Qui presentiamo un metodo standard per isolare in modo efficiente cellule staminali e adipociti derivati dalle adipoci, caratterizzato da una riduzione del >90% dei tempi di lavorazione, un'elevata vitalità cellulare e una compatibilità ampia.
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Articolo metodologico
Isolamento efficiente di cellule staminali e adipociti derivati dall'adiposo dal tessuto adiposo suino
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali derivate dalle adipose (ADSC) sono emerse come cellule semi ideali nella medicina rigenerativa grazie alle loro abbondanti fonti, alla raccolta minimamente invasiva, al potenziale di differenziazione multi-lineage e alle proprietà immunomodulatrici. Le loro applicazioni comprendono la riparazione dei tessuti, la modellazione delle malattie e la terapia cellulare; tuttavia, l'isolamento efficiente degli ADSC ad alta vitalità rimane fondamentale per far avanzare la ricerca e la traduzione clinica. I metodi convenzionali di isolamento, come la digestione enzimatica combinata con dissociazione meccanica tramite pipetta, sono limitati da tempi di elaborazione lunghi (1–3 ore), scarsa vitalità cellulare (spesso <70%) e una sostanziale variabilità da batch a lotto, compromettendo gli esperimenti a valle.
Qui presentiamo il sistema SoniConvert (un sistema meccanico di separazione cellulare basato su onde), che combina la digestione a onda meccanica e la digestione enzimatica per affrontare queste sfide. Il sistema integra un'unità di controllo basata su microprocessore che regola la dissociazione mediata da onde meccaniche tramite feedback digitale, insieme a un reagente di allentamento specifico per il tessuto e ottimizzato per il tessuto adiposo (incubazione di 5–15 minuti). Questo approccio consente la rapida conversione del tessuto in una sospensione unicellulare, con la dissociazione meccanica completata in 3–9 secondi.
Il sistema offre tre vantaggi: (1) elaborazione ultra-veloce, con il processo di isolamento del nucleo — dalla digestione enzimatica alla separazione iniziale delle frazioni cellulari — completato in circa 30 minuti (>90% rispetto ai metodi convenzionali); (2) alta conservazione della viabilidade, con la colorazione blu di tripano che conferma la vitalità cellulare dell'80–95%, superando i protocolli tradizionali; e (3) ampia compatibilità, poiché le sospensioni monocellulari risultanti soddisfano i requisiti per coltura cellulare primaria, citometria a flusso, saggi di citotossicità e costruzione di organoidi adiposi. Riducendo i tempi di elaborazione, migliorando l'integrità cellulare e limitando la variabilità, questo sistema fornisce una piattaforma pratica per la ricerca legata all'adipo.
Introduzione
Le cellule staminali derivate dalle parti adipose (ADSC), un sottoinsieme critico delle cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dal tessuto adiposo, mostrano un notevole potenziale terapeutico grazie alla loro accessibilità, prelievo minimamente invasivo, robusta capacità proliferativa, potenziale di differenziazione multi-lineage e potenti proprietà paracrine eimmunomodulatrici 1,2,3,4 . Queste caratteristiche hanno posizionato gli ADSC come candidati promettenti per la medicina rigenerativa, l'ingegneria tissutale e l'immunoterapia. Tuttavia, l'utilità traslazionale degli ADSC dipende dalla capacità di isolare popolazioni funzionalmente intatte e ad alta purezza — un processo che rimane tecnicamente impegnativo. La biologia unica del tessuto adiposo introduce due ostacoli principali: (1) l'elevato contenuto lipidico degli adipociti li rende soggetti a rottura durante il processo meccanico, rilasciando lipidi liberi che contaminano la frazione vascolare stromaica (SVF) e compromettono la vitalità e la resacellulare 5,6; e (2) la complessità strutturale del tessuto, composta da fascia, cellule endoteliali, cellule immunitarie e componenti delsangue 7, complica la separazione delle cellule derivate dall'adipo. Queste limitazioni sottolineano l'urgente necessità di un metodo efficiente, rapido e che preservi la vitalità per isolare ADSC e adipociti di alta qualità, che sono altrettanto critici per applicazioni a valle come la modellazione delle malattie metaboliche e le terapie cellulari.
Attualmente sono disponibili diversi metodi consolidati per isolare cellule derivate dall'adiposo, tra cui la digestione enzimatica, la coltura di expiantiti e la separazionemeccanica 8,9,10. La digestione enzimatica, l'approccio più ampiamente adottato, impiega la collagenasi per degradare i componenti della matrice extracellulare (ECM), rilasciando cellule staminali incapsulate. Questo metodo prevede tipicamente la triturazione dei tessuti, la digestione della collagenasi (37 °C, 1–2 ore), l'isolamento SVF tramite centrifugazione e la purificazione in coltura aderente. Sebbene efficace per la degradazione della MEC, la digestione enzimatica presenta notevoli svantaggi: tempi di lavorazione prolungati (3–4 ore in totale), dipendenza da grandi volumi di campioni e rischi di citotossicità enzimatica o variabilità da batch a lotto da collagenasi di origine animale—tutti elementi che ostacolano la traduzione clinica. La coltura espiantita, che sfrutta la migrazione delle cellule staminali dai frammenti di tessuto, produce cellule con vitalità preservata ma soffre di basso rendimento e ritardo nel recupero cellulare (7–10 giorni). La dissociazione meccanica, che si basa su interruzioni fisiche (ad esempio, oscillazione, taglio), riduce i tempi di elaborazione ma spesso compromette l'integrità cellulare, portando a una diminuzione della vitalità e a popolazioni impure. Collettivamente, questi metodi non riescono a conciliare efficienza, purezza e fattibilità — criteri critici per l'isolamento cellulare di grado clinico. Pertanto, proponiamo un metodo innovativo per isolare cellule derivate dalle adipose (adipociti e ADSC) che combina la digestione enzimatica con la dissociazione mecanica mediata da onde11. Questo approccio raggiunge due progressi chiave: (1) efficienza temporale: combinando cocktail enzimatici, pre-ottimizzati e privi di animali, con onde meccaniche a bassa frequenza, il tempo totale di elaborazione viene ridotto da 3–4 ore a ~30 min (Figura 1); (2) Conservazione della vitalità: la dispersione meccanica delicata minimizza la rottura degli adipociti e il rilascio lipidico. È importante notare che il periodo di 30 minuti si riferisce al flusso di lavoro di isolamento del nucleo (digestione, dissociazione meccanica, filtrazione e centrifugazione iniziale) per ottenere frazioni grezze di adipociti e SVF; i passaggi opzionali di purificazione a valle, come la lisi dei globuli rossi (RBC), richiedono un tempo di gestione aggiuntivo.
Il nostro metodo ottimizzato di isolamento delle cellule adipose dimostra un notevole potenziale di applicazione in molteplici ambiti di ricerca e clinici. Nella ricerca fondamentale, le cellule ad alta vitalità ottenute mostrano prestazioni eccezionali negli studi di differenziazione adipogenica e osteogenica, fornendo una fonte cellulare affidabile per applicazioni di ingegneria tissutale. In medicina traslazionale, studi clinici hanno dimostrato il potenziale terapeutico degli ADSC nel trattamento di condizioni come l'osteoartrite12, le malattiecardiovascolari 13, la sclerosimultipla 14 e la malattia infiammatoria intestinale (IBD)/malattiadi Crohn 15. Gli ADSC rapidamente isolati rappresentano mattoni ideali per costruire organoidi del tessuto adiposo e implementare applicazioni di terapia cellulare, promuovendo significativamente la ricerca sullo screening farmacologico e sulla modellazione delle malattie. Inoltre, le sospensioni monocellulari di alta qualità sono adatte per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola. In conclusione, questo approccio integrato stabilisce una solida piattaforma tecnologica per il tessuto adiposo, supportando sia la ricerca di base che la traduzione clinica nella medicina rigenerativa.
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Protocollo
Tutte le ricerche sugli animali sono state condotte in conformità con il Regolamento per l'Amministrazione degli Affari Riguardanti gli Animali Sperimentali (Ministero della Scienza e Tecnologia, Cina, revisionato nel marzo 2017), e approvato dal Comitato Etico e per il Benessere Animale dell'Università Agricola del Sichuan (Numero di autorizzazione: 20230089). Questo protocollo richiede l'uso del sistema SoniConvert, un dispositivo commercialmente disponibile per la dissociazione meccanica assistita da onde (d'ora in poi chiamato sistema di dissociazione meccanica). Il protocollo è ottimizzato per il tessuto adiposo suino, e la sua dipendenza da queste apparecchiature specializzate rappresenta una limitazione chiave.
1. Raccolta e preparazione del tessuto adiposo
- Disinfezione preoperatoria e rimozione dei peli
- Eutanasiare il maiale tramite overdose endovenosa di pentobarbital sodio (100 mg/kg di peso corporeo). Confermare la morte prima della raccolta dei tessuti.
- Applicare garza sterile imbevuta nel 2% di iodoforo per la disinfezione a spirale del dorso suino, estendendosi per 15 cm dalla linea mediana. Lascia asciugare per 30 secondi.
- Usa un rasoio sterile per radere i peli da un'area di 16 cm × 8 cm. Assicurati che tutti i peli vengano rimossi dall'area operatoria.
- Strofina il retro due volte con etanolo al 75% usando una garza sterile.
- Raccolta di tessuto adiposo
- Fai un'incisione trasversale di 20 cm lungo la linea mediana dorsale con un bisturi sterile.
- Solleva il bordo dell'incisione con una pinza sterile. Dissezionare lungo il piano naturale tra tessuto adiposo e derma per ottenere uno strato superiore completo di tessuto adiposo sottocutaneo dorsale (ULB) di circa 2–3 mm di spessore.
- Risciacquare l'ULB una volta in soluzione salina sterile ghiacciata e metterlo in una teglia di coltura sterile (Figura 2).
Figura 2: Raccolta di ULB di maiale per isolamento cellulare. (A) Illustrazione della struttura del tessuto adiposo del dorso del maiale; (B) Sito di taglio del minipig Bama; (C) Presentazione del tessuto adiposo dorsale, la schiena del maiale la parte adiposa sottocutanea contiene due strati, lo strato superiore (ULB) e quello interno (ILB); (D) Ha raccolto ULB. Abbreviazione: ULB = strato superiore della schiena; ILB = strato interno della schiena. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Punto di pausa: Il tessuto adiposo raccolto può essere conservato in soluzione salina sterile fredda come ghiaccio o in soluzione di D-Hanks a 4 °C per un breve periodo prima di una ulteriore dissezione.
NOTA: L'obiettivo è raccogliere l'ULB. Evitare di includere lo strato inferiore di tessuto adiposo sottocutaneo dorsale (ILB) durante la dissezione.
- Dissezione e pulizia del tessuto adiposo
- Aggiungi 10 mL di tampone D-Hanks gelato per ogni 1,8 g di fazzoletto sul piatto e assicurati che il tessuto sia completamente sommerso.
- Identifica ed elimina tutti i vasi sanguigni visibili dal tessuto usando forbici chirurgiche sterili. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo e componenti fibrotici. Scartare i materiali estisi in contenitori designati come biohazard.
NOTA: Usa estrema cautela quando maneggia strumenti affilati; Taglia sempre via dal corpo e getta lame e forbici usate in contenitori per oggetti appuntiti subito dopo l'uso. - Risciacqua il tessuto all'interno del D-Hanks Buffer per rimuovere sangue residuo e detriti.
NOTA: Per campioni con ematoma eccessivo, sostituire il tampone 1–3 volte secondo necessità per ottenere chiarezza visiva. Mantenere tutti i passaggi di dissezione sul ghiaccio per preservare la vitalità dei tessuti.
- Dissociazione meccanica del tessuto adiposo
- Trasferire 1,8 g dei frammenti di tessuto risciacquati in un tubo sterile da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 800 μL di buffer di dissociazione tissutale di tipo A (A-Buffer) al tubo.
- Utilizzando forbici oftalmiche sterili, trita il tessuto nel tubo in piccoli pezzi di circa 1–2mm 3 in dimensione.
NOTA: Se si osservano perdite lipidiche significative durante o dopo la tritura, lavare nuovamente il tessuto con 1 mL di soluzione di D-Hanks preraffreddata prima di procedere con la digestione enzimatica per rimuovere i lipidi dagli adipociti rotti. Questo passaggio preserva l'integrità degli adipociti per l'analisi a valle.
2. Isolamento cellulare e omogeneizzazione
- Elaborazione enzimatica
- Aggiungere 200 μL dell'Agente di Dissociazione Tissutale di Tipo A (Soluzione di tipo A) a un nuovo tubo microcentrifuga. Ruota e scuoti delicatamente il tubo a mano 3 volte per mescolare il contenuto e assicurarti che i frammenti adiposi siano completamente immersi nella soluzione dissociativa.
- Verifica che il tappo del tubo sia ben chiuso. Metti il tubo in un bagno metallico a 37 °C e incuba per 5–10 minuti.
NOTA: Monitorare la soluzione finché non diventa torbida e i frammenti di tessuto sembrano parzialmente digeriti. La soluzione di tipo A contiene collagenasi e proteasi neutra. Indossa guanti in nitrilo, camice da laboratorio e occhiali di sicurezza durante la maneggiazione. Evita il contatto con la pelle; Se si verifica l'esposizione, risciacqua immediatamente con acqua abbondante per 15 minuti. L'A-Buffer non verrà scartato dopo aver aggiunto la Soluzione di Tipo A.
- Dissociazione meccanica assistita da ultrasuoni
- Trasferire i frammenti di tessuto adiposo parzialmente digeriti insieme al tampone circostante dal tubo della microcentrifuga in un tubo sterile da 1,5 mL designato per il sistema di dissociazione meccanica.
- Esegui il programma presettato per il tessuto adiposo nel sistema di dissociazione meccanica per eseguire la dissociazione meccanica usando un'onda sinusoidale a 200 Hz.
3. Filtrazione per ottenere una sospensione a singola
- Filtrazione e centrifugazione
- Raccogli la sospensione cellulare e passala attraverso un filtro cellulare da 200 μm in un nuovo tubo centrifuga da 50 mL per rimuovere grandi detriti e grumi di tessuto non digeriti.
- Aggiungi 5 mL di soluzione D-Hanks preraffreddata (4 °C) al colino. Risciacqua il colino con la soluzione D-Hanks due volte per massimizzare la resa cellulare.
- Centrifuga la sospensione a celle filtrate a 500 × g per 5 minuti a 4 °C.
Punto di pausa: Dopo la centrifugazione, la sospensione della cella può essere processata immediatamente o mantenuta sul ghiaccio per un breve periodo prima della separazione degli strati. - Raccolta degli adipociti: per raccogliere gli adipociti, aspirare e scartare lo strato lipidico soprantantante utilizzando una pipetta pasteur sterile, lasciando 1 mL di tampone per proteggere lo strato adipocitico. Raccogliere il secondo strato per l'analisi a valle degli adipociti. Evita di disturbare il terzo e il quarto livello.
- Raccolta SVF (frazione stromalare vascolare): Dopo la rimozione degli strati superiori, sospezione delicata del pellet inferiore contenente la frazione stromale vascolare (SVF) in 1 mL di D-Hanks/PBS. Risospendere delicatamente la pellet cellulare in 1 mL di D-Hanks/PBS per ottenere una concentrazione cellulare di 2–5 × 106 cellule/mL.
NOTA: Idealmente, dopo la centrifugazione si possono osservare quattro strati: lo strato lipidico nella parte superiore; il secondo strato contiene adipociti; il terzo è lo strato tampone idrofilo; e lo strato inferiore è la SVF, che contiene cellule staminali (Figura 1).
- Lisi dei globuli rossi
- NOTA: Se il pellet cellulare presenta un colore rosso significativo, indicando la contaminazione da globuli rossi, eseguire la lisi dei globuli rossi.
Risospendere il pellet cellulare in 1–3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) utilizzando una pipetta P1000 con punte a grande diametro. Incubare sul ghiaccio per 15 minuti con qualche miscelazione occasionale. - Preraffreddare tutte le soluzioni e i rotori della centrifuga a 4 °C per minimizzare l'attività metabolica durante la lavorazione.
- Centrifugare a 500 × g per 10 minuti a 4 °C. Aspira completamente il soprantantante.
- Lavare nuovamente le celle risospendendo il pellet in 5 mL di soluzione di D-Hanks preraffreddata e centrifugare a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Scartate il soprannatante.
- NOTA: Se il pellet cellulare presenta un colore rosso significativo, indicando la contaminazione da globuli rossi, eseguire la lisi dei globuli rossi.
- Sospensione finale
- Risospendere il pellet a celle finali in D-Hanks/PBS per applicazioni a valle.
4. Applicazioni a valle e analisi
- Valutazione della vitalità delle cellule SVF e della resa cellulare
- Prepara la sospensione della cella SVF ottenuta in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Tieni la sospensione sul ghiaccio fino all'uso.
- Mescolare 10 μL della sospensione delle cellule SVF con 10 μL di soluzione di Trypan Blue allo 0,4% in un tubo microcentrifuga sterile da 0,5 mL. Pipetta delicatamente su e giù per 3 volte per garantire una miscelazione uniforme.
NOTA: La concentrazione finale di Trippan Blue nella miscela è dello 0,2%. Evita di introdurre bolle d'aria durante la miscelazione, poiché potrebbero interferire con il conteggio automatico delle cellule.
Trasferire 10 μL della miscela di cellule colorate su un vetrino di conteggio adatto al contatore automatico delle celle. Assicurati che il campione riempia completamente la camera senza traboccare. - Inserisci il diavolo di conteggio nel Contatore Celle. Seleziona il tipo di saggio Trypan Blue e regola l'intervallo di concentrazione cellulare se necessario.
- Premi il pulsante Conteggio per avviare il conteggio automatico delle celle. Lo strumento catturerà immagini della camera di conteggio e distinguerà automaticamente le cellule vive da quelle morte.
- Registra la percentuale di vitalità delle celle e conta il numero totale di celle vitali visualizzate sullo schermo dello strumento. Effettuare tre misurazioni indipendenti per ciascun campione e calcolare la media di vitalità e la resa cellulare per grammo di tessuto adiposo.
NOTA: Pulire il vetrino di conteggio e la porta di carico degli strumenti con etanolo al 70% dopo ogni utilizzo per prevenire la contaminazione incrociata tra campioni.
- Osservazione della morfologia degli adipociti
- Tingere gli adipociti isolati con 5 μg/mL di Hoechst per i nuclei e 1 μM di BODIPY per i lipidi in D-Hanks/PBS per 15 minuti a 37 °C.
Punto di pausa: Dopo la colorazione, i campioni devono essere prontamente acquisiti con l'immagini; se necessario, possono essere tenuti protetti dalla luce a 4 °C per un breve periodo prima della microscopia. - Usa un sistema di vetro a copertura per vetrini adatto agli adipociti per la preparazione delle vetrine, evitando la compressione delle cellule.
- Osserva i nuclei (colorati con Hoechst) e le gocce lipidiche (colorate con BODIPY) al microscopio a fluorescenza.
NOTA: A causa delle grandi dimensioni (20–300 μm) e dell'elevato contenuto lipidico, gli adipociti sono fragili, tendono a galleggiare e ad impilarsi in più strati, rendendo i metodi di montaggio convenzionali inadatti per un'osservazione microscopica chiara (Figura 3A). Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un sistema di montaggio adatto agli adipociti fatto in casa, utilizzando vetrine e coperture standard (Figura 3B).
- Tingere gli adipociti isolati con 5 μg/mL di Hoechst per i nuclei e 1 μM di BODIPY per i lipidi in D-Hanks/PBS per 15 minuti a 37 °C.
- Purificazione delle componenti vascolari stromali e osservazione morfologica degli ADSC
- Seminare la SVF appena isolata in una fiaschetta di coltura di cellule T25 contenente 5 mL di DMEM integrati con FBS al 10% e 1% di penicillina-estreptomicina. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂.
- Dopo 48 ore, lava delicatamente la fiaschetta due volte con PBS preriscaldato per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungi un substrato fresco per la coltura e continua l'incubazione.
- Sostituisci il substrato di coltura ogni 2-3 giorni. Monitorare la morfologia e la confluenza cellulare al microscopio invertito.
- Quando le cellule raggiungono l'80–90% di confluenza (tipicamente dopo 7–10 giorni), si staccano le cellule usando tripsina-EDTA allo 0,25% per 3–5 minuti a 37 °C. Neutralizza con un mezzo di coltura e raccoglie la sospensione cellulare.
- Eseguire la colorazione con Trypan Blue per rilevare la vitalità della cellula prima del rilevamento e dell'ordinamento FACS.
- Osserva la morfologia degli ADSC purificati e coltivati al microscopio ottico.
- Filtrare la sospensione delle cellule raccolte attraverso un setaccio da 70 μm per rimuovere eventuali aggregati residui. Risospendere le cellule in PBS contenenti il 2% di FBS per l'analisi FACS.
- Tingere le cellule con anticorpi coniugati con fluorocromo contro CD73, CD90, CD11b e CD45 per 30 minuti a 4 °C al buio.
- Lava le cellule 2 volte con tampone di colorazione e risospendi in PBS contenente FBS al 2%.
- Eseguire un'analisi citometrica di flusso utilizzando un ugello da 70 μm a 20 psi e portata inferiore a 3,0.
- Escludere i detriti cellulari facendo un gate sulla popolazione principale utilizzando parametri di area di scattering frontale (FSC-A) e area di dispersione laterale (SSC-A).
- Rimuovere i doppietti tramite gating FSC-A rispetto a FSC-H e selezionare la popolazione di singoletti valida per l'analisi a valle.
- Analizza le cellule portate basandosi sull'espressione dei marcatori superficiali. Usa CD73 e CD90 come marker positivi e CD11b e CD45 come marker negativi per verificare il fenotipo ADSC.
- Osserva la morfologia degli ADSC arricchiti e coltivati al microscopio ottico. La caratteristica morfologia a forma di fuso, simile a un fibroblasto, indica un arricchimento ADSC riuscito.
- Differenziazione adipogenica ADSC
- Seminare la terza generazione di ADSC a una densità di 1 × 104 cellule/cm 2. Quando la confluenza cellulare raggiunge circa il 90%, si avvia l'induzione adipogenica.
- Prepara il mezzo di induzione adipogenico utilizzando il mezzo di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio che contiene il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,5 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM di desametasone, 10 μg/mL di insulina e 1 μM di rosiglitazone.
- Dopo 3 giorni di induzione, sostituisci il substrato con un mezzo di manutenzione e cambia la soluzione ogni 2 giorni.
- Dopo 14 giorni di induzione, colora le cellule con olio rosso O e osserva le gocce lipidiche al microscopio invertito.
- Differenziazione osteogenica ADSC
- Quando la confluenza cellulare raggiunge l'80–90%, inizia l'induzione osteogenica. Formulare il mezzo di induzione osteogenico con DMEM ad alto contenuto di glucosio che contiene il 10% di FBS, 10 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 μM di calcitriolo e 1 μM di desametasone.
- Cambia il substrato ogni 2–3 giorni e prosegue il processo di induzione per circa 14 giorni.
- Tingi le cellule con 2% di Alizarina Rossa S (pH 5,2) e osservale al microscopio invertito.
- Costruzione e identificazione organoidi
- Preparare una sospensione monocellulare di ADSC in un mezzo di coltura completo e regolare la concentrazione cellulare a 2 × 104 cellule/20 μL.
- Invertire il coperchio di una ciotola da 100 mm e distribuire gocce di 20 μL della sospensione della cella sulla superficie interna del coperchio.
- Aggiungi PBS sterile sul fondo della ciotola per mantenere l'umidità, copri con cura il coperchio e incuba le gocce sospese in condizioni di coltura standard.
- Osserva le gocce ogni giorno e lascia che le cellule si aggregano e formino sferoidi per 6 giorni.
- Raccogli delicatamente gli sferoidi usando una pipetta e trasferili in Matrigel preraffreddato su ghiaccio.
- Inserire gli sferoidi in Matrigel e implattare la miscela in piastre di coltura prima di incubarla in condizioni di coltura standard.
- Sostituire regolarmente il mezzo e monitorare la crescita organoide fino ai giorni 18–28, quando le strutture diventano compatte e mature.
- Fissare gli organoidi con il 4% di paraformaldeide, permeabilizarli con il 0,1% di Triton X-100 e bloccare il legame non specifico con il 5% di BSA.
- Incubare i campioni con anticorpi primari contro CD73, CD90, CD11b e CD45, poi incubarli con i corrispondenti anticorpi secondari fluorescenti.
- Tingi gli organoidi con Hoechst e BODIPY per visualizzare rispettivamente nuclei e gocce lipidiche, e osserva i campioni colorati al microscopio a fluorescenza.
NOTA: Eseguire la selezione cellulare e tutte le manipolazioni che coinvolgono colture aperte, inclusi la semina, l'alimentazione e la preparazione della colorazione, in condizioni asettiche rigorose in un armadietto di biosicurezza.
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Risultati
Figura 1: Illustrazione schematica del processo di isolamento cellulare derivato dall'adipo. Il diagramma rappresenta il metodo tradizionale e quello attuale come flussi di lavoro illustrativi. Sono coinvolti tre passaggi principali nell'isolamento delle cellule derivate dalle membrane: il primo è il pretratt...
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Discussione
Il presente studio introduce un nuovo approccio integrato per isolare cellule derivate dalle adipose (principalmente adipociti e ADSC) che affronta limitazioni critiche dei metodi convenzionali. Combinando l'allentamento enzimatico specifico del tessuto con la dissociazione meccanica a onde di precisione, questo sistema raggiunge un isolamento cellulare rapido (tempo totale di elaborazione ~30 min), alta vitalità (80–95%) e riproducibile.
La digestione enzimat...
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Dichiarazioni
L'autore Ziyi Zhao e Jiaying Yu sono affiliati con Chengdu DosSense Biotech Co., Ltd, che produce il sistema SoniConvert (SC-L1W) e il Kit di Dissociazione del Tessuto Adiposo (TM008) utilizzati in questo protocollo. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Questo lavoro fu sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (Li M: 32421005 e 32225046, Lu L: 32472857); i Progetti di Scienza e Tecnologia della Regione Autonoma Xizang della Cina (XZ202501ZY0147 a M.L.); la Fondazione Scientifica Postdottorato Cinese (Lu L: 2024M763881); il Finanziamento Speciale Postdottorato di Chongqing (Lu L: 2023CQBSHTB3098); il Programma Nazionale/Provinciale di Formazione Triennale in Innovazione e Imprenditorialità (Lu L: 202510626001); e il Progetto Major in Scienze e Tecnologie Agrarie.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di Dissociazione Tissutale di Tipo A | Docsense | TM001 | Contiene un agente di dissociazione tissutale di tipo A (soluzione di tipo A) e un buffer di dissociazione tissutale di tipo A (buffer A). |
| Kit per Medium di Differenziazione Adipogenica | OriCell | GUXMD-90031 | Utilizzato per la differenziazione adipogenica, inclusi il medio Eagle's modificato (non modificato) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio e il mezzo di manutenzione |
| Alizarin Red S | OriCell | A5533ALIR-10001 | Colorazione mineralizzata per differenziazione osteogenica (pH 5,2) |
| Acido ascorbico | Sigma-Aldrich | A4544 | Acido L-ascorbico, coltura cellulare testata, per induzione osteogenica |
| Bama minipigs | Chengdu Dossy Animali Sperimentali Co., Ltd | Maschi, animali di un anno, di grado SPF, mantenuti secondo procedure standardizzate di vaccinazione, sverminazione e pulizia.https://www.cd-dossy.cn/animalpl_detail/12606067609851863 04.html | |
| Contatore Automatico di Celle Bio-Rad TC20 | Laboratori Bio-Rad | 1450011 | Contatore automatico di celle per la valutazione della vitalità e della resa |
| BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3922 | Colorazione lipidica neutra |
| BSA (5%) | Sigma-Aldrich | A9418 | Albumina sierica bovina, polvere liofilizzata, per bloccare |
| Calcitriolo | Sigma-Aldrich | C9756 | 1α,25-Diidrossivitamina D3, per l'induzione osteogenica |
| Crivello cellulare (70 & mu; m) | Corning | 352350 | Falcon 70 & mu; Filtratore di cellule m, sterile, per la preparazione del campione FACS |
| Filtro di cellule (200 e mu; m) | pluriSelect | 43-50200-03 | pluriScolino, rete PET, monta tubi da 50 mL, sterile e nbsp; |
| tubo centrifugo (50 mL) | Corning | 352098 | Falcon 50 mL tubo conico ad alta nitidezza, sterile, polipropilene |
| Slide di conteggio (per Bio-Rad TC20) | Laboratori Bio-Rad | 1450011 | Slide di conteggio a doppia camera per contatore cellulari automatico TC20 & nbsp; |
| piatto di coltura (100 mm) | Corning | 430167 | Piatto sterile di polistirene, per la formazione di organoidi a goccia sospeso |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D4902 | ≥ 98%, per induzione adipogenica e osteogenica |
| Soluzione salina bilanciata di D-Hanks o PBS | Gibco | 10010015 | Pre-raffreddato a 4 °C; C, pH 7,4. |
| DMEM | Gibco | 11965084 | Questo viene utilizzato per la coltivazione di SVF appena isolata |
| DNasi I | Beyotime | D7073 | Opzionale, consigliato se si osservano grumi. |
| etanolo | Sigma-Aldrich | 459836 | 75% per la disinfezione superficiale. |
| Siero Fetale Bovino (FBS) | Gibco | A4736201 | Sistema Tet approvato, origine USA, sterile |
| Citometro di flusso | BD in Biologia | BD FACSCanto II | 3 laser (405 nm, 488 nm, 633 nm), 8 canali di fluorescenza, per l'analisi dei marcatori superficiali (CD73, CD90, CD11b, CD45), raggiunge 70  requisito ugello a 20 psi |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus | Modello invertito o verticale capace di set di filtri FITC e DAPI. | |
| Anticorpi secondari fluorescenti | Thermo Fisher Scientific | A-11001 (anti-topo), A-11008 (anti-coniglio) | Alexa Fluor coniugata, per immunofluorescenza |
| Anticorpi coniugati con fluorocromo (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD in Biologia | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | Per l'analisi citometrica a flusso del fenotipo ADSC |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Colorazione nucleare per la valutazione delle cellule vive/morte. |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | ≥ 99% (HPLC), per mezzo di induzione adipogenica |
| Soluzione salina sterile gelida | Baxter | 2F7124 | Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%, USP, per risciacquare i tessuti |
| Insulina | Sigma-Aldrich | I9278 | Ricombinante, espresso nel lievito, per l'induzione adipogenica |
| Iodoforo | Sigma-Aldrich | 25104 | Soluzione disinfettante al 2%. |
| Matrigel | Corning | 354230 | Fattore di crescita ridotto, privo di fenolo, per l'inserimento di sferoidi |
| Bagno Metallico | Servicebio | SMB-H | Usato per incubazione a 37 °C. |
| Oil Red O | OriCell | OILR-10001 | Colorazione lipidica per la differenziazione degli adipociti |
| Microscopio ottico | Olympus | Microscopio standard da campo chiaro con 10x e linee; 40 obiettivi. | |
| Kit per medium di differenziazione osteogenica | OriCell | GUXMD-90021 | Utilizzato per la differenziazione osteogenica, inclusi il medium Eagle's modificato (non modificato) di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio e il medium di manutenzione |
| Pipetta P1000 con punte a diametro largo | Beckman Coulter | B01113 | Punte a diametro largo Biomek P1000 Span-8, sterili |
| Paraformaldeide (4%) | Thermo Fisher Scientific | J61899 | Soluzione acquosa, per fissare organoidi |
| Pipetta pasteur | Corning | 7095S-5C | Sterile, usa e getta. |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15070063 | 10.000 U/mL di penicillina, 10.000 e mu; g/mL streptomicina, sterile |
| Pentobarbital sodio | Hikma Pharmaceuticals USA Inc. | 24201-010-20 | Iniettabile, per l'eutanasia (100 mg/kg di peso corporeo, endovenosa). ANDA 203619 |
| Anticorpi primari (CD73, CD90, CD11b, CD45) | BD in Biologia | 561254 (CD73), 561970 (CD90), 557321 (CD11b), 555485 (CD45) | Per l'immunocolorazione organoide |
| Buffer di lisi dei globuli rossi (RBC) | Solarbio | R1010 | Se necessario per applicazioni a valle. |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5702R | Utilizzato per i passaggi di centrifugazione a 4 °C. |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 71740 | ≥ 98%, PPAR & gamma; agonista per l'induzione adipogenica |
| Contenitore per oggetti pungenti | Becton Dickinson | 305270 | Contenitore antiforatura per lame e forbici usate |
| Sistema di preparazione per la sospensione a celle singole SoniConvert | Docsense | SC-L1W | Utilizzato per la dissociazione meccanica dei tessuti. |
| Tamponamento di colorazione (buffer di colorazione per citometria a flusso) | eBioscienza (Thermo Fisher Scientific) | 00-4222-57 | 200 mL, pronti all'uso, contengono FBS e 0,09% azide di sodio come conservante, per diluizione di anticorpi e cellule, colorazione superficiale e passaggi di lavaggio nella citometria a flusso |
| Tubo Eppendorf sterile da 1,5 mL | Eppendorf | 30121.517 | Tubo microcentrifuga Safe-Lock, sterile, per la triturazione dei tessuti |
| Piatto di coltura sterile | Corning | 430167 | Vaso di coltura sterile da 100 mm x 20 mm, per la raccolta dei tessuti |
| Pinza sterile | Sklar | 96-1719 | Pinza sterile per il pollice, seghettata, per la gestione dei tessuti & nbsp; |
| Garza sterile | Dukal Corporation | 7060033 | Compresse di garza sterili, per disinfezione e pulizia |
| Forbici oftalmiche sterili | Sklar | 10023-580 | Forbici a molla stile Vannas, per triturare tessuto in 1-2 mm e sup3; Pezzi |
| Rasoio sterile | 3M | 9681 | Rasoio di preparazione chirurgica, per la depilazione dall'area operatoria |
| Bisturi sterile | Integra Miltex | 4-415 | Bisturi sterile usa e getta, per l'incisione |
| Forbici chirurgiche sterili | Sklar | 10022-580 | Forbici Merit Sterile Iris, per dissezionare vasi sanguigni e tessuto connettivo |
| Fiaschetta di coltura cellulare T25 | Corning | 430639 | Fiaschetta di coltura cellulare Falcon T25, tappo ventilato, sterile |
| Triton X-100 (0,1%) | Sigma-Aldrich | T8787 | Grado di laboratorio, per permeabilizzazione |
| Trippan Blue | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Soluzione allo 0,4% per il conteggio della vitalità cellulare. |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | 0,25% tripsina, 1 mM EDTA, per distacco degli ADSC |
| β-Glicerofosfato | Sigma-Aldrich | G9422 | Sale disodio pentaidrato, per induzione osteogenica |
Riferimenti
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