La valutazione del drenaggio linfatico utilizzando imaging ICG nel vicino infrarosso e ultrasuoni dopo frattura

Sommario

Questo protocollo valuta il drenaggio linfatico dopo la frattura combinando l'imaging nel vicino infrarosso dell'indocyanina verde (ICG) con l'ecografia per quantificare la clearance plantare dell'ICG e l'ingrossamento dei linfonodi poplitei nei topi.

Abstract

Le fratture traumatiche sono spesso accompagnate da una funzione di drenaggio linfatico compromessibile. Un drenaggio linfatico ridotto e l'ingrossamento dei linfonodi dopo la frattura indicano processi dinamici e continui della risposta infiammatoria acuta e del reclutamento delle cellule immunitari. Questo articolo descrive un metodo in cui 6 μL di 0,2 mg/mL di verde di indocyanina sono stati iniettati intradermicamente nella regione plantare dei topi sottoposti a chirurgia di frattura simulata o tibiale. L'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso ha quantificato il segnale ICG plantare a 0 h e 24 h per calcolare il tasso di eliminazione a 24 ore come lettura del drenaggio linfatico murino. L'ecografia è stata utilizzata simultaneamente per ricostruire in 3D i linfonodi poplitei (PLN), confrontarne i volumi e valutare l'ingrossamento indotto da frattura.  I risultati hanno dimostrato che, dopo la frattura, il tasso di clearance linfatico diminuiva significativamente, l'intensità di fluorescenza dell'ICG nella regione plantare era notevolmente più alta e il volume delle PLN era significativamente ingrandito.  Rispetto ai metodi precedenti di misurazione del sistema linfatico, come le sezioni istopatologiche o la linfescentigrafia, che spesso non riescono a ottenere un'osservazione in vivo, dinamica e continua, questo metodo dimostra elevata stabilità e riproducibilità. In particolare, consente un monitoraggio dinamico in vivo. della funzione del drenaggio linfatico, fornendo un solido supporto tecnico per indagare i cambiamenti nel reflusso linfatico nei modelli di frattura.

Introduzione

Le fratture traumatiche spesso causano danni e gonfiore significativi ai tessuti, aumentando il rischio di complicazioni come infezioni, necrosi e non unione^{ossea 1,2}. Grzegorz Szczesny et al. hanno dimostrato che la disfunzione del drenaggio linfatico, che porta a edema tissutale, è collegata a un ritardo nella^{guarigione 3}. Gli studi indicano che durante il processo di guarigione della frattura, oltre alla riparazione del tessuto osseo, anche il sistema linfatico nel sito della frattura svolge un ruolo importante. I vasi linfatici sono responsabili non....

Protocollo

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali del Shanghai Model Organisms Center (Approvazione n. NMB-SMP-IACUC-01-0002-R02-03). In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57 con modello di frattura (6–8 settimane di età). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Cura preoperatoria

1. Acclimatare i topi per almeno una settimana con l'accesso ad libitum. Accesso a cibo e acqua. Assegnare casualmente gli animali al gruppo frattura o finta utilizzando una lista....

Risultati

Nei giorni 1, 7 e 14 dopo aver stabilito il modello di frattura, l'intensità di fluorescenza plantare ICG (FI_24h) a 24 ore nel gruppo fratturante è stata costantemente superiore a quella del gruppo di chirurgia fittizia (Figura 3). L'analisi quantitativa relativa dell'intensità della fluorescenza ICG dalle immagini plantari raccolte ha mostrato che il tasso di clearance linfatico dell'ICG nel gruppo fratturatore era significativamente inferiore ri.......

Discussione

Il protocollo include diversi dettagli facilmente trascurati. Ad esempio, il tempo di esposizione non è fisso e deve essere determinato in base all'intensità specifica di fluorescenza. Tuttavia, il tempo di esposizione per lo stesso gruppo di topi a 0 h e 24 h deve rimanere costante; altrimenti, i risultati potrebbero essere inaffidabili. Quando si utilizza l'ecografia per l'osservazione, è essenziale coprire completamente gli arti inferiori del topo con un agente di accoppiamento, poich.......

Materiali

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Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 Microliter Microsyringe	Hamilton Company	80330/00	La microseringa Hamilton 80330/00 è uno strumento di precisione con una capacità di 10L, dotata di un ago calibro 26s, lunghezza di 51 mm e stile punta 2. È progettata per la consegna accurata di piccoli volumi in applicazioni di cromatografia, iniezione di campioni e chimica analitica.
3D Ultrasound Vevo 3100 Imaging System		Vevo 2100	Il Vevo 2100 è un sistema di imaging ad ultrasuoni ad alta frequenza per la ricerca preclinica, che fornisce una visualizzazione 3D in tempo reale di piccoli animali. Offre una risoluzione superiore per studi cardiovascolari, oncologici e di biologia dello sviluppo, integrato con il software Vevo LAB per l'analisi dei dati.
75% Ethanol	Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.	G73537O	L'etanolo al 75% è una soluzione disinfettante ampiamente utilizzata nei laboratori per la sterilizzazione delle superfici, la pulizia delle attrezzature e l'antisepsi. Uccide efficacemente batteri, virus e funghi attraverso la denaturazione delle proteine ed è comunemente applicato in ambienti biologici e clinici.
Cotton Swab	Hebei Kangji Medical Equipment Co., Ltd.	20250303	I tamponi di cotone sono applicatori assorbenti sterili utilizzati per la raccolta precisa di campioni, l'applicazione di soluzioni o la pulizia in procedure mediche, diagnostiche e di laboratorio. Presentano bastoncini di legno o plastica con punte di cotone per una manipolazione igienica.
Coupling Agent	Tianjin Jinya Technology Development Co., Ltd.	20241029	L'agente di accoppiamento, comunemente noto come gel per ultrasuoni, è un mezzo a base d'acqua utilizzato per migliorare la trasmissione acustica tra il trasduttore ad ultrasuoni e la pelle. Elimina le sacche d'aria per un'imaging chiara, non è irritante e viene fornito in un contenitore da 250 mL per uso medico e diagnostico.
Graphpad Prism	GraphPad Software	Prism 10	Un software scientifico per la grafica e l'analisi statistica utilizzato per l'analisi, la visualizzazione e la presentazione dei dati.
Image J	National Institutes of Health	ImageJ 1.54d	Un programma di elaborazione e analisi delle immagini basato su Java a dominio pubblico ampiamente utilizzato per l'analisi delle immagini biologiche e mediche.
indocyanine green	Dandong Yichuang Pharmaceutical Co., Ltd.	8305128	L'indocianina verde è un colorante anionico solubile in acqua utilizzato nella diagnostica medica per determinare il flusso cardiaco, la funzione epatica, il flusso sanguigno epatico e l'angiografia oftalmica. Viene fornito in flaconcini da 25 mg per somministrazione endovenosa e mostra fluorescenza nello spettro del vicino infrarosso a scopo di imaging.
isoflurance	RWD	R650-IE	L'isoflurano è un anestetico generale inalatorio. Ha un piccolo coefficiente di partizione sangue/gas. Quando utilizzato per l'anestesia animale, può indurre l'anestesia in modo fluido, rapido e confortevole, con una rapida ripresa, buona rilassamento muscolare e nessun effetto eccitatorio sul sistema nervoso simpatico. Il tasso metabolico dell'isoflurano nel fegato è basso, quindi ha poca tossicità per il fegato e non ci sono evidenti effetti collaterali anche con un uso ripetuto. Per evitare gli effetti avversi del gas residuo anestetico sull'ambiente e sul personale di laboratorio, si consiglia di utilizzarlo insieme a un sistema di recupero del gas.
Microbalance	Shanghai Precision Scientific Instrument Co., Ltd.	FA1004B	La microbilancia FA1004B è uno strumento analitico ad alta precisione progettato per la pesatura accurata di piccoli campioni, offrendo una leggibilità fino a 0,0001 g e adatto per applicazioni di laboratorio che richiedono misure precise nella ricerca e nel controllo qualità.
Near-Infrared Imaging System	Olympus	MVX10	L'Olympus MVX10 è un sistema di microscopio a fluorescenza zoom macro ottimizzato per l'imaging nel vicino infrarosso. Offre una visualizzazione ad alta risoluzione di grandi campioni con un ampio intervallo di zoom, ottica avanzata per la penetrazione in profondità dei tessuti e compatibilità con le tecniche di fluorescenza nella ricerca biologica e sui materiali.
Vevo lab	\	Vevo LAB	Un pacchetto software di analisi delle immagini utilizzato per analizzare i dati di imaging Vevo, inclusi misurazione, calcolo e generazione di report.

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