La stimolazione magnetica a tutto il corpo riduce l'alimentazione simile all'abbuffata in un modello murino di disturbi alimentari

Sommario

La stimolazione magnetica a tutto il corpo (WB-MS) è stata utilizzata in un modello di alimentazione simile all'abbuffata che prevedeva l'accesso intermittente a una dieta appetibile. WB-MS riduceva temporaneamente l'aspirazione durante la simulazione senza alterare l'ingresso del chow. Tuttavia, gli effetti non sono stati sostenuti, poiché il comportamento simile all'abbuffata è riemerso dopo il trattamento, senza cambiamenti nel peso, nell'adiposità o nell'espressione di accumbens c-Fos.

Abstract

La stimolazione magnetica a tutto il corpo (WB-MS) è stata utilizzata in un modello di alimentazione simile all'abbuffata che prevedeva l'accesso intermittente a una dieta appetibile. WB-MS riduceva temporaneamente l'aspirazione durante la simulazione senza alterare l'ingresso del chow. Tuttavia, gli effetti non sono stati sostenuti, poiché il comportamento simile all'abbuffata è riemerso dopo il trattamento, senza cambiamenti nel peso, nell'adiposità o nell'espressione di accumbens c-Fos.

Introduzione

La compulsione è un modello di alimentazione disregolato caratterizzato dal rapido consumo di grandi quantità di cibo altamente appetibile in assenza di fame fisiologica. È una caratteristica centrale del disturbo da alimentazione incontrollata (BED), una condizione fortemente associata all'obesità e alla disfunzione^{metabolica 1,2}. Evidenze crescenti evidenziano il ruolo dei circuiti di ricompensa mesolimbici nella perdita di controllo sul comportamento alimentare ^3,4. La BED è sempre più concettualizzata come un disturbo della segnalazione corticostriale alterata, in cui una comunicazione disregolata tra sistemi di controllo legati alla ricompensa e esecutivi favorisce l'assunzione compulsiva di cibo. A livello neurobiologico, la segnalazione dopaminergica all'interno della via mesolimbica, insieme agli input glutamamantici, contribuisce a una salienza degli incentivi alterata e a una motivazione eccessiva per cibi appetibili ^5,6. Inoltre, segnali metabolici periferici come GLP-1, insulina e grelina interagiscono con questi circuiti per modulare la valutazione della ricompensa e il comportamento alimentare⁷. Evidenze recenti indicano inoltre che il comportamento simile all'abbuffata è associato a cambiamenti nella dinamica neurale all'interno del NAc, incluse oscillazioni a bassa frequenza nei range delta e theta (2–8 Hz), che sono state collegate a stati di anticipazione della ricompensa e desiderio precedenti alla perdita del^{controllo 8}.

Il NAc agisce come un hub integrativo che collega i sistemi limbico, corticalo e motorio, traducendo segnali motivazionali in comportamenti orientati agli obiettivi. La perturbazione di questo sistema, in particolare durante l'esposizione ripetuta a cibi gustevoli, favorisce schemi di assunzione compulsivi e^abitudinati. I modelli sperimentali che utilizzano l'accesso intermittente a cibi appetibili inducono in modo affidabile l'alimentazione compulsiva sono associati a un'attivazione aumentata del NAc, supportandone il ruolo nel comportamento di alimentazione^{compulsiva 11–14}. La neuromodulazione non invasiva si riferisce a tecniche che alterano l'attività cerebrale senza intervento chirurgico, inclusi approcci basati sul campo magnetico come la stimolazione magnetica^{transcranica 15}. Queste strategie hanno acquisito rilevanza clinica per la loro capacità di modulare l'eccitabilità neurale e l'attività di rete nei disturbi neuropsichiatrici^16,17. Negli esseri umani, è stato dimostrato che la neuromodulazione riduce i sintomi dell'abbuffata e migliora il controllo comportamentale, oltre a influenzare la regolazione^{metabolica 18,19}.

Sulla base di queste evidenze, la stimolazione magnetica a tutto il corpo (WB-MS) potrebbe rappresentare un approccio terapeutico non invasivo capace di modulare i circuiti coinvolti nell'alimentazione compulsiva. A differenza delle tecniche focali, i campi magnetici a bassa frequenza possono influenzare l'eccitabilità neuronale e le reti cerebrali distribuite, suggerendo un potenziale impatto su strutture sottocorticali come^{NAc 8}. Studi sperimentali hanno dimostrato che tali campi modulano la neurotrasmissione dopaminergica e glutamatergica 6,7,8,19, fornendo un meccanismo plausibile per influenzare i circuiti legati alla ricompensa. Tuttavia, i suoi effetti sul comportamento simile al binge food restano sconosciuti. Pertanto, il presente studio ha valutato gli effetti della SM a bassa frequenza in un modello murino di alimentazione simile all'abbuffata indotta dall'accesso intermittente a cibi appetibili, valutando l'assunzione alimentare, il peso corporeo, l'adiposità e l'espressione di c-Fos nel NAc.

Protocollo

Tutte le procedure sono state condotte in conformità con lo Standard Ufficiale Messicano per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (NOM-062-ZOO-199) e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (CICUAL) presso l'Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), secondo il protocollo numero 035-CIC-2023. Tutti i materiali utilizzati nello studio sono menzionati nella Tabella dei Materiali.

Definizione e acquisizione della popolazione

Al giorno postnatale 30 (P30), con un peso corporeo iniziale di 15–18 g, sono stati utilizzati 30 C57BL/6 topi (9 femmine e 21 maschi). I topi venivano ospitati singolarmente in gabbie domestiche in condizioni ambientali controllate: un ciclo chiaro-buio di 12:12 h (luci accese alle 6:00), una temperatura ambiente di 23 ± 2 °C e un'umidità relativa di 70 ± 10%.

Abituazione

A P30, gli animali venivano ospitati individualmente in gabbie domestiche con accesso ad libitum ad acqua e cibo standard. Tutte le gabbie erano arricchite ambientalmente con tubi di cartone e furono usate truciole di legno come biancheria da letto. Durante il periodo di abituazione di 7 giorni, sono stati registrati peso corporeo, assunzione di cibo e consumo di acqua ogni 24 ore.

Assunzione simile a un abbuffamento

Il modello sperimentale utilizzato in questo studio si basa sul paradigma intermittente di abbuffata e assunzione descritto dai^{ricercatori 14}. Prima dell'assegnazione dei gruppi, tutti gli animali sono stati portati a un peso corporeo medio comparabile (17 g) per ridurre la variabilità di base. Gli animali (N = 30) sono stati poi assegnati casualmente a gruppi sperimentali utilizzando uno strumento digitale "spin-the-wheel", in cui i singoli soggetti venivano elencati e assegnati sequencialmente a uno dei tre gruppi. Il gruppo standard includeva femmine (gruppo femminile standard, SFG; n = 3) e maschi (gruppo maschile standard, SMG; n = 7), che avevano accesso continuo al cibo e all'acqua standard. Il gruppo ad accesso continuo includeva femmine (gruppo femminile continuo, CFG; n = 3) e maschi (gruppo maschio continuo, CMG; n =7) con accesso continuo ad libitum al cibo standard, acqua e cibo appetibile (M&M). Il gruppo di accesso intermittente includeva femmine (gruppo femmine intermittenti, IFG; n =3) e maschi (gruppo maschi intermittenti, IMG; n = 7), che avevano accesso ad libitum a cibo e acqua standard, e avevano accesso a cibo appetibile tre volte a settimana (lunedì, mercoledì e venerdì) per 2 ore (16:00-18:00). Queste condizioni di alimentazione sono state mantenute per 35 giorni.

Stimolazione magnetica a tutto il corpo (WB-MS)

Questo paradigma di stimolazione è stato selezionato sulla base di studi precedenti utilizzando campi elettromagnetici a bassa frequenza (50 Hz, 1 mT) in topi C57BL/6 in condizioni sperimentali simili^20,21. WB-MS veniva eseguito utilizzando un dispositivo di magnetoterapia pulsata (Dhan 1000, unità di magnetoterapia) che generava un campo magnetico sinusoidale alternato di 10 Gauss (1 mT) a 50 Hz. Per le sessioni di stimolazione, i topi sono rimasti singolarmente alloggiati nelle loro gabbie domestiche, che venivano posizionate tra due piastre elettromagnetiche ai lati opposti di ciascuna gabbia. Per evitare interferenze da campo magnetico, i componenti metallici, inclusi la gabbia di filo, la griglia e la bottiglia d'acqua, venivano temporaneamente rimossi durante la stimolazione. Questa configurazione permetteva agli animali di muoversi liberamente durante tutta la procedura senza costrizioni o stress aggiuntivo.

Per garantire la coerenza sperimentale, sono state mantenute condizioni di manipolazione e ambientali identiche sia durante le sessioni di stimolazione che di non stimolazione. Durante le sessioni di controllo (giorni 15–21), le placche magnetiche erano posizionate in modo identico ma rimasero inattive, controllando così i potenziali effetti della manipolazione, della manipolazione della gabbia, del rumore ambientale o della posizione delle placche elettromagnetiche.

La WB-MS consisteva in esposizioni giornaliere di 20 minuti dalle 15:40 alle 16:00 per sette giorni consecutivi (giorni 22–28 del protocollo sperimentale), immediatamente prima del periodo di valutazione del cibo incontrollato (16:00–18:00). Dal giorno 29 al 35, i topi sono stati nuovamente sottoposti a sessioni senza stimolazione, dopo le quali è stata valutata la loro assunzione di cibo.

Raccolta di tessuto adiposo

Al termine del protocollo sperimentale (giorno 36, 8:00), è stato raccolto tessuto adiposo da tutti i gruppi sperimentali. Il SG era composto da tre femmine e due maschi (n = 5), il CG da tre femmine e tre maschi (n = 6), e il CG da tre femmine e quattro maschi (n = 7). Tutti gli animali sono stati anestetizzati con ketamina (60 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg⁾²², e l'assenza di una risposta nocicettiva alla stimolazione da pizzicatore delle dita ha confermato una profondità adeguata dell'anestesia. È stata quindi eseguita un'incisione ventrale della linea mediana utilizzando una lama n. 3 del bisturi, che si estende attraverso le regioni addominali sottocostali, inguinale e mediana, seguita da una delicata retrazione laterale della pelle per esporre la cavità addominale.

I depositi di tessuto adiposo di Gonadal, retroperitoneale e sottocutaneo sono stati accuratamente identificati, dissezionati ed estratti in condizioni standardizzate per minimizzare la variabilità tra campioni. Immediatamente dopo la dissezione, i tessuti venivano pesati utilizzando una bilancia analitica calibrata (capacità massima 220 g, leggibilità 0,1 mg), precedentemente verificata secondo le specifiche del^{produttore 23}. Tutti i campioni sono stati processati in condizioni identiche tra i gruppi per garantire la coerenza sperimentale.

Preparazione del tessuto cerebrale e immunofluorescenza

I topi sono stati eutanasiati 90 minuti dopo l'ultima sessione^{di consumo di cibo 24}. I cervelli sono stati prelevati dopo perfusione intracardiaca con paraformaldeide al 4% e successivamente processati per analisi istologica. Le sezioni cerebrali coronali (30 μm) sono state ottenute utilizzando un criostato mantenuto a −18 °C e conservato in PBS contenente azide di sodio fino alla lavorazione. Un sottoinsieme di maschi di ciascun gruppo sperimentale è stato assegnato alla preparazione del tessuto cerebrale per analisi di immunofluorescenza (SG, n = 4; CG, n = 4; IG, n = 4), mentre gli altri animali venivano utilizzati per la raccolta del tessuto adiposo. Questa allocazione differenziale è stata determinata a priori sulla base di requisiti metodologici, poiché la perfusione intracardiaca con paraformaldeide comporta una fissazione tissutale incompatibile con il successivo prelievo di tessuto adiposo a causa della perturbazione dell'integrità del tessuto adiposo. Pertanto, la distribuzione del campione era guidata esclusivamente da vincoli tecnici ed era indipendente dall'assegnazione sperimentale di gruppo o dagli esiti biologici.

Per l'immunofluorescenza c-Fos, sono state incubate sezioni per 72 ore con un anticorpo monoclonale anti-c-Fos (1:1000, sc-166940) diluito in PBS contenente lo 0,25% di gelatina della pelle di maiale e 0,5% di Triton X-100, che fungeva da soluzione di blocco e permeabilizzazione. L'incubazione primaria degli anticorpi è stata eseguita per 24 ore a temperatura ambiente, seguita da 48 ore a 4 °C. Dopo l'incubazione, le sezioni sono state risciacquate accuratamente in PBS e incubate per 2 ore con un anticorpo secondario anti-topo policlonale asino (Alexa Fluor 488-coniugato, 1:500, AB_2338840) diluito nella stessa soluzione. Infine, le sezioni venivano montate su carrelli in vetro utilizzando un mezzo di montaggio.

Acquisizione e quantificazione dell'immagine

L'imaging confocale veniva eseguito utilizzando un microscopio dotato di un laser da 488 nm e di una lente obiettivo da 20x. Le immagini Z-stack venivano acquisite utilizzando il software NIS-Elements C e memorizzate sotto identificatori codificati per l'analisi cieca. La quantificazione dei nuclei c-Fos positivi è stata effettuata utilizzando ImageJ (ImageJ 2.9.0 / 1.53t). Nei conteggi venivano inclusi solo nuclei completamente contenuti, e fu applicato un approccio basato su quadranti per prevenire il doppio conteggio delle singole cellule. Per ogni animale, è stata acquisita un'immagine da ciascuna delle tre sezioni immunocolorate indipendenti utilizzando parametri di acquisizione identici in tutti i gruppi sperimentali. Il numero di nuclei positivi a c-Fos veniva quantificato individualmente per ogni immagine, e i valori ottenuti dalle tre sezioni corrispondenti allo stesso animale venivano sommati. Questo valore totale è stato successivamente normalizzato all'area totale analizzata ed espresso come densità c-Fos (nuclei positivi/mm²). Lo schema complessivo delle procedure sperimentali utilizzate è illustrato nella Figura 1A–H.

Figura 1: Disegno sperimentale e cronologia del protocollo per il binge-like eating e dell'intervento WB-MS. (A) mostra un'immagine rappresentativa di un topo che indica le condizioni abitative iniziali. Un totale di 30 topi (9 femmine e 21 maschi) sono stati ospitati individualmente in gabbie domestiche a partire da P30 e hanno seguito un periodo di abitudine di una settimana. (B) illustra le condizioni dietetiche implementate durante tutto il protocollo di alimentazione simile all'abbuffata dal giorno sperimentale 1 al giorno 35. Il gruppo di controllo aveva accesso ad libitum a cibo e acqua standard. I gruppi ad accesso continuo avevano accesso ad libitum a cibo standard, acqua e cibo gustoso. I gruppi di accesso intermittente avevano accesso ad libitum a cibo e acqua standard. Allo stesso tempo, il cibo appetibile veniva fornito solo il lunedì, mercoledì e venerdì dalle 16:00 alle 18:00 (C), il che indica che dal giorno 15 al 21 gli animali hanno continuato a seguire le stesse condizioni dietetiche, mentre piastre di stimolazione magnetica venivano poste sotto le gabbie senza fornire stimolazione (esposizione simulata). (D) mostra che dal giorno 22 al 28, la WB-MS è stata somministrata 20 minuti prima dell'esposizione a cibo appetibile, mantenendo le condizioni dietetiche corrispondenti per ciascun gruppo. (E) indica che dai giorni 29 al 35 il WB-MS è stato interrotto, anche se le condizioni alimentari sono rimaste invariate. (F) mostra che i cervelli sono stati prelevati al giorno postnatale 72 (P72), seguiti dalla raccolta del tessuto adiposo al giorno postnatale 73 (P73). (G) illustra la sezionazione cerebrale usando un criostato e procedure immunoistochimiche. Infine, (H) mostra l'analisi da microscopia confocale dell'immunoreattività del c-Fos. Le immagini sono state create dagli autori utilizzando Biorender ed è stata ottenuta una licenza adeguata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando la versione 25 di SPSS. Poiché non si poteva assumere una distribuzione normale, sono stati utilizzati test non parametrici durante tutto lo studio. Le differenze tra SG, CG e IG sono state valutate utilizzando il test di Kruskal–Wallis. Confronti ripetuti all'interno di ciascun gruppo sperimentale sono stati analizzati utilizzando il test di Friedman, seguiti da test di confronto multiplo quando appropriato. A causa delle dimensioni limitate dei campioni per alcuni endpoint sperimentali, in particolare nelle femmine (n = 3 per gruppo), i dati di maschi e femmine di topi C57BL/6 sono stati aggregati per le analisi presentate nelle Figure 2, Figure 3 e Figure 4 per migliorare la robustezza statistica e supportare una valutazione esplorativa degli esiti sperimentali. Inoltre, sono stati analizzati dati aggregati sull'ingestione simile all'abbuffata maschio e femmina di topi C57BL/6 utilizzando un'ANOVA bidirezionale, seguiti da test di confronto multiplo per valutare gli effetti del gruppo sperimentale e del tempo durante il protocollo di alimentazione, inclusa la settimana di stimolazione WB-MS. La significatività statistica è stata definita come p ≤ 0,05.

Risultati

Durante l'abbuffata, i soggetti nei gruppi ad accesso intermittente (IMG per maschi, IFG per le donne) hanno mostrato un apporto calorico significativamente superiore rispetto a quelli dei gruppi standard (SFG e SMG) e continuo (CFG e CMG) nei giorni 15, 17 e 19 (test di Kruskal-Wallis; p < 0,05; Figura 2A–B). WB-MS è stato somministrato a un'intensità di 1 mT e a una frequenza di 50 Hz per 20 minuti al giorno in sette giorni consec...

Discussione

I risultati attuali suggeriscono che la WB-MS potrebbe modulare temporaneamente il comportamento simile all'alimentazione incontrollata in un modello murino indotto dall'accesso intermittente a cibi appetibili. Sebbene non siano stati rilevati cambiamenti significativi nell'attività neuronale nel NAc, l'assunzione di cibo appetibile è diminuita progressivamente durante le sessioni di accesso intermittente durante il periodo di stimolazione, culminando in una diminuzione significativa dur...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ImageJ	imagej.net	Public Domain, BSD-2	Software. Programma di elaborazione delle immagini basato su Java. Sviluppato presso il National Institutes of Health e il Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Coverslips	Corning	2935	Vetrino di copertura 24 x 50 mm (Spessore 0.13–0.17)
Secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	AB_2340758	Anticorpo secondario policlonale di asino anti-topo
Laboratory Rodent Diet 5001	LabDiet	1320	Cibo standard. https://di.facmed.unam.mx/comisiones/Composici%C3%B3n%20del%20alimento%20Laboratory%20Rodent%20Diet%205001.pdf
Leica CM1510 S	Leica	CM1510 S	Criostato per istologia di routine.
M&Ms 43.8g (Confezione marrone)	M&M´s	NA	Cibo appetibile. Contenuto nutrizionale per 100: 480 kcal, 19 g di grassi, 70 g di carboidrati, 5.1 g di proteine, 0.13 g di saleIngredienti: zucchero, pasta di cacao, latte scremato in polvere, burro di cacao, lattosio, amido, grasso del latte, grasso di palma, sciroppo di glucosio, grasso di karité, stabilizzante (gomma arabica), dextrina, agenti lucidanti (cera d'api, cera di carnauba), coloranti (E100, carminio, E132, E133, E150a, E150c, E150d, E153, E160a, E160e, E162, E163, E170), concentrato di barbabietola, emulsionanti (lecitina di soia, E445), sale, aromi, olio di nocciolo di palma, antiossidante (E306). (Può contenere: arachidi, nocciole, mandorle). Il cioccolato al latte contiene solidi del latte al 14% minimo. Il cioccolato al latte contiene grassi vegetali oltre al burro di cacao.
Dhan 1000	Magnetoterapia SA de CV	MAG1000	Dispositivo di magnetoterapia pulsata
PBS	MEYER	Monobasic 2415. Dibasic 2410.  NaCl S3014	Sodio Fosfato Monobasico monoidrato. Sodio Fosfato Dibasico eptaidrato. Cloruro di Sodio Cristallino grado biologia molecolare.
Nikon Microscope	Nikon Instruments, Inc	A1R+ STORM	Microscopio confocale
Gabbia per topi in policarbonato	Orchid Scientific	EM01	Gabbia in policarbonato non ferromagnetico utilizzata per l'esposizione WB-MS, completamente trasparente e autoclave (373 x 190 x 138 mm).
Anesket	Pisa	040.000.0226.00	Ketamine soluzione iniettabile
Procin Equus	Pisa	Q-7833-111	Xylazine soluzione iniettabile
c-Fos antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-166940	Anticorpo monoclonale di topo anti-c-Fos
Bilancia da laboratorio	Sartorius		Bilancia analitica
VECTASHIELD Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000-10	Il medium di montaggio antifade è formulato appositamente per preservare i segnali di fluorescenza nella microscopia di immunofluorescenza (IF) minimizzando lo sbiadimento fotochimico.
Vetrine per microscopio	VELAB	VE-P30	Vetrine per microscopio Frosted su un lato 26 x 76 mm (Spessore 0.8–1.1 mm)
Sodium azide		K 6048.0100	99% Sodium azide