Articolo metodologico

Dissezione su piccola scala e colorazione di anticorpi dei dischi immaginari occhio-antenna e alare da Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/70434

⸱

15 maggio 2026

 , 
1Department of Developmental and Cell Biology, Charlie Dunlop School of Biological Sciences, University of California, Irvine, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine

In questo articolo

Sommario

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Questo articolo descrive un protocollo efficiente di dissezione immaginale del disco e colorazione degli anticorpi, economico con i reagenti e facilita la gestione di dischi immaginari in piccole quantità.

Abstract

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I dischi immaginali di Drosophila sono stati a lungo studiati come modelli di sviluppo, modellazione e rigenerazione epiteliali. La marcatura e l'imaging degli anticorpi dei dischi immaginari dissezionati sono importanti per visualizzare i modelli di espressione proteica come marcatori dei processi di sviluppo e fisiologici. Questo metodo di dissezione e marcatura immaginale dei dischi è stato originariamente sviluppato per la microscopia a elettroni immuni dei dischi immaginari occhio-antenna da Tomlinson e Ready. Utilizzando piastre da 60 micropozzi e trasferendo tessuti tra soluzioni invece che trasferendole soluzioni, è possibile un'attenzione individualizzata ai campioni di tessuto con pochissimo spreco. Anche dischi immaginari singoli possono essere processati. Il metodo richiede solo piccoli volumi di anticorpi e altri reagenti. Come esempio dell'applicazione del metodo ad altri piccoli tessuti, l'articolo dimostra anche come i dischi immaginari delle ali possano essere sezionati e etichettati con lo stesso metodo. Un approccio simile può essere applicato a qualsiasi piccolo tessuto di dimensioni simili, e anche ad altre procedure istochimiche e di marcatura oltre alla colorazione degli anticorpi.

Introduzione

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I dischi immaginali di Drosophila sono tessuti progenitori che vengono messi da parte durante l'embriogenesi e crescono all'interno della larva senza differenziarsi, contribuendo alle strutture epidermiche adulte durante lo stadiopupale 1. Il loro studio ha fornito molte intuizioni sui meccanismi di patterning dello sviluppo, con i dischi immaginari dell'occhio e delle ali particolarmentestudiati 2,3,4,5,6. L'immunoistochimica è particolarmente utile per indagare i modelli spaziali e temporali di espressione genica nei dischi immaginari, nonché per caratterizzare i comportamenti cellulari, inclusa la divisione e la morte cellulare.

Per facilitare le ulteriori esigenze dell'analisi microscopica elettronica dei dischi immaginari oculari marcati da anticorpi, Tomlinson e Ready hanno sviluppato un protocollo su piccola scala particolarmente economico con i reagenti e che offre un altissimo grado di affidabilità epersonalizzazione 7. Il loro metodo è descritto in stampa, ma non è disponibile alcun video 3,8,9. Il metodo è facilmente modificato per l'etichettatura di altri dischi immaginali (o altri tessuti) e può essere applicato ai dischi immaginali alari oltre che ai dischi immaginali occhio-antennali.

La marcatura degli anticorpi dei dischi immaginali di Drosophila segue il contorno generale applicabile a qualsiasi tessuto10 (Figura 1). Il tessuto deve essere dissezionato e fissato prima dell'incubazione con anticorpi specifici per le proteine di interesse. Dopo che l'anticorpo non legato è stato rimosso, viene aggiunto un anticorpo secondario marcato (spesso fluorescente), che si lega all'anticorpo primario, il quale stesso è legato alla proteina di interesse nel tessuto fissato. Dopo il lavaggio per rimuovere l'anticorpo secondario non legato, il tessuto può essere montato per un esame microscopico e visualizzare le proteine di interesse. Sono disponibili molte descrizioni generali di questo processo e possono essere applicate a dischi immaginari e altri tessuti di Drosophila 11. Qui viene fornito un protocollo per il metodo Tomlinson & Ready, in cui i campioni di tessuto vengono trasferiti individualmente tra piccoli pozzi di incubazione su una piastra di micropozzo e vengono osservati da un microscopio stereo ad ogni fase (Figura 2). Questo approccio funziona meglio per colorare un numero più piccolo di tessuti alla volta (decine di campioni) ed è non ideale per grandi lotti (cioè centinaia). Questo approccio richiede solo piccoli volumi di soluzione di 13 μL in ciascun pozzo e quindi può essere eseguito con pochissimi anticorpi. Poiché la perdita tissutale è minima, non esiste una dimensione minima del campione e anche i singoli dischi immaginari possono essere processati in modo affidabile.

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Protocollo

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I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Realizzazione dello strumento di trasferimento

  1. Usa una pinza per tagliare ~2,5 cm di filo di tungsteno da 0,005" di diametro. Usa le pinze per formare un'estremità del filo in un gancio o un anello (Figura 3). Inserisci l'altra estremità in un portaago. Questo verrà usato per trasferire i dischi con poco o nessun trasferimento di liquidi. L'anello può essere il più facile da usare, ma il gancio trasferisce meno liquido tra le soluzioni.

2. Dissezione e fissazione dei dischi immaginari occhio-antenna

  1. Risciacquo le larve con ~7,5 mL 0,1 M fosfato di sodio (pH7,2) in una piastra di Petri (diametro 60 mm) per rimuovere qualsiasi substrato per mosche o altri detriti. Vedi il passaggio 6 per la dissezione dei dischi immaginali alari anziché dei dischi oculari-antennali. Entrambi questi dischi immaginari si trovano nella porzione anteriore del corpo (Figura 4).
    NOTA: Il PBS può essere utilizzato anche al posto del tampone fosfato nei passaggi 2.1–2.3.
  2. Trasferire le larve in una piastra di Petri contenente tampone fresco.
    NOTA: Alcuni ricercatori preferiscono dissezionare le singole larve con singole gocce tampone in una piastra di Petri da 60 mm; altri usano vetrine per depressione.
  3. Durante l'osservazione al microscopio dissezionale, tenere le larve al ~50% del percorso lungo il corpo usando una pinza. Usa una seconda pinza fine per afferrare i ganci e tirare. I dischi dell'antenna oculare usciranno attaccati alle parti della bocca. Il cervello può anche rimanere attaccato ai dischi oculari.
  4. Utilizzare lo strumento a filo per trasferire il tessuto dissezionato in una piccola piastra di Petri (diametro 35 mm) contenente ~3 mL di fissatore, ad esempio 3,7% di formaldeide in un tampone fosfato di sodio (pH7,2) a 0,1 M, ottenuto diluendo una soluzione di formaldeide al 37% in tampon.
    NOTA: Segui le procedure di sicurezza approvate localmente per la manipolazione del formaldeide. Il formaldeide al 3,7% è un semplice fissativo che sarà soddisfacente in molti casi, ma altri fissativi possono essere ottimali per alcuni antigeni. PBS o PEM (0,1 M PIPES pH 7,0, 2 mM MgSO4, 1 mM EGTA) possono essere utilizzati come tampone fissativi al posto di 0,1 M fosfato di sodio, oppure si può ottenere una soluzione di formaldeide dissolvendo paraformaldeide solido, invece che da una soluzione concentrata di stock. Il fissativo paraformaldeide-lisina-periodato (PLP) combina una fissazione proteica più lieve con il reticolamento dei carboidrati e preserva meglio le strutture delle membrane12. La glicoproteina scabrosa di Drosophila, ad esempio, rimarrà antigenica dopo la fissazione del PLP ma non dopo la fissazione con formaldeide. Preparare il PLP fresco come segue: (1) Aggiungere 2 g di polvere di paraformaldeide a 25 mL di acqua deionizzata in una fiaschetta conica in una cappa e mescolare a bassa temperatura; (2) Immergi una pipetta in una soluzione di idrossido di sodio al 50% e trasferisci una traccia del liquido (molto meno di una goccia) alla miscela. Il paraformaldeide dovrebbe sciogliersi entro pochi minuti senza che la soluzione arrivi a ebollizione. Durante il raffreddamento della soluzione di formaldeide all'8%, sciogliere 0,36 g di lisina in 10 mL d'acqua deionizzata, 7,5 mL 0,1 M fosfato di sodio pH 7,2, 2,5 mL 0,1 M Na2HPO 4 e mantenere sul ghiaccio. Mescola 15 mL di questa soluzione di lisina tamponata a freddo con 5 mL di formaldeide fresca all'8% e 50 mg di periodato di sodio in un tubo a tappo a vite da 50 mL, mescola vortice e usa quando è fresco.
  5. Dopo 15–20 minuti a temperatura ambiente, trasferire il tessuto dissezionato in un'altra piastra di Petri contenente 0,1 M fosfato di sodio (pH 7,2).
    NOTA: Si può anche utilizzare PBS al posto del tampone fosfato. La fissazione sul ghiaccio può essere preferibile per alcuni antigeni, oppure quando si desidera ottenere immagini della fluorescenza endogena di GFP o RFP espressa nel tessuto. La fissazione per il PLP è sempre per 45 minuti sul ghiaccio.

3. Blocco e incubazione con anticorpi primari

  1. Trasferire il tessuto in una piastra di Petri da 35 mm contenente ~3 mL di detergente anticorpo NSG per il blocco della testa. Incubare la piastra di Petri sul ghiaccio per almeno 15 minuti. La NSG contiene 0,1 M di fosfato di sodio (pH 7,2), 0,1% saponina, 5% Siero normale di capra. I depositi di lavaggio vengono conservati sterilizzati con filtro a 4 °C.
    NOTA: Diversi wash buffer possono essere ottimali per determinati anticorpi. Ad esempio, mentre la saponina è un detersivo delicato e non ionico che solubilizza in particolare la membrana plasmatica, altri detersivi possono essere preferibili per rilevare gli antigeni all'interno del nucleo. Come ulteriore esempio, l'anticorpo sviluppato contro la proteina nucleare atonale da Jarman et al.13 è il più immunoreattivo nei tamponi contenenti NP40 come detersivo. Vedi la Tabella dei Materiali per le ricette dei buffer di lavaggio alternativi: PDT, PBT o NSG. Quando si utilizza il siero normale come proteina bloccante, idealmente dovrebbe provenire dalla specie in cui viene prodotto l'anticorpo secondario, ad esempio siero normale per capra se si usano anticorpi secondari di capra, o siero normale per asino se si usano anticorpi secondari di asino. In pratica, questo fa poca differenza.
  2. Rimuovere eventuali tessuti indesiderati dai dischi immaginari oculari-antennali durante il blocco usando pinze sottili, ad eccezione dei ganci orcali. Lascia le parti boccali attaccate per ora per facilitare i trasferimenti.
    NOTA: Anche i tessuti estranei, ad esempio il cervello, possono essere lasciati fino al montaggio del vetrino (passo 5.4), purché non interferiscano con la colorazione o la visibilità.
  3. Durante la bloccazione, preparare una diluizione 1:100 di soluzione di anticorpi mAb40-1a in NSG, ad esempio 1 μL di anticorpo in 100 μL di NSG. Mescola tramite pipetta, non vortice.
    NOTA: mAb40-1a è un anticorpo monoclonale elevato contro la beta-galattosidasi. La diluizione ottimale degli anticorpi e il wash buffer variano a seconda degli anticorpi specifici utilizzati.
  4. Aggiungere soluzioni di anticorpi da 13 μL a ciascuno dei sei pozzi nella prima colonna di un minivassoio micropozzo da 60 pozzi. I micropozzi conici con lati dritti sono importanti per la chiarezza ottica. Se sono necessari più di sei pozzi, inizia un secondo minivassoio.
  5. Trasferire dischi immaginali occhio-antennali, preferibilmente ancora attaccati alle parti boccali, alla soluzione primaria di anticorpi uno alla volta usando l'anello o uncino di filo.
    NOTA: Il numero di dischi immaginali che possono essere aggiunti a ciascun pozzo dipende dall'anticorpo. Troppo tessuto può esaurire alcuni anticorpi al punto che la marcatura diminuisce. 5 coppie per pozzo sono solitamente soddisfacenti. Così, ~60 dischi possono essere facilmente etichettati usando le 6 file di piastre microtitolate a 60 pozzi. Per ciascuna delle righe possono essere utilizzati diversi anticorpi. La possibilità di riutilizzare soluzioni di anticorpi richiede test empirici per ogni caso; Non è una routine nel nostro laboratorio.
  6. Chiudi la piastra con il coperchio e sigilla con parafilm per limitare l'evaporazione. Incubare sul ghiaccio o a 4 °C per 4 ore fino a tutta la notte. Non è necessario dondolarsi.
    NOTA: Il tempo ottimale e la temperatura di incubazione degli anticorpi dipendono dall'anticorpo. In molti casi, 1–2 ore a temperatura ambiente saranno sufficienti, ma alcuni anticorpi migliorano i risultati dopo l'incubazione a 4 °C, e spesso può essere conveniente incubare a 4 °C durante la notte. In pochissimi casi, incubazioni primarie di anticorpi di 2–3 giorni possono essere ottimali. Sigillare il coperchio del micropozzo è necessario solo per incubazioni più lunghe di ~4 ore.

4. Lavaggio e incubazione con anticorpi secondari

  1. Aggiungere 13 μL di buffer NSG alle tre colonne successive dei pozzi dopo ogni pozzo di anticorpi, poiché i campioni saranno lavati tre volte. Trasferisci i campioni a lavare per 5 minuti in ogni pozzo consecutivamente.
  2. Durante il lavaggio, preparare una diluizione 1:200–400 di anticorpi secondari coniugati fluorescenti in un tampone NSG, ad esempio 0,5 μL di anticorpi in 100 μL NSG. Mescola tramite pipetta, non vortice. Centrifugare la soluzione di stock secondaria di anticorpi per 60 secondi (alla velocità massima di diluizione), poiché gli aggregati di anticorpi possono legarsi in modo non specifico alla superficie del tessuto.
    NOTA: La diluizione ottimale degli anticorpi secondari può variare a seconda del produttore. Anticorpi coniugati con Alexa o cianina sono disponibili sottratti per altre specie per facilitare l'etichettatura multipla.
  3. Aggiungere 13 μL della soluzione secondaria di anticorpi alla colonna successiva (5) di pozzi.
  4. Trasferire i campioni nell'anticorpo secondario usando l'anello o un gancio.
  5. Chiudi la piastra con il coperchio e sigilla con parafilm per limitare l'evaporazione. Incubare sul ghiaccio per 4 ore durante la notte.
    NOTA: Il tempo ottimale e la temperatura di incubazione degli anticorpi dipendono dall'anticorpo. In molti casi, 1–2 ore a temperatura ambiente saranno sufficienti, ma alcuni anticorpi migliorano i risultati dopo l'incubazione a 4 °C, e spesso può essere conveniente incubare a 4 °C durante la notte. Sigillare il coperchio del micropozzo è necessario solo per incubazioni più lunghe di ~4 ore.

5. Lavaggio e montaggio dei tessuti per microscopia

  1. Preparare le tre colonne successive dei pozzi dopo il pozzo secondario di anticorpi con 13 μL di NSG. Trasferire i campioni in ogni pozzo per 5 minuti.
  2. Trasferire i campioni in un lavaggio finale nelnono pozzo utilizzando 13 μL di fosfato di sodio 0,1M (pH 7,2). Questo lavaggio tampone è necessario quando i tamponi contengono componenti che precipitano nel mezzo di montaggio.
  3. . Aggiungere 13 μL di mezzo di montaggio alla colonna finale (10) dei pozzi. Il mezzo di montaggio si ottiene dissolvendo il 2% di n-propile gallato in 75% glicerolo e tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2. Prepara ogni settimana un nuovo mezzo di montaggio mescolando i componenti su una piattaforma rotante. Lascia che eventuali bolle d'aria si diradano prima dell'uso.
    NOTA: I supporti di montaggio sono disponibili anche commercialmente.
  4. Pipetta 20 μL di mezzo di montaggio su un vetrino pulito del microscopio. Trasferisci i campioni nel mezzo sul vetrino. Questa è un'ultima opportunità per rimuovere i tessuti indesiderati. Le parti bucali cuticolari devono essere rimosse dai dischi oculari-antennali.
  5. Per disporre i campioni in modo che non si spostino quando il vetro di copertura viene sovrapposto, usa lo strumento a filo per trascinare i campioni fuori dalla goccia principale del montante. Abbassa delicatamente un vetro pulito di copertura di 22 mm x 40 mm di spessore #1,5 sulla slitta usando la pinza, senza introdurre bolle d'aria.
  6. Lascia riposare le guide per 1 ora in un portascorrimenti di cartone per far sedimentare il supporto di montaggio. Evita di disturbare le vetrine poiché i campioni fragili possono danneggiarsi se il vetro di copertura si muove.
  7. Una volta che il vetro di copertura si è assestato, sigilla i bordi con lo smalto. Non muovere né premere il vetro della copertura mentre lo fai. Lascia asciugare lo smalto per almeno 1 ora prima dell'immagini.
    NOTA: Purtroppo, la maggior parte degli smalti cosmetici ora utilizza solventi che non si diffondono uniformemente sulle vetrine di vetro e non sono utili, quindi è necessario procurarsi uno smalto scientifico.
  8. Conserva i vetri a 4 °C. I campioni possono normalmente essere visualizzati e ri-immaginati per mesi.
    NOTA: Le vetrine possono anche essere conservate a -20 °C.

6. Dissezione e fissazione dei dischi immaginali delle ali

  1. Per sezionare i dischi immaginali alari invece che quelli oculari-antennali, segui i passaggi seguenti al posto dei passaggi 2.3–2.5 sopra.
  2. Al microscopio dissezionale, afferrare le parti boccali larvali con una pinza fine. Utilizzando forbici per microdissezione si dividono le larve dal 30%0 al 40% dalla parte anteriore.
  3. Inverti la porzione anteriore della larva aprendo l'estremità aperta e tagliata della larva usando una seconda pinza e spingendo la testa e le parti boccali, simile a invertire un calzino
  4. Utilizzare le pinze per trasferire le larve anteriori invertite in un fissativo in una piccola piastra di Petri (diametro 35 mm) contenente ~2,5 mL di fissativo, ad esempio 3,7% di formaldeide in un tampone fosfato di sodio 0,1 M (pH 7,2), ottenuto diluendo una soluzione di stock di formaldeide al 37% in PBS.
    NOTA: Se desiderato, le carcasse rovesciate possono essere trasferite a 400 μL di fissativo in un tubo microfuge, che facilita la fissazione in una cappa a fumi. Le stesse opzioni di fissazione disponibili per la fissazione del disco occhio-immaginario si applicano anche alla fissazione del disco alare (vedi NOTA al passo 2.4). La fissazione ottimale e per l'etichettatura dei dischi immaginari occhio-antennali sarà solitamente la stessa per i dischi alari.
  5. Dopo 15–20 minuti a temperatura ambiente, trasferire il tessuto dissezionato in un'altra piastra di Petri contenente 0,1 M fosfato di sodio (pH 7,2).
    NOTA: Le stesse opzioni di wash buffer disponibili per la fissazione del disco immaginario per l'occhio si applicano anche alla fissazione del disco alare (vedi NOTA al passo 2.4). Il buffer di lavaggio ottimale per l'etichettatura dei dischi immaginari occhio-antenna sarà solitamente lo stesso per i dischi alari.
  6. Rimuovere i dischi alari dalle larve usando pinze sottili. Se ancora presenti, il disco haltere più piccolo e il disco della gamba possono essere rimossi ora o rimanere attaccati ai dischi alari per facilitare i trasferimenti.
    NOTA: I dischi alari potrebbero non essere facilmente visibili nella carcassa finché il corpo adiposo o altro tessuto non viene tirato via (identifica sempre un tessuto prima di rimuoverlo). I dischi alari sono i più grandi dischi immaginari e sono fissati alla parete del corpo, strettamente associati alla trachea. Hanno una forma a goccia, simile al contorno del Sud America1 (Figura 4).
  7. Continua con i passaggi 3–5 come sopra.

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Risultati

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La procedura Tomlinson and Ready produce regolarmente eccellenti risultati di colorazione degli anticorpi. Qui sono illustrati dischi immaginari per occhi, antenna e ali etichettati triplicemente. Nella Figura 5A, un disco immaginario antennale oculare di terzo stadio è stato triplo marcato per rilevare il fattore di trascrizione Senseless (blu), il marcatore progenitore neurale Elav (rosso) e l'anti-GFP dei cloni cellulari che esprimono RNAi per il trascrip...

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Discussione

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La colorazione anticorpale dei tessuti di Drosophila utilizzando piastre coniche a 60 pozzi con il metodo Tomlinson and Ready dà risultati eccellenti ed è altamente affidabile, poiché ogni disco immaginario viene seguito al microscopio disezionale durante ogni manipolazione. Il metodo richiede solo piccole quantità di reagenti anticorpali e scambia le soluzioni in modo più completo ad ogni passaggio, poiché i campioni vengono trasferiti con pochissimo liquido associato. È partic...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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NEB ringrazia Andrew Tomlinson per aver condiviso il metodo e Lucy Firth per i miglioramenti. Ringraziamo Abhishek Bhattacharya per aver contribuito con la Figura 5A. Ringraziamo Joyner Cruz, Jonathan Gonzalez, Chelsea Nguyen e Jensen Northrup. La ricerca nel laboratorio degli autori è finanziata da sovvenzioni del NIH (GM120451 e CA284362). La Figura 2 e la Figura 4 sono state create con Biorender.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fosfato disodioFisher7558-79-4Na2HPO4 - fosfato di sodio dibase anidro. Possono essere usati altri stati di idratazione ma cambiano il peso molecolare
Pinza: Dumont #5 Pinza BiologieStrumenti scientifici di qualità11252-20Stile: #5
           Forma della punta: dritta
               Lunghezza: 11cm
           Autoclave Safe: Sì
           Consigli: Biologia
           Dimensioni della punta:
         0,05 x 0,02mm
           Lega / Materiale: Inox
FormaldeideFisherBP531-500Grado biologia molecolare, 37% di formaldeide. 500ml
Fissativo a formaldeideFisherBP531-5003,7% formaldeide in 0,1M Sodium Phosphate Buffer pH7,2 prodotto per diluizione dal 37% di stock.
GliceroloBioreagenti FisherBP229-1
GhiaccioPreferenze utente
L-Lisina, 98%TermoscientificoJ62225.22
mAb40-1DHSB40-1a-sAnti-beta galactosidasi
Tubi microcentrifugheScientifico USA1615-5520Tubi da 1,5 mL per contenere campioni.
Forbici per microdissezioneStrumenti scientifici di qualità15003-08Taglio da 5mm, punta dritta, 8,5cm
Fosfato monosodioFisher7558-80-7NaH2PO4 - Fosfato di sodio monobasico anidro. Se si usa una forma idratata, il peso necessario per produrre una soluzione da 0,1M cambierebbe.
Mezzo di montaggioSoluzione di glicerolo al 75% in 0,1M fosfato di sodio tampone pH7,2 con gallato di n-propile al 2,5%. Mescola per inversione per minimizzare le bolle.
NSG0,1M fosfato di sodio tampone pH7,2, 0,1% saponina, 5% NGS
N-propile gallatoMP Biomedici210274780
Smalto per unghieTed Pella, acquistato da FisherNC0381432Per le vetrine di sigillatura
PortaaghiFisherNC0099380Per aghi microdisseccanti. Acciaio inossidabile cavo; lunghezza del manico: 4 3/4" di lunghezza
Nunc Microwell MiniTraysThermo Scientific12565155MicroWell MiniTray per applicazioni sierologiche. Conteggio dei pozzi 60
ParafilmStatLabPM996StatLab ParaFilm M Film Flessibile Autosigillante
ParaformaldeidePolysciences, Inc.00380-250
10x PBSPreferenze utentePrepara 800 mL di acqua distillata in un contenitore adatto.
           Aggiungi 1,37M di cloruro di sodio alla soluzione.
             Aggiungi 26,8 mM di cloruro di potassio alla soluzione.
             Aggiungi 101 mM di Dibasico di fosfato di sodio alla soluzione.
         Aggiungi 18,0 mM di monobasico fosfato di potassio alla soluzione.
         Regolare la soluzione al pH desiderato (tipicamente pH &asinto; 7,4).
           Aggiungi acqua distillata finché il volume non raggiunge 1 L.
PBTPreferenze utente0,1M fosfato di sodio tampone pH7,2, 0,1% albumina sierica bovina e 0,2% Triton X-100.
PDTPreferenze utente0,1M tampone fosfato di sodio (pH = 7,2), 0,3% desossicolato e 0,3% Triton x-100
Piastra di PetriFalconCorning 351007Ciocchia di Petri; 60mm; Non trattato
Piastra di PetriFalconCorning 351008Ciocchia di Petri; 35mm; Non trattato
PinzePreferenze utente
PLPn/a2% paraformaldeide 1,35% lisina in 0,05M fosfato di sodio tampone pH7,2
Anticorpi secondariJackson ImmunoResearch715-545-1510,5 mg Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG.
CopriacostiviVWR48393-172VWR Coverglass #1.5 22x40 (CASE)
DiapositiveFisher125442Fisher Glass Slides 10bx/CS
Sodio OssicolatoThermo Fisher Sci89904detersivo disossicolato di sodio; 5mg
Periodato di sodioSigma Aldrich71859-25GPeriodato di sodio – 25 grammi
Tampone fosfato di sodio0,1M del tampone NaPO4 pH 7,2. Mescola 28 ml di stock fosfato monosodio qualsiasi 0,1M (11,998g NaH2PO4 a 1L di acqua distillata) con 72 ml di stock fosfato disodio anyidro 0,1M (14,196g Na2HPO4 a 1L di acqua distillata) per generare 100ml di tampone NaPO4 0,1M. In alternativa, può essere utilizzato PBS.
Filo di tungstenoTed Pella27-11.005" dia.
Triton x-100Thermo Fisher SciA16046AE
VorticePreferenze utente

Riferimenti

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