Sintesi, incapsulamento dell'emoglobina e PEGilazione biortogonale in nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 per applicazioni di somministrazione di ossigeno

Sommario

Questo protocollo dettaglia la sintesi, l'incapsulamento dell'emoglobina e la PEGilazione superficiale di nanoparticelle gerarchicamente porose di UiO-66 progettate per la somministrazione di ossigeno. La procedura combina l'ingegneria dei difetti con la coniugazione biortogonale promossa dalla deformazione per generare portatori altamente permeabili e fisiologicamente stabili, adatti alle applicazioni biomediche.

Abstract

I portatori di ossigeno a base di emoglobina (HBOC) sono una piattaforma importante per la somministrazione di ossigeno al fine di mitigare l'ipossia in diversi contesti biomedici. Tuttavia, l'emoglobina libera (Hb) è instabile e vasoattiva al di fuori dei globuli rossi. Qui presentiamo un protocollo passo dopo passo riproducibile e scalabile per la fabbricazione di nanoparticelle di UiO-66 gerarchicamente porose (HP-UiO-66 NP) che incapsulano Hb e sono stabilizzate da gusci bioortogonali di polietilenico glicole (PEG). La mesoporosità gerarchica viene introdotta tramite modulazione dell'acido dodecanoico e successiva lavaggio acido, ottenendo NP HP-UiO-66-NH₂ con cristallinità preservata e isoterme combinate di tipo I/IV_N2 . Le ammini di superficie vengono convertite in azidi (HP-UiO-66-N₃ NP), permettendo la cicloadizione alchina-azide promossa da cenici senza catalizzatore (SPAAC) di produrre Hb@HP-UiO-66-PEG NP. Il flusso di lavoro comprende: i) ingegneria dei difetti degli NP UiO-66-NH₂, ii) rimozione dei modulatori, iii) installazione di azidi, iv) carico di Hb in mezzi acquosi tamponati e v) PEGylazione mediata da SPAAC. Parametri sperimentali critici, modalità standard di guasto e strategie di risoluzione dei problemi sono dettagliati in ogni fase per migliorare la riproducibilità inter-laboratorio. Il protocollo è adatto alla produzione su scala grammatica di NP HP-UiO-66-NH₂ per lotto. Efficienze di incapsulamento di ~35% (contenuto di carico ~24 wt%) per Hb si ottengono in condizioni miti, con NP ridispersibili con diametro idrodinamico di ~140 nm e bassa polidispersione dopo la PEGilazione. Una caratterizzazione fisicochimica completa verifica l'integrità della struttura, la mesoporosità, la chimica superficiale efficace e una corona diffusa di PEG larga fino a ~12 nm. I saghi funzionali mostrano ossigenazione/deossigenazione reversibile dell'Hb incapsulato, indicando la capacità di trasporto dell'ossigeno mantenuta. La PEGylation migliora notevolmente la stabilità colloidale e strutturale nella soluzione salina, HEPES e nel siero, prevenendo la degradazione indotta da fosfato osservata nei corrispettivi non PEGylati. Integrando linee guida dettagliate per la risoluzione dei problemi, visualizzazione assistita da video dei passaggi critici e considerazioni di scala, questo protocollo modulare offre un percorso robusto e accessibile verso HBOC basati su framework metal-organic. La strategia è facilmente adattabile ad altre biomacromolecole o enzimi che richiedono microambienti protettivi ma accessibili per la somministrazione terapeutica.

Introduzione

Un'ossigenazione adeguata è fondamentale per una terapia efficace e una guarigione dei tessuti in diversi contesti^{biomedici 1}. In caso di trauma e emorragia chirurgica, una grave perdita di ossigeno può essere pericolosa per la vita, evidenziando la necessità di sostituti sicuri del sangue quando il sangue donato non è^{disponibile 2}. In oncologia, le regioni tumorali ipossiche limitano l'efficacia dei trattamenti dipendenti dall'ossigeno, e la somministrazione supplementare di ossigeno può aumentare notevolmente l'efficacia^terapeutica 3,4,5,6. L'ossigeno svolge anche un ruolo centrale nella guarigione delle ferite, dove l'aumento della disponibilità di ossigeno favorisce l'angiogenesi e la riparazione dei^{tessuti 7}. Analogamente, in condizioni ischemiche e trapianti di organi, i portatori di ossigeno possono ridurre la lesione ipossica e migliorare la vitalità e il recupero dei^{tessuti 8,9}.

I portatori di ossigeno sintetici a base di emoglobina (Hb) rappresentano un approccio promettente per mitigare l'ipossia¹⁰. Tuttavia, l'Hb al di fuori dei globuli rossi (globuli rossi) è intrinsecamente instabile e si dissocia rapidamente in dimeri che possono causare nefrotossicità, danni ossidatori e vasocostrizione dovuti alla riparazione di ossido^{nitrico 11}. Per mitigare queste sfide, sono state sviluppate strategie di incapsulamento per stabilizzare l'Hb all'interno di nanocarrier biocompatibili come i^{liposomi 12}, i^{polimeromi 13} e le nanoparticelle polimeriche (NPs^{) 14,15,16,17}. Sebbene questi sistemi migliorino la stabilità dell'Hb, ottenere un'elevata efficienza di incapsulamento mantenendo la funzione nativa di legame dell'ossigeno rimane^{una sfida 18}. Inoltre, la conversione ossidativa in metathemoglobina e perdite di eme può compromettere le prestazioni di trasporto di ossigeno¹⁹. La rapida eliminazione e la perdita prematura di Hb limitano ulteriormente i tempi di circolazione e la traslazione^{clinica 20}.

I framework metal-organici (MOF) sono recentemente emersi come nanopiattaforme versatili per la somministrazione di farmaci e biomacromolecole grazie alla loro architettura cristallina, all'ampia superficie e alla porosità^{sintonizzabile 21}. Composti da nodi metallici coordinati con link organici, i MOF permettono diffusione molecolare e personalizzazione strutturale, rendendoli attraenti per applicazioni biomediche. Tuttavia, la maggior parte dei MOF possiede prevalentemente cavità microporose (<2 nm), che limitano severamente l'incapsulamento post-sintetico di macromolecole come proteine, acidi nucleici o^enzimi 22,23,24,25. Un approccio per superare questa limitazione è la mineralizzazione biomimetica in situ, dove le biomolecole agiscono come centri di nucleazione durante la crescita del MOF, come dimostrato per ZIF-8 e ZIF-90 26,27,28. Nonostante la sua efficacia, questa strategia richiede condizioni di sintesi lievi, che limitano l'intervallo delle chemiche MOF^{compatibili 29,30}.

UiO-66, un MOF a base di zirconio costruito con nodi ottaedrici_{Zr 6}O₄(OH)₄ e collegatori 1,4-benzendicarboxylate (BDC), si distingue per la sua eccezionale stabilità chimica e^{biocompatibilità 31}. Il suo robusto quadro resiste alla decomposizione in ambienti acquosi e fisiologici, rendendolo ideale per applicazioni^{biomediche 32}. Tuttavia, la sua struttura microporosa intrinseca limita la sua utilità per l'incapsulamento di biomacromolecole. Hb, con una dimensione molecolare di ~5 nm, non può essere ospitato nei pori interni di UiO-66 incontaminato. Di conseguenza, solo un numero limitato di studi ha esplorato UiO-66 in sistemi correlati all'Hb, in cui i MOF sono utilizzati principalmente per il rilevamento Hb basato su superficie piuttosto che per l'incapsulamento del framework^33,34. Di conseguenza, le piattaforme basate su UiO-66 per l'incapsulamento Hb rimangono relativamente poco sviluppate.

Molto recentemente, abbiamo introdotto un NP gerarchicamente poroso di UiO-66 (HP-UiO-66 NP) che supera questa restrizione di dimensione dei pori incorporando domini mesoporosi in grado di accogliere Hb, estendendo così l'ambito funzionale di UiO-66 per lo sviluppo di^{HBOC 35}. La porosità gerarchica viene introdotta tramite ingegneria dei difetti, in particolare impiegando acidi monocarbossilici a catena lunga, come l'acido dodecanoico (DA), come modulatori durante la^{sintesi 36,37}. Questo modulatore compete con il ligando BDC per la coordinazione con Zr⁴⁺, portando alla formazione di difetti e all'ingrossamento dei mesopori. La successiva rimozione del modulatore produce NP HP-UiO-66 contenenti domini micro- e mesoporosi coesistenti, con dimensione dei pori sintonizzabili tramite concentrazione del modulatore o lunghezza^{della catena 36}.

Sebbene l'introduzione della mesoporosità migliori l'accessibilità molecolare, può anche compromettere l'integrità del quadro nei tamponi contenenti fosfato. Gli ioni fosfato possono coordinarsi con i cluster Zr, portando a una disintegrazione strutturale parziale o^{completa 38,39}. Di conseguenza, le strategie di stabilizzazione superficiale sono essenziali per preservare la stabilità colloidale e chimica in condizioni fisiologiche⁴⁰. In generale, la stabilizzazione della superficie MOF può essere ottenuta tramite interazioni non covalenti (ad esempio, interazione di van der Waals e legami a idrogeno)⁴¹, interazioni di coordinamento con siti metallici^{esposti 42}, o attacco covalente a collegatori^{organici 43}. Tra i diversi linker, il polietilenglicole (PEG) è particolarmente attraente per la sua ampia disponibilità e la minima complessità^{sintetica 44}. È importante sottolineare che la modifica della superficie PEG, comunemente nota come PEGilation, conferisce diverse proprietà favorevoli ai sistemi di somministrazione dei farmaci, tra cui un'eccellente biocompatibilità, una riduzione dell'adsorbimento proteico non specifico e una riduzione del riconoscimento immunitario e dell'assorbimento dei^{macrofagi 45,46}. Collettivamente, questi effetti riducono le risposte immunogeniche e prolungano la circolazione^{sistemica 47}.

Le tecniche tradizionali di PEGilazione spesso si basano sulla chimica del carbodiimide o della maleimide, che tipicamente richiede catalizzatori o intermediari reattivi in grado di danneggiare biomolecole sensibili, come l'Hb. Per aggirare questa limitazione, impiegiamo la cicloadizione alchino-azida promossa da sforzo (SPAAC), una reazione bioortogonale senza catalizzatori tra specie funzionalizzate da azide e dibenzilciclooctina (DBCO), che consente una coniugazione site-specific in condizioni acquose^{miti 35,48}. Questo approccio garantisce una modifica efficiente della superficie senza compromettere la funzione Hb incapsulata.

Basandosi sul nostro precedente HP-UiO-66 NPs³⁵, che si concentrava sulla progettazione strutturale e sulla validazione biofunzionale, il presente protocollo enfatizza la trasparenza metodologica e la riproducibilità fornendo un flusso di lavoro sperimentale dettagliato passo dopo passo con intervalli di parametri definiti e considerazioni critiche di gestione. Sono incluse indicazioni di risoluzione dei problemi per le fasi chiave della sintesi, l'incapsulamento di Hb e la PEGylation tramite la chimica SPAAC, che producono infine NP stabili Hb@HP-UiO-66-PEG (vedi Figura 1).

Il flusso di lavoro prevede: (i) ingegneria dei difetti usando DA come modulatore per sintetizzare_NP HP-UiO-66-NH modificati con amminocemento; (ii) funzionalizzazione azidica dei gruppi amminici superficiali; (iii) incapsulamento di Hb in condizioni miti e acquose; (iv) coniugazione covalente PEG tramite SPAAC.

Per ogni passaggio principale, questo protocollo identifica sfide sperimentali comuni, come l'aggregazione di particelle, il collasso dei pori o la funzionalizzazione inefficiente della superficie, e fornisce strategie pratiche di risoluzione dei problemi per migliorare la riproducibilità inter-laboratorio. È importante notare che questo articolo dimostra ampiamente che la sintesi degli NP HP-UiO-66 è facilmente scalabile, consentendo una produzione affidabile su scala grammatica per lotto.

I nanoportatori finali PEGilati mostrano un'elevata stabilità colloidale in soluzione salina, acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina-etanosulfonico (HEPES) e siero, mantenendo al contempo la capacità di legame e rilascio dell'ossigeno dell'Hb^{a 35}. Metodi analitici come la spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR), la risonanza magnetica nucleare (NMR), la diffrazione a raggi X delle polveri (PXRD), l'assorbimento dell'azoto (N₂), l'analisi del potenziale zeta (ζ), la diffusione dinamica della luce (DLS), la microscopia elettronica a scansione (SEM) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) confermano la trasformazione chimica, l'integrità del quadro, la porosità, la morfologia su scala nanometrica e la funzionalizzazione superficiale riuscita della superficie.

Enfatizzando riproducibilità, scalabilità e chiarezza operativa, supportate dalla visualizzazione video di passaggi tecnicamente sensibili, questa metodologia fornisce una via riproducibile, robusta e accessibile per fabbricare portatori di ossigeno stabili basati su MOF. È importante sottolineare che l'approccio è modulare e facilmente adattabile ad altre biomacromolecole o enzimi che richiedono un microambiente protetto ma permeabile all'ossigeno per mantenere la funzionalità. Di conseguenza, i NP Hb@HP-UiO-66-PEG rappresentano un passo promettente verso la creazione di HBOC in grado di fornire ossigeno in modo efficiente resistendo al degrado nei fluidi biologici.

Da un punto di vista pratico, questa strategia può essere estesa ad altre biomacromolecole oltre l'Hb, a condizione che abbiano dimensioni inferiori a circa 20 nm, corrispondenti alla dimensione massima accessibile del mesoporo, e presentino una o più delle seguenti caratteristiche: (i) sensibilità a condizioni chimiche difficili, favorendo una lieve sintesi e modifica superficiale; (ii) la necessità di un microambiente idratato e permeabile all'ossigeno per mantenere l'attività funzionale; e (iii) suscettibilità alla degradazione della MOF indotta dai fosfati, che richiede la stabilizzazione superficiale. L'approccio si basa su densità di difetti moderate per bilanciare l'accessibilità del mesoporo con l'integrità del quadro. Quando è necessaria una modifica superficiale senza catalizzatori e specifica per il sito per preservare la funzione della biomolecola, la PEGylation basata su SPAAC offre chiari vantaggi. Di conseguenza, questo protocollo è particolarmente adatto per un carico efficiente delle biomacromolecole, la conservazione funzionale e la stabilità colloidale a lungo termine in condizioni fisiologiche, mentre biomolecole o sistemi molto più grandi che richiedono una stabilità termica o acida estrema possono richiedere piattaforme MOF alternative.

Protocollo

1. Estrazione Hb (durata prevista: 2 giorni)

NOTA: L'estrazione di Hb dal sangue bovino disponibile in commercio (SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK) viene effettuata seguendo il nostro precedente^{protocollo 49}.

1. Trasferire il sangue bovino (tipicamente 10 mL per estrazione) in un tubo centrifuga conico da 50 mL. Aggiungi un volume uguale di soluzione salina dello 0,9% (p/v) per diluire il sangue e ridurre la viscosità. Invertire delicatamente più volte fino a ottenere una sospensione omogenea.
2. Centrifuga il sangue diluito a 1.500 x g per 20 minuti a 4 °C. Dopo la centrifugazione, un sovrandanante giallo chiaro (plasma) appare sopra un denso pellet rosso (RBC). Se la pelletazione completa non è completa, si prosegue la centrifugazione se necessario.
3. Scartare con cura lo strato di plasma senza disturbare il pellet. Aggiungere soluzione salina fresca (10 mL), risospendere il pellet del globulo rosso con inversione leggera e ripetere la fase di centrifugazione in condizioni identiche. Esegui in totale due cicli di lavaggio per rimuovere le proteine plasmatiche e le piastrine.
   NOTA: Il processo di lavaggio è cruciale per ottenere globuli rossi puri liberi da contaminanti plasmamici che potrebbero interferire con l'estrazione a valle del toluene.
4. Dopo il secondo lavaggio, si elimina il sovrantato e si risospende il pellet di RBC pulito in una miscela di toluene, acqua ultrapura e soluzione salina al rapporto di volume di 1:0,4:1. Ad esempio, mescola 10 mL di toluene, 4 mL di acqua ultrapura e 10 mL di soluzione salina in un imbuto separativo da 50 mL prima di aggiungere la pellet.
5. Sigilla l'imbuto e inverti delicatamente più volte per mescolare le fasi. Posizionare il fumaiolo a 4 °C durante la notte (~12-16 h) per consentire una completa separazione di fase. La fase toluene estrae le membrane lipidiche, lasciando una fase acquosa chiara arricchita in Hb.
6. Il giorno seguente, raccogliere con cura lo strato acquoso inferiore utilizzando il rubinetto del imbuto separatorio. Questo strato appare trasparente e rosso scuro.
7. Trasferire la soluzione acquosa di Hb in tubi centrifughe e centrifugare a 8.000 x g per 20 minuti a 4 °C per rimuovere eventuali residui cellulari o materiale emulsionato.
8. Filtra il surnatant attraverso una fritta di terra diatomea usando un sistema di filtrazione a vuoto. Applica solo un vuoto delicato (evita pressioni negative elevate che possono causare schiuma o denaturazione delle proteine).
9. Raccogli il filtrato contenente Hb privo di stroma. Conserva questo materiale su ghiaccio se usato immediatamente, oppure aliquota (~1 mL) e congela a −80 °C per un uso a lungo termine.
   NOTA: Le aliquote di Hb possono essere conservate congelate per diversi mesi senza una degradazione rilevabile.
10. Quantificare la concentrazione di Hb utilizzando un saggio proteico sull'acido bicinconinico secondo il protocollo del produttore, utilizzando puro Hb bovino come standard di calibrazione. Regolare la scorta finale di Hb alla concentrazione di lavoro desiderata (tipicamente 20 mg ^mL-1 nel tampone HEPES, pH 7,4).
    NOTA: Aspettatevi una soluzione di Hb chiara e rossa, priva di materiale cellulare.
11. Opzionale: misurare gli spettri di assorbimento UV-vis (375-700 nm) dell'Hb estratto per valutarne la capacità di legame e rilascio dell'ossigeno. Registra lo spettro UV-vis iniziale. Aggiungi ditionite di sodio e purga con gas_N2 per 10 minuti per rilasciare ossigeno, e registra lo spettro dell'Hb deossigenato. Successivamente, purgare con aria per 10 minuti per permettere la riossigenazione e registrare nuovamente lo spettro.
    NOTA: La presenza di bande Soret e Q caratteristiche di Hb ossigenato (~412 nm per la banda Soret; ~541 e ~577 nm per le bande Q) e deossigenato (~430 nm per la banda Soret; ~557 nm per la banda Q) dopo purga con aria e N₂, rispettivamente, indica che Hb rimane funzionale (Figura supplementare 1).
    ATTENZIONE: Maneggiare il toluene con attenzione in una cappa elettrica indossando l'attrezzatura di protezione personale adeguata, inclusi camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti. Nel presente studio, tutti i liquidi di scarto contenenti toluene sono stati raccolti e smaltiti come rifiuti chimici organici liquidi in contenitori designati (Gruppo C), etichettati come "toluene e miscela", in conformità con le linee guida del Ministero dell'Ambiente danese. La corrispondente documentazione sullo smaltimento dei rifiuti è fornita nel File Supplementare 1.

2. Fabbricazione di HP-UiO-66-NH₂ NP (Durata prevista: 3 giorni)

ATTENZIONE: HCl (37%) è corrosivo; Manico all'interno di una cappa con camice da laboratorio, guanti resistenti agli acidi e protezione oculare adeguata. Aggiungi acido lentamente ed evita l'inalazione di vapori.

1. Pesa_{ZrCl 4} (400 mg, 1,715 mmol) in una fiaschetta a fondo rotondo da 250 mL. Aggiungi lentamente DMF (80 mL) e fai ultrasonicare per 5 minuti per sciogliere completamente lo ZrCl₄. Aggiungi DA (12 g, 60 mmol) e ultrasuoni per altri 30 minuti fino a ottenere una soluzione chiara e omogenea. Misurare il volume totale della soluzione utilizzando un cilindro graduato e aggiungere DMF secondo necessità per regolare il volume finale a 100 mL. DA agisce come modulatore competitivo, introducendo difetti controllati nel reticolo.
   NOTA: Aggiungere DMF lentamente durante la dissoluzione dello ZrCl₄, poiché il processo di coordinamento è esotermico e può causare un leggero fumo; Esegui tutte le operazioni in una cappa a fumo. Considera l'aumento di volume causato dall'incorporazione di DA utilizzando un volume iniziale di 80 mL DMF per sciogliere_{ZrCl 4} e DA, e regola il volume finale a 100 mL solo dopo la completa dissoluzione per garantire un controllo accurato della concentrazione.
2. Aggiungere acido 2-amino-1,4-benzenedrossicarbossico (BDC-NH₂, 155 mg, 0,857 mmol) nella stessa fiaschetta e sonicare per altri 30 minuti. Continuare fino a ottenere una soluzione omogenea di colore giallo pallido.
3. Trasferire la miscela in un autoclave rivestito di Teflon da 150 mL o in un recipiente a pressione a fondo rotondo adatto alla sintesi solvotermica. Sigilla bene e mettila in una caldaia a silueta preriscaldata a 120 °C per 18 ore. Non disturbare il reattore durante il riscaldamento per evitare una nucleazione incontrollata.
4. Dopo la reazione, spegni il forno e lascia raffreddare il recipiente naturalmente alla temperatura ambiente (~2 ore). Osserva una fine sospensione gialla che appare uniformemente in tutto il substrato.
5. Raccogli il prodotto tramite centrifugazione (11.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) e scarta il surnadante. Lavare il pellet con DMF (100 mL) tre volte utilizzando le stesse condizioni di centrifugazione per rimuovere il ligando in eccesso e il DA non reatto. Se il prodotto non è completamente pelletato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
6. Prepara una soluzione di rimozione acida composta da DMF (100 mL) contenente 0,5 mL di HCl concentrato (37%). Immergi completamente il pellet lavato in questa soluzione e scaldalo in una fornace a muuffo a 90 °C per 12 ore. Questo passaggio rimuove il modulatore DA, creando mesopori all'interno della struttura.
7. Dopo 12 ore, centrifugare (11.000 x g, 5 min, a temperatura ambiente) e scartare il soprantantante. Ripetere il trattamento con acido utilizzando un nuovo lotto di DMF contenente 0,5 mL di HCl per garantire la completa rimozione della DA. Se il prodotto non è completamente pelletato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
8. Lava il pellet in sequenza con DMF, acetone ed etanolo (100 mL, 11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) per rimuovere eventuali residui di acido e solvente. Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario. Tra un lavaggio e l'altro, ridisperdi delicatamente il pellet tramite vortice o lieve sonicazione.
9. Asciuga il prodotto in un forno a vuoto (140 °C) durante la notte dopo l'asciugatura ambientale all'interno di una cappa a fumo. I materiali finali (HP-UiO-66-NH₂ NP) appaiono come polvere gialla fine. Aspettati una resa tipica di ~428 mg.
10. Confermare che i picchi di PXRD a 2θ = 7,3°, 8,4°, 25,7° rimangono netti (Figura 2A), indicando la conservazione della topologia cristallina UiO-66. Verificare la completa rimozione della DA tramite ¹H NMR dopo una digestione alcalina (2 M KOH in_{D 2}O) (nessun picco di metilene a 1,2 ppm) (Figura 2B).
11. Caratterizzare la porosità tramite adsorbimento e desorbimento N₂ a 77 K⁵⁰. La curva mostra un'isoterma combinata di Tipo I/IV con un anello di isteresi (Figura 2C), confermando la formazione del mesoporo.
    NOTA: Un'essiccazione incompleta ad alta temperatura o una massa del campione insufficiente portano a misurazioni di porosità imprecise utilizzando isoterme di adsorbito-desorbimento_N2 ; ripetere il processo di essiccazione sotto vuoto a 140 °C e assicurarsi che il peso del campione superi i 100 mg se l'area Brunauer−Emmett−Teller (BET) è < 1.000^{m 2 g-1}.
12. Opzionale: valuta la morfologia degli NP usando SEM. Gli NP HP-UiO-66-NH₂ presentano morfologia sferica con una distribuzione di dimensioni ristretta di ~100 nm (Figura 2D).
    NOTA: Prevedetevi HP-UiO-66-NH₂ NP che possiedono sia micro- che mesopori, adatti a un successivo incapsulamento di Hb.
13. La sintesi_{degli NP} HP-UiO-66-NH 2 può essere ampliata aumentando proporzionalmente tutti i reagenti e solventi utilizzati nei passaggi 2.1 - 2.9 ed eseguendo molteplici reazioni solvotermiche parallele. Mantenendo gli stessi rapporti molari, concentrazioni, temperatura di reazione e tempi di reazione, e aumentando le quantità di reagenti e solventi di 1,5 volte, due o più autoclavi rivestite in Teflon o recipienti a fondo arrotondato da 150 mL possono essere azionati simultaneamente, consentendo la produzione su scala grammatica di HP-UiO-66-NH₂ NP (Figura 3).
    NOTA: Maneggiare tutti i solventi organici all'interno di una cappa fumigero indossando camice da laboratorio, guanti resistenti agli acidi e una protezione oculare adeguata. Raccogliere tutti i liquidi di scarto contenenti DMF e smaltirli come rifiuti chimici organici liquidi in contenitori designati (Gruppo C) etichettati come "DMF e miscela" secondo le linee guida del Ministero dell'Ambiente danese. Le soluzioni di scarto contenenti tracce di_{ZrCl 4} e HCl sono state gestite di conseguenza. La corrispondente documentazione sullo smaltimento dei rifiuti è fornita nel File Supplementare 1.

3. Funzionalizzazione azide delle NP HP-UiO-66-NH₂ (NP HP-UiO-66-N₃ ) (Durata prevista: 1 giorno)

ATTENZIONE: Trimetilsilylazide (TMSN₃) e tert-butil nitrito (tBuONO) sono tossici e volatili. Esegui tutti i passaggi con una cappa fumaria indossando camice da laboratorio, guanti in nitrilo e protezione per gli occhi.

1. Pesa con precisione_{HP-UiO-66-NH 2} NP (50 mg) in una fiaschetta a fondo rotondo da 25 mL. Aggiungi THF (10 mL) e ultrasuoni per 5 minuti per disperdere completamente le particelle. La sospensione diventa opaca ma uniforme.
   NOTA: La dispersione uniforme delle NP dopo la sonicazione è fondamentale per un contatto efficace con i reagenti. Se la dispersione è incompleta, si aumenta il volume della soluzione e si ripete la sonicazione.
2. Posizionare la fiaschetta in un bagno d'acqua ghiacciata (0 °C) su un agitatore magnetico impostato a 400 giri/min. Utilizzando una siringa di vetro, aggiungi tBuONO (0,4 mL) a goccia per 5 minuti mantenendo la temperatura sotto i 5 °C.
3. Aggiungi immediatamente TMSN₃ (0,35 mL) a gocce nelle stesse condizioni di freddo. Può comparire una lieve effervescenza, indicando un progresso di nitrosazione. Avvolgi la vasca con della carta stagnola per proteggere la reazione dalla luce...
4. Continuare a mescolare la miscela di reazione per tutta la notte (~16 ore) nel bagno d'acqua ghiacciato per permettere la completa sostituzione azide dei gruppi amminici sulla superficie MOF.
5. Rimuovi il bagno di ghiaccio e lascia che la sospensione raggiunga la temperatura ambiente. Centrifuga (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) per raccogliere i NP modificati. Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
6. Lava accuratamente la pellet con THF (10 mL) tre volte, raccogliendola tramite centrifugazione (11.000 x g, 5 min, temperatura ambiente) dopo ogni lavaggio. Segui con tre lavaggi aggiuntivi con acetone (10 mL), centrifugando nelle stesse condizioni, per rimuovere reagenti residui e sottoprodotti. Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
7. Asciugare il prodotto (_{HP-UiO-66-N 3} NP) utilizzando un forno (140 °C) sotto vuoto durante la notte dopo l'asciugatura ambientale all'interno di una cappa a fumo. Aspettati una resa tipica di ~45 mg.
8. Verifica la trasformazione chimica tramite spettroscopia FTIR: si osserva una netta allungamento asimmetrico dell'azide a ~2122 ^cm-1 (Figura 4A). L'intensità della banda è correlata con l'efficienza di sostituzione superficiale.
   NOTA: Una conversione incompleta può compromettere la successiva coniugazione dei clic. Se la banda azide è debole, si ripete la funzionalizzazione usando quantità 2 volte di tBuONO e TMSN₃. Aspettatevi_{HP-UiO-66-N 3} NP con terminazione azido-terminata con cristallinità preservata e architettura mesoporosa (Figura 4B-D), pronti per l'incapsulamento in Hb e la PEGylazione SPAAC.
   ATTENZIONE: Raccogliere tutti i liquidi di scarto contenenti TMSN₃, inclusi i miscel con altri reagenti (ad esempio, tBuONO e THF), in contenitori designati del Gruppo O per rifiuti pericolosi in conformità con le linee guida del Ministero dell'Ambiente danese. Etichetta chiaramente tutti i contenitori per indicare la presenza di TMSN₃ e delle sue miscele. La documentazione pertinente per lo smaltimento dei rifiuti è fornita nel Fascicolo Supplementare 1.

4. Carico e quantificazione Hb (durata prevista: 2 giorni)

1. Trasferire_{HP-UiO-66-N 3} NP (5 mg) in un tubo centrifuga da 2 mL, seguito da una sonicación di ~2 min in 0,5 mL di buffer HEPES (20 mM, pH 7,4). Aggiungi 0,5 mL di buffer HEPES contenente Hb (20 mg ^mL-1) e inverti delicatamente il tubo più volte per disperdere completamente gli NP.
2. Posizionare il tubo su un termoshaker e incubare a temperatura ambiente (22-25 °C) sotto 1.000 giri/min agitando per 2 ore.
3. Dopo l'incubazione, centrifugare 13.500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per granulare i risultati Hb@HP-UiO-66-N₃ NP. Raccogliere con cura il soprantantante per quantificare l'Hb non intrappolato. Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
4. Lava delicatamente il pellet con acqua ultrapura (1 mL) pipettando su e giù per rimuovere l'Hb leggermente adsorbitato, e ripeti il lavaggio due volte. Raccogliere con cura il sovrantato di ogni lavaggio per quantificare l'Hb non intrappolato. Sospendere il pellet finale in acqua ultrapura da 0,5 mL per la caratterizzazione. Conserva i campioni in frigorifero (4 °C) per prevenire l'ossidazione.
5. Determinare l'Hb non intrappolato nei soprantantanti raccolti utilizzando il saggio⁵¹ di lauril solfato di sodio (SLS)-Hb. Pipetta 10 μL di ciascun sovrantante in una micropiastra a 96 pozzi e aggiungi 100 μL di reagente SLS (0,6 mg ^mL-1 in acqua ultrapura). Incubare 5 minuti a temperatura ambiente al buio, poi leggere l'assorbanza a 412 nm usando uno spettrofotometro UV-vis.
6. Prepara una curva standard utilizzando soluzioni Hb stock (0-10 mg ^mL-1) in un buffer HEPES per convertire i valori di assorbanza in concentrazione.
7. Calcola l'efficienza dell'incapsulamento (EE) e il contenuto di carico (LC) come:
   EE (%) = [(Hb iniziale - Hb soprantante)/Hb iniziale] × 100
   LC (%) = [(Hb incapsulato)/(massa Hb incapsulata + NP)] × 100
8. Per aumentare l'incapsulamento di Hb, incubare 100 mg di NP con 20 mL di soluzione di Hb (10 mg mL⁻¹). Per valutare la porosità dopo l'incapsulamento, immergere le NP risultanti nell'etanolo per 24 ore, poi asciugare per tutta la notte in un forno a vuoto a 140 °C, e registrare l'isoterma di adsorbimento_N2 per valutare la porosità. Il colore rosso della polvere indica un incapsulamento riuscito di Hb (Figura 5A), e una marcata diminuzione dell'assorbimento di N₂ conferma il riempimento riuscito dei mesopori con Hb (Figura 5B).
9. Misurare il potenziale ζ usando un Zetasizer Nano ZS. La carica superficiale diminuisce da ~+40 mV (HP-UiO-66-N₃ NP) a ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N₃ NP), coerente con l'adsorbimento di Hb (Figura 5C).
10. Opzionale: acquisire micrografia SEM (Figura 5D) e diffrattogramma PXRD (Figura 5E) per garantire integrità morfologica e stabilità strutturale.
11. Registra gli spettri UV-vis (375-700 nm) per valutare il legame reversibile dell'ossigeno delle NP. Aggiungi ditionite di sodio e purga con N₂ per 10 minuti per rilasciare ossigeno, registra lo spettro, poi purga con aria per 10 minuti per permettere il rilegato, e registra nuovamente lo spettro (Figura 5F).
    NOTA: La presenza di Hb caratteristici di Soret e Q, rispettivamente ossigenati (~412 nm per la banda Soret; ~541 e ~577 nm per le bande Q) e deossigenati (~430 nm per la banda Soret; ~557 nm per la banda Q) dopo purga con aria e N₂, indica che Hb rimane funzionale.
12. Aspettatevi_{Hb@HP-UiO-66-N} 3 NP rossi uniformi contenenti Hb funzionalmente attivo con comportamento di ossigenazione reversibile.

5. Fabbricazione di NP Hb@HP-UiO-66-PEG: PEGylation tramite SPAAC (Durata prevista: 2 giorni)

1. Prepara un tubo centrifugo da 2 mL contenente Hb@HP-UiO-66-N₃ NP (10 mg) dispersi in acqua ultrapura da 0,5 mL. Aggiungi DBCO-PEG (MW ~2.000, 20 mg in 0,5 mL di acqua ultrapura) per ottenere un rapporto 2:1 (p/w) tra PEG e NP. Vortice delicatamente fino a quando non è completamente mescolato.
2. Incubare la miscela su un termoshaker a temperatura ambiente e a 1.000 giri al minuto per 1 ora, poi trasferirla in frigorifero (4 °C) per una reazione notturna (~16 h). Questa reazione SPAAC senza catalizzatori accoppia covalentemente DBCO ai gruppi azidici, formando legami stabili di triazoli.
3. Centrifugare a 12.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pelletare i PEGylated Hb@HP-UiO-66-PEG NP. Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario. Scartare il sovrantantante contenente PEGO non reatto.
4. Lavare il pellet tre volte con acqua ultrapura (2 mL ciascuno tramite pipettatura su e giù) in condizioni di centrifugazione identiche. Questo garantisce la rimozione di catene PEG libere e di piccoli sottoprodotti molecolari.
5. Risospendere le NP purificate Hb@HP-UiO-66-PEG in 2 mL di acqua ultrapura e conservarle a 4 °C.
   Il colloide appare omogeneo e leggermente opalescente, indicando una buona stabilità di dispersione.
6. Confermare la PEGilazione riuscita tramite spettroscopia FTIR (Figura 6A): scomparsa della banda azide a 2122 ^cm-1 ed emergere di segnali di metilene (−CH₂−) e di legame etere (−O−) derivati da PEG a 2883 e 1097 ^cm-1, rispettivamente.
7. Verificare con ¹H NMR (Figura 6B) dopo la digestione alcalina in 2 M KOH/_{D 2}O; I campioni PEGilati mostrano un segnale aggiuntivo a δ = 3,53 ppm corrispondente ai protoni ossietilene del PEG.
8. Misurare il diametro idrodinamico e l'indice di polidispersione (PDI) tramite DLS (Figura 6C).
   Un aumento da ~115 nm (PDI ~0,1) a ~140 nm (PDI ~0,17) conferma il rivestimento superficiale con uno strato polimerico sottile.
9. Opzionale: misurare il potenziale ζ superficiale usando un Nano ZS Zetasizer per verificare l'effetto trascurabile della PEGylation superficiale sulla carica superficiale (Figura 6D). Una piccola variazione dopo la PEGylazione (da ~+20 mV a ~+17 mV) indica un impatto minimo sulla carica superficiale.
10. Osserva la morfologia tramite TEM (Figura 6E). Il TEM rivela un bordo diffuso di ~10-12 nm attorno al bordo della particella che rappresenta la corona PEG.
11. Eseguire un saggio di rilascio dell'ossigeno utilizzando un elettrodo di ossigeno (Figura 6F) per mostrare che la funzione Hb rimane intatta dopo la PEGilazione, simile alla forma non PEGilata. Ci si aspetta una Hb@HP-UiO-66-PEG stabile, dispersa di colore rosso-marrone, che mostra una forte stabilità colloidale e capacità di legame dell'ossigeno mantenuta, adatti a test fisiologici a lungo termine.
12. Opzionale: condurre curve di dissociazione dell'ossigeno (ODC) di Hb e Hb liberi incapsulati in NP Hb@HP-UiO-66-PEG per identificare la pressione parziale di ossigeno al 50% di Hb, saturazione di ossigeno (p50) e coefficiente di Hill (Hill-n) (Figura 7).

6. Valutazione della stabilità degli NP (durata prevista: 7 giorni)

1. Distribuire Hb@HP-UiO-66-PEG NP (~5 mg) in sette tubi centrifughe da 2 mL. Aggiungere 2 mL di ciascun mezzo: acqua ultrapura, soluzione salina (0,9% NaCl), HEPES (20 mM), siero per topi, plasma umano, Eagle's medium−high glucosio modificato (DMEM) di Dulbecco, e soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Assicurati che i tappi dei tubi della centrifuga siano ben chiusi per evitare l'evaporazione del mezzo durante l'incubazione. Il siero di topo CD-1 e il plasma umano sono acquistati da Innovative Research (Novi, MI, USA).
2. Incubare i campioni a 37 °C in un termoshaker a 1.000 giri/min per un massimo di 7 giorni.
3. Dopo 3 e 7 giorni, raccogliere le particelle tramite centrifugazione (12.000 g, 10 min, a temperatura ambiente), lavare una volta con acqua ultrapura e asciugare per il PXRD (Figura 8A). Se il precipitato non è completamente granulato, estendere il tempo di centrifugazione se necessario.
4. A 0, 24, 72 e 168 ore, preleva le aliquote (~50 μL) e diluiscele 20 volte per l'analisi DLS (dimensione e PDI) (Figura 8B).
5. Opzionale: preparare i campioni SEM dopo 48 ore in PBS per controllare visivamente la morfologia (Figura 8C).
   NOTA: Diluire la sospensione degli NP (in PBS) con acqua ultrapura è essenziale per l'analisi SEM poiché riduce le interferenze di fondo dai componenti del buffer e facilita un'imaging chiara dei NP.
6. Confrontare_{con NP} Hb@HP-UiO-66-N non PEGilati in condizioni identiche; la rapida scomparsa di riflessioni cristalline caratteristiche e l'emergere di ampie caratteristiche amorfe di scattering indicano instabilità senza rivestimento PEG.
   NOTA: I campioni PEGylati rimangono strutturalmente intatti dopo 7 giorni in tutti i mezzi, mentre quelli non PEGylati si decompongono entro 24 ore in PBS o DMEM.

7. Caratterizzazione fisicochimica (Durata prevista: ~15 giorni)

NOTA: Questa sezione descrive i metodi analitici necessari per confermare la morfologia, la composizione, la porosità e l'integrità degli Hb degli NP. Queste tecniche di caratterizzazione convalidano collettivamente la riproducibilità dei processi di sintesi e modifica.

1. PXRD
   1. Asciuga ~5 mg di ogni campione NP in un essiccatore da congelatore durante la notte prima della misurazione per rimuovere l'umidità adsorbida.
   2. Carica il campione su un supporto piatto in silicone senza fondo e appiattiscilo delicatamente usando un vetrino di vetro pulito per formare uno strato sottile e uniforme.
      NOTA: Evita di premere troppo forte, che può indurre effetti di orientamento preferito.
   3. Registrare i modelli PXRD utilizzando un diffrattometro da banco dotato di radiazione Cu Kα (λ = 1,5418 Å). Imposta i parametri di scansione a 2θ = 4-50°, la dimensione del passo = 0,02°, il dstay = 1 s per passo.
   4. Confrontare i pattern ottenuti con la struttura simulata di UiO-66 generata tramite il software Mercury basandosi sui dati cristallini^{precedentemente riportati 31}. La presenza di picchi acuti a 7,3°, 8,4° e 25,7° indica integrità cristallina.
2. N₂ Adsorbimento-Desorbo (area superficiale BET e distribuzione delle dimensioni dei pori)
   1. Degas ~100 mg di ogni campione NP a 140 °C sotto vuoto per 24 ore utilizzando un sistema Micromeritics Smart VacPrep con purga ad altissima purezza N₂.
   2. Trasferire immediatamente i campioni degassati alla porta di analisi di un analizzatore di superficie Micromeritics Tristar. Record_{N 2} isoterme a 77 K all'interno di un intervallo di pressione relativa (P/P₀) di 0-1.
   3. Calcolare le aree superficiali utilizzando il metodo BET seguendo il criterio esteso^{di Rouquerol 52}. Calcola la distribuzione delle dimensioni dei pori tramite la teoria della funzione della densità non locale implementata nel software Micromeritics.
   4. Genera le curve di adsorbimento/desorbo e i grafici di distribuzione delle dimensioni dei pori utilizzando Origin 2022. Importare i dati di adsorbimento/desorbimento nel software, con pressione relativa (P/P₀) sull'asse X e il volume adsorbito di N₂ sull'asse Y.
   5. Traccia i dati di distribuzione della dimensione dei pori con larghezza dei pori come asse X e volume incrementale dei pori come asse Y. Presenta i risultati come grafici "Linea + Simbolo". Esegui tutte le analisi utilizzando le impostazioni predefinite del software.
3. Spettroscopia FTIR
   1. Macina ~5 mg di ogni campione essiccato in una polvere fine usando un mortaio d'agata pulito. Posizionare la polvere sul cristallo ATR di uno spettrometro Bruker^{ALPHA-P 53}.
   2. Raccogliere spettri nell'intervallo 4.000-400 ^cm-1 con risoluzione 2 ^cm-1 .
   3. Identificare i picchi caratteristici: La comparsa di allungamento di N₃ a ~2122 ^cm-1 conferma la formazione di azide (Figura 4A). Dopo la PEGilazione, si osservano le bande −CH₂− e C-O-C rispettivamente a ~2883 ^cm-1 e ~1097 ^cm-1, insieme alla scomparsa dello stiramento N₃ (Figura 6A). Ci si aspetta la scomparsa della banda azide e l'emergere di segnali di metilene (−CH₂−) e osso etere (−O−) derivati dal PEG che confermano il completamento della reazione SPAAC.
   4. Traccia le curve FTIR usando Origin 2022. Importare i dati grezzi nel software con i valori X (numero d'onda) e Y (trasmettimento). Genera grafici in formato "Linea" utilizzando le impostazioni predefinite del software.
4. ¹H NMR
   1. Aggiungi ~10 mg di NP a 0,5 mL di 2 M KOH in D_2Oin una fiala di vetro, e riscalda a 80 °C per 1-2 ore per digerire il corpo.
   2. Centrifuga (12.000 x g, 10 min, temperatura ambiente) per centrifugare i residui non disciolti. Trasferire il sovrandanante su un tubo NMR da 5 mm.
   3. Registra uno spettro NMR di ¹H su uno spettrometro Bruker Avance a 400 MHz.
   4. Assegnare gli spostamenti chimici caratteristici, inclusi i protoni aromatici di BDC-NH₂ (δ = 6-8 ppm) e i segnali PEG (δ = ~3,53 ppm, Figura 6B), utilizzando il software di MestReNova. Analizza i dati NMR utilizzando il modulo di elaborazione NMR del software con le sue impostazioni predefinite.
5. SEM
   1. Depositare ~5 μL di goccia di sospensione NP su una wafer di silicio; lascia asciugare all'aria in un mobile privo di polvere. Se si verifica la carica, sputter-coat con oro da 5 nm.
   2. Immagine su un FEI Quanta 200 SEM a tensione di accelerazione di 10-20 kV.
   3. Analizza le immagini usando ImageJ. Importare le immagini TIFF originali con le informazioni di scala incorporate nel software e regolare luminosità e contrasto solo per la visualizzazione. Non applicare ulteriori elaborazioni che possano influenzare le informazioni dimensionali. Genera le barre di bilancia usando la funzione Analisi del software.
6. TEM
   1. Posizionare ~5 μL di dispersione NP su una griglia di Cu a laccio di carbonio (mesh 300). Tampona l'eccesso con carta filtrante e asciuga a condizioni ambienti.
   2. Esamina sotto un FEI Tecnai T20 G2 TEM a 200 kV.
   3. Analizza le immagini usando ImageJ. L'elaborazione delle immagini segue le procedure descritte nella Sezione 7.5.3.
7. DLS e ζ-Potenziale
   1. Diluire le NP ~20 volte in acqua ultrapura per dimensione e analisi PDI; per ζ-potenziale, diluire in tampone HEPES (20 mM, pH 7,4).
   2. Misura usando un Zetasizer Nano ZS a 25 °C. Vengono preparati almeno tre campioni indipendenti (n = 3), e ogni campione viene misurato in triplice.
   3. Traccia i dati DLS e ζ-potenziale usando Origin 2022. Presentare la distribuzione delle dimensioni delle particelle ponderata per intensità come grafi "Linea + Simbolo" e i risultati ζ-potenziale come grafi "Colonna". Riporta i dati come media ± deviazione standard (n = 3). Esegui tutte le analisi utilizzando le impostazioni predefinite del software.
8. Spettroscopia UV-vis per funzionalità Hb
   1. Disperdere 3 mg di Hb libero o una quantità corrispondente di NP (cioè contenenti una quantità equivalente di Hb incapsulato) in 3 mL di acqua ultrapura. Trasferisci le sospensioni su una cuvetta in quarzo. Registra spettri UV-vis da 375 a 700 nm usando uno spettrofotometro UV-2600 UV−vis.
   2. Aggiungi un pizzico di ditionite di sodio alla soluzione di Hb o alla sospensione NP e purga con_N2 per 10 minuti per deossigenare il campione. Registra lo spostamento della banda Soret da 412 a 430 nm e la fusione delle bande Q. Reossigenare il campione facendo bollire l'aria per 10 minuti per osservare l'inversione (Figura 5F e Figura Supplementare 1).
   3. Traccia i dati usando Origin 2022. Presentare gli spettri come grafi "Line", con lunghezza d'onda sull'asse X e assorbanza sull'asse Y.
9. Quantificazione dell'ossigeno rilasciato
   1. Dispersi 1 mg di Hb libero o una quantità corrispondente di Hb@HP-UiO-66-N₃ e Hb@HP-UiO-66-PEG NP (contenenti una quantità equivalente di Hb incapsulato) in acqua ultrapura da 600 μL. Trasferisci le sospensioni in fiale di vetro da 2 mL e sigillale bene con tappi di gomma.
   2. Inserire con cura la sonda a ago dell'elettrodo dell'ossigeno attraverso il tappo di gomma nella sospensione per monitorare il livello di ossigeno disciolto usando un metro_O2 a ago.
   3. Aggiungere rapidamente la soluzione di K₃[Fe(CN)₆] (10% in 100 μL di acqua ultrapura) alla sospensione usando un ago per siringa e registrare continuamente la variazione del livello di ossigeno.
   4. Calcola l'ossigeno rilasciato sottraendo il valore massimo osservato dopo l'aggiunta di K₃[Fe(CN₎₆] dal valore iniziale precedente all'aggiunta. Normalizzare i valori ottenuti all'ossigeno rilasciato dalla stessa quantità di Hb libero (Figura 6F) usando Origin 2022. Misurare tre campioni indipendenti (n = 3) per l'Hb libero o per ogni NP.
      NOTA: Hb@HP-UiO-66-N₃ e Hb@HP-UiO-66-PEG NP mostrano un rilascio di ossigeno comparabile, ciascuno rilasciando ~60% dell'ossigeno rilasciato dall'Hb libero.
10. Misurazione delle ODC e calcolo di p50 e Hill-n
    1. Preparare NP liberi di Hb bovino o Hb@HP-UiO-66-PEG a una concentrazione finale di Hb di ~1 mg ^mL-1 in 3 mL di HEPES-saline cushioner (20 mM HEPES, 0,9% (w/v) NaCl, pH 7,4). Trasferire il campione in una cuvetta al quarzo dotata di una barra magnetica di mescolamento.
    2. Metti la cuvette in un analizzatore Hemox. Imposta la temperatura di misura a 37 °C e lascia che il sistema si equilibri sotto una mescolata continua fino a raggiungere una linea di base stabile.
    3. Registrare le ODC tramite deossigenazione a passo su un intervallo di pressione parziale da 1-148 mmHg. Usa il software analizzatore Hemox preinstallato per misurare gli ODC e calcola p50 e Hill-n usando le impostazioni di analisi predefinite. Misura tre campioni indipendenti (n = 3) per ciascun campione.
    4. Esporta i dati elaborati e traccia le ODC usando Origin 2022 nel formato predefinito "Line" del grafico.

8. Riproducibilità e analisi statistica

1. Esegui tutte le procedure descritte in questo protocollo almeno tre volte in modo indipendente. Riporta i risultati come risultati tipici osservati durante queste ripetizioni. Mantenere i parametri sperimentali chiave, come tempi di reazione e temperature, entro un intervallo ragionevole per garantire riproducibilità e affidabilità per gli altri utenti.
2. Presentiamo la caratterizzazione strutturale (PXRD, N₂ adsorbimento-desorbo, FTIR, ¹H NMR, SEM, UV-vis) come dati rappresentativi per la conferma qualitativa senza effettuare analisi statistiche.
3. Riportare le misurazioni quantitative (DLS, ζ-potenziale, p50, Hill-n) come media ± SD (n ≥ 3). Determinare la significatività statistica utilizzando il test t di Welch a due code non accoppiati o l'ANOVA unidirezionale, a seconda dei conti. Indicare i livelli di significatività come ns (non significativi), * = p < 0,05, ** = p < 0,005, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001.

Risultati

La sintesi riuscita di HP-UiO-66-NH₂ NP è stata verificata da PXRD (Figura 2A), che ha mostrato i picchi caratteristici di diffrazione a 2θ = 7,3°, 8,4° e 25,7°, in buona concordanza con la struttura simulata^{di UiO-66 36}. Il leggero allargamento del picco rispetto al pattern simulato è stato attribuito alle dimensioni nanoscale delle particelle e alla conferma della conservazione dell'integrità cristallina dopo la sintesi

Discussione

Questo protocollo presenta una via robusta e riproducibile per sintetizzare, funzionare e caratterizzare le NP di HP-UiO-66 progettate per applicazioni di incapsulamento in Hb e di somministrazione di ossigeno. Adottando un approccio ingegneristico inside-out, questo lavoro stabilisce un quadro generalizzabile per la progettazione di NP MOF per applicazioni biomediche, inclusa la somministrazione di biomacromolecole e farmaci. Sebbene il concetto di materiale sottostante e le prestazioni...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-amino-1,4-benzenedcarboxylic acido	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	381071-25G
4-(2-Idrossietil)piperazina-1-acido etanosulfonico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	H3375-100G
Acetone (99%)	VWR International (Sø borg, DK)	23J244030
Analisi proteica dell'acido bicinonicotinico	Thermo Fisher Scientific (Roskilde, DK)	23235
Sangue bovino	SSI Diagnostica A/S (Hillerø d, DK)	77667
Tubo centrifuga
Centrifugatrice	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)	75009903	Megafuge ST Plus serie & nbsp;
Ossido di deuterio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	151882
Dibenzociclooctin-polietilene glicole	BroadPharm	BP-23949
Acido dodecanoico	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L556-1KG
Dulbecco' s Aquila Modificata' s medium e minus; glucosio alto	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	11965092
Etanolo (100%)	VWR International (Sø borg, DK)	24L044013
Spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier	Bruker (Billerica, USA)
Analizzatore emosus	TSC Scientific Crp (PA, USA)
Plasma citato umano	TebuBio	SER-PLP25
Acido cloridrico (37%)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	320331-500ML
Software ImageJ	Istituti Nazionali di Salute (USA)		Versione 1.47t
Griglia cu laceo-carbonio (mesh 300)	Agar Scientific Ltd., (Stansted Essex, Regno Unito)	AGS166-3H
Agitatore magnetico	IKA-Werke GmbH & Contia KG (,DE)	Ident. No.: 0010011496
MestReNova sofeware	Mestrelab Research (Spagna)		Versione 12
Analizzatore di superficie Micromeritics Tristar	Thermo Fisher Scientific Inc	ASAP 2020 Plus
Mini centrifuga	Eppendorf Nordic (Hø rsholm, DK)	N. catalogo e nbsp; 5452000010
Siero per topi	Ricerca innovativa (Novi, MI, USA)	IGMSCD1SER10ML
Forno a siluetto	Nabertherm GmbH (Brema, DE)	Caldaia a silenzio LE 6/11
N,N′-dimetilformamide (99,9%)	VWR International (Sø borg, DK)	250131a008
Nanodrop 2000c equipaggiamento & nbsp;	Thermo Fisher
Risonanza magnetica nucleare	Bruker (Billerica, USA)
O2 metro	PreSens (Ratisbona, Germania)
Software Origin 2022	OriginLab Corporation (MA, USA)		Versione 2022
Sensore di ossigeno	PreSens (Regensburg, DE)	Traccia OXY-1 ST
Soluzione salina tamponata con fosfato	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	P4417-50TAB
Lettore di piastre	Tecan Group Ltd.  (Mä nnedorf, CH)
Esacianoferrato di potassio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	60299-100G
Idrossido di potassio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	221473-500G
Diffrazione a raggi X in polvere	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Regno Unito)		Modello: Malvern Panalytical Aeris Research 600W XRD per misurazioni di polvere (Rilasciato 2020)
Vaso a pressione a fondo rotondo	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170004-1EA
Microscopia elettronica a scansione	Compagnia FEI (Hillsboro, USA)	Dual Beam FEI Helios Nanolab 600
cloruro di sodio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71376
Ditionite di sodio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	71699-250G
Dodecilo solfato di sodio	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	L4509-100G
Synthware e commercio; Recipiente a pressione a fondo rotondo	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	SYNP170003
Tert-butil nitrito	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	20370-100ml-F
Tetraidrofurano (99,7%)	VWR International (Sø borg, DK)	201022A004
Termoshaker	Grant Instruments (Cambridge) Ltd (Regno Unito)	PHMT-PSC18 (01012015020119)
Microscopia elettronica a trasmissione	Compagnia FEI (Hillsboro, USA)	FEI Tecnai T20
Trimetilsililazide	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	155071-10G
Sistema TSC HEMOX DAQ	TSC Scientific Crp (PA, USA)		Software analizzatore Hemox
Ultrosound sonicator	Branson Ultrasonics Corporation (Danbury, USA)	SKU: 2410240003
Spettrofotometro UV-Vis	Shimadzu (Kyoto, JP)
Forno a vuoto	Thermo Fisher Scientific Inc (Massachusetts, USA)
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical Ltd., (Malvern, Regno Unito)	Numero di serie. MAL1188530
Cloruro di zirconio(IV)	Merck Life Science A/S (Sø borg, DK)	357405-100G