Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino

Summary

Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del >90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.

Abstract

Le cellule staminali derivate dalle adipose (ADSC) sono emerse come cellule semi ideali nella medicina rigenerativa grazie alle loro abbondanti fonti, alla raccolta minimamente invasiva, al potenziale di differenziazione multi-lineage e alle proprietà immunomodulatrici. Le loro applicazioni comprendono la riparazione dei tessuti, la modellazione delle malattie e la terapia cellulare; tuttavia, l'isolamento efficiente degli ADSC ad alta vitalità rimane fondamentale per far avanzare la ricerca e la traduzione clinica. I metodi convenzionali di isolamento, come la digestione enzimatica combinata con dissociazione meccanica tramite pipetta, sono limitati da tempi di elaborazione lunghi (1–3 ore), scarsa vitalità cellulare (spesso <70%) e una sostanziale variabilità da batch a lotto, compromettendo gli esperimenti a valle.

Qui presentiamo il sistema SoniConvert (un sistema meccanico di separazione cellulare basato su onde), che combina la digestione a onda meccanica e la digestione enzimatica per affrontare queste sfide. Il sistema integra un'unità di controllo basata su microprocessore che regola la dissociazione mediata da onde meccaniche tramite feedback digitale, insieme a un reagente di allentamento specifico per il tessuto e ottimizzato per il tessuto adiposo (incubazione di 5–15 minuti). Questo approccio consente la rapida conversione del tessuto in una sospensione unicellulare, con la dissociazione meccanica completata in 3–9 secondi.

Il sistema offre tre vantaggi: (1) elaborazione ultra-veloce, con il processo di isolamento del nucleo — dalla digestione enzimatica alla separazione iniziale delle frazioni cellulari — completato in circa 30 minuti (>90% rispetto ai metodi convenzionali); (2) alta conservazione della viabilidade, con la colorazione blu di tripano che conferma la vitalità cellulare dell'80–95%, superando i protocolli tradizionali; e (3) ampia compatibilità, poiché le sospensioni monocellulari risultanti soddisfano i requisiti per coltura cellulare primaria, citometria a flusso, saggi di citotossicità e costruzione di organoidi adiposi. Riducendo i tempi di elaborazione, migliorando l'integrità cellulare e limitando la variabilità, questo sistema fornisce una piattaforma pratica per la ricerca legata all'adipo.

Introduction

Le cellule staminali derivate dalle parti adipose (ADSC), un sottoinsieme critico delle cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal tessuto adiposo, mostrano un notevole potenziale terapeutico grazie alla loro accessibilità, prelievo minimamente invasivo, robusta capacità proliferativa, potenziale di differenziazione multi-lineage e potenti proprietà paracrine e^{immunomodulatrici} 1,2,3,4 . Queste caratteristiche hanno posizionato gli ADSC come candidati promettenti per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e l'immunoterapia. Tuttavia, l'utilità traslazionale degli ADSC dipende dalla capacità di isolare popolazioni funzionalmente intatte e ad alta purezza — un processo che rimane tecnicamente impegnativo. La biologia unica del tessuto adiposo introduce due ostacoli principali: (1) l'elevato contenuto lipidico degli adipociti li rende soggetti a rottura durante il processo meccanico, rilasciando lipidi liberi che contaminano la frazione vascolare stromaica (SVF) e compromettono la vitalità e la resa^{cellulare 5,6}; e (2) la complessità strutturale del tessuto, composta da fascia, cellule endoteliali, cellule immunitarie e componenti del^{sangue 7}, complica la separazione delle cellule derivate dall'adipo. Queste limitazioni sottolineano l'urgente necessità di un metodo efficiente, rapido e che preservi la vitalità per isolare ADSC e adipociti di alta qualità, che sono altrettanto critici per applicazioni a valle come la modellazione delle malattie metaboliche e le terapie cellulari.

Attualmente sono disponibili diversi metodi consolidati per isolare cellule derivate dall'adiposo, tra cui la digestione enzimatica, la coltura di expiantiti e la separazione^{meccanica 8,9,10}. La digestione enzimatica, l'approccio più ampiamente adottato, impiega la collagenasi per degradare i componenti della matrice extracellulare (ECM), rilasciando cellule staminali incapsulate. Questo metodo prevede tipicamente la triturazione dei tessuti, la digestione della collagenasi (37 °C, 1–2 ore), l'isolamento SVF tramite centrifugazione e la purificazione in coltura aderente. Sebbene efficace per la degradazione della MEC, la digestione enzimatica presenta notevoli svantaggi: tempi di lavorazione prolungati (3–4 ore in totale), dipendenza da grandi volumi di campioni e rischi di citotossicità enzimatica o variabilità da batch a lotto da collagenasi di origine animale—tutti elementi che ostacolano la traduzione clinica. La coltura espiantita, che sfrutta la migrazione delle cellule staminali dai frammenti di tessuto, produce cellule con vitalità preservata ma soffre di basso rendimento e ritardo nel recupero cellulare (7–10 giorni). La dissociazione meccanica, che si basa su interruzioni fisiche (ad esempio, oscillazione, taglio), riduce i tempi di elaborazione ma spesso compromette l'integrità cellulare, portando a una diminuzione della vitalità e a popolazioni impure. Collettivamente, questi metodi non riescono a conciliare efficienza, purezza e fattibilità — criteri critici per l'isolamento cellulare di grado clinico. Pertanto, proponiamo un metodo innovativo per isolare cellule derivate dalle adipose (adipociti e ADSC) che combina la digestione enzimatica con la dissociazione mecanica mediata da onde¹¹. Questo approccio raggiunge due progressi chiave: (1) efficienza temporale: combinando cocktail enzimatici, pre-ottimizzati e privi di animali, con onde meccaniche a bassa frequenza, il tempo totale di elaborazione viene ridotto da 3–4 ore a ~30 min (Figura 1); (2) Conservazione della vitalità: la dispersione meccanica delicata minimizza la rottura degli adipociti e il rilascio lipidico. È importante notare che il periodo di 30 minuti si riferisce al flusso di lavoro di isolamento del nucleo (digestione, dissociazione meccanica, filtrazione e centrifugazione iniziale) per ottenere frazioni grezze di adipociti e SVF; i passaggi opzionali di purificazione a valle, come la lisi dei globuli rossi (RBC), richiedono un tempo di gestione aggiuntivo.

Il nostro metodo ottimizzato di isolamento delle cellule adipose dimostra un notevole potenziale di applicazione in molteplici ambiti di ricerca e clinici. Nella ricerca fondamentale, le cellule ad alta vitalità ottenute mostrano prestazioni eccezionali negli studi di differenziazione adipogenica e osteogenica, fornendo una fonte cellulare affidabile per applicazioni di ingegneria tissutale. In medicina traslazionale, studi clinici hanno dimostrato il potenziale terapeutico degli ADSC nel trattamento di condizioni come l'osteoartrite¹², le malattie^{cardiovascolari 13}, la sclerosi^{multipla 14} e la malattia infiammatoria intestinale (IBD)/malattia^{di Crohn 15}. Gli ADSC rapidamente isolati rappresentano mattoni ideali per costruire organoidi del tessuto adiposo e implementare applicazioni di terapia cellulare, promuovendo significativamente la ricerca sullo screening farmacologico e sulla modellazione delle malattie. Inoltre, le sospensioni monocellulari di alta qualità sono adatte per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola. In conclusione, questo approccio integrato stabilisce una solida piattaforma tecnologica per il tessuto adiposo, supportando sia la ricerca di base che la traduzione clinica nella medicina rigenerativa.

Protocol

Tutte le ricerche sugli animali sono state condotte in conformità con il Regolamento per l'Amministrazione degli Affari Riguardanti gli Animali Sperimentali (Ministero della Scienza e Tecnologia, Cina, revisionato nel marzo 2017), e approvato dal Comitato Etico e per il Benessere Animale dell'Università Agricola del Sichuan (Numero di autorizzazione: 20230089). Questo protocollo richiede l'uso del sistema SoniConvert, un dispositivo commercialmente disponibile per la dissociazione meccanica assistita da onde (d'ora in poi chiamato sistema di dissociazione meccanica). Il protocollo è ottimizzato per il tessuto adiposo suino, e la sua dipendenza da queste apparecchiature specializzate rappresenta una limitazione chiave.

1. Raccolta e preparazione del tessuto adiposo

1. Disinfezione preoperatoria e rimozione dei peli
   1. Eutanasiare il maiale tramite overdose endovenosa di pentobarbital sodio (100 mg/kg di peso corporeo). Confermare la morte prima della raccolta dei tessuti.
   2. Applicare garza sterile imbevuta nel 2% di iodoforo per la disinfezione a spirale del dorso suino, estendendosi per 15 cm dalla linea mediana. Lascia asciugare per 30 secondi.
   3. Usa un rasoio sterile per radere i peli da un'area di 16 cm × 8 cm. Assicurati che tutti i peli vengano rimossi dall'area operatoria.
   4. Strofina il retro due volte con etanolo al 75% usando una garza sterile.
2. Raccolta di tessuto adiposo
   1. Fai un'incisione trasversale di 20 cm lungo la linea mediana dorsale con un bisturi sterile.
   2. Solleva il bordo dell'incisione con una pinza sterile. Dissezionare lungo il piano naturale tra tessuto adiposo e derma per ottenere uno strato superiore completo di tessuto adiposo sottocutaneo dorsale (ULB) di circa 2–3 mm di spessore.
   3. Risciacquare l'ULB una volta in soluzione salina sterile ghiacciata e metterlo in una teglia di coltura sterile (Figura 2).

Figura 2: Raccolta di ULB di maiale per isolamento cellulare. (A) Illustrazione della struttura del tessuto adiposo del dorso del maiale; (B) Sito di taglio del minipig Bama; (C) Presentazione del tessuto adiposo dorsale, la schiena del maiale la parte adiposa sottocutanea contiene due strati, lo strato superiore (ULB) e quello interno (ILB); (D) Ha raccolto ULB. Abbreviazione: ULB = strato superiore della schiena; ILB = strato interno della schiena. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Punto di pausa: Il tessuto adiposo raccolto può essere conservato in soluzione salina sterile fredda come ghiaccio o in soluzione di D-Hanks a 4 °C per un breve periodo prima di una ulteriore dissezione.
NOTA: L'obiettivo è raccogliere l'ULB. Evitare di includere lo strato inferiore di tessuto adiposo sottocutaneo dorsale (ILB) durante la dissezione.

3. Dissezione e pulizia del tessuto adiposo
   1. Aggiungi 10 mL di tampone D-Hanks gelato per ogni 1,8 g di fazzoletto sul piatto e assicurati che il tessuto sia completamente sommerso.
   2. Identifica ed elimina tutti i vasi sanguigni visibili dal tessuto usando forbici chirurgiche sterili. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e componenti fibrotici. Scartare i materiali estisi in contenitori designati come biohazard.
      NOTA: Usa estrema cautela quando maneggia strumenti affilati; Taglia sempre via dal corpo e getta lame e forbici usate in contenitori per oggetti appuntiti subito dopo l'uso.
   3. Risciacqua il tessuto all'interno del D-Hanks Buffer per rimuovere sangue residuo e detriti.
      NOTA: Per campioni con ematoma eccessivo, sostituire il tampone 1–3 volte secondo necessità per ottenere chiarezza visiva. Mantenere tutti i passaggi di dissezione sul ghiaccio per preservare la vitalità dei tessuti.
4. Dissociazione meccanica del tessuto adiposo
   1. Trasferire 1,8 g dei frammenti di tessuto risciacquati in un tubo sterile da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 800 μL di buffer di dissociazione tissutale di tipo A (A-Buffer) al tubo.
   2. Utilizzando forbici oftalmiche sterili, trita il tessuto nel tubo in piccoli pezzi di circa 1–2^{mm 3} in dimensione.
      NOTA: Se si osservano perdite lipidiche significative durante o dopo la tritura, lavare nuovamente il tessuto con 1 mL di soluzione di D-Hanks preraffreddata prima di procedere con la digestione enzimatica per rimuovere i lipidi dagli adipociti rotti. Questo passaggio preserva l'integrità degli adipociti per l'analisi a valle.

2. Isolamento cellulare e omogeneizzazione

1. Elaborazione enzimatica
   1. Aggiungere 200 μL dell'Agente di Dissociazione Tissutale di Tipo A (Soluzione di tipo A) a un nuovo tubo microcentrifuga. Ruota e scuoti delicatamente il tubo a mano 3 volte per mescolare il contenuto e assicurarti che i frammenti adiposi siano completamente immersi nella soluzione dissociativa.
   2. Verifica che il tappo del tubo sia ben chiuso. Metti il tubo in un bagno metallico a 37 °C e incuba per 5–10 minuti.
      NOTA: Monitorare la soluzione finché non diventa torbida e i frammenti di tessuto sembrano parzialmente digeriti. La soluzione di tipo A contiene collagenasi e proteasi neutra. Indossa guanti in nitrilo, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza durante la maneggiazione. Evita il contatto con la pelle; Se si verifica l'esposizione, risciacqua immediatamente con acqua abbondante per 15 minuti. L'A-Buffer non verrà scartato dopo aver aggiunto la Soluzione di Tipo A.
2. Dissociazione meccanica assistita da ultrasuoni
   1. Trasferire i frammenti di tessuto adiposo parzialmente digeriti insieme al tampone circostante dal tubo della microcentrifuga in un tubo sterile da 1,5 mL designato per il sistema di dissociazione meccanica.
   2. Esegui il programma presettato per il tessuto adiposo nel sistema di dissociazione meccanica per eseguire la dissociazione meccanica usando un'onda sinusoidale a 200 Hz.

3. Filtrazione per ottenere una sospensione a singola

1. Filtrazione e centrifugazione
   1. Raccogli la sospensione cellulare e passala attraverso un filtro cellulare da 200 μm in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL per rimuovere grandi detriti e grumi di tessuto non digeriti.
   2. Aggiungi 5 mL di soluzione D-Hanks preraffreddata (4 °C) al colino. Risciacqua il colino con la soluzione D-Hanks due volte per massimizzare la resa cellulare.
   3. Centrifuga la sospensione a celle filtrate a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
      Punto di pausa: Dopo la centrifugazione, la sospensione della cella può essere processata immediatamente o mantenuta sul ghiaccio per un breve periodo prima della separazione degli strati.
   4. Raccolta degli adipociti: per raccogliere gli adipociti, aspirare e scartare lo strato lipidico soprantantante utilizzando una pipetta pasteur sterile, lasciando 1 mL di tampone per proteggere lo strato adipocitico. Raccogliere il secondo strato per l'analisi a valle degli adipociti. Evita di disturbare il terzo e il quarto livello.
   5. Raccolta SVF (frazione stromalare vascolare): Dopo la rimozione degli strati superiori, sospezione delicata del pellet inferiore contenente la frazione stromale vascolare (SVF) in 1 mL di D-Hanks/PBS. Risospendere delicatamente la pellet cellulare in 1 mL di D-Hanks/PBS per ottenere una concentrazione cellulare di 2–5 × 10⁶ cellule/mL.
      NOTA: Idealmente, dopo la centrifugazione si possono osservare quattro strati: lo strato lipidico nella parte superiore; il secondo strato contiene adipociti; il terzo è lo strato tampone idrofilo; e lo strato inferiore è la SVF, che contiene cellule staminali (Figura 1).
2. Lisi dei globuli rossi
   1. NOTA: Se il pellet cellulare presenta un colore rosso significativo, indicando la contaminazione da globuli rossi, eseguire la lisi dei globuli rossi.
      Risospendere il pellet cellulare in 1–3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) utilizzando una pipetta P1000 con punte a grande diametro. Incubare sul ghiaccio per 15 minuti con qualche miscelazione occasionale.
   2. Preraffreddare tutte le soluzioni e i rotori della centrifuga a 4 °C per minimizzare l'attività metabolica durante la lavorazione.
   3. Centrifugare a 500 × g per 10 minuti a 4 °C. Aspira completamente il soprantantante.
   4. Lavare nuovamente le celle risospendendo il pellet in 5 mL di soluzione di D-Hanks preraffreddata e centrifugare a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
3. Sospensione finale
   1. Risospendere il pellet a celle finali in D-Hanks/PBS per applicazioni a valle.

4. Applicazioni a valle e analisi

1. Valutazione della vitalità delle cellule SVF e della resa cellulare
   1. Prepara la sospensione della cella SVF ottenuta in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Tieni la sospensione sul ghiaccio fino all'uso.
   2. Mescolare 10 μL della sospensione delle cellule SVF con 10 μL di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% in un tubo microcentrifuga sterile da 0,5 mL. Pipetta delicatamente su e giù per 3 volte per garantire una miscelazione uniforme.
      NOTA: La concentrazione finale di Trippan Blue nella miscela è dello 0,2%. Evita di introdurre bolle d'aria durante la miscelazione, poiché potrebbero interferire con il conteggio automatico delle cellule.
      Trasferire 10 μL della miscela di cellule colorate su un vetrino di conteggio adatto al contatore automatico delle celle. Assicurati che il campione riempia completamente la camera senza traboccare.
   3. Inserisci il diavolo di conteggio nel Contatore Celle. Seleziona il tipo di saggio Trypan Blue e regola l'intervallo di concentrazione cellulare se necessario.
   4. Premi il pulsante Conteggio per avviare il conteggio automatico delle celle. Lo strumento catturerà immagini della camera di conteggio e distinguerà automaticamente le cellule vive da quelle morte.
   5. Registra la percentuale di vitalità delle celle e conta il numero totale di celle vitali visualizzate sullo schermo dello strumento. Effettuare tre misurazioni indipendenti per ciascun campione e calcolare la media di vitalità e la resa cellulare per grammo di tessuto adiposo.
      NOTA: Pulire il vetrino di conteggio e la porta di carico degli strumenti con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo per prevenire la contaminazione incrociata tra campioni.
2. Osservazione della morfologia degli adipociti
   1. Tingere gli adipociti isolati con 5 μg/mL di Hoechst per i nuclei e 1 μM di BODIPY per i lipidi in D-Hanks/PBS per 15 minuti a 37 °C.
      Punto di pausa: Dopo la colorazione, i campioni devono essere prontamente acquisiti con l'immagini; se necessario, possono essere tenuti protetti dalla luce a 4 °C per un breve periodo prima della microscopia.
   2. Usa un sistema di vetro a copertura per vetrini adatto agli adipociti per la preparazione delle vetrine, evitando la compressione delle cellule.
   3. Osserva i nuclei (colorati con Hoechst) e le gocce lipidiche (colorate con BODIPY) al microscopio a fluorescenza.
      NOTA: A causa delle grandi dimensioni (20–300 μm) e dell'elevato contenuto lipidico, gli adipociti sono fragili, tendono a galleggiare e ad impilarsi in più strati, rendendo i metodi di montaggio convenzionali inadatti per un'osservazione microscopica chiara (Figura 3A). Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un sistema di montaggio adatto agli adipociti fatto in casa, utilizzando vetrine e coperture standard (Figura 3B).
3. Purificazione delle componenti vascolari stromali e osservazione morfologica degli ADSC
   1. Seminare la SVF appena isolata in una fiaschetta di coltura di cellule T25 contenente 5 mL di DMEM integrati con FBS al 10% e 1% di penicillina-estreptomicina. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂.
   2. Dopo 48 ore, lava delicatamente la fiaschetta due volte con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungi un substrato fresco per la coltura e continua l'incubazione.
   3. Sostituisci il substrato di coltura ogni 2-3 giorni. Monitorare la morfologia e la confluenza cellulare al microscopio invertito.
   4. Quando le cellule raggiungono l'80–90% di confluenza (tipicamente dopo 7–10 giorni), si staccano le cellule usando tripsina-EDTA allo 0,25% per 3–5 minuti a 37 °C. Neutralizza con un mezzo di coltura e raccoglie la sospensione cellulare.
   5. Eseguire la colorazione con Trypan Blue per rilevare la vitalità della cellula prima del rilevamento e dell'ordinamento FACS.
   6. Osserva la morfologia degli ADSC purificati e coltivati al microscopio ottico.
   7. Filtrare la sospensione delle cellule raccolte attraverso un setaccio da 70 μm per rimuovere eventuali aggregati residui. Risospendere le cellule in PBS contenenti il 2% di FBS per l'analisi FACS.
   8. Tingere le cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro CD73, CD90, CD11b e CD45 per 30 minuti a 4 °C al buio.
   9. Lava le cellule 2 volte con tampone di colorazione e risospendi in PBS contenente FBS al 2%.
   10. Eseguire un'analisi citometrica di flusso utilizzando un ugello da 70 μm a 20 psi e portata inferiore a 3,0.
   11. Escludere i detriti cellulari facendo un gate sulla popolazione principale utilizzando parametri di area di scattering frontale (FSC-A) e area di dispersione laterale (SSC-A).
   12. Rimuovere i doppietti tramite gating FSC-A rispetto a FSC-H e selezionare la popolazione di singoletti valida per l'analisi a valle.
   13. Analizza le cellule portate basandosi sull'espressione dei marcatori superficiali. Usa CD73 e CD90 come marker positivi e CD11b e CD45 come marker negativi per verificare il fenotipo ADSC.
   14. Osserva la morfologia degli ADSC arricchiti e coltivati al microscopio ottico. La caratteristica morfologia a forma di fuso, simile a un fibroblasto, indica un arricchimento ADSC riuscito.
4. Differenziazione adipogenica ADSC
   1. Seminare la terza generazione di ADSC a una densità di 1 × 10⁴ cellule/^{cm 2}. Quando la confluenza cellulare raggiunge circa il 90%, si avvia l'induzione adipogenica.
   2. Prepara il mezzo di induzione adipogenico utilizzando il mezzo di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio che contiene il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM di desametasone, 10 μg/mL di insulina e 1 μM di rosiglitazone.
   3. Dopo 3 giorni di induzione, sostituisci il substrato con un mezzo di manutenzione e cambia la soluzione ogni 2 giorni.
   4. Dopo 14 giorni di induzione, colora le cellule con olio rosso O e osserva le gocce lipidiche al microscopio invertito.
5. Differenziazione osteogenica ADSC
   1. Quando la confluenza cellulare raggiunge l'80–90%, inizia l'induzione osteogenica. Formulare il mezzo di induzione osteogenico con DMEM ad alto contenuto di glucosio che contiene il 10% di FBS, 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 μM di calcitriolo e 1 μM di desametasone.
   2. Cambia il substrato ogni 2–3 giorni e prosegue il processo di induzione per circa 14 giorni.
   3. Tingi le cellule con 2% di Alizarina Rossa S (pH 5,2) e osservale al microscopio invertito.
6. Costruzione e identificazione organoidi
   1. Preparare una sospensione monocellulare di ADSC in un mezzo di coltura completo e regolare la concentrazione cellulare a 2 × 10⁴ cellule/20 μL.
   2. Invertire il coperchio di una ciotola da 100 mm e distribuire gocce di 20 μL della sospensione della cella sulla superficie interna del coperchio.
   3. Aggiungi PBS sterile sul fondo della ciotola per mantenere l'umidità, copri con cura il coperchio e incuba le gocce sospese in condizioni di coltura standard.
   4. Osserva le gocce ogni giorno e lascia che le cellule si aggregano e formino sferoidi per 6 giorni.
   5. Raccogli delicatamente gli sferoidi usando una pipetta e trasferili in Matrigel preraffreddato su ghiaccio.
   6. Inserire gli sferoidi in Matrigel e implattare la miscela in piastre di coltura prima di incubarla in condizioni di coltura standard.
   7. Sostituire regolarmente il mezzo e monitorare la crescita organoide fino ai giorni 18–28, quando le strutture diventano compatte e mature.
   8. Fissare gli organoidi con il 4% di paraformaldeide, permeabilizarli con il 0,1% di Triton X-100 e bloccare il legame non specifico con il 5% di BSA.
   9. Incubare i campioni con anticorpi primari contro CD73, CD90, CD11b e CD45, poi incubarli con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti.
   10. Tingi gli organoidi con Hoechst e BODIPY per visualizzare rispettivamente nuclei e gocce lipidiche, e osserva i campioni colorati al microscopio a fluorescenza.
       NOTA: Eseguire la selezione cellulare e tutte le manipolazioni che coinvolgono colture aperte, inclusi la semina, l'alimentazione e la preparazione della colorazione, in condizioni asettiche rigorose in un armadietto di biosicurezza.

Results

Figura 1: Illustrazione schematica del processo di isolamento cellulare derivato dall'adipo. Il diagramma rappresenta il metodo tradizionale e quello attuale come flussi di lavoro illustrativi. Sono coinvolti tre passaggi principali nell'isolamento delle cellule derivate dalle membrane: il primo è il pretratt...

Discussion

Il presente studio introduce un nuovo approccio integrato per isolare cellule derivate dalle adipose (principalmente adipociti e ADSC) che affronta limitazioni critiche dei metodi convenzionali. Combinando l'allentamento enzimatico specifico del tessuto con la dissociazione meccanica a onde di precisione, questo sistema raggiunge un isolamento cellulare rapido (tempo totale di elaborazione ~30 min), alta vitalità (80–95%) e riproducibile.

La digestione enzimat...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di Dissociazione Tissutale di Tipo A	Docsense	TM001	Contiene un agente di dissociazione tissutale di tipo A (soluzione di tipo A) e un buffer di dissociazione tissutale di tipo A (buffer A).
Kit per Medium di Differenziazione Adipogenica	OriCell	GUXMD-90031	Utilizzato per la differenziazione adipogenica, inclusi il medio Eagle's modificato (non modificato) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio e il mezzo di manutenzione
Alizarin Red S	OriCell	A5533ALIR-10001	Colorazione mineralizzata per differenziazione osteogenica (pH 5,2)
Acido ascorbico	Sigma-Aldrich	A4544	Acido L-ascorbico, coltura cellulare testata, per induzione osteogenica
Bama minipigs	Chengdu Dossy Animali Sperimentali Co., Ltd		Maschi, animali di un anno, di grado SPF, mantenuti secondo procedure standardizzate di vaccinazione, sverminazione e pulizia.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html
Contatore Automatico di Celle Bio-Rad TC20	Laboratori Bio-Rad	1450011	Contatore automatico di celle per la valutazione della vitalità e della resa
BODIPY	Thermo Fisher Scientific	D3922	Colorazione lipidica neutra
BSA (5%)	Sigma-Aldrich	A9418	Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata, per bloccare
Calcitriolo	Sigma-Aldrich	C9756	1α,25-Diidrossivitamina D3, per l'induzione osteogenica
Crivello cellulare (70 & mu; m)	Corning	352350	Falcon 70 & mu; Filtratore di cellule m, sterile, per la preparazione del campione FACS
Filtro di cellule (200 e mu; m)	pluriSelect	43-50200-03	pluriScolino, rete PET, monta tubi da 50 mL, sterile e nbsp;
tubo centrifugo (50 mL)	Corning	352098	Falcon 50 mL tubo conico ad alta nitidezza, sterile, polipropilene
Slide di conteggio (per Bio-Rad TC20)	Laboratori Bio-Rad	1450011	Slide di conteggio a doppia camera per contatore cellulari automatico TC20 & nbsp;
piatto di coltura (100 mm)	Corning	430167	Piatto sterile di polistirene, per la formazione di organoidi a goccia sospeso
Desametasone	Sigma-Aldrich	D4902	≥ 98%, per induzione adipogenica e osteogenica
Soluzione salina bilanciata di D-Hanks o PBS	Gibco	10010015	Pre-raffreddato a 4 °C; C, pH 7,4.
DMEM	Gibco	11965084	Questo viene utilizzato per la coltivazione di SVF appena isolata
DNasi I	Beyotime	D7073	Opzionale, consigliato se si osservano grumi.
etanolo	Sigma-Aldrich	459836	75% per la disinfezione superficiale.
Siero Fetale Bovino (FBS)	Gibco	A4736201	Sistema Tet approvato, origine USA, sterile
Citometro di flusso	BD in Biologia	BD FACSCanto II	3 laser (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 canali di fluorescenza, per l'analisi dei marcatori superficiali (CD73, CD90, CD11b, CD45), raggiunge 70 requisito ugello a 20 psi
Microscopio a fluorescenza	Olympus		Modello invertito o verticale capace di set di filtri FITC e DAPI.
Anticorpi secondari fluorescenti	Thermo Fisher Scientific	A-11001 (anti-topo), A-11008 (anti-coniglio)	Alexa Fluor coniugata, per immunofluorescenza
Anticorpi coniugati con fluorocromo (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD in Biologia	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo ADSC
Hoechst	Thermo Fisher Scientific	H3570	Colorazione nucleare per la valutazione delle cellule vive/morte.
IBMX	Sigma-Aldrich	I5879	≥ 99% (HPLC), per mezzo di induzione adipogenica
Soluzione salina sterile gelida	Baxter	2F7124	Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP, per risciacquare i tessuti
Insulina	Sigma-Aldrich	I9278	Ricombinante, espresso nel lievito, per l'induzione adipogenica
Iodoforo	Sigma-Aldrich	25104	Soluzione disinfettante al 2%.
Matrigel	Corning	354230	Fattore di crescita ridotto, privo di fenolo, per l'inserimento di sferoidi
Bagno Metallico	Servicebio	SMB-H	Usato per incubazione a 37 °C.
Oil Red O	OriCell	OILR-10001	Colorazione lipidica per la differenziazione degli adipociti
Microscopio ottico	Olympus		Microscopio standard da campo chiaro con 10x e linee; 40 obiettivi.
Kit per medium di differenziazione osteogenica	OriCell	GUXMD-90021	Utilizzato per la differenziazione osteogenica, inclusi il medium Eagle's modificato (non modificato) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio e il medium di manutenzione
Pipetta P1000 con punte a diametro largo	Beckman Coulter	B01113	Punte a diametro largo Biomek P1000 Span-8, sterili
Paraformaldeide (4%)	Thermo Fisher Scientific	J61899	Soluzione acquosa, per fissare organoidi
Pipetta pasteur	Corning	7095S-5C	Sterile, usa e getta.
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070063	10.000 U/mL di penicillina, 10.000 e mu; g/mL streptomicina, sterile
Pentobarbital sodio	Hikma Pharmaceuticals USA Inc.	24201-010-20	Iniettabile, per l'eutanasia (100 mg/kg di peso corporeo, endovenosa). ANDA 203619
Anticorpi primari (CD73, CD90, CD11b, CD45)	BD in Biologia	561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45)	Per l'immunocolorazione organoide
Buffer di lisi dei globuli rossi (RBC)	Solarbio	R1010	Se necessario per applicazioni a valle.
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5702R	Utilizzato per i passaggi di centrifugazione a 4 °C.
Rosiglitazone	Cayman Chemical	71740	≥ 98%, PPAR & gamma; agonista per l'induzione adipogenica
Contenitore per oggetti pungenti	Becton Dickinson	305270	Contenitore antiforatura per lame e forbici usate
Sistema di preparazione per la sospensione a celle singole SoniConvert	Docsense	SC-L1W	Utilizzato per la dissociazione meccanica dei tessuti.
Tamponamento di colorazione (buffer di colorazione per citometria a flusso)	eBioscienza (Thermo Fisher Scientific)	00-4222-57	200 mL, pronti all'uso, contengono FBS e 0,09% azide di sodio come conservante, per diluizione di anticorpi e cellule, colorazione superficiale e passaggi di lavaggio nella citometria a flusso
Tubo Eppendorf sterile da 1,5 mL	Eppendorf	30121.517	Tubo microcentrifuga Safe-Lock, sterile, per la triturazione dei tessuti
Piatto di coltura sterile	Corning	430167	Vaso di coltura sterile da 100 mm x 20 mm, per la raccolta dei tessuti
Pinza sterile	Sklar	96-1719	Pinza sterile per il pollice, seghettata, per la gestione dei tessuti & nbsp;
Garza sterile	Dukal Corporation	7060033	Compresse di garza sterili, per disinfezione e pulizia
Forbici oftalmiche sterili	Sklar	10023-580	Forbici a molla stile Vannas, per triturare tessuto in 1-2 mm e sup3; Pezzi
Rasoio sterile	3M	9681	Rasoio di preparazione chirurgica, per la depilazione dall'area operatoria
Bisturi sterile	Integra Miltex	4-415	Bisturi sterile usa e getta, per l'incisione
Forbici chirurgiche sterili	Sklar	10022-580	Forbici Merit Sterile Iris, per dissezionare vasi sanguigni e tessuto connettivo
Fiaschetta di coltura cellulare T25	Corning	430639	Fiaschetta di coltura cellulare Falcon T25, tappo ventilato, sterile
Triton X-100 (0,1%)	Sigma-Aldrich	T8787	Grado di laboratorio, per permeabilizzazione
Trippan Blue	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15250061	Soluzione allo 0,4% per il conteggio della vitalità cellulare.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	0,25% tripsina, 1 mM EDTA, per distacco degli ADSC
β-Glicerofosfato	Sigma-Aldrich	G9422	Sale disodio pentaidrato, per induzione osteogenica