10}. L'AH esce principalmente dall'occhio attraverso le vie convenzionali e^{uveosclerali 11}. Sia negli occhi normali che in quelli glaucomati, il percorso convenzionale che comprende la rete trabecolare (TM) e il canale di Schlemm (SC) è la principale fonte di resistenza al flusso che influenza l'omeostasi^IOP 12,13,14. Pertanto, le proprietà biomeccaniche di TM e SC sono essenziali affinché l'occhio si adatti ai cambiamenti in^IOP 15,16,17.

I recenti progressi tecnologici hanno facilitato una valutazione più accurata del flusso di AH. Approcci invasivi, come la perfusione basata sulla gravità e il sistema siringa-pompa, sono stati sviluppati per calcolare la struttura di uscita (C), che indica come TM e SC regolano il deflusso in regime^stazionario 18,19,20,21,22,23,24. Metodi non invasivi, come la tonografia²⁵ e la fluorofotometria²⁶, sono stati utilizzati clinicamente per determinare la C nei pazienti con glaucoma. Tuttavia, la maggior parte degli approcci non riesce a valutare specificamente la funzione della MT e della SC. Ad esempio, nel sistema siringa-pompa, i dati di portata e pressione allo stato stazionario vengono adattati tramite una semplice regressione lineare, e la pendenza viene interpretata come una C dipendente dalla pressione. Tuttavia, questo C calcolato nei topi vivi non può riflettere accuratamente la capacità di uscita di AH attraverso la via convenzionale perché è influenzato dalla secrezione di AH, dall'uscita uveosclerale e dalla pressione venosa episclerale, come descritto dall'equazione di Goldmann.

Per affrontare questa limitazione, Millar et al. hanno calcolato l'afflusso di AH, il deflusso convenzionale e l'uscita uveosclerale nello stesso occhio del topo tramite molteplici misurazioni a flusso costante basate sull'assunzione di un afflusso di AH, nessuna pressione venosa episclerale e un flusso uveosclerale invariato dopo^{l'eutanasia 22}. Nel 2016, Sherwood et al. hanno riportato che il flusso uveosclerale è 0 negli occhi ex vivo a 0 mmHg, e hanno poi affrontato la stessa questione introducendo un modello a legge di potenza usando iPerfusion (un sistema di perfusione controllato a pressione, d'ora in poi chiamato sistema di perfusione⁾²⁷. I progressi metodologici hanno chiarito i ruoli distinti di TM e SC, migliorando la comprensione delle loro funzioni fisiologiche nel mantenimento dell'uscita di AH in stato stazionario.

Inoltre, la risposta transitoria di TM e SC alle fluttuazioni della IOP è essenziale per mantenere l'omeostasi della IOP. Per tracciare questo movimento, Xin et al. hanno sviluppato la tomografia ottica a coerenza sensibile alla fase (OCT), che consente l'osservazione su una scala temporale di²⁸ secondi. La microscopia elettronica a scansione a faccia a blocchi seriali tridimensionale può esaminare questo moto a un livello^{ultrastrutturale 29}. Tuttavia, i metodi basati su immagini stimano solo le proprietà biomeccaniche di TM e SC e non forniscono valori reali di drenaggio transitorio dell'AH. Nel 2019, dopo aver sviluppato iPerfusion, Sherwood et al. hanno calcolato la compliance oculare (φ) come indicatore chiave sia dell'elasticità corneosclerale sia della risposta transitoria di TM e SC³⁰. Questo progresso fornisce un parametro quantitativo per valutare i comportamenti transitori di TM e SC in risposta alle fluttuazioni IOP.

Basandosi su questi progressi nella valutazione della funzione TM e SC, questo studio ha migliorato il sistema siringa-pompa incorporando il modello a legge di potenza per il calcolo C e integrando nuove metodologie per calcolare φ. Queste misurazioni sono state confrontate con i dati pubblicati ottenuti utilizzando il sistema di perfusione per valutare se il sistema ottimizzato con pompa siringa sia adatto a valutare la capacità di uscita e la compliance oculare negli occhi topini ex vivo .

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva e con le linee guida sulla cura e l'uso degli animali da laboratorio del Qingdao University Medical Center (QDU-AEC-2022069).

1. Selezione e gestione degli animali

1. Usa topi di 5 mesi con un background genetico del 50% C57BL/6 e del 50% BALB/c. Non considerare il sesso nel disegno sperimentale.
2. Mantenere i topi sotto un ciclo chiaro-buio di 12 ore e 12 ore a 23 ± 2 °C e umidità di 50 ± 5%.

2. Misurazione dell'IOP

1. Anestesiare i topi usando isoflurano al 2,5% con 80% (vol/vol) di ossigeno in una camera sigillata per 3,5 minuti.
   ATTENZIONE: L'isoflurano è un anestetico volatile. Esegui l'anestesia in un'area ben ventilata o in un sistema di contenimento appropriato.
2. Trasferire i topi su una piattaforma operativa. Mantieni l'anestesia con una mascherina per altri 30 secondi.
3. Esegui tutte le misurazioni tra le 9:00 e le 12:00. Annota tre misurazioni per occhio. Calcola il valore medio per ogni punto di dato.

3. Configurazione del sistema (Figura 1)

1. Collega una siringa da 100 μL a una pompa per siringa.
2. Collega la siringa a un sensore di pressione di flusso diretto.
3. Collega il sensore a un sistema di acquisizione dati.
   NOTA: Assicurati che il sensore di pressione e il portaocchi siano allineati alla stessa altezza per evitare artefatti di pressione.
4. Riempire il sistema con 1× soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovi tutte le bolle d'aria.
5. Posizionare l'occhio in un supporto con una rientranza circolare (diametro 4–6 mm). Assicurati che l'occhio sia stabile durante la cannulazione. Posiziona il sensore di pressione e il portaocchi alla stessa altezza.
   NOTA: Il disallineamento può introdurre errori di misurazione della pressione. Il file di progettazione STL per il portaocchi personalizzato è fornito come File Supplementare 1.

4. Funzionamento del software

1. Calibrazione del sensore di pressione
   1. Apri il software di acquisizione dati. Carica il file di configurazione della calibrazione. Seleziona la funzione di calibrazione .
   2. Collega il sistema a un serbatoio d'acqua a due altezze definite.
   3. Pressioni misurate e effettive in ingresso usando la conversione:
      1 cm H₂O = 0,735 mmHg
2. Configurazione della pompa
   1. Apri le impostazioni del modulo. Carica il file di configurazione del regolatore.
   2. Seleziona il dispositivo della pompa. Inserisci la portata massima e il diametro della siringa.
3. Registrazione dei dati
   1. Inizia a registrare.
   2. Smetti di registrare dopo ogni passo di pressione.
   3. Inserisci il valore di pressione successivo.
   4. Riavvia la registrazione.

5. Preparazione dell'ago

1. Estrai una micropipetta di vetro secondo un protocollo⁸ stabilito.
2. Macinare la punta a un diametro interno di 80–100 μm. Lucida la punta dell'ago.
   ATTENZIONE: Maneggiare con attenzione gli aghi di vetro per evitare infortuni.
3. Monta l'ago su un micromanipolatore. Collega l'ago al trasduttore di pressione.
4. Riempi l'ago con PBS.
5. Posiziona la punta dell'ago alla stessa altezza del sensore di pressione.
6. Misurazione della resistenza
   1. Applica una pressione di 1 mmHg. Registra la portata d'acqua.
   2. Calcola la resistenza dell'ago:
      
   3. Usa aghi con resistenza compresa tra 0,01 e 0,5 mmHg/(μL/min).

6. Facilità di sistema e conformità

1. Misurazione della struttura
   1. Perfondi il sistema con PBS. Sigilla il sistema usando una valvola a tre vie.
   2. Applicare passi di pressione di 6, 8, 10, 12, 14 e 16 mmHg.
   3. Registra P e Q per 10 minuti a ogni passaggio. Calcola i valori medi degli ultimi 5 minuti.
   4. Esegui la regressione lineare. Interpreta la pendenza come una struttura di sistema.
2. Validazione
   1. Ripeti le misurazioni 3 volte.
   2. Conferma che la funzione di sistema sia inferiore a 0,2 nL/min/mmHg.
3. Misurazione della conformità
   1. Inserisci un tubo in silicone da 35 cm nel sistema.
   2. Misura la conformità con e senza tubi in Teflon.
   3. Calcola la variazione di volume usando un metodo a volume^{discreto 14}.
   4. Determina la conformità di sistema come 4 nL/mmHg.
4. Controllo della sensibilità
   1. Confermare che la conformità rilevabile del sistema sia superiore a 9,9 nL/mmHg.

7. Enucleazione

1. Eutanasia i topi usando CO₂ a una portata di 0,7 L/min per 3 minuti.
   ATTENZIONE: L'eutanasia per CO₂ deve seguire le linee guida istituzionali per garantire obiettivi umani.
2. Dissezionare i muscoli extraoculari e i nervi ottici utilizzando strumenti sterili. Enuclea i bulbi oculari.
3. Monta immediatamente un occhio nel supporto a 35,5 °C.
4. Conservare l'occhio controlaterale a 4 °C.
5. Misura entrambi gli occhi usando lo stesso sistema.

8. Canulazione

1. Inserimento dell'ago
   1. Inserire l'ago attraverso la cornea centrale con un angolo di 45°.
   2. Avanzare l'ago fino a una profondità di 0,3–0,5 mm nella camera anteriore.
2. Validazione
   1. Stabilizzare il sistema. Conferma la fluttuazione di pressione ≤ 0,4 mmHg negli ultimi 5 minuti.

9. C_oculare

1. Stabilizza l'occhio a 8 mmHg per 30 minuti.
2. Applicare passi di pressione di 6, 8, 10, 12, 14 e 16 mmHg.
3. Applica un passo finale a 8 mmHg.
4. Raccolta dati
   1. Imposta la portata massima a 4 μL/min.
   2. Registra P e Q per 10 minuti a ogni passaggio.
5. Analisi
   1. Traccia le curve P–T e Q–T. Calcola i valori medi degli ultimi 5 minuti.
   2. Dati di adattamento al modello di legge di potenza²⁷:
      
6. Definisci C_r (dopo la sottrazione della struttura del sistema) come struttura di uscita oculare.
7. Impostare P_r = 8 mmHg.
8. Definisci β come il coefficiente non lineare.

10. Oculare Φ_r

1. Analizza le curve P–T e Q–T durante gli incrementi di pressione. Identifica l'aumento del flusso fino a Q_max e la successiva decelerazione.
2. Calcola la variazione di volume tra t_p e t_max usando il metodo del volume^{discreto 30}.
3. Dati di adattamento all'equazione modificata di Friedenwald³⁰:
   
4. Impostare P_r = 13 mmHg. Definisci Φ_r (dopo aver sottratto la conformità di sistema) come conformità oculare Φ_r, _eye e γ come parametro materiale.

Risultati

Le prestazioni del sistema ottimizzato con pompa a siringa sono state valutate confrontando C e φ in topi di 5 mesi con valori precedentemente pubblicati da studi di perfusione oculare controllata a pressione. La normalità dei dataset nella Figura 2F è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk, e confronti statistici sono stati effettuati utilizzando un test Student a due code abbinate.

Come mostrato nella

Discussione

Questo studio presenta un sistema di pompa a siringhe ottimizzato per stimare la capacità di uscita e la compliance oculare negli occhi del topo, ottenendo valori coerenti con quelli riportati utilizzando sistemi di perfusione oculare controllati a pressione. L'approccio attuale migliora la precisione delle misurazioni basate su siringa mantenendo un sistema sperimentale semplice e accessibile. Questa combinazione di perfezionamento metodologico e accessibilità può facilitare un'adozione...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente	1× PBS Buffer	Thermo Fisher Scientific	10010023
Isoflurano	Shenzhen Rewoode Life Sciences Co., Ltd., Cina	R640
Materiale	100 & mu; Siringa ad alta precisione L	Hamilton	1710
Vetro borosilicato	Sutter, Novato, CA	BF100-50-10
Siringa sterile usa e getta	Fenglin Medical Devices Co., Ltd. Jiangxi, Cina	10 ml
Sensore di pressione	IcuMedical	PX26-015G
Tubo in silicone	Runze Fluid Co., Ltd, Nanchino, Cina & nbsp;	N/A
Tubo PTFE trasparente	Runze Fluid Co., Ltd, Nanchino, Cina & nbsp;	N/A
Equipaggiamento	Estratore di pipette fiammeggiante/marrone	Sutter, Novato, CA	P-97
Micromanipolatore manuale	Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)	M3301
Bagno metallico	Biologia del Castore, Suzhou, Cina	2016C
MicroForge	Laboratorio Scientifico di Strumenti Narishige, Tokyo, Giappone	MF830
Smerigliatrice a micropipette	MPInstrument Co., Ltd., Wuhan, Cina	KDG-02
Microscopio binoculare stereo zoom PZMIII	Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)	PZMIII
Pompa a siringa	Strumenti di Precisione Mondiale (WPI)	AL-1000