Progettazione sperimentale e preparazione della trama
L'esperimento è stato condotto a luglio e all'inizio di agosto 2023 e nel 2024. Tipicamente, la stagione di coltivazione della soia in Ohio si svolge approssimativamente da aprile a novembre. I siti utilizzati durante la stagione di crescita 2023 si sono trovati nella contea di Clinton (39.488, -83.769) e nella contea di Union (40.296, -83.283), Ohio. I siti utilizzati durante la stagione di crescita 2024 si sono trovati nella contea di Clinton (39.489, -83.762), nella contea di Preble (39.893, -84.611) e nella contea di Licking (39.948, -82.501), Ohio.
L'esperimento utilizzò un progetto randomizzato a blocchi completi per controllare gli effetti spaziali all'interno del campo di soia. All'interno di ogni blocco, 5 lotti erano destinati a un trattamento specifico. I trattamenti includevano due fasi di crescita (R3 e R5) e due tempi di applicazione (prima mattina e mezzogiorno), oltre a un controllo non trattato. Questo ha portato alle seguenti 4 applicazioni di pesticidi su appezzamenti all'interno di ogni blocco: R3 a metà mattina, R3 a metà giornata, R5 a metà mattina, R5 a metà giornata. Le applicazioni durante la mattina o mezzogiorno avvenivano entro una finestra di ~2 ore, con le applicazioni a metà mattina circoscritte intorno alle 10:00 e a mezzogiorno intorno alle 12:30. Oltre ai 5 lotti di trattamento all'interno di ogni blocco, 3 appezzamenti sono stati designati come ricambi che potevano essere inseriti nei lotti di trattamento in caso di scarsa insediamento o crescita della soia. Gli stadi delle piante di soia sono stati determinati con l'aiuto di guide di staging come quella pubblicata dall'Università del Minnesota Extension39.
I blocchi di appezzamenti di soia erano distanziati di circa 1,016 m (40 in) per permettere ai ricercatori di camminare facilmente tra di essi. I lotti di soia erano di 1,9 m per 8,5 m (0,0016 ha; 6,25 ft per 28 ft), e la varietà di soia utilizzata per tutti i siti era Pioneer P35T155E (Corteva, Indianapolis, IN). In ogni appezzamento furono piantati 6 file distanziate a 38 cm (15 in). È stata utilizzata una percentuale di semina di 370.658 semi per ettare (150.000 semi per acro). Le api coinvolte nell'esperimento provenivano tutte da popolazioni locali. I ricercatori non hanno aggiunto api supplementari. Gli autori non avevano conoscenza né di apiari stazionari né migratori vicino ai siti sperimentali. Tutti i materiali utilizzati per l'esperimento sono elencati nella Tabella dei Materiali.
Preparazione dei pesticidi
I pesticidi utilizzati erano il fungicida Fitness (principio attivo di propiconazolo al 41,8%) e l'insetticida Fastac EC (principio attivo alfa-cipermetrina al 10,9%). Le tasse di applicazione del pesticida erano di 6 fl oz/ac (438,47 mL/ha) per il fungicida SBI e 3,8 fl oz/ac (277,70 mL/ha) per l'insetticida piretroide. Per preparare i pesticidi all'applicazione, sono stati miscelati 9,375 mL di fungicida SBI e 5,937 mL di insetticida piretroide con acqua per ottenere un volume finale di 3 L come miscela per il serbatoio. Durante la preparazione della miscela venivano indossati guanti resistenti ai prodotti chimici. La concentrazione finale di fungicida SBI nel serbatoio è stata di 3,125 mL per L. La concentrazione finale di insetticida piretroide nell'acquario era di 1,979 mL per L.
Applicazione dei pesticidi
Questa miscela veniva applicata ai singoli appezzamenti di soia all'interno di ogni blocco utilizzando uno spruzzatore portatile personalizzato. La miscela di pesticidi veniva applicata sulla sommità della chioma della soia, a una velocità di ~5 km all'ora. Dopo aver avviato il processo di applicazione del pesticida per un determinato trattamento, ci sono voluti ~10 minuti perché tutti i lotti ricevessero l'applicazione. Per ogni vasca da 3 L, si può coprire un'area di ~0,027 ha con la miscela di pesticidi. Il volume di spruzzo consumato per ettaro è di circa 113 L. Ciò significa che ~0,18 L della miscela del serbatoio sono stati applicati per ogni parcella. Per evitare che i pesticidi si propaghino ad altri appezzamenti a causa del vento, si evitavano le applicazioni nei giorni di vento. Durante l'applicazione del pesticida veniva indossato equipaggiamento completo di protezione individuale (camicia a maniche lunghe e pantaloni lunghi, guanti resistenti ai prodotti chimici, scarpe più calzini e occhiali protettivi). Se c'era un eccesso di miscela di pesticidi dopo la conclusione di un'applicazione, veniva smaltita secondo le raccomandazioni dell'agenzia statale per il controllo ambientale.
Configurazione/utilizzo del registratore
La configurazione generale e l'uso dei registratori audio sono simili a un protocollo descritto da altriautori 40. I registratori audio portatili (Sony ICD-PX370) venivano fissati a pali di plastica con gancio a rampa con nastro a gancio e loop, e una schiuma a celle aperte veniva posta sopra il microfono come parabrezza. Una copertura antipioggia stampata in 3D a forma di cono era fissata al paletto ~3 cm sopra il registratore per proteggerlo dalle intemperie.
I registratori audio venivano poi posizionati al centro di ogni appezzamento ~24 ore prima della prima applicazione di pesticida e lasciati in funzione per almeno 24 ore dopo ogni applicazione. Dodici registratori furono schierati per ogni giorno di applicazione, quattro per ogni gruppo orario del giorno (prima mattina, mezzogiorno, controllo) sia in R3 che in R5.
Elaborazione dei dati audio
Tutte le registrazioni audio venivano processate tramite lo strumento di apprendimento automatico "buzzdetect"41 , disponibile su: https://github.com/OSU-Bee-Lab/buzzdetect. Questo strumento è stato addestrato a distinguere i ronzi degli insetti da altri suoni che si verificano frequentemente in ambienti sperimentali, come automobili, mietitrebbie o aerei. Il programma non è in grado di distinguere l'Apis mellifera ronzante da altre specie di api. Tuttavia, buzzDetect è in grado di distinguere i rumori di ronzio da altri suoni di insetti non ronzanti, anche se rumori specifici (come i richiami dei grilli, soprattutto durante la notte) sono ancora difficili da distinguere. Istruzioni più specifiche su come eseguire buzzDetect si trovano su: https://buzzdetect.readthedocs.io/en/latest/gui/. Dopo l'analisi audio, R42 veniva utilizzato per calcolare la velocità di rilevamento entro intervalli di 1 ora e 8 ore.
Dati sulla defogliazione
Le valutazioni di defogliazione sono state effettuate valutando visivamente le foglie della chioma superiore della soia su 10 piante di ogni appezzamento coinvolto nell'esperimento, inclusi tutti i trattamenti e i lotti di controllo non trattati come raccomandato dall'Università del Nebraska Extension43. Queste valutazioni sono state effettuate 24 ore dopo l'applicazione del pesticida durante la fase di crescita R5.
Dati di resa
La soia veniva raccolta e la resa misurata in bushel per acro utilizzando una mietrebbia per parcelle e un sistema di pesatura a grano. Le misurazioni della resa sono state regolate al 13% di umidità. I lotti avevano 6 righe ciascuno; solo le 4 file centrali sono state raccolte per le misurazioni della ressa.
Analisi statistica
Tutte le statistiche sono state eseguite in R42. I dati sono stati analizzati con modelli lineari a effetti misti tramite il pacchettolme4 44 o con regressione beta tramite il pacchetto glmmTMB45. I dati grezzi di BuzzDetect sono disponibili nei materiali supplementari. Per questo studio sono stati analizzati tre tipi principali di dati. Dati medi sull'attività delle api nell'arco di 1 e 8 ore dopo l'applicazione di un pesticida, la resa di ciascun appezzamento di soia e la defogliazione osservata nella fase di crescita R5.
L'attività media delle api è stata ottenuta calcolando la proporzione di tempo positivo per il ronzio delle api in una finestra di 8 o 1 ora. La finestra di 1 ora è pensata per stimare gli effetti acuti dell'applicazione dei pesticidi sull'attività delle api, mentre la finestra di 8 ore è pensata per stimare gli effetti acuti e residui. I dati di tossicità residua non sono disponibili per l'alfa-cipermetrina, ma la tossicità residua per altri piretroidi è stata riportata a ~8 ore dopo l'applicazioneiniziale 46. Poiché il calcolo dell'attività delle api è proporzionale, le differenze di attività sono state analizzate utilizzando la regressione beta condotta con il pacchetto R "glmmTMB". I modelli hanno esaminato i tassi medi di rilevamento per 1 o 8 ore dopo l'applicazione di un pesticida e come variavano confrontando i lotti trattati con quelli di controllo (la condizione "spruzzata"), la fase di crescita della soia, l'ora del giorno in cui il pesticida è stato applicato o una fase di crescita e un periodo di interazione del giorno. Il confronto tra grafici trattati e di controllo è fatto riferimento dalla variabile "spruzzata" sia nelle formule del modello a 1 ora che a 8 ore.
Nel modello della finestra di un'ora, gli effetti fissi erano la condizione di "spruzzo", la fase di crescita, l'ora della giornata e uno stadio di crescita e un termine di interazione dell'ora della giornata. Il modello ha applicato sia un termine di interazione annuale che uno per anno per sito come effetti casuali. La formula completa del modello era:
(1)
Il tasso di rilevamento variabile riflette la media delle rilevazioni di api osservate rispetto alla finestra totale di osservazione—in questo caso, 1 ora. La variabile spruzzata corrisponde al fatto che un appezzamento abbia ricevuto l'applicazione di un pesticida o se fosse un appezzamento di controllo non trattato. La variabile time_of_day corrisponde al fatto che le rilevazioni siano state catturate dopo l'applicazione del pesticida a metà mattina o a metà giornata per il periodo di tempo desiderato. Lo stadio variabile corrisponde allo stadio di crescita in cui sono state catturate le rilevazioni.
Nel modello a finestra di 8 ore, gli effetti fissi erano la fase di crescita e la condizione di "spruzzato". Il modello da 8 ore include ore notturne per la spruzzatura di mezzogiorno, il che rende il confronto iniusto tra i tempi di spruzzatura di metà mattina e di metà giornata. Questo perché gli orari di applicazione a metà giornata non rilevano l'intera tossicità residua di 8 ore dovuta all'inattività delle api durante la sera, una componente importante di queste finestre di 8 ore. Pertanto, le applicazioni di metà giornata sono state escluse dal modello, così come i termini "ora del giorno" e "ora del giorno:fase". La formula completa per questo modello era:
(2)
Le variabili tasso di rilevamento, la spruzzata e la fase hanno lo stesso significato in questa formula come nella formula usata per le finestre di 1 ora. L'unica differenza è che il tasso di rilevamento variabile viene calcolato per una finestra di 8 ore. I dati di resa sono stati analizzati con un modello lineare a effetti misti. Il modello ha analizzato i bushel per acro per ogni appezzamento e come la resa variava in base al trattamento. L'effetto fisso nel modello era il trattamento, e il sito e l'anno erano stati adattati come effetti casuali. La formula completa del modello si scrive come:
(3)
La defogliazione delle foglie di soia è stata misurata come la percentuale media di superficie fogliare mancante per appezzamento. È stato utilizzato un modello lineare a effetti misti per confrontare l'effetto dell'ora del giorno di applicazione del pesticida sulla percentuale di defogliamento. L'effetto fisso nel modello era l'ora del giorno in cui i plot venivano spruzzati. Sito e anno sono stati adattati come effetti casuali. La formula completa del modello è:
(4)
Tutti i protocolli utilizzati in questo studio sono compilati nel File Supplementare 1.