Protocollo per la dissociazione a singola cellula, sequenziamento dell'RNA e isolamento delle cellule mioepiteliali e dei fibroblasti dalle ghiandole lacrimali e salivari invecchiate

Summary

Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per dissociare ghiandole lacrimali di topo invecchiati al fine di ottenere singole cellule vitali per il sequenziamento di RNA a singola cellula. La digestione enzimatica sequenziale e la gestione delicata preservano l'integrità cellulare, fornendo sospensioni di alta qualità adatte all'isolamento specifico per tipo cellulare e all'analisi trastrascrittomica dei cambiamenti associati all'invecchiamento nelle popolazioni di ghiandole lacrimali.

Abstract

L'invecchiamento della ghiandola lacrimale (LG) è associato a una riduzione della secrezione lacrimale e all'infiammazione cronica, contribuendo alla secchezza oculare. I cambiamenti legati all'età includono infiltrazione delle cellule immunitari, danni cellulari, accumulo lipidico nelle cellule acinar, deposizione della matrice extracellulare e dilatazione duttale. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) fornisce un approccio potente per il profilo dell'eterogeneità cellulare e i cambiamenti trascrizionali durante l'invecchiamento; tuttavia, generare sospensioni monocellulari vitali da tessuto LG invecchiato è tecnicamente difficile a causa dell'aumento della fibrosi, della fragilità cellulare e dell'accumulo lipidico. Questo studio presenta un protocollo ottimizzato e riproducibile per la dissociazione efficiente delle LG di topo anziani e l'isolamento di più tipi cellulari, adatto all'analisi scRNA-seq a valle. È importante notare che questo protocollo è applicabile anche a ghiandole lacrimali giovani, congiuntiva e altri tessuti esocrini. Il flusso di lavoro utilizza una strategia di dissociazione enzimatica a passo in grado utilizzando Collagenasi IV, Dispase II e DNasi I per la digestione iniziale dei tessuti, seguita da Accutasi per dissociare i cluster cellulari rimanenti e un trattamento finale con DNasi I per ottenere una sospensione unicellulare pulita. Per minimizzare i danni cellulari, tutta la plastica viene pre-rivestita con PBS contenente albumina sierica bovina, e il processamento dei tessuti viene eseguito in condizioni controllate di temperatura e agitazione. La lisi dei globuli rossi e la filtrazione sequenziale attraverso diversi filtri migliorano migliorano ulteriormente la purezza cellulare. L'isolamento specifico per tipo cellulare viene ottenuto utilizzando linee di topi di topi segnalati con fluorescenza (FACS). Utilizzando topi^{Acta2 GFP} e Pdgfra^EGFP, abbiamo isolato con successo cellule mioepiteliali e fibroblasti, rispettivamente, dopo immunocolorazione con un anticorpo EpCAM. FACS ha permesso la separazione della popolazione mioepiteliale EpCAM⁺/αSMA⁺, mentre le cellule EGFP⁺ dei topi^{Pdgfra EGFP}rappresentavano la popolazione di fibroblasti. Questo protocollo produce sospensioni monocellulari di alta qualità e vitali da LG anziane e può essere facilmente adattato ad altri tessuti fibrotici o esocrini invecchiati che richiedono dissociazione delicata e isolamento cellulare mirato.

Introduction

La ghiandola lacrimale (LG) è una ghiandola esocrina tubuloacinar responsabile della secernenza dello strato acquoso della pellicola lacrimale. Durante tutta la vita, la superficie corneale e la LG sono esposte a infezioni batteriche e virali, che possono portare a una disordinazione sistemica delle cellule epiteliali, all'induzione di risposte infiammatorie croniche, all'infiltrazione delle cellule immunitarie nella LG e alla mancanza di rigenerazione. L'invecchiamento è accompagnato da un aumento dell'incidenza di malattie infiammatorie^{croniche 1}. Tra queste, la malattia dell'occhio secco (DED) è una delle dieci cause più comuni di disabilità visiva a livello mondiale ed è un fattore importante della diminuzione dell'indipendenza, della mobilità e del funzionamento quotidiano nella popolazione^{anziana 2}. Una causa primaria della DED è la disfunzione LG³.

Con l'avanzare dell'età, il LG del topo e dell'uomo subiscono notevoli alterazioni strutturali e funzionali, tra cui atrofia delle cellule acinar, dilatazione duttale, infiltrazione delle cellule immunitarie, fibrosi e deposizione^lipidica 4,5,6,7. Questi cambiamenti degenerattivi sono accompagnati anche da infiammazione cronica della LG e fibrosi ^tissutale 3,5,8,9. Nonostante la chiara associazione tra invecchiamento e patologia LG, i meccanismi molecolari e cellulari che guidano questi cambiamenti rimangono poco compresi.

Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula consente una profilazione completa delle popolazioni cellulari e dei loro cambiamenti trascrizionali durante^{l'invecchiamento di 10} anni. Questo approccio consente un'identificazione imparziale di distinti tipi cellulari e stati all'interno della ghiandola lacrimale, rivelando come l'invecchiamento alteri i profili di espressione genica, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e le interazioni epiteliali-mesenchimali.

Attualmente sono disponibili numerosi metodi di dissociazione dei tessuti, inclusi i metodi di dissociazione^{meccanica 11} e protocolli che prevedono la digestione enzimatica calda a 37 °C con enzimi come Collagenase, Dispase o^{Tripsina 12}. Sono state descritte varie strategie di dissociazione per un'ampia gamma di tessuti, tra cui fegato, polmoni, reni, cuore e molteplici tipi^{tumorali 13,14,15}. Tuttavia, preparare sospensioni monocellulari vitali da tessuto delle ghiandole lacrimali invecchiate rimane tecnicamente difficile a causa dell'aumento della fibrosi e della fragilità cellulare. Inoltre, come abbiamo già riportato, il recupero di fragili cellule acinar può essere difficile, poiché i cambiamenti associati alla dissociazione nella permeabilità della membrana possono aumentare il rilascio di RNA ambientale da queste grandi cellule secretorie, contribuendo al segnale di fondo nei dataset a valle di singole^{cellule 16}. Sebbene diversi studi abbiano riportato atlanti scRNA-seq di ghiandole lacrimali invecchiate, la qualità di questi dataset è stata limitata da metodi di dissociazione subottimali, con conseguente resa di cellule epiteliali rispetto a popolazioni stromali. Qui presentiamo un protocollo dettagliato e ottimizzato per la dissociazione efficiente della LG di topo invecchiata e l'isolamento di popolazioni cellulari distinte per analisi scRNA-seq a valle e RNA-seq bulk (Figura 1). Questo approccio fornisce uno strumento potente per studiare i meccanismi molecolari alla base della disfunzione delle ghiandole lacrimali legata all'età.

Il protocollo consente la generazione di sospensioni monocellulari di alta qualità e vitali da ghiandole lacrimali invecchiate, fornendo una base affidabile per analisi trascricomiche complete. Consente un'identificazione dettagliata e la caratterizzazione molecolare di diverse popolazioni cellulari, incluse cellule mioepiteliali, fibroblasti e altri tipi cellulari epiteliali e stromali che subiscono cambiamenti legati all'età. Il flusso di lavoro ottimizzato preserva l'integrità cellulare e minimizza gli artefatti trascrizionali indotti dallo stress, garantendo una rappresentazione accurata degli stati cellulari in vivo. Inoltre, la metodologia è ampiamente applicabile e può essere adattata ad altre ghiandole esocrine o tessuti fibrotici, dove la dissociazione dei tessuti delicati e l'isolamento preciso di popolazioni cellulari distinte sono fondamentali per studi a valle di singola cellula.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso lo Scripps Research Institute (protocollo n. 08-0123; approvato il 29 agosto 2023). La cura degli animali presso lo Scripps Research Institute è accreditata dall'Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC). I topi sono stati mantenuti con un ciclo standard di 12 ore di luce e 12 ore di buio, con cibo e acqua forniti ad libitum. Per gli esperimenti sono state utilizzate linee transgeniche di topi^{Pdgfra EGFP} e ^{Acta2 GFP}. Le informazioni dettagliate sulle linee di topi sono fornite nella sezione "Tabella dei materiali".

1. Considerazioni generali

1. Segui le Precauzioni Universali^{NIH 17} quando si maneggiano materiali biopericolosi e tessuti animali. Esegui tutto il lavoro animale in conformità con i protocolli IACUC approvati e i livelli di biosicurezza animale designati.
2. Segui le pratiche standard di sicurezza di laboratorio evitando la pipetazione in boca, minimizzando l'uso di oggetti pungenti, utilizzando un armadietto di sicurezza biologica per le procedure di generazione di aerosol, indossando DPI appropriati, smaltendo i pezzi pungenti in contenitori resistenti alle perforazioni e etichettando e decontaminando correttamente tutti i rifiuti biopericolosi prima dello smaltimento.
3. Decontaminare regolarmente superfici di lavoro e attrezzature utilizzando disinfettanti appropriati (ad esempio, candeggina al 10%).
4. Eseguire tutti i passaggi di centrifugazione a 4 °C in una centrifuga refrigerata pre-raffreddata per preservare la vitalità della cella e minimizzare lo stress indotto dalla temperatura.
5. Ottimizzare le impostazioni del citometro a flusso e del selezionatore cellulare per la configurazione specifica dello strumento e regolare i parametri per ciascun coniugato anticorpi-fluoroforo utilizzando campioni di controllo appropriati. Utilizzare lo stesso citometro e strumento di ordinamento, con impostazioni fisse e ottimizzate, durante una serie sperimentale per minimizzare la variabilità.
6. Prepara le soluzioni selezionate fino a un giorno di anticipo e conserva adeguatamente fino all'uso. Prepara tutte le soluzioni in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza.
7. Tieni separate le soluzioni contenenti Ca²⁺/^{Mg 2+} dai buffer contenenti EDTA per prevenire la chelazione durante le fasi enzimatiche. Tutti i reagenti necessari per questa procedura sono indicati nella Tabella dei Materiali.

2. Plastica

1. In condizioni sterili, pre-coat piatti, tubi e siringhe con 1x PBS + 1% BSA per 1 ora a temperatura ambiente (RT). Aspira e mantiene tutto sterile fino all'uso.
2. Punte della pipetta pre-rivestimento. Aspira e somministra 1x PBS + 1% BSA tre volte con ogni punta per rivestire la superficie interna. Rimetti le punte rivestite nella scatola della punta sterile e lasciale asciugare tutta la notte in un incubatore sterile. Usa queste punte pre-rivestite il giorno successivo durante la procedura di isolamento cellulare.

3. Soluzioni e buffer

1. DNasi I Stock (5 mg/mL)
   1. Preparare 150 mM di NaCl dal calcio 5M NaCl e filtrare sterilmente la soluzione.
   2. Aggiungere 1 M CaCl₂ alla soluzione filtrata di NaCl da 150 mM per ottenere una concentrazione finale di 5 mM di CaCl₂.
   3. Risospendere 100 mg di DNasi I in 20 ml di tampone da 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ per ottenere una soluzione di base di DNasi I da 5 mg/mL.
   4. Preparare aliquote da 500 μL e conservarle a −20 °C per un massimo di 6 mesi. Evitare cicli ripetuti di congelamento-disgelo per evitare la perdita di attività enzimatica.
2. Mezzo digeritivo
   1. Il giorno prima dell'esperimento, prepara la miscela di base del mezzo mescolando DMEM/F12 con il 0,5% di BSA e filtrandola.
   2. Aggiungere 1M HEPES e 1M CaCl₂ al mezzo base DMEM/F12 / 0,5% BSA per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 15 mM e 3 mM.
   3. Aggiungi tutti i seguenti enzimi subito prima dell'uso: Collagenasi IV (1 mg/mL; 125 U/mL), Dispase II (2,5 mg/mL; 1,25 U/mL) e DNasi I (20 U/mL; 0,05 mg/mL dal stock da 5 mg/mL).
3. Mezzo Bloccante 1 (BM1)
   1. Aggiungere 1M HEPES e 0,5M EDTA a 1x HBSS per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 15 mM e 3 mM.
4. Medio Bloccante 2 (BM2)
   1. Aggiungere FBS e 1M HEPES a DMEM/F12 per ottenere concentrazioni finali rispettivamente del 10% e 15 mM.
5. Mezzo per il trattamento della DNasi
   1. Il giorno prima dell'esperimento, prepara il substrato di base mescolando 1x HBSS con 0,5% di BSA e filtrandolo.
   2. Aggiungere 1M HEPES, 1M CaCl₂ e 1M MgCl₂ al mezzo base 1x HBSS / 0,5% BSA per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 10 mM, 1,5 mM e 2 mM.
   3. Subito prima dell'uso, aggiungi DNasi I (200 U/mL; 0,5 mg/mL dal magazzino da 5 mg/mL) al mix preparato.
6. Medio Bloccante 3 (BM3)
   1. Utilizzare lo stesso mezzo di base filtrato 1x HBSS / 0,5% BSA e aggiungere 1M HEPES e 0,5M EDTA per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 10 mM e 1 mM.
7. Medio 4 Bloccante (BM4)
   1. Utilizzare lo stesso mezzo di base filtrato 1x HBSS / 0,5% BSA e aggiungere 1M HEPES per ottenere concentrazioni finali di 10 mM.
8. FACS Buffer
   1. Il giorno prima dell'esperimento, prepara il mezzo di base mescolando 1x DPBS con 0,5% di BSA e filtrandolo.
   2. Aggiungere 1M HEPES e 0,5M EDTA a 1x DPBS / 0,5% BSA per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 25 mM e 1 mM.
9. Mezzo per scRNAseq (MSC)
   1. Il giorno prima dell'esperimento, prepara il mezzo mescolando 1x DPBS con lo 0,4% di BSA e filtrandolo.

4. Prelievo e microdissezione dei tessuti (~ 40 - 50 min)

1. Anestetizzare il topo con isoflurano e sopportare l'eutanasia tramite lussazione cervicale secondo le linee guida istituzionali IACUC.
2. Usa pinze sottili e forbici per incidere la pelle tra l'occhio e l'orecchio e ritrarla delicatamente per esporre la ghiandola lacrimale.
3. Per isolare la ghiandola, sollevarla leggermente usando una pinza a punta smussata e separare con cura il tessuto connettivo circostante stuzzicarlo delicatamente con un movimento circolare. I confini della ghiandola lacrimale sono chiaramente visibili, permettendo una facile separazione dai tessuti adiacenti, inclusa la ghiandola parotide.
4. Trasferire la ghiandola lacrimale (ogni ghiandola pesa circa 10-25 mg, a seconda del peso, sesso e età del topo) in una piastra di Petri da 35 mm contenente 2 mL di PBS freddo 1x su ghiaccio. Al microscopio dissezionale, rimuovere il grasso residuo e rimuovere con cura la capsula del tessuto connettivo usando due pinze.
5. Confermare la marcatura cellulare esaminando un piccolo frammento di tessuto al microscopio a fluorescenza e verificando il segnalatore o il segnale fluorescente atteso prima di procedere con la digestione enzimatica.
6. Posiziona una piastra di Petri sterile da 35 mm sul ghiaccio e aggiungi 800-1000 μL di PBS freddo 1x (volume regolato in base alla dimensione della ghiandola) al centro della piastrella. Trasferisci una ghiandola lacrimale nel PBS 1x.
7. Utilizzando due bisturi sterili, trita finemente la ghiandola in piccoli frammenti finché non raggiunge una consistenza morbida e pasta. Assicurati che i frammenti di tessuto rimangano immersi nel PBS durante tutto il processo di tritatura, ma non lasciarli fluttuare liberamente sul piatto.
8. Raccogli i frammenti di tessuto da un lato della piastrella, aspira PBS residuo e lava i frammenti con 1 mL di PBS fresco e freddo.
9. Trasferire i frammenti di tessuto lavati in una piastra a 6 pozzi contenente 2 mL per pozzetto di mezzo digeritivo preriscaldato. Lasciare la piastra sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non saranno processati.

5. Prima digestione enzimatica (~1,5 - 2 h)

1. Incubare il piatto in un bagno d'acqua agitato a 37 °C, 60 giri al minuto per 30 minuti.
2. Triturare delicatamente il tessuto 15 volte con una punta larga da 1 mL, poi riportare la piastra nel bagno d'acqua a 37 °C, 60 giri/min per altri 30 minuti.
3. Triturare delicatamente il campione 10 volte con una punta normale da 1 mL, poi riportare il piatto nel bagno d'acqua agitato a 37 °C, 60 giri/min per altri 30 minuti.
4. Triturare delicatamente il campione 10 volte e trasferire la sospensione della cella in tubi microcentrifughe Dolphin da 2 mL.
5. Aggiungi 1 mL di BM1 freddo in ciascun pozzo della lastra per raccogliere il residuo di mezzo digeritivo contenente cellule residue. Posiziona la piastra sul ghiaccio fino al passaggio successivo.
   NOTA: Se a questo stadio sono ancora osservati grandi gruppi cellulari o frammenti di tessuto, estendere ogni fase di incubazione di ulteriori 10-20 minuti. Non superare il numero indicato di passati di triturazione (massimo 10-15 passaggi delicati), poiché uno stress meccanico aggiuntivo comprometterà la vitalità cellulare.

6. Terminazione dell'attività enzimatica e lavaggi primari (~ 15 min)

1. Centrifugare i tubi contenenti la sospensione della cella a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
2. Scartare il soprandante. Trasferire il BM1 da ciascun pozzetto della piastra iniziale (contenente le cellule residue) nel tubo corrispondente e risospendere delicatamente i pellet delle celle.
3. Risciacquare ogni pozzo con ulteriori 600 μL di BM1 freddo e combinare il lavaggio con il tubo corrispondente per raccogliere tutte le cellule rimanenti.
4. Sospezione delicata della sospensione della cella, centrifugare di nuovo a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il sovrantante.

7. Trattamento con Accutasi e DNasi (~ 30 - 35 min)

1. Aggiungi 1 mL di Accutase ai pellet cellulari e risospendi delicatamente. Incuba il tubo solo per 5-10 minuti a 37 °C e 60 giri al minuto.
   NOTA: Posizionare il tubo su un fianco durante l'incubazione per evitare che le cellule si depositino e si attacchino al fondo.
2. Triturare delicatamente 10 volte usando una punta di pipetta da 1 mL.
3. Aggiungi 1 mL di BM2 freddo per interrompere la reazione enzimatica diluendo l'Accutasi.
4. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
5. Risospendere le cellule nel mezzo per il trattamento con DNasi, riempiendo il tubo fino in alto.
6. Incubare per 10 minuti a RT, risospendendo delicatamente una volta dopo 5 minuti.
7. Nel frattempo, si pre-umidisce un filtro a celle da 70 μm con 1 mL di BM3 posizionato su un tubo conico da 15 mL.
8. Trasferisci la sospensione a celle sul colino.
9. Risciacqua il tubo di raccolta originale con 1 mL di BM3 e trasferisci il risciacquo sullo stesso colino.
10. Lava il colino con altri 5 mL di BM3.

8. Conteggio delle cellule e controllo di vitalità

1. Prendi 10 μL della sospensione delle cellule filtrate in BM3 e mescola con 10 μL di Trypan Blue. Determina la concentrazione e la vitalità cellulare usando l'esclusione del Trypan Blue e quantifica tramite conteggio manuale o un contatore automatico di celle (ad esempio, Countess 3 Automatic Cell Counter). Prosegue solo se la vitalità raggiunge la soglia richiesta per applicazioni a valle (tipicamente ≥70-80%).
   NOTA: Consideri il volume totale ora ~7-9 mL nel tubo da 15 mL quando calcoli la ressa.
2. Procedere secondo l'applicazione a valle. Per scRNA-seq, proseguire alla Sezione 9. Per la selezione cellulare basata su citometria di flusso, proseguire alla Sezione 10.
   NOTA: Il flusso di lavoro scRNA-seq include la lisi dei globuli rossi e la rimozione magnetica delle cellule morte per ridurre detriti e RNA ambientale e migliorare la qualità dei dati. Tuttavia, questi passaggi possono influenzare preferenzialmente la rappresentazione dei tipi cellulari influenzando preferentemente popolazioni epiteliali fragili o rare, incluse le cellule acinar. Per la selezione basata su citometria di flusso, questi passaggi sono stati omessiti per massimizzare il recupero e preservare gli epitopi della superficie cellulare. La selezione del flusso di lavoro dovrebbe quindi essere guidata da obiettivi sperimentali, dando priorità alla qualità dei dati per scRNA-seq o recupero cellulare e alla fattibilità per l'ordinamento e le applicazioni a valle.

9. Preparazione delle cellule per scRNA-seq (~ 1 - 1,5 h)

1. Prepara una soluzione di 1x RBC ricostituendo la soluzione 10x con acqua milliQ.
2. Centrifugare il tubo da 15 mL contenente la sospensione della cella a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
3. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di 1x tampone di globuli rossi e incubare per 5 minuti a RT.
4. Centrifugare di nuovo a 300 × g per 5 minuti a 4 °C e eliminare il soprandante.
5. Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di BM4 fredda.
6. Prendere 10 μL della sospensione cellulare filtrata in BM4 e mescolare con 10 μL di Trippan Blue per valutare la concentrazione e la vitalità cellulare.
7. Pre-bagna il filtro MACS da 30 μm con 1 mL 1x HBSS e filtra la sospensione della cella attraverso il filtro in un tubo da 15 mL.
8. Risciacquo il tubo di raccolta precedente con 2 mL di BM4 freddo e passa il lavaggio attraverso lo stesso colino nel tubo da 15 mL.
9. Lava il colino con altri 10 mL di BM4 freddo.
10. Centrifuga il tubo da 15 mL a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e rimuovi completamente il soprantantante.
11. Sospendere delicatamente il pellet in 100 μL di microsfere MACS e incubare per 15 minuti a RT.
12. Nel frattempo, prepara 1x Binding Buffer (BB) dal kit di rimozione delle cellule morte usando acqua sterile doppiamente distillata.
13. Lava una colonna MS MACS con 500 μL 1x BB per equilibrarla.
14. Aggiungi 400 μL BB al campione, risospendi le cellule con microsfere e applica l'intero volume sulla colonna di MS equilibrata. Raccogli il flusso in un tubo da 15 mL.
15. Lavare la colonna quattro volte con 500 μL BB ciascuna, raccogliendo tutte le frazioni di flusso diretto.
16. Centrifugare il flusso raccolto a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
17. Risospendere le celle in 400 μL di buffer MSC e trasferire la sospensione su un tubo da 1,5 mL.
18. Risciacqua il tubo precedente con un tampone MSC da 700 μL e raccogli il risciacquo con il campione.
19. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
20. Risospendere il pellet cellulare nel buffer MSC utilizzando una punta a larga cilindrata fino a un volume finale di circa 1,5 mL.
21. Centrifugare di nuovo a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il sovrantantante.
22. Lasciare ~100 μL di sovrantante, risospendere delicatamente la pellet e contare nuovamente le cellule mescolando celle da 6 μL con 6 μL di Trippan Blue.
23. Regolare il volume finale con il buffer MSC per raggiungere 700-1200 cellule/μL e ricontare le celle per confermare la concentrazione cellulare.
24. Assicurarsi che la vitalità cellulare dopo la lisi dei globuli rossi e la rimozione delle cellule morte sia ≥ 70% (tipicamente 70-95%) prima del caricamento per il processamento del cromo 10x (Soluzione Single Cell 3' di cromo V3).
25. Applicare criteri di controllo qualità di base scRNA-seq: nUMI > 500, nGene > 200 e frazione genica mitocondriale <15%. Utilizzare una soglia mitocondriale permissiva (15%) per preservare popolazioni epiteliali con maggiore attività metabolica. Includere solo cellule che soddisfano tutti i criteri di QC nelle analisi a valle.
    NOTA: Queste soglie QC rappresentano valori di esempio derivati dai nostri dataset (Figura Supplementare 1) e sono state riportate nella nostra precedente^{pubblicazione 18}.

10. Preparazione delle cellule per la selezione cellulare basata su citometria di flusso (~ 1 - 1,5 h)

1. Per l'isolamento basato su citometria di flusso di MEC e fibroblasti, sono state utilizzate rispettivamente linee di topi reporter ^{Pdgfra EGFP} e Acta2 GFP, per consentire un'identificazione precisa di ciascuna popolazione.
2. Centrifugare il tubo da 15 mL con sospensione a celle a 400 × g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
3. Risospendere il pellet cellulare nel buffer FACS freddo a una concentrazione finale di 5 x 10⁵ a 2 x 10⁶ celle per 100 μL.
4. Preparare i controlli necessari per la compensazione FACS: controllo negativo - cellule non colorate da un topo di tipo selvatico, controllo della fluorescenza di fondo - cellule non colorate da topi ^{Acta2 GFP} e Pdgfra^EGFP, controllo con una singola colorazione - cellule di un topo di tipo selvatico colorate individualmente con ciascun anticorpo usato nell'esperimento.
   NOTA: Per ogni campione di controllo, utilizzare almeno 1 × 10⁵ cellule risospese in 100 μL di buffer FACS.
5. Aggiungi FcBlock (1:100) e incuba per 5 minuti sul ghiaccio.
6. Aggiungere anticorpo monoclonale CD326 (EpCAM)-APC (1:100) o CD140a (PDGFRα) (1:100). Incubare per 45 minuti sul ghiaccio, protetto dalla luce.
7. Sospezione delicata delle cellule ogni 15 minuti durante l'incubazione degli anticorpi.
8. Riempi ogni tubo fino in cima con un tampone FACS freddo e centrifuga a 300 × g per 5 minuti a 4 °C.
9. Prepara la soluzione operativa FxCycle (1:1000) nel buffer FACS.
10. Risospendere i campioni in 1 mL e controllare 500 μL di buffer FACS freddo con FxCycle.
11. Trasferire tutti i campioni nei tubi FACS e tenerli sul ghiaccio, protetti dalla luce.
12. Procedere immediatamente al Nucleo di Citometria a Flusso per la classificazione. Raccogliere le cellule ordinate in FACS buffer, mezzo di coltura, tampone di lisi o RNAlater, a seconda delle applicazioni a valle.
    NOTA: Le impostazioni degli strumenti (ad esempio, dimensione e pressione dell'ugello) e i tassi di evento dipendono dalla configurazione del classificatore e dalla popolazione di celle target; pertanto, si raccomanda una prima esecuzione pilota per determinare i parametri ottimali per ogni esperimento.

Results

La dissociazione delle ghiandole esocrine invecchiate è difficile a causa dell'accumulo di lipidi e dell'estesa deposizione di ECM. Le ghiandole invecchiate mostrano una marcata infiltrazione linfocitaria e una pronunciata dilatazione duttale con il materiale intraluminale, riflettendo i cambiamenti strutturali e infiammatori che complicano la dissociazione tissutale. La ghiandola lacrimale è un organo esocrino composto da tre principali tipi di cellule epiteliali: cellule acinarie, duct...

Discussion

Qui, abbiamo ottimizzato e valutato un protocollo significativamente migliorato per generare sospensioni monocellulari da tessuti esocrini, concentrandoci sulla ghiandola lacrimale. Utilizzando questo approccio, abbiamo generato sospensioni a singola cellula pulite e di alta qualità sia da LG vecchi che giovani, adatte al sequenziamento a singola cellula e ad altre applicazioni a valle.

Nonostante la disponibilità di numerosi protocolli di dissociazione tissu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiale
BSA	Sigma-Aldrich	A4919
CaCl2 (1  Soluzione M)	BioVision	B1010-100
Collagenasi IV	Sigma-Aldrich	C5138
Kit per la rimozione delle celle morte	Miltenyi biotec	130-090-101
Kit per la rimozione delle celle morte	Miltenyi biotec	130-090-101
Dispase II	Roche	C756V28
DNasi I	Sigma-Aldrich	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14190-144
Siero fetale bovino, IgG ultra-basso	Gibco	# 16250078
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)	Corning (Thermo Fisher Scientific)	21-022-CV
HEPES (1  Soluzione M)	Sigma-Aldrich	H0887
Soluzione di isoflurano	Covertus	# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 & micro; m)	Miltenyi biotec	130-098-458
MACS® SmartStrainers (70 & micro; m)	Miltenyi biotec	130-110-916
Media/F12 (DMEM/F12)	Millipore	DF-042-B
MgCl2 1M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
Colonne MS	Miltenyi biotec	130-042-201
NaCl (stock 5M)	Invitrogen e commercio;	AM9759
Compresse di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P8920-500ML
Soluzione per la lisi dei globuli rossi (10 volte)	Miltenyi biotec	130-094-183
StemPro Accutasi	Gibco, Thermo Fisher Scientific	A1110501
Soluzione Trippan Blue, 0,4%	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061
EDTA ultra-puro (0,5M, pH 8,0)	Invitrogen	15575020
Anticorpi
CD140a (PDGFRA) Anticorpi monoclonali (APA5), APC-eFluor & trade; 780, Rat / IgG2a, kappa	eBioscienza	47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (bloccante Fc CD16/CD32)	BD in Bioscienze	553141; RRID:AB_394656
FxCycle & trade; Macchia violetta	Thermo Fisher Scientific	F10347
Anticorpo monoclonale ratto CD326 (EpCAM)-APC (G8.8), IgG2a ratto, kappa	eBioscienza	17-579182; RRID:AB_2716944
Topi
Acta2GFP	Gentile regalo dal dottor Ivo Kalajzic	PMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J	Il laboratorio Jackson	RRID:IMSR_JAX:007669
Equipaggiamento
Invitrogen e commercio;   Contessa & Trade; 3 Contatore Automatico delle Celle	Fisher Scientific	A49862; RRID:SCR_026963