Qui presentiamo un protocollo per valutare l'attività sinergica della fosfomicina in combinazione con ceftriaxone, meropenem e gentamicina contro isolati di Escherichia coli resistenti al carbapenema utilizzando il metodo di diluizione dell'agar. È stata osservata sinergia con meropenem e gentamicina, ma non con ceftriaxone.
Articolo di revisione
Protocollo per l'analisi a scacchiera da diluizione dell'agar delle combinazioni di antibiotici a base di fosfomicina contro Escherichia coli resistente ai carbapenemi
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In questo articolo
Sommario
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Abstract
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A causa delle opzioni di trattamento limitate per gli Enterobacterales resistenti ai carbapenemi, i regimi di terapia combinata hanno acquisito sempre più importanza. Questo studio mirava a indagare i tassi di resistenza alla fosfomicina e a valutare le interazioni sinergiche in vitro della fosfomicina in combinazione con meropenem, gentamicina e ceftriaxone contro isolati di Escherichia coli resistenti al carbapenema. Sessanta ceppi di E. coli resistenti ai carbapenemi, isolati da vari campioni clinici (urina, sangue, aspirazione, ferita, liquido cerebrospinale, aspirazione endotracheale) ottenuti da pazienti nei reparti clinici e nelle unità di terapia intensiva degli ospedali della Facoltà Medica della Dicle University Medical School, sono stati inclusi nello studio. L'identificazione delle specie è stata effettuata utilizzando un sistema automatico di identificazione microbica. I test di suscettibilità agli antibiotici e la conferma della resistenza ai carbapenemi sono stati effettuati tramite diffusione del disco con ertapenem, imipenem e meropenem. La resistenza alla fosfomicina e le interazioni tra antibiotici sono state valutate tramite diluizione dell'agar. Inoltre, le combinazioni di antibiotici sono state valutate attraverso gradienti di concentrazione doppio serialmente utilizzando il protocollo basato sulla diluizione dell'agar, e sono stati calcolati indici di concentrazione inibitori frazionari (FICI) per determinare sinergia, indifferenza o antagonismo. I tassi di resistenza erano del 76,6% per la fosfomicina, 61,6% per il meropenem, 85,0% per la gentamicina e 98,3% per il ceftriaxone. Interazioni sinergiche sono state osservate nel 35% degli isolati per la combinazione fosfomicina–meropenem, nel 33,4% per la combinazione fosfomicina–gentamicina e nell'1,7% per quella fosfomicina–ceftriaxone. L'antagonismo è stato rilevato in un solo isolato della combinazione fosfomicina-meropenem. Le combinazioni di fosfomicina con meropenema e gentamicina hanno mostrato attività sinergica in vitro contro E. coli resistente ai carbapenemi. Sono necessari ulteriori studi in vitro per confermare questi risultati.
Introduzione
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La famiglia degli Enterobacterales comprende un gruppo altamente diversificato di bacilli gram-negativi, molti dei quali hanno una notevole importanzaclinica 1. Tra queste, Escherichia coli è la specie più frequentemente isolata nei laboratori di microbiologia clinica ed è ampiamente associata a infezioni che coinvolgono quasi tutti i sistemi d'organo, incluse infezioni delle vie urinarie, infezioni delle ferite, polmonite nei pazienti immunocompromissi, gastroenterite e meningite neonatale. È anche una delle principali cause di sepsi Gram-negativa e shock settico mediato da endotossine. Oltre alla medicina umana, E. coli è anche un importante patogeno veterinario, causando infezioni respiratorie e sistemiche in varie specie animali, inclusi gli equini, estendendo la prospettiva dell'area ospite della patogenesi di E. coli sia su ospiti umani cheanimali 2,3,4.
Gli Enterobacterale produttori di beta-lattamasi a spettro esteso (ESBL), in particolare E. coli e Klebsiella pneumoniae, sono stati associati a un aumento della mortalità, ricovero prolungato e costi sanitari più elevati. L'uso diffuso di antibiotici è un fattore principale della resistenza multifarmacologica (MDR) tra questiorganismi: 1. I meccanismi di resistenza includono la produzione di carbapenemasi, ESBL, enzimi modificatori degli aminoglicosidi (AME), mutazioni che conferiscono resistenza ai chinoloni e alterazioni nei sistemi di porine ed effluxi. In E. coli e Klebsiella pneumoniae, la resistenza è principalmente mediata dai plasmidi, facilitando il trasferimento genico orizzontale. Tali tratti di resistenza sono anche sempre più segnalati in E. coli di origine animale, inclusi isolati di bovini, supportando il concetto One Health e indicando un potenziale rischio di trasmissione zoonotica 2,3.
I carbapenemi sono considerati agenti di ultima linea per infezioni gravi multi-resistenti ai farmaci. Tuttavia, gli Enterobacterale resistenti ai carbapenemi (CRE) sono emersi come una delle principali preoccupazioni per la saluteglobale 4. Questa resistenza è principalmente mediata da carbapenemasi, inclusi metallo-beta-lattamasi di classe B, contribuendo a fenotipi estesamente resistenti ai farmaci e allapan-resistente 5.
I ceppi MDR di E. coli limitano significativamente le opzioni terapeutiche e complicano la gestione delle infezioni. Questo sottolinea la necessità di strategie terapeutiche alternative come le terapie combinate per migliorare gli esiti clinici. Inoltre, questi ceppi resistenti sono sempre più segnalati non solo in contesti clinici, ma anche da fonti alimentari come i latticini. Questo amplia il contesto epidemiologico della diffusione della resistenza antimicrobica e supporta la terapia combinata come strategia potenziale per mitigarne la diffusione e l'impattoclinico 6,7. Aminoglicosidi, tigeciclina e polimicine sono agenti terapeutici comunemente utilizzati nelle infezioniMDR 8. La fosfomicina ha inoltre dimostrato attività contro l'E. coli produttrice di ESBL, in particolare nelle infezioni delle vieurinarie.
La fosfomicina, scoperta per la prima volta nel 1969, inibisce la sintesi precoce della parete cellulare batterica ed è riemersa come agente promettente nella terapiacombinata 10. Effetti sinergici tra fosfomicina e aminoglicosidi o β-lattami sono stati segnalati negli organismiMDR 11,12. Inoltre, la fosfomicina è stata valutata in ampie coorti cliniche, dimostrando efficacia nelle infezioni gravi quando utilizzata da sola o in regimicombinati 13. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti include popolazioni batteriche eterogenee, e i dati specifici che riguardano E. coli resistente ai carbapenemi restano limitati.
I metodi standard di test di suscettibilità agli antimicrobici includono diluizione dell'agar, diluizione del brodo e diffusione su disco. I test combinati basati su diluizione dell'agar permettono la valutazione quantitativa delle interazioni antimicrobiche determinando i MIC e calcolando i FICI. Metodi alternativi come time-kill e diffusione a gradiente forniscono dati di interazione dinamici o semplificati, ma possono differire nella riproducibilità e nellastandardizzazione 13,14. Questo protocollo è più adatto per la valutazione in vitro controllata di combinazioni antibiotiche definite. Tuttavia, non riflette pienamente le condizioni farmacocinetiche invivo 15. Tra questi, la diluizione dell'agar è considerata un metodo di riferimento per la determinazione della MIC; tuttavia, il suo utilizzo nella valutazione dell'attività combinata di fosfomicina contro E. coli resistente ai carbabonemi rimane limitato.
Questo studio fornisce una valutazione sistematica delle combinazioni a base di fosfomicina rispetto a isolati di E. coli resistenti ai carbapenemi clinicamente confermati. È stato utilizzato un approccio standardizzato a scacchiera per diluizione dell'agar, generando dati comparativi diretti di interazione in condizioni controllate in vitro.
Pertanto, il presente studio testa l'ipotesi che la fosfomicina in combinazione con meropenem, gentamicina o ceftriaxone manifesti attività sinergica in vitro contro isolati di CRE E. coli.
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Revisione e prospettiva
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L'approvazione per questo studio è stata ottenuta dal Comitato Etico della Ricerca Clinica Non Interventistica della Facoltà di Medicina della Dicle University (Decisione n. 100, Data: 01.01.2021).
Il protocollo di seguito descrive un metodo standardizzato di diluizione dell'agar per valutare la sinergia della combinazione di fosfomicina contro isolati di E. coli resistenti ai carbapenemi.
Raccolta di isolati
Tra il 15.02.2021 e il 15.12.2021, sono stati inclusi in totale 60 ceppi di E. coli resistenti ai carbapenemi, isolati da vari campioni clinici (urina, sangue, aspirazione, ferita, liquido cerebrospinale e aspirazione endotracheale) provenienti da pazienti ricoverati presso gli ospedali della facoltà medica della Dicle University. L'identificazione veniva effettuata utilizzando un sistema di spettrometria di massa MALDI-TOF. Quando sono stati recuperati più isolati dallo stesso paziente, è stato incluso solo il primo isolato. Sono stati esclusi i campioni provenienti da ambulatori ambulatoriali e pazienti ricoverati per meno di 48 ore. Tutti gli isolati di E. coli resistenti ai carbapenemi che soddisfacevano i criteri di inclusione predefiniti durante il periodo di studio sono stati inclusi consecutivamente; Pertanto, la dimensione del campione è stata determinata dal numero totale di isolati idonei disponibili e non è stato effettuato alcun calcolo a priori della dimensione del campione. E. coli ATCC 13846 ed E. coli ATCC 25922 furono utilizzate come ceppi di controllo qualità. I ceppi di controllo qualità sono stati testati in parallelo con isolati clinici sotto condizioni identiche di diluizione dell'agar. Tutte le corse sono state valutate da due osservatori indipendenti. I risultati delle ceppi di controllo qualità hanno mostrato i modelli di inibizione della crescita attesi in tutti gli esperimenti, e non sono stati osservati risultati fuori intervallo o invalidi.
Tutte le procedure che hanno coinvolto isolati clinici sono state eseguite in condizioni di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Veniva utilizzato l'equipaggiamento di protezione individuale appropriato (camice da laboratorio, guanti e protezione per gli occhi), e tutte le manipolazioni venivano effettuate in un armadietto certificato per la sicurezza biologica.
Identificazione della specie e test di suscettibilità agli antimicrobici
Sono stati effettuati test di resistenza ai carbapenemi e suscettibilità agli antimicrobici utilizzando un sistema automatizzato di identificazione microbica e test di suscettibilità. La resistenza ai carbapenemi rilevata dal sistema è stata confermata tramite test di diffusione su disco con ertapenem, imipenem e meropenem. I diametri delle zone sono stati interpretati secondo i punti di rotturaEUCAST 16,17 (Tabella 1). Tutti gli isolati sono stati conservati in un brodo di soia triptico contenente il 20% di glicerolo e conservati a −20 °C.
Tabella 1: Punti di rottura del diametro delle zone per i carbapenemi determinati per E. coli tramite test di diffusione su disco (DDT). Criteri interpretativi di diffusione del disco utilizzati per i test di suscettibilità ai carbapenemi. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Le bottiglie di ematocoltura adatte a campioni pediatrici e aerobici sono state incubate in un sistema automatico di emecoltura. Le bottiglie positive sono state sottocolte su agar EMB, agar di sangue di pecora al 5% e agar di destrosio Sabouraud.
I campioni di urina e aspirato endotracheale sono stati colti con metodi quantitativi, mentre altri campioni sono stati processati con metodi semi-quantitativi. I campioni di aspirato endotracheale sono stati valutati tramite colorazione di Gram, e solo i campioni con punteggio di Bartlett > 0 e punteggio di Murray > 3 sono stati considerati significativi e inclusi18.
Per i campioni di ferita, la valutazione della colorazione di Gram è stata effettuata secondo il sistema di punteggio Q; i campioni con punteggio Q superiore a 0 sonostati inclusi 19.
Gli isolati batterici sono stati identificati tramite Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometria. Un punteggio di ≥2,0 è stato considerato affidabile per l'identificazione a livello di genere e specie, mentre punteggi tra 1,7 e 2,0 indicavano un'identificazione affidabile a livello di genere20,21. Sono stati inclusi solo isolati con punteggi di ≥2,0.
Determinazione della suscettibilità alla fosfomicina tramite il metodo della diluizione dell'agar
Secondo il Comitato Europeo per i Test di Suscettibilità Antimicrobica (EUCAST), il metodo di diluizione dell'agar è raccomandato per determinare la suscettibilità alla fosfomicina nei membri della famiglia degli Enterobacterales16.
Preparazione della fosfomicina e di altre soluzioni antibiotiche efficaci
Per il metodo di diluizione dell'agar, si utilizzava fosfomicina idrato di sale disodico in polvere, e acqua distillata sterile per creare la diluizione. Erano previste otto diverse diluizioni per ciascun antibiotico, che variavano da 4 volte inferiori a 3 volte superiori al valore limite di MIC determinato da EUCAST.
Una soluzione di deposito di fosfomicina (contenente 2560 μg/mL di fosfomicina) è stata preparata sciogliendo 51,2 mg di fosfomicina disodio sterile, calcolata utilizzando la formula volume/peso/potenza (Volume (mL) = Peso (mg) × Potenza (μg/mg)/ Concentrazione (μg/mL)) e pesata in condizioni sterili, in 20 mL di acqua distillata sterile. La concentrazione finale era prevista per essere di 256 μg/mL, risultante da una diluizione di 10 volte della soluzione standard quando è stato aggiunto il MHA.
Di conseguenza, sono stati determinati i livelli di diluizione per fosfomicina (2-256 μg/mL), meropeneme e gentamicina (0,125–16 μg/mL) e ceftriaxone (0,0625–8 μg/mL).
Le diluizioni venivano preparate con diluizioni seriali doppie in tubi conici sterili contenenti 10 mL di acqua distillata sterile. Furono eseguite in totale 7 diluizioni seriali doppie fino a raggiungere una concentrazione di 2 μg/mL. I restanti 10 mL nell'ultimo tubo furono scartati. Questo ha portato a otto diverse concentrazioni di antibiotici: 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4 e 2 μg/mL.
Lo stesso metodo usato per la fosfomicina è stato utilizzato per gli altri antibiotici per preparare la soluzione iniziale di scambio. Sono stati pesati 1,6 mg di antibiotico in polvere per ceftriaxone e 3,2 mg per meropenem e gentamicina utilizzando una bilancia di precisione. Sono state effettuate sette diluizioni per ogni antibiotico. Così, sono state ottenute otto diverse concentrazioni di diluizioni antibiotiche per meropenem, gentamicina e ceftriaxone (Figura 1).
Figura 1: Fasi di preparazione delle soluzioni di diluizione della fosfomicina. Fasi di diluizione seriale utilizzate per ottenere concentrazioni di lavoro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Preparazione del mezzo per agar
Il Mueller-Hinton Agar (CAMHA) regolato per cationi è stato preparato seguendo le istruzioni del produttore. È stato sterilizzato a 121 °C e 1 atmo per 15–20 minuti utilizzando un'autoclave, poi mantenuto a 45–55 °C in un bagno d'acqua.
Tutti i materiali biologici sono stati sterilizzati tramite autoclaving a 121 °C per 15–20 minuti prima dello smaltimento. I rifiuti contenenti antibiotici venivano smaltiti in conformità con i protocolli istituzionali di biosicurezza e rifiuti chimici.
Passo critico: Mantenere la temperatura dell'agar tra 45 e 55 °C prima dell'aggiunta di antibiotici. Un calore eccessivo può ridurre l'attività della fosfomicina e influenzare i risultati della CMI.
Aggiunta del G6P al mezzo
Per determinare la suscettibilità alla fosfomicina, EUCAST raccomanda di aggiungere 25 μg/mL di glucosio-6-fosfato (G6P) all'agar e al brodo5. Per ogni litro di agar, 25 mg di G6P venivano sciolti in 20 mL di MHA, filtrati per sterilizzare e poi mescolati nel lotto principale di agar.
Preparazione delle piastre di diluizione dell'agar
Per determinare i valori di CMI in monoterapia per fosfomicina, meropenem, gentamicina e ceftriaxone, è stata utilizzata una piastra di Petri per diluizione (ad esempio, 8 diluizioni per fosfomicina, variabili da 2 a 256 μg/mL). Le concentrazioni di antibiotici sono state annotate sulle placche.
Per lo studio combinato, sono state rilevate le concentrazioni di fosfomicina e dell'altro antibiotico oggetto di studio sulle placche (ad esempio, fosfomicina 256 μg/mL e meropeneme 32 μg/mL). Così, furono preparate 64 tavole per ogni combinazione, e sulla lastra fu annotata la concentrazione di fosfomicina e dell'altro antibiotico utilizzato. Sono stati preparati in totale 32 piastre meropenem-gentamicinetri per la monoterapia e 192 per la combinazione. Un disegno standard contenente 56 piccoli quadrati da 1 cm fu realizzato su una superficie di marmo. Tutte le lastre furono inoculate direttamente su questo disegno. Così, la lettura e l'inoculazione sono state standardizzate (Figura 2 e Figura 3).
Figura 2: Diagramma standard creato per l'inoculazione e la lettura. Schema standardizzato utilizzato per l'inoculazione e la valutazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Metodo di valutazione delle piastre di diluizione dell'agar. Valutazione della crescita batterica per la determinazione della MIC. F = fosfomicina; M = meropenem. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Due millilitri di soluzione antibiotica sono stati miscelati con 18 mL di CAMHA fuso per ottenere la concentrazione finale di lavoro. Questo mezzo, preparato secondo il foglietto del produttore, veniva raffreddato a 45−55 °C in un bagno d'acqua calda. Una parte (2 mL) della miscela antibiotica è stata usata e 9 parti (18 mL) di MHA sono state mescolate nelle piastre di Petri (l'antibiotico è stato diluito 1/10). Il volume finale della placca di agar è stato standardizzato a circa 20 mL per piastra (18 mL di agar + 2 mL di soluzione antibiotica), e le concentrazioni finali di antibiotico sono state calcolate dopo diluizione. In questo modo, le concentrazioni di antibiotici sono state raggiunte nelle lastre di diluizione dell'agar (2–256 μg/mL per fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL per ceftriaxone e 0,125–16 μg/mL per meropeneme e gentamicina). Sono state utilizzate piastre preparate dal mezzo senza soluzione antibiotica come controlli della crescita (Figura 4). Le miscele composte da mezzo e soluzione antibiotica sono state lasciate solidificare a temperatura ambiente.
Figura 4: Mezzo di controllo senza soluzione antibiotica. Un mezzo senza antibiotici viene utilizzato per confermare la vitalità batterica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Passo critico: Profondità di agar diseguale o miscelazione insufficiente degli antibiotici può portare a interpretazioni imprecise della CIM e a risultati di interazione falsi.
Preparazione e inoculazione degli isolati
I ceppi puri precedentemente conservati sono stati inseriti su agar di sangue di pecora al 5% a temperatura ambiente e incubati a 37 °C per 16–24 ore. Le colonie provenienti da colture fresche venivano sospese in soluzione salina sterile, e una torbidità di McFarland di 0,5 fu ottenuta utilizzando un lettore ottico.
Il metodo di diluizione dell'agar richiedeva un inoculo batterico di circa10,4 CFU per macchia. Un valore di McFarland di 0,5 contiene circa 10,8 CFU/mL di batteri. Una densità batterica di10,7 CFU/mL è stata ottenuta diluendo la soluzione 1:10 con soluzione salina sterile.
2 μL di ciascuna sospensione batterica venivano raccolti dal tubo utilizzando una pipetta automatica. Questo volume corrisponde a circa 2 × 104 CFU per macchia. L'inoculazione è stata eseguita su aree target della superficie dell'agar, iniziando dalla piastra contenente la concentrazione più bassa di fosfomicina e proseguendo verso la più alta.
Pertanto, l'inoculazione è stata definita come CFU per macchia, con ogni punto di inoculazione contenente circa 104 CFU. L'inoculazione di ogni sospensione batterica è stata completata entro 15 minuti.
Prima di inoculare le placche contenenti fosfomicina, è stata inoculata una piastra di controllo della crescita per verificare la contaminazione. L'inoculazione veniva lasciata asciugare a temperatura ambiente. L'incubazione è stata eseguita a 35–37 °C per 16–24 ore in condizioni aerobiche, e la torbidità è stata misurata con un densitometro calibrato.
Un'eccessiva densità di inoculi può causare crescita di residui e difficoltà nella determinazione degli endpoint. Riaggiusta la torbidità a 0,5 McFarland e ripeti l'inoculazione se si verifica una crescita confluente.
Test combinati
Sono stati utilizzati gli antibiotici in polvere meropenem, fosfomicina, gentamicina, ceftriaxone e glucosio-6-fosfato.
Le quantità di antibiotici sono state calcolate utilizzando la formula volume/peso/potenza. Dopo la preparazione delle soluzioni standard, sono state preparate soluzioni antibiotiche a concentrazioni di tre diluizioni doppie superiori e quattro diluizioni doppie sotto l'intervallo suscettibile di MIC. I range di diluizione sono stati calcolati come 2–256 μg/mL per la fosfomicina, 0,0625–8 μg/mL per la ceftriaxona e 0,125–16 μg/mL per gentamicina e meropeneme (Tabella 2, Tabella 3 e Tabella 4).
Tabella 2: Preparazione di soluzioni antibiotiche per la combinazione fosfomicina-gentamicina. Fasi di preparazione e concentrazioni utilizzate per stock e soluzioni di lavoro. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 3: Preparazione di soluzioni antibiotiche per la combinazione Fosfomicina-Meropenem. Fasi di preparazione e concentrazioni utilizzate per stock e soluzioni di lavoro. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 4: Preparazione di soluzioni antibiotiche per la combinazione fosfomicina-ceftriaxone. Fasi di preparazione e concentrazioni utilizzate per stock e soluzioni di lavoro. Clicca qui per scaricare questa tabella.
In questo studio, sono state preparate soluzioni separate di stock di fosfomicina per esperimenti di monoterapia e combinazione per compensare le differenze nei fattori finali di diluizione durante i test basati sull'agar. Per gli esperimenti monoterapici veniva utilizzata una soluzione standard di stocco, mentre per esperimenti combinati una soluzione di base standard a concentrazione più alta veniva utilizzata per compensare la diluizione aggiuntiva durante la premixazione degli antibiotici.
Le soluzioni standard venivano preparate come primo passo per la diluizione seriale. Per la fosfomicina, 256 mg di polvere venivano pesati accuratamente utilizzando una bilancia analitica in condizioni sterili e sciolti in 50 mL di acqua distillata sterile con miscelazione continua (agitatore magnetico) fino al raggiungimento della completa dissoluzione, ottenendo una concentrazione finale di 5120 μg/mL di fosfomicina disodio. Sono state preparate soluzioni stock separate di gentamicina, meropenem e ceftriaxone.
Per diluizioni seriali a doppia parte, sono stati preparati sette tubi conici sterili contenenti 25 mL di acqua distillata sterile. Dalla soluzione originale, 25 mL venivano trasferiti nel primo tubo utilizzando una pipetta regolabile, seguiti da un trasferimento sequenziale nei tubi successivi per ottenere diluizioni seriali doppie. Ogni tubo veniva miscelato accuratamente con un miscelatore a vortice per 5–10 secondi dopo ogni passaggio di trasferimento. Dal tubo finale, 25 mL venivano scartati per mantenere volumi uguali. In questo modo è stata ottenuta una serie di diluizione che ha prodotto una concentrazione minima di 40 μg/mL, e sono state preparate in totale otto diverse concentrazioni di fosfomicina.
La stessa procedura è stata applicata per gentamicina, meropenem e ceftriaxone. Tuttavia, a causa delle differenze negli intervalli di concentrazione target, 16 mg di gentamicina e meropenem (per un intervallo 0,125–16 μg/mL) e 8 mg di ceftriaxone (per un intervallo 0,0625–8 μg/mL) sono stati pesati e sciolti separatamente in acqua distillata sterile da 50 mL in condizioni asettiche a temperatura ambiente. Le diluizioni seriali doppie venivano eseguite come descritto sopra. Le concentrazioni finali più basse sono state 2,5 μg/mL per gentamicina e meropenem, e 1,25 μg/mL per ceftriaxone. Per ogni antibiotico sono stati preparati otto tubi contenenti 25 mL di diverse concentrazioni. Poiché la fosfomicina è stata testata in combinazione con tre antibiotici, sono stati preparati in totale 24 tubetti di diluizione della fosfomicina (8 × 3).
Per la preparazione dell'agar, 18 mL di agar Mueller–Hinton integrati con glucosio-6-fosfato (25 μg/mL) sono stati preraffreddati a 45–50 °C e distribuiti in piastre di Petri sterili. Successivamente, sono stati aggiunti 1 mL di soluzione di fosfomicina e 1 mL della seconda soluzione antibiotica utilizzando pipette sterili. Le lastre venivano delicatamente miscelate con rotazione circolare per garantire una distribuzione omogenea e lasciate solidificarsi a temperatura ambiente. A causa della miscelazione a volume uguale e dell'aggiunta di agar, le concentrazioni di antibiotici sono state ridotte di circa 9 volte.
Per i test combinati, 1 mL della concentrazione più bassa di fosfomicina (40 μg/mL) è stato combinato con 1 mL di ciascuna delle otto diluizioni di gentamicina (2,5–320 μg/mL), poi aggiunto a diverse piastre di Petri e miscelato delicatamente. La stessa procedura è stata ripetuta per la successiva concentrazione di fosfomicina (80 μg/mL), e proseguita a passo in passo fino a 5120 μg/mL, assicurando che tutte le possibili combinazioni di concentrazione fossero testate. Per ogni trasferimento veniva utilizzata una nuova punta sterile per pipetta per prevenire contaminazioni incrociate. In totale, sono stati preparati 64 piastre di Petri (8 × 8 combinazioni) per la combinazione fosfomicina–gentamicina (Tabella 5).
La stessa procedura è stata applicata alla fosfomicina in combinazione con meropenema e ceftriaxone, ottenendo 64 piastre per ogni combinazione di antibiotici (Tabella 6 e Tabella 7).
Tabella 5: Disposizione della combinazione fosfomicina-gentamicina su mezzo MHA. Disposizione delle concentrazioni di antibiotici sull'agar Mueller–Hiton. FF = fosfomicina; GN = gentamicina. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 6: Disposizione della combinazione fosfomicina-meropenema su mezzo MHA. Disposizione delle concentrazioni di antibiotici sull'agar Mueller–Hiton. FF = fosfomicina; MEM = meropenem. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 7: Disposizione della combinazione fosfomicina-ceftriaxone sul mezzo MHA. Disposizione delle concentrazioni di antibiotici sull'agar Mueller–Hiton. FF = fosfomicina; CRO = ceftriaxone. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Dopo aver preparato le miscele antibiotiche, sono stati aggiunti 18 mL di agar Mueller–Hinton fuso (45–50 °C) a ciascuna piastra contenente 1 mL della miscela antibiotica, assicurando che le condizioni di temperatura non compromettessero l'attività antibiotica. Questo ha portato a una diluizione approssimativa di 9 volte della soluzione antibiotica iniziale.
Per una valutazione sistematica, le tavole erano disposte in formato a scacchiera (diluizione bidimensionale). Le concentrazioni di fosfomicina erano organizzate lungo l'asse verticale (file A–H), con la concentrazione più alta nella serie A e concentrazioni decrescenti verso la linea H. Il secondo antibiotico era disposto lungo l'asse orizzontale (colonne 1–8), con concentrazioni crescenti dalla colonna 1 alla colonna 8. Ogni posizione ben equivalente, quindi, rappresentava una combinazione unica di due concentrazioni di antibiotici, permettendo una valutazione completa degli effetti di interazione.
Valutazione dei risultati
I risultati della concentrazione inibitoria minima sono stati valutati secondo le raccomandazioni EUCAST v.11. Le piastre di controllo della crescita hanno mostrato una crescita batterica visibile, mentre le piastre di controllo della sterilità (non inoculate) non hanno mostrato crescita. La MIC è stata definita come la concentrazione più bassa in cui non si è verificata alcuna crescita visibile. Per i test combinati, gli effetti di interazione sono stati interpretati utilizzando i valori FICI. La sinergia era definita come FICI ≤ 0,5, indifferenza > 0,5–4 e antagonismo come > 4. Per la fosfomicina, valori di MIC ≤ 32 μg/mL erano considerati suscettibili, mentre quelli > 32 μg/mL erano considerati resistenti. Per gentamicina e meropenema (nelle infezioni da meningite), valori di CIM ≤ 2 μg/mL erano considerati suscettibili, mentre quelli > 2 μg/mL erano considerati resistenti. Per il meropeneme (nelle infezioni non meningitiche), i valori di CMI ≤ 2 μg/mL sono stati considerati suscettibili. I valori > 8 μg/mL sono stati considerati resistenti, la CMI ≤ 1 μg/mL per ceftriaxone (per infezioni non meningitiche) è stata considerata suscettibile, la CMI ≤ 2 μg/mL per ceftriaxone (per le infezioni da meningite) è stata considerata suscettibile, e la CMI > 1 μg/mL per ceftriaxone (per infezioni da meningite) è stata considerata resistente16.
L'analisi statistica dei dati dello studio è stata effettuata utilizzando software statistico.
Statistica: Le variabili categoriche sono state espresse come numeri e percentuali. Il test chi-quadrato di Pearson è stato utilizzato per confronti in cui tutti i conteggi cellulari attesi erano ≥5. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per analisi con campioni di dimensioni ridotte o quando il conteggio cellulare previsto era <5. In particolare, il test chi-quadrato è stato utilizzato per confronti complessivi dei tassi di resistenza alla fosfomicina, mentre il test esatto di Fisher è stato utilizzato per analisi di sottogruppi dei tassi di interazione sinergica, additivi e antagonistici dovuti a distribuzioni a bassa frequenza in alcune combinazioni. Un valore P ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
Nota sull'interpretazione: Piccole colonie singole all'interno delle zone inibitorie non erano considerate in crescita a meno che non fossero confluenti o riproducibili in test ripetuti.
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Conclusioni
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Nello studio sono stati inclusi in totale 60 isolati di E. coli resistenti ai carbapenemi. Tutti gli isolati sono stati ottenuti da pazienti ricoverati in unità di terapia intensiva o reparti clinici degli ospedali della Facoltà di Medicina della Dicle University. I pazienti adulti rappresentavano l'83,3% dei casi, mentre i pazienti pediatrici il 16,7% (Tabella 8 e Tabella 9). La resistenza multifarmaco è stata osservata nell'80% (n = 48) degli isolati.<...
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Dichiarazioni
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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.
Ringraziamenti
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Questo studio è stato supportato dall'Unità di Coordinamento dei Progetti di Ricerca Scientifica (DÜBAP) della Dicle University con il numero di progetto SBE.21.004.
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