La valutazione del drenaggio linfatico utilizzando imaging ICG nel vicino infrarosso e ultrasuoni dopo frattura

Sommario

Questo protocollo valuta il drenaggio linfatico dopo la frattura combinando l'imaging nel vicino infrarosso dell'indocyanina verde (ICG) con l'ecografia per quantificare la clearance plantare dell'ICG e l'ingrossamento dei linfonodi poplitei nei topi.

Abstract

Le fratture traumatiche sono spesso accompagnate da una funzione di drenaggio linfatico compromessibile. Un drenaggio linfatico ridotto e l'ingrossamento dei linfonodi dopo la frattura indicano processi dinamici e continui della risposta infiammatoria acuta e del reclutamento delle cellule immunitari. Questo articolo descrive un metodo in cui 6 μL di 0,2 mg/mL di verde di indocyanina sono stati iniettati intradermicamente nella regione plantare dei topi sottoposti a chirurgia di frattura simulata o tibiale. L'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso ha quantificato il segnale ICG plantare a 0 h e 24 h per calcolare il tasso di eliminazione a 24 ore come lettura del drenaggio linfatico murino. L'ecografia è stata utilizzata simultaneamente per ricostruire in 3D i linfonodi poplitei (PLN), confrontarne i volumi e valutare l'ingrossamento indotto da frattura.  I risultati hanno dimostrato che, dopo la frattura, il tasso di clearance linfatico diminuiva significativamente, l'intensità di fluorescenza dell'ICG nella regione plantare era notevolmente più alta e il volume delle PLN era significativamente ingrandito.  Rispetto ai metodi precedenti di misurazione del sistema linfatico, come le sezioni istopatologiche o la linfescentigrafia, che spesso non riescono a ottenere un'osservazione in vivo, dinamica e continua, questo metodo dimostra elevata stabilità e riproducibilità. In particolare, consente un monitoraggio dinamico in vivo. della funzione del drenaggio linfatico, fornendo un solido supporto tecnico per indagare i cambiamenti nel reflusso linfatico nei modelli di frattura.

Introduzione

Le fratture traumatiche spesso causano danni e gonfiore significativi ai tessuti, aumentando il rischio di complicazioni come infezioni, necrosi e non unione^{ossea 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. hanno dimostrato che la disfunzione del drenaggio linfatico, che porta a edema tissutale, è collegata a un ritardo nella^{guarigione 3}. Gli studi indicano che durante il processo di guarigione della frattura, oltre alla riparazione del tessuto osseo, anche il sistema linfatico nel sito della frattura svolge un ruolo importante. I vasi linfatici sono responsabili non solo del drenaggio del liquido interstiziale e della prevenzione del^gonfiore, ma anche della regolazione della migrazione delle cellule immunitarie e della pulizia dei rifiuti metabolici. Tuttavia, nelle fasi iniziali della frattura, fattori pro-infiammatori come TNF-α, IL-1, IL-6 e il fattore stimolante della colonia di macrofagi (MCSF) possono danneggiare le cellule endoteliali^{linfatiche 5}, portando a cambiamenti patologici come degenerazione, edema e^{fibrosi 6}. Studi rilevanti hanno dimostrato la presenza di cellule endoteliali linfatiche nell'osso e nel periosteo, così come nei tessuti adiposi e muscolari circostanti. Inoltre, il drenaggio linfatico partecipa anche alla regolazione del microambiente dell'ematoma dopo la frattura; un drenaggio linfatico efficace facilita la sopravvivenza degli osteoblasti e la proliferazione delle cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC⁾⁷. Durante una frattura, i fattori pro-infiammatori (TNF-α, IL-1 e IL-6) e i fattori di crescita (TGFβ1 e PDGF) prodotti dalle cellule immunitarie nel sito danneggiato sono fattori regolatori importanti per l'apoptosi degli osteoblasti e la proliferazione^{BMSC 8}. Hüseyin Arslan e altri studiosi hanno confermato l'impatto negativo dell'edema linfatico sugli osteoblasti. Questi risultati evidenziano l'importante ruolo del drenaggio linfatico nella guarigione delle fratture. I recenti progressi nell'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR) dell'ICG hanno facilitato l'osservazione non invasiva e in tempo reale della dinamica del flusso linfatico sia nei modelli animali che nell'uomo ^9,10,11. Questa tecnica consente una valutazione quantitativa della contrattibilità dei vasi linfatici, della velocità di drenaggio e dell'integrità delle vie^10,11. Uno studio che utilizza modelli murini di artrite e infiammazione ha dimostrato che l'imaging ICG-NIR può differenziare tra risposte linfatiche acute e croniche, evidenziando distinti modelli di drenaggio durante lesioni tissutali e recupero. Inoltre, l'imaging linfatico NIR si è dimostrato efficace per monitorare il recupero funzionale dopo il drenaggio linfico manuale e per valutare l'efficacia delle terapie mirate linfaticamente. L'ecografia fornisce una modalità quantitativa complementare per valutare la morfologia e il volume dei linfonodi drenanti, così come l'edema tissutale associato a un drenaggio linfatico compromesso. L'integrazione dell'imaging a fluorescenza NIR con l'ecografia consente una valutazione parallela della funzione linfatica e dei cambiamenti anatomici, fornendo un approccio multimodale per indagare la dinamica linfatica in vivo. Nonostante il crescente riconoscimento del ruolo fondamentale della disfunzione linfatica nella guarigione post-traumatica, i metodi standardizzati e riproducibili per valutare il drenaggio linfatico dopo le fratture restano inesistenti. Molti metodi di imaging attuali sono invasivi, mancano di una risoluzione spaziale adeguata o non monitorano dinamicamente il flusso linfatico. Pertanto, si prevede che lo sviluppo di un protocollo che combini ICG-NIR e imaging ultrasonico affronterà questa carenza metodologica e fornirà uno strumento efficace per valutare il recupero linfatico e il suo contributo alla riparazione ossea.

Questo studio presenta un quadro innovativo che combina l'imaging a fluorescenza ICG-NIR con ultrasuoni ad alta risoluzione per valutare il drenaggio linfatico dopo fratture tibiali nei topi. Questo approccio consente un'analisi semi-quantitativa dell'efficienza del drenaggio e misura il volume dei linfonodi durante il processo di guarigione della frattura. Ha anche alcune limitazioni. Innanzitutto, l'ICG-NIR è principalmente utilizzato per valutare i vasi linfatici superficiali, e la sua capacità di imaging per strutture più profonde è limitata. In secondo luogo, sebbene le variazioni nel volume dei linfonodi forniscano alcune informazioni, mancano di specificità e non possono sostituire completamente le misurazioni funzionali dirette. Questa metodologia ha un significativo potenziale traslazionale e migliora la nostra comprensione della funzione linfatica nella rigenerazione ossea.

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Shanghai Model Organisms Center (Approvazione n. NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57 con modello di frattura (6–8 settimane di età). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Cura preoperatoria

1. Acclimatare i topi per almeno una settimana con l'accesso ad libitum. Accesso a cibo e acqua. Assegnare casualmente gli animali al gruppo frattura o finta utilizzando una lista di randomizzazione generata al computer.
2. Posiziona i topi su un cuscinetto riscaldante per animali e mantiene una temperatura costante di 37 °C.
3. Accendi la macchina per l'anestesia a gas e metti il topo nella camera di induzione per 5 minuti al 2%–3% di isoflurano.
4. Dopo l'induzione, passa all'isoflurano all'1%–2% e mantiene l'anestesia tramite un cono nasale fino alla fine della procedura.

2. Procedura sperimentale

NOTA: Standardizzare le impostazioni anestesiche, la dose e il volume dell'ICG, il sito e la profondità dell'iniezione, il tempo di esposizione, la definizione del ROI e i parametri della scansione ultrasonica in tutte le sedute per minimizzare la variabilità tra animali.

1. Imaging NIR-ICG
   NOTA: La procedura passo dopo passo per l'imaging ICG nel vicino infrarosso è mostrata nella Figura 1.
   1. Pesa 0,2 mg di verde di indocianina (ICG), trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e scioglilo in 1 mL PBS per preparare una soluzione ICG da 0,2 mg/mL. Avvolgi il tubo con della carta stagnola per proteggerlo dalla luce.
   2. Accendi il sistema di imaging e apri FluoBeam v1.46. Regola l'altezza della telecamera secondo necessità.
   3. Inumidisce un cotton fiampon con etanolo al 75% e disinfetta la superficie plantare della zampa posteriore modellata.
   4. Utilizzando una microsiringa da 10 μL, aspirare 6 μL della soluzione ICG. Inserire l'ago di circa 1 mm nella superficie plantare e iniettare la soluzione a velocità costante fino a quando non viene erogato il volume completo.
   5. Nel software, attiva sia la funzione "telecamera" che quella "laser". Clicca su "modifica" per creare una nuova cartella e impostala come cartella di salvataggio. Mantieni il tempo di esposizione identico per l'acquisizione dell'immagine a 0 h e 24 h.
   6. Posiziona il topo sotto la telecamera in posizione prona con l'arto posteriore modellato centrato nel campo visivo. Assicurati che il ramo posteriore modellato sia centrato nel campo visivo.
   7. Imposta il tempo di esposizione a 30 ms e mantienilo identico sia per le immagini a 0 h che a 24 h. Acquisire immagini dello stesso ROI di iniezione plantare a 0 e 24 ore dopo l'iniezione per misurare l'intensità del segnale ICG. Mantieni il tempo di esposizione identico a 0 h e 24 h.
   8. Quando i vasi linfatici dell'arto posteriore sono chiaramente visibili nel campo visivo, clicca su "foto" per catturare le immagini.
   9. Dopo l'acquisizione dell'immagine, esportare i dati e utilizzare un software di analisi per quantificare l'intensità di fluorescenza a 0 h e 24 h, e poi calcola il tasso di clearance della fluorescenza.
   10. Apri il software di analisi delle immagini.
   11. Importare le immagini di fluorescenza cliccando su File → Apri, e aprire l'immagine plantare a 0 h corrispondente allo stesso animale e allo stesso giorno d'esame (poi apri l'immagine corrispondente a 24 ore successivamente).
   12. Seleziona Ovale, poi clicca su Modifica → Selezione → Specifica; imposta Larghezza = 30 e Altezza = 30, scegli Ovale e clicca OK.
   13. Metti il cerchio sopra un'area di fondo.
   14. Clicca su Analizza → Misura e registra il valore medio nella finestra dei Risultati come intensità di fluorescenza a 0 h di fondo (FI0hbg).
   15. Posiziona il cerchio sopra il sito di osservazione del bersaglio, clicca su Analizza → Misura e registra il valore medio nella finestra dei Risultati come FI0h.
   16. Calcola l'intensità di fluorescenza corretta a 0 h come FI0h corretta = FI0h − FI0hbg.
   17. Apri l'immagine corrispondente a 24 ore e ripeti i passaggi 3–7 per ottenere la Correggiata FI24h.
   18. Calcola la velocità di clearance usando l'intensità di fluorescenza corretta al fondo come segue: Clearance rate = (FI0h − FI0hbg) − (FI24h − FI24hbg)] / (FI0h − FI0hbg) × 100%.
2. Ecografia in modalità B
   NOTA: La procedura passo dopo passo per l'ecografia e la delineazione dei linfonodi è illustrata in Figura 2.
   1. Accendi l'ecografia, collega il trasduttore e posiziona il topo in modo che il membro posteriore sia chiaramente visibile. In anestesia continua, posizionare il topo in posizione prona sul palco di imaging, con la testa orientata lontano dall'operatore e la coda rivolta all'operatore. Flette il ginocchio in modo che la fossa poplitea sia rivolta verso l'alto e leggermente lateralmente, e posiziona il trasduttore sopra la depressione della fossa poplitea.
   2. Applica il gel di accoppiamento per ultrasuoni sull'arto posteriore modellato.
   3. Ruota il trasduttore in modo che il suo angolo rimanga parallelo all'asse longitudinale del ramo posteriore.
   4. Imposta la distanza di scansione a 4 mm e la dimensione del passo a 0,04 mm. Identifica il linfonodo popliteo sull'immagine in base alla sua posizione anatomica.
   5. Stabilizza il topo tenendo la coda e l'arto posteriore modellato con entrambe le mani. Non muovere l'animale mentre il trasduttore è in fase di scansione.
   6. Acquisire immagini. Identificare il linfonodo popliteo come un piccolo nodulo ovale o leggermente a forma di fagiolo con ecogenicità intermedia o bassa, leggermente inferiore a quella del grasso circostante e chiaramente delimitato dal muscolo scuro e striato adiacente.
   7. Esporta le immagini in un software di ricostruzione 3D per l'elaborazione tridimensionale delle immagini.
   8. Dopo aver completato la scansione 3D sulla console del sistema di imaging a ultrasuoni, salva la scansione come dataset 3D e registra l'identificazione animale, il codice di gruppo e il momento (0 h / 24 h).
   9. Esportare i dati grezzi dalla console di acquisizione al computer di analisi, mantenendo invariata la struttura originale delle cartelle; Usa una cartella per ogni animale in ogni momento orario quando possibile.
   10. Apri il software di ricostruzione 3D.
   11. Clicca su "Studia" per entrare nel modulo e seleziona "Importa".
   12. Clicca sulla cartella dati , controlla i dati da importare e fai doppio clic per aprirla.
   13. Nella modalità visualizzazione, seleziona "Elaborazione immagini" → "Carica in 3D" → "Vista trasversale" → "Misurazione volume" → "Inizia."
   14. Conferma che l'orientamento della fetta e i parametri a passo ("voxel/spacing") siano coerenti con le impostazioni di acquisizione.
   15. Usa la rotellina del mouse o lo slider a fetta per scorrere dall'estremità prossimale a quella distale e identifica la prima fetta in cui appare il PLN (di solito appare come una struttura ovale o a forma di fagiolo, leggermente ipoecoica rispetto al grasso circostante, con un confine relativamente chiaro).
   16. Inizia a tracciare la prima fetta in cui appare il PLN cliccando con il tasto sinistro per iniziare il contorno.
   17. Traccia un contorno chiuso punto per punto lungo il bordo del linfonodo, mantenendo il contorno il più vicino possibile alla capsula esterna ed evitando l'inclusione del calore adiposo o del lumen vascolare circostante.
   18. Usa la rotella del mouse per spostarti nella sezione che mostra l'area massima della sezione trasversale del PLN, e ripeti il Passo 10 per completare il secondo contorno.
   19. Usa la rotella del mouse per spostarti sulla sezione poco prima che il PLN scompaia, e ripeti il Passo 10 per completare il terzo contorno.
   20. Clicca su "Termina" per generare il volume segmentato 3D e inviare la misurazione del volume.
   21. Registra il volume PLN (mm³) nel pannello dei risultati.
   22. Nel pannello dei risultati delle misurazioni, seleziona "Esporta" ed esporta i risultati come file .csv o .xls.
   23. Seleziona il tipo di file ed esporta l'immagine come TIFF Image Area (.tif).
   24. Mantieni l'accecamento durante l'analisi mostrando solo il codice animale e il punto temporale, senza mostrare l'assegnazione di gruppo (frattura/sham), fino a quando tutta l'estrazione del volume è stata completata e i gruppi sono decodificati per l'analisi statistica.
3. Analisi statistica utilizzando software di analisi statistica
   1. Seleziona Nuova Tabella e Grafico, scegli Raggruppato.
   2. Imposta il formato di inserimento dati su Inserisci valori replicati, impilati in sottocolonne.
   3. Inserisci i valori grezzi per 1 / 7 / 14 e Sham / Frattura. - Apri il grafico.
   4. Cambia il tipo di grafico in Scatter (valori individuali) + media + barre di errore.
   5. Formatta gli assi: imposta l'asse Y e cambia il titolo dell'asse.
   6. Clicca su Analizza ed esegui un'ANOVA bidirezionale.
   7. Confronta Sham con Fracture in ogni momento di tempo.
   8. Aggiungi i risultati di significato al grafico.

3. Cure post-operatorie

1. Alla fine dell'esperimento, posiziona il topo su una borsa termica e lascia che si riprenda dall'anestesia.
2. Monitorare attentamente le sue condizioni e, se non vengono osservate anomalie, riportarlo nella gabbia per continuare a essere alloggiato.

4. Valutazione

NOTA: Far eseguire l'acquisizione delle immagini e analisi quantitative da un ricercatore cieco sull'allocazione dei gruppi, e mantenere tutti i dataset codificati fino al completamento delle analisi statistiche.

1. Imaging NIR-ICG
   1. Utilizzare software di analisi delle immagini per eseguire un'analisi quantitativa relativa dell'intensità di fluorescenza nelle immagini ICG raccolte dai footpad del topo.
      NOTA: La formula di calcolo per il tasso di clearance dell'ICG nei footpad dei topi è la seguente:
      Tasso di risoluzione (%) = [(FI_0h – FI_24h) / (FI_0h)] × 100%
   2. Utilizzare lo stesso metodo per registrare il tasso di clearance per ogni misurazione e analizzare la relazione tra tasso di clearance linfatico e tempo utilizzando software di analisi statistica.
2. Ecografia in modalità B
   1. Analizza immagini in modalità B e tridimensionale utilizzando software di ricostruzione 3D per determinare il volume delle PLN.
   2. Valuta le variazioni nel drenaggio linfatico e nel volume dei linfonodi nel tempo creando diagrammi a scatter con software di analisi statistica.
3. Analisi statistica
   1. Analizza misurazioni ripetute ottenute nei giorni 1, 7 e 14 utilizzando ANOVA a misura ripetuta a due vie.

Risultati

Nei giorni 1, 7 e 14 dopo aver stabilito il modello di frattura, l'intensità di fluorescenza plantare ICG (FI_24h) a 24 ore nel gruppo fratturante è stata costantemente superiore a quella del gruppo di chirurgia fittizia (Figura 3). L'analisi quantitativa relativa dell'intensità della fluorescenza ICG dalle immagini plantari raccolte ha mostrato che il tasso di clearance linfatico dell'ICG nel gruppo fratturatore era significativamente inferiore ri...

Discussione

Il protocollo include diversi dettagli facilmente trascurati. Ad esempio, il tempo di esposizione non è fisso e deve essere determinato in base all'intensità specifica di fluorescenza. Tuttavia, il tempo di esposizione per lo stesso gruppo di topi a 0 h e 24 h deve rimanere costante; altrimenti, i risultati potrebbero essere inaffidabili. Quando si utilizza l'ecografia per l'osservazione, è essenziale coprire completamente gli arti inferiori del topo con un agente di accoppiamento, poich...

Materiali

```html

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	La microseringa Hamilton 80330/00 è uno strumento di precisione con una capacità di 10L, dotata di un ago calibro 26s, lunghezza di 51 mm e stile punta 2. È progettata per la consegna accurata di piccoli volumi in applicazioni di cromatografia, iniezione di campioni e chimica analitica.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	Il Vevo 2100 è un sistema di imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza per la ricerca preclinica, che fornisce una visualizzazione 3D in tempo reale di piccoli animali. Offre una risoluzione superiore per studi cardiovascolari, oncologici e di biologia dello sviluppo, integrato con il software Vevo LAB per l'analisi dei dati.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	L'etanolo al 75% è una soluzione disinfettante ampiamente utilizzata nei laboratori per la sterilizzazione delle superfici, la pulizia delle attrezzature e l'antisepsi. Uccide efficacemente batteri, virus e funghi attraverso la denaturazione delle proteine ed è comunemente applicato in ambienti biologici e clinici.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	I tamponi di cotone sono applicatori assorbenti sterili utilizzati per la raccolta precisa di campioni, l'applicazione di soluzioni o la pulizia in procedure mediche, diagnostiche e di laboratorio. Presentano bastoncini di legno o plastica con punte di cotone per una manipolazione igienica.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	L'agente di accoppiamento, comunemente noto come gel per ultrasuoni, è un mezzo a base d'acqua utilizzato per migliorare la trasmissione acustica tra il trasduttore ad ultrasuoni e la pelle. Elimina le sacche d'aria per un'imaging chiara, non è irritante e viene fornito in un contenitore da 250 mL per uso medico e diagnostico.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Un software scientifico per la grafica e l'analisi statistica utilizzato per l'analisi, la visualizzazione e la presentazione dei dati.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Un programma di elaborazione e analisi delle immagini basato su Java a dominio pubblico ampiamente utilizzato per l'analisi delle immagini biologiche e mediche.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	L'indocianina verde è un colorante anionico solubile in acqua utilizzato nella diagnostica medica per determinare il flusso cardiaco, la funzione epatica, il flusso sanguigno epatico e l'angiografia oftalmica. Viene fornito in flaconcini da 25 mg per somministrazione endovenosa e mostra fluorescenza nello spettro del vicino infrarosso a scopo di imaging.
isoflurance	RWD	R650-IE	L'isoflurano è un anestetico generale inalatorio. Ha un piccolo coefficiente di partizione sangue/gas. Quando utilizzato per l'anestesia animale, può indurre l'anestesia in modo fluido, rapido e confortevole, con una rapida ripresa, buona rilassamento muscolare e nessun effetto eccitatorio sul sistema nervoso simpatico. Il tasso metabolico dell'isoflurano nel fegato è basso, quindi ha poca tossicità per il fegato e non ci sono evidenti effetti collaterali anche con un uso ripetuto. Per evitare gli effetti avversi del gas residuo anestetico sull'ambiente e sul personale di laboratorio, si consiglia di utilizzarlo insieme a un sistema di recupero del gas.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	La microbilancia FA1004B è uno strumento analitico ad alta precisione progettato per la pesatura accurata di piccoli campioni, offrendo una leggibilità fino a 0,0001 g e adatto per applicazioni di laboratorio che richiedono misure precise nella ricerca e nel controllo qualità.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	L'Olympus MVX10 è un sistema di microscopio a fluorescenza zoom macro ottimizzato per l'imaging nel vicino infrarosso. Offre una visualizzazione ad alta risoluzione di grandi campioni con un ampio intervallo di zoom, ottica avanzata per la penetrazione in profondità dei tessuti e compatibilità con le tecniche di fluorescenza nella ricerca biologica e sui materiali.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Un pacchetto software di analisi delle immagini utilizzato per analizzare i dati di imaging Vevo, inclusi misurazione, calcolo e generazione di report.

```