Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari arricchite da esosomi da cellule mammiferiche infettate dal virus della dengue tipo 2

Summary

Qui descriviamo l'isolamento di vescicole extracellulari arricchite da esosomi da un supernatant cellulare infettato da virus Dengue tipo 2, seguito dalla caratterizzazione dell'integrità e distribuzione delle dimensioni della vescicola, e dalla valutazione dell'assenza di virus infettivo rilevabile tramite analisi della placca in condizioni sperimentali definite.

Abstract

Gli EV arricchiti di esosomi sono vescicole rilasciate da vari tipi cellulari in fluidi extracellulari come plasma, urina, saliva, medi di coltura cellulare e altri fluidi corporei. I loro diametri variano da 30 nm a 150 nm. Sono stati implicati in diversi processi cellulari, inclusi i comunicazioni cellulari e la modulazione immunitaria durante l'infezione. Basandosi su questi effetti, sono stati utilizzati per studiare la patogenesi di diversi virus. È difficile isolare EV arricchiti da esosomi da soprantantanti cellulari infettati da virus utilizzando le attuali tecniche di purificazione. Ciò è dovuto in gran parte alla sovrapposizione di dimensioni tra alcuni virus e i veicoli elettrici arricchiti da esosomi. Qui, miriamo a purificare EV arricchiti da esosomi da supernatanti di colture cellulari infettate da Dengue tipo 2. I veicoli elettrici arricchiti con esosomi sono stati isolati utilizzando un kit commerciale di isolamento per esosomi. Per gli EV isolati arricchiti con esosomi in questo protocollo, nessun virus infettivo è stato rilevato tramite test di placche nelle condizioni testate. Gli EV purificati arricchiti da esosomi sono stati caratterizzati utilizzando western blotting per tetraspanine, analisi di tracciamento delle nanoparticelle e microscopia elettronica a trasmissione per la conferma della dimensione. Abbiamo dimostrato che i nostri EV arricchiti da esosomi sono intatti e all'interno dell'intervallo normale del diametro degli esosomi di 30-150 nm. Nel complesso, il nostro protocollo fornisce un metodo economico per purificare EV arricchiti di esosomi da supernatanti cellulari infettati da virus, che può essere utilizzato per saggi funzionali a valle.

Introduction

Gli EV arricchiti da esosomi sono vescicole nanodimensionate rilasciate da ogni cellula del corpo. Sono sottotipi di vescicole extracellulari (EV) di origine endocitica. I veicoli elettrici arricchiti di esosomi sono stati scoperti per la prima volta nei mezzi di coltura di^{reticolociti 1}. Negli ultimi decenni, i veicoli elettrici arricchiti di esosomi sono stati purificati da diversi fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte materno, fluidi seminali e liquidi amniotici 2,3,4,5. Hanno un diametro che varia da 30 nm a 150^{nm 6}. Il loro rilascio nel compartimento extracellulare avviene tramite la fusione di corpi multivescicolari (MVB) con la membrana plasmatica cellulare. Nel contesto delle infezioni e della risposta immunitaria, è noto che le EV arricchite da esosomi possono provocare una risposta specifica nelle cellule dei mammiferi. Tali risposte includono il rilascio di citochine o alterazioni nella suscettibilità^{all'infezione 7,8,9}.

Il contenuto degli EV arricchiti di esosomi è influenzato da diversi fattori, il più importante è il tipo e lo stato della cellula che li produce^10,11. Inoltre, il loro contenuto determina anche gli effetti che hanno sulle cellule riceventi ingenue. Attualmente vengono utilizzati diversi metodi per isolare EV arricchiti di esosomi dai fluidi biologici. I metodi comuni includono ultracentrifugazione differenziale, precipitazione, cattura dell'immunoaffinità, cromatografia a esclusione di dimensioni, isolamento magnetico e isolamento microfluidico.

L'ultracentrifugazione differenziale è considerata una delle tecniche più utilizzate 12,13,14. Il metodo di purificazione con ultracentrifuga è costoso e richiede una notevole competenza tecnica. Questo metodo comporta anche una significativa perdita di EV a causa di molteplici passaggi di ultracentrifugazione. Infine, le EV arricchite da esosomi risultanti non sono prive di particelle virali attive a causa delle loro proprietà fenotipiche simili. Questo ha reso difficile la purificazione degli EV arricchiti da esosomi provenienti da supernanti cellulari infettati da virus. È quindi importante sviluppare un protocollo ottimizzato per ridurre efficacemente i livelli del virus della dengue (DENV) a livelli non rilevabili nella soluzione EV arricchita da esosomi, poiché i virus condividono dimensioni e densità simili con gli^{esosomi 15,16}.

Rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate, questo protocollo offre diversi vantaggi, tra cui la riduzione dei tempi di purificazione, la dipendenza da apparecchiature di laboratorio economiche e ampiamente accessibili, e la capacità di isolare EV arricchiti con esosomi senza contaminazioni virali vive rilevabili. Inoltre, sebbene metodi come la centrifugazione a gradiente di densità e l'isolamento a base magnetica possano offrire vantaggi, tra cui maggiore resa e maggiore purezza, questi approcci richiedono un primo passaggio di ultracentrifugazione. L'obiettivo di questo articolo è presentare un metodo per isolare EV arricchiti di esosomi da soprantantanti infetti senza virus infettivi rilevabili tramite test di placca nelle condizioni testate.

Protocol

1. Preparazione di mezzi privi di esosomi

1. Collegare un filtro da 0,1 μm alla base del ricevitore all'interno dell'armadio di biosicurezza di Classe II (BSC).
2. Versa asepticamente il siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore sul filtro e collegalo alla pompa a vuoto all'interno del BSC.
3. Ripeti il passaggio 1.2 con il flowthrough altre due volte.
4. Prepara un substrato completo per contenere il 10% della FBS triplicemente filtrata, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% della L-glutamina.
   NOTA: Il metodo di tripla filtrazione viene utilizzato per evitare la necessità di strumenti come un'ultracentrifuga.

2. Infezione da virus della dengue nelle cellule dei mammiferi

1. Coltivare cellule di Vero durante la notte in una fiaschetta di coltura T75^{cm 2} all'interno di un incubatore di coltura tissutale a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Il giorno seguente, verifica che la cellula sia tra il 70% e l'80% confluente e infetta le cellule con 0,1 molteplicità di infezione (MOI) di DENV-2 in 5 mL di mezzo intero e incuba a 37 °C con il 5% di_CO2 per 2 ore.
3. Dopo 2 ore, rimuovere il sovrantato e lavare la fiaschetta 3 volte con soluzione salina fosfatata (PBS) sterile.
4. Aggiungere 50 mL di mezzo intero nella fiaschetta e incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 4 giorni (poco prima di osservare gli effetti citopatici).

3. Purificazione degli esosomi a base di kit

1. Trasferire il materiale di coltura cellulare dalla fiaschetta a un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 200 × g per 15 minuti a temperatura ambiente.
2. Trasferisci il supporto in un nuovo tubo conico. Aggiungi 125 μL di reagente di precipitazione EV, seguito da 600 μL di resina. Vortice per 10 secondi e lascialo riposare per 10 minuti all'interno del BSC a temperatura ambiente.
3. Vortice per altri 10 secondi e centrifuga a circa 450 × g per 2 minuti a temperatura ambiente. Trasferire al BSC, scartare il surnatante e applicare 600 μL di buffer di risospensione al pellet.
4. Vortice per 10 secondi e incuba a temperatura ambiente per 15 minuti.
5. Vortice per altri 10 secondi e centrifuga a circa 25 × g per 2 minuti a temperatura ambiente.
6. Trasferire il sovrantato in una colonna di filtri spin e centrifugare a circa 4.500 × g per 1 minuto a temperatura ambiente. Raccogli il flowthrough contenente veicoli elettrici intatti arricchiti da esosomi e conservalo a -80 °C fino a quando non sarà pronto all'uso.
7. Confermare che l'EV arricchito con esosomi sia privo di virus viventi effettuando un test della^{placca 17}.
8. Caratterizzare l'EV arricchito da esosomi utilizzando microscopia elettronica per l'analisi delle dimensioni e del tracciamento delle nanoparticelle per la distribuzione delle dimensioni e la^{concentrazione 18}.

4. Caratterizzazione dell'EV arricchito da esosomi tramite western blot

1. Determinare la concentrazione proteica dell'EV arricchito da esosomi utilizzando saghi come la BCA.
2. Mescola volumi uguali di soluzione EV arricchita con esosomi e buffer RIPA e aggiungi 4x buffer di carico LDS (4:1).
3. Separare le proteine EV arricchite da esosomi utilizzando un gel Bis-Tris al 4-12%.
4. Trasferire le proteine a una membrana di nitrocellulosa.
5. Blocca per 1 ora usando latte scremato al 5% scilto in 1x TBS-Tween buffer a temperatura ambiente.
6. Diluire gli anticorpi primari usando il 5% di latte scremato fino a una diluizione 1:1.1000 e sondare la membrana per proteine esosomiche come CD63 e CD9 a 4 °C durante la notte.
7. Rimuovi l'anticorpo primario e lava 5 x 5 min con 1x TBS-Tween buffer su un dondolino.
8. Diluire l'anticorpo secondario (anti-Rabbit IgG HRP) con latte secco scremato fino a una diluizione 1:5.000 e incubare la membrana con questa soluzione per 1 ora a temperatura ambiente.
9. Rimuovi l'anticorpo secondario e lava 5 x 5 minuti con 1x TBS-Tween buffer su un oscillante.
10. Sviluppare la membrana utilizzando il reagente di rilevamento ECL e rilevare i segnali proteici utilizzando il dispositivo di imaging chemiluminescenze.

5. Caratterizzazione degli EV arricchiti da esosomi tramite microscopia elettronica a trasmissione

1. Aggiungere 5 μL di campioni di esosoma alle griglie di rame da 200 mesh con formvar e rivestimento al carbonio e lasciarli asciugare all'aria a temperatura ambiente.
2. Tingi la griglia con acetato di uranile acquoso all'1% per 60 secondi e asciuga all'aria.
3. Cattura l'immagine usando il TEM a 80^{kV 18}.

Results

Abbiamo analizzato l'EV arricchito da esosomi isolati come descritto nel protocollo utilizzando un test a placca per determinare se fosse possibile rilevare particelle DENV-2 attive nella miscela. Come mostrato nella Figura 1, nessuna placca è stata rilevata nelle condizioni testate rispetto al controllo positivo. Questi risultati indicano che il virus infettivo era al di sotto della soglia di rilevamento del test sulla placc...

Discussion

I recenti progressi nella ricerca sulle malattie infettive hanno dimostrato che i veicoli elettrici arricchiti di esosomi rilasciati da cellule ingenue infettate da virus svolgono un ruolo fondamentale nel modulare la risposta immunitaria^{dell'ospite 7,8,9}. Gli EV arricchiti di esosomi possono potenziare la difesa immunitaria promuovendo una risposta antivirale appropriata oppure, al contrario, f...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpi anti-coniglio legati IgG-HRP	Segnalazione cellulare	7074S	Anticorpo secondario
CD63	Segnalazione cellulare	52090S	Anticorpo primario
CD9	Segnalazione cellulare	13174S	Anticorpo primario
Kit per purificazione di esosomi per colture cellulari	Norgen	60600	Kit di purificazione degli esosomi
Virus della dengue 2	ATCC	VR-1584	Virus
DMEM	Fisher scientifico	11-995-073	Media culturali
EMEM	ATCC	30-2003	Media culturali
Microscopio elettronico a trasmissione FEI Talos F200X	Thermofisher Scientific
Eerum bovino fetale	Nevrologia	FBS002	Supplemento Media
Analizzatore di nanotracciamento delle particelle	Particle Metrix
Celle Vero	ATCC	CCL-81	Linea cellulare di mammiferi