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Articolo di ricerca
Questo studio dimostra che la formula Shengdu Pingmu allevia la stitichezza nei ratti aumentando il contenuto di acqua fecale e la propulsione intestinale. Gli effetti sono associati all'attivazione della via PI3K/AKT, alla regolazione all'alza di AQP3 e AQP8 e alla modulazione della composizione del microbiota intestinale.
La stitichezza è un disturbo gastrointestinale comune e i trattamenti attuali spesso presentano dei limiti. La Formula Shengdu Pingmu (SDPF), una formulazione modificata derivata dalla Medicina Tradizionale Cinese, è stata utilizzata clinicamente per trattare la stitichezza, ma il suo meccanismo d'azione rimane poco chiaro. Questo studio ha utilizzato l'analisi UPLC-Q/TOF-MS per identificare 188 composti nella SDPF, di cui 50 sono stati confermati in modo conclusivo. Negli esperimenti sugli animali, il trattamento con SDPF ha significativamente migliorato la propulsione intestinale, aumentato il contenuto di acqua fecale e ridotto il tempo per la prima fece nera. La farmacologia di rete e le analisi di aggancio molecolare suggeriscono il coinvolgimento della via PI3K/AKT, che è stata successivamente validata dall'osservazione della regolazione all'alza di questa via e dall'aumento dell'espressione di AQP3 e AQP8 nel retto. Inoltre, il sequenziamento genico del rRNA 16S ha rivelato che la SDPF ha ripristinato l'omeostasi del microbiota intestinale elevando batteri benefici come Lactobacillus e Bacteroides , riducendo al contempo i batteri associati all'infiammazione. Collettivamente, la SDPF allevia efficacemente la stitichezza attraverso meccanismi che regolano la via PI3K/AKT e modulano il microbiota intestinale.
La stitichezza è un disturbo gastrointestinale diffuso caratterizzato da movimenti intestinali poco frequenti, sforzo e feci dure, che colpisce circa il 20% della popolazione mondiale con significative implicazionisocioeconomiche. La stitichezza cronica non solo causa complicazioni fisiche come emorroidi, fessure anali e impazione fecale, ma contribuisce anche a disagio psicologico, tra cui ansia e depressione, compromettendo gravemente la qualità della vita deipazienti 2. Le terapie convenzionali, inclusi lassativi osmotici e integrazione con fibre alimentari, spesso producono risultati subottimali a causa dell'efficacia limitata, dei potenziali effetti collaterali e del rischio di dipendenza3. La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) offre un approccio olistico, utilizzando formulazioni erboristiche e agopuntura per regolare la motilità intestinale ripristinando il flusso di Qi e l'omeostasiviscerale 4. Tuttavia, la mancanza di protocolli standardizzati e di chiarezza meccanicistica limita un'adozione clinica più ampia. Ricerche emergenti evidenziano il potenziale di interventi innovativi, come la modulazione del microbiota intestinale e composti bioattivi derivati dalla MTC, che possono migliorare sinergicamente la funzione intestinale con effetti avversiminimi 5. Di conseguenza, lo sviluppo di una terapia integrativa basata su evidenze che combini i principi della MTC con la farmacoterapia moderna offre potenzialità per rivoluzionare la gestione della stitichezza.
La stitichezza a transito lento (STC) è un modello patologico fondamentale nella ricerca di base, che simula efficacemente il caratteristico disturbo della motilità umana della stitichezza—un transito colonico significativamenteritardato 6. Serve come "decodificatore" per chiarire i meccanismi molecolari della stitichezza, permettendo ai ricercatori di esaminare direttamente i cambiamenti patologici nel tessutorettale 7, nel sistema nervosoenterico 8, nelle cellule interstiziali di Cajal9 e nelle vie chiave disegnalazione 10, colmando così i sintomi macroscopici con anomalie cellulari e molecolari al di fuori della portata degli studiclinici 11. A livello internazionale, i metodi consolidati per sviluppare modelli STC sui ratti includono principalmente approcci chimicamenteindotti 12, in particolare l'uso di loperamide—un agonista periferico del recettore oppioide che sopprime l'attività neuronale e il rilascio di acetilcolina per indurre costantemente un transito ritardato entro 5–7 giorni—e strategie che imitano l'eziologia13, come la somministrazione a lungo termine di lassativi stimolanti ad alta dose, che porta a deficit nervoso colonico, melanosi coli, e successivamente l'inerzia colonica dipendente da lassativi. Pertanto, il modello STC del ratto non solo offre una finestra sulla complessa eziologia della stitichezza, ma funge anche da ponte cruciale che collega le intuizioni meccanicistiche di base con le applicazioni cliniche.
La Formula Shengdu Pingmu (SDPF), composta da Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian), è una preparazione ospedaliera modificata derivata dalla teoria della Medicina Tradizionale Cinese ed è da tempo utilizzata nel nostro dipartimento per disturbi correlati. Le osservazioni cliniche preliminari del nostro ospedale suggerivano che la SDPF potesse alleviare i sintomi della stitichezza (dati non pubblicati). Le ricerche hanno dimostrato che la via di segnalazione PI3K/AKT è coinvolta nella regolazione della motilitàcolonica 14, in cui il microbiota intestinale e i loro metaboliti possono svolgere un ruolo critico modulando le attività neurali e muscolari liscienteici 15. Tuttavia, i meccanismi regolatori precisi rimangono incompletamente compresi. Proponiamo che la via PI3K/AKT e il microbiota intestinale costituiscano insieme un asse essenziale per regolare la motilità del colon. Si ipotizza che gli effetti terapeutici delle formulazioni della MTC sulla dismotilità colonica possano essere associati alla modulazione della via PI3K/AKT e al riequilibrio dell'asse microbiota-intestino. Questo studio colma questa lacuna proponendo e testando una nuova ipotesi integrata: che la via PI3K/AKT e il microbiota intestinale funzionino come asse critico e interdipendente per la motilità colonica. L'obiettivo principale di questo lavoro è determinare se l'effetto terapeutico della SDPF sulla stitichezza a transito lento sia mediato dalla doppia modulazione di questo asse. In particolare, utilizzando un modello di ratto, abbiamo indagato gli effetti della SDPF sulle proteine chiave di segnalazione PI3K/AKT, i cambiamenti nella composizione del microbiota intestinale e la funzione di motilità colonica. Elucidando questo meccanismo combinato, questa ricerca fornisce, per quanto ne sappiamo, la prima evidenza sperimentale per un asse microbiota-PI3K/AKT come bersaglio unificato di interventi basati sulla MTC, offrendo così una base molecolare più completa per il trattamento dei disturbi della motilità del colon.
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Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio (National Institutes of Health, revisionata nel 2011) e sono state approvate dal Consiglio di Revisione Etica dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong (numero di Licenza Etica del Benessere: SDUTCM20250421238).
Preparazione della SDPF
La miscela erboristica è composta da Radix Paeoniae Alba (Baishao) 20 g, Curcuma longa (Jianghuang) 10 g, Rhizoma Cibotii (Tanggouji) 10 g, Siegsbeckia orientalis L. (Xixiancao) 30 g e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) 30 g. Questo rapporto combinato è stato determinato in base all'esperienza clinica. La formula è stata estratta prima immergendola in acqua deionizzata a un rapporto solido-liquido di 1:9 (g/mL) per 30 minuti, seguita da ebollizione per 60 minuti. La soluzione risultante fu immediatamente filtrata attraverso garze e centrifugata a 4.500 × g per 5 minuti per raccogliere il soprantantante. Il residuo è stato poi riestratto due volte nelle stesse condizioni (rapporto 1:9, acqua deionizzata) con un tempo di ebollizione ridotto di 30 minuti per ogni successiva estrazione. I soprannatanti di tutte e tre le estrazioni venivano combinati, concentrati e liofilizzati per 5–7 giorni per ottenere la polvere SDPF, che veniva conservata in refrigerazione per un uso successivo.
Analisi dei componenti della SDPF
Per preparare campioni solidi, una quantità adeguata di materiale omogeneizzato veniva trasferita in un tubo centrifuga da 2 mL, combinato con 1 mL di metanolo al 70% in acqua e perle d'acciaio inossidabile da 3 mm, quindi lavorato in una macinatrice automatica per 3 minuti, seguito da 10 minuti di vortice. I campioni liquidi sono stati diluiti con metanolo puro e sottoposti a un vortice per 10 minuti. Successivamente, tutti i campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C, e i soprantativi risultanti sono stati filtrati attraverso un filtro da 0,22 μm. Prima dell'analisi strumentale, la 2-clorofenilalanina (standard interno, 100 μg/mL) veniva incorporata nel filtrato per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/L. La separazione cromatografica veniva eseguita su un sistema LC-MS dotato di una colonna C18 (1,8 μm × 2,1 mm × 100 mm), mantenuta a 30 °C, con una portata di 0,3 mL/min. La fase mobile era composta dallo 0,1% di acido formico in acqua (A) e acetonitrile puro (B). Il volume di iniezione fu impostato a 2 μL e l'autocampionatore fu mantenuto a 4 °C. La rilevazione della spettrometria di massa è stata eseguita sia in modalità ionizzazione positiva che negativa nelle seguenti condizioni: temperatura del riscaldatore a 325 °C, gas di guaina a 45 unità arbitrarie, gas ausiliario a 15 arb, gas di sweep a 1 arb, tensione elettrospray a 3,5 kV, temperatura capillare a 330 °C e livello RF della lente S al 55%. I dati sono stati acquisiti in un intervallo m/z da 100 a 1500 in modalità MS a scansione completa con una risoluzione di 120.000, mentre la frammentazione MS/MS è stata effettuata in modalità acquisizione dipendente dai dati (dd-MS2, TopN=5) a risoluzione 60.000 utilizzando dissociazione collisionale ad energia più elevata.
Esperimento animale
Settantadue maschi di ratti Sprague-Dawley (di età 6 settimane, peso corporeo iniziale 180–200 g; RRID: IMSR_JAX:000664) sono stati ospitati in condizioni SPF (24 ± 1 °C, ciclo luce/scuro di 12 ore) con libero accesso a cibo e acqua. Dopo una settimana di acclimatazione, sono stati divisi casualmente in sei gruppi (n=12/gruppo) in base al peso corporeo: (1) controllo a vuoto (soluzione salina normale), (2) gruppo modello di stitichezza (10 mg/kg cloridrato di loperamide), (3) gruppi bassi (SDPF-L), (4) gruppi a dosi medie (SDPF-M) e (5) gruppi SDPF ad alta dose (SDPF-H) rispettivamente (6, 9 e 12 g/kg), e (6) controllo positivo (2 mg/kg mosapride citrato). La SDPF veniva preparata fresca come sospensione in acqua distillata a concentrazioni di 3, 4,5 e 6 g/mL e somministrata con gavage orale a un volume fisso di 2 mL/kg, corrispondenti rispettivamente a dosi di 6, 9 e 12 g/kg. Il cloridrato di loperamide veniva preparato fresco come sospensione in acqua distillata a una concentrazione di 5 mg/mL e somministrato tramite gavage orale a un volume fisso di 2 mL/kg (equivalente a 10 mg/kg). Dopo una settimana di acclimatazione, la stitichezza è stata indotta in gruppi (2) – (6) da una dose orale di cloridrato di loperamide una volta al giorno per una settimana. Il gruppo di controllo vuoto riceveva un volume equivalente di soluzione salina normale. Successivamente, per la settimana successiva, i ratti nei gruppi (3)–(5) hanno ricevuto il trattamento SDPF tramite gavage orale una volta al giorno, il gruppo di controllo positivo (6) ha inoltre ricevuto citrato di mosapride (2 mg/kg) contemporaneamente, mentre i ratti nei gruppi (2) – (6) hanno continuato a ricevere loperamide cloridrato (10 mg/kg) una volta al giorno per mantenere il modello di stitichezza. Il gruppo di controllo a vuoto continuò a ricevere soluzione salina normale. Al termine del periodo di trattamento, tutti i ratti venivano digiunati durante la notte con libero accesso all'acqua. Gli animali sono stati quindi anestetizzati con un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (40 mg/kg di peso corporeo). Dopo un'anestesia profonda confermata dall'assenza di riflessi pedalali, i ratti sono stati soppressi da lussazione cervicale. Subito dopo, i tessuti rettali venivano rapidamente prelevati. Per le analisi istologiche e immunoistochimiche, i segmenti tissutali erano fissati nel 4% di paraformaldeide. Per l'analisi dell'espressione proteica, i campioni di tessuto venivano congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
Prima fece nera
Il tempo fino all'espulsione delle prime feci nere è stato registrato per tre ratti per gruppo. Prima dell'esperimento, tutti i ratti venivano digiunati per 12 ore con libero accesso all'acqua. Ogni animale ricevette poi una somministrazione intragastrica di una sospensione a inchiostro preparato (5% carbone attivo e 5% gomma arabica) a una dose di 10 mL/kg di peso corporeo, con il tempo esatto di somministrazione registrato. Dopo la gareggiata, i ratti venivano ospitati individualmente in gabbie separate con accesso ad libitum a cibo e acqua. La comparsa delle prime feci nere di ogni ratto veniva osservata e registrata con attenzione per calcolare il tempo di transito intestinale.
Contenuto di acqua fecale
Dopo il successo dell'istituzione del modello e al termine del trattamento, sono stati raccolti nuovi campioni fecali escreti entro 2 ore da ciascun gruppo di ratti (n = 6) e inseriti in tubi EP secchi pre-pesati. Il peso umido delle feci è stato immediatamente registrato. Successivamente, i campioni sono stati trasferiti in un forno di essiccazione e disidratati a 60 °C per 36 ore. Dopo il periodo iniziale di asciugatura, i campioni venivano pesati e rimessi in forno, con le misurazioni del peso ripetute ogni 2 ore fino a raggiungere un peso costante (indicando la completa disidratazione). La percentuale di contenuto di acqua fecale è stata poi calcolata utilizzando la seguente formula:
Contenuto di acqua fecale (%) = [(Peso umido - Peso secco) / Peso umido] × 100%
Velocità di propulsione intestinale
Dopo un periodo di digiuno di 12 ore (con libero accesso all'acqua), ai ratti di ciascun gruppo (n = 6) è stata somministrata una dose intragastrica (10 mL/kg) di sospensione d'inchiostro contenente il 5% di carbone attivo e il 5% di gomma arabica. Venticinque minuti dopo, gli animali sono stati anestetizzati tramite iniezione intraperitoneale di cloral idrato al 5%. La regione addominale è stata disinfettata pulendo con etanolo al 75% prima della raccolta del tessuto, e gli arti sono stati poi fissati su una tavola disseczionale. La cavità addominale è stata accuratamente esposta con forbici chirurgiche e il tratto intestinale dal pilore alla giunzione ileocecale è stato espulso. L'intestino isolato fu raddrizzato su carta filtrante sterile e furono registrate due misurazioni: (1) la lunghezza totale dell'intestino tenue e (2) la distanza percorsa dalla parte anteriore dell'inchiostro. Il rapporto di propulsione intestinale è stato poi calcolato utilizzando la seguente formula:
Tasso di propulsione intestinale (%) = (Distanza di migrazione dell'inchiostro / Lunghezza intestinale totale) × 100%
Macchiatura HE
Per i gruppi controllo, modello, SDPF-M e Mos (n = 3 per gruppo), sono stati raccolti e processati campioni rettali per la colorazione di ematossilina ed eosina (HE). I campioni erano fissati nel 4% di paraformaldeide, disidratati in etanolo classificato e inseriti in blocchi di paraffina. Sono state preparate e fissate sezioni sottili, di spessore 4–5 μm, su vetrini di vetro prima di sottoporsi a colorazione convenzionale di ematossilina ed eosina. La procedura iniziava con la deparaffinizzazione tramite xilene, seguita dalla reidratazione tramite una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo. I nuclei sono stati colorati esponendo sezioni all'ematossilina per 5–8 minuti. Dopo differenziazione in alcol acido all'1% e bluing in acqua ammoniaca allo 0,2%, il citoplasma e la matrice extracellulare sono stati controcolorati con eosina per 1–2 minuti. Infine, le sezioni colorate furono disidratate, rimosse e montate con coperture per osservazione microscopica. Questo approccio ha permesso una valutazione dettagliata della morfologia mucosa intestinale, inclusa la struttura dei villi e delle cripte, la condizione delle cellule epiteliali e la presenza di infiltrati infiammatori all'interno della lamina propria.
Analisi dell'arricchimento del percorso KEGG e GO
Sfruttando il profilo chimico precedentemente stabilito della SDPF, sono state effettuate previsioni in silico dei target proteici per ciascun componente utilizzando la piattaforma SwissTargetPrediction. I target presunti rilevanti per la stitichezza sono stati filtrati e sottoposti a annotazione funzionale utilizzando il database DAVID 6.8, con un cutoff di significatività di P < 0,05. Il set genico risultante è stato successivamente sottoposto a classificazione GO per chiarire i suoi ruoli nei processi biologici, nelle funzioni molecolari e nei componenti cellulari. Per chiarire ulteriormente il loro coinvolgimento nella patogenesi della malattia, questi bersagli sono stati successivamente mappati ai percorsi KEGG, rivelando diverse cascate di segnalazione significativamente arricchite e potenzialmente implicate nell'insorgenza e nello sviluppo della stitichezza.
Costruzione della rete "Componente-Bersaglio-Pathway"
Una rete "Componente-Bersaglio-Via" è stata assemblata in Cytoscape (versione 3.6.1) integrando sistematicamente i costituenti chimici della SDPF, i rispettivi obiettivi terapeutici per la stitichezza e le relative vie arricchite. All'interno di questo modello grafico, sono state impiegate diverse geometrie dei nodi per rappresentare i tre tipi di dati: cerchi per i composti, triangoli per i bersagli e rettangoli per i percorsi. La forza delle connessioni tra questi nodi è stata quantificata tramite la pesatura dei bordi, fornendo una visione olistica delle interazioni farmacologiche intricate e multilivello.
Aggancio molecolare
Per l'analisi di aggancio molecolare, quattro composti bioattivi—ovvero Ciclocurcumina, Albiflorina, acido clorogenico e quercetina—sono stati selezionati come molecole di ligando, con le loro strutture scaricate dal database PubChem utilizzando i corrispondenti numeri di registro CAS. Per preparare i recettori proteici, è stato consultato il knowledge base UniProt per confermare le proteine target PI3K e AKT, e le loro strutture tridimensionali sono state successivamente recuperate dalla banca dati proteica RCSB. Queste strutture proteiche e composte sono state poi processate nel Discovery Studio 2019, dove sono stati aggiunti atomi di idrogeno, assegnate cariche e definiti tipi di atomi; Inoltre, sono state identificate potenziali tasche di legame sui recettori. I liganti e i recettori preparati sono stati successivamente salvati in formato PDBQT per simulazioni di attracco. La procedura di attracco fu eseguita con la seguente configurazione: un raggio di cluster di pose di 0,5, generazione di 10 conformazioni casuali di liganti e 10 orientamenti di raffinamento. Dopo il completamento delle corse di attracco, i complessi candidati sono stati valutati e classificati in base alle loro energie libere di legame previste. Le posizioni di legame energeticamente più favorevoli sono state infine selezionate e visualizzate utilizzando PyMOL per illustrare le interazioni intermolecolari chiave.
Immunoistochimica
I campioni rettali incorporati in paraffina, tagliati a uno spessore di 4 μm e ottenuti dalle coorti di trattamento Control, Model e SDPF-M, sono stati prima eliminati dalla paraffina e progressivamente idratati. I siti antigenici sono stati smascherati riscaldando i vetrini in tampone di citrato regolati al pH 6,0. Per stingere le perossidasi endogene, i tessuti sono stati trattati con una soluzione di perossido di idrogeno al 3%, seguita da incubazione con siero di capra normale per ridurre il legame anticorpale aspecifico. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari che hanno puntato a PI3K fosforilata e AKT; Sezioni parallele incubate con PBS fungevano da controlli negativi. Dopo un lavaggio accurato, sono stati applicati anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano e l'immunocolorazione è stata sviluppata utilizzando un cromogeno DAB sotto osservazione microscopica per controllare il tempo di reazione. Infine, i tessuti sono stati leggermente contrastati con ematossilina, disidratati tramite alcolici gradati, puliti e montati. I livelli di espressione di p-PI3K e p-AKT sono stati valutati qualitativamente da due ricercatori indipendenti ciechi rispetto ai gruppi sperimentali, e sono state selezionate immagini rappresentative per illustrare le differenze tra i gruppi.
Western blotting
I campioni di tessuto rettale di ratti sono stati risciacquati due volte con soluzione salina raffreddata con fosfato tamponato prima di essere omogeneizzati sul ghiaccio per 10 minuti in un volume adeguato di tampone di lisi RIPA. Dopo l'omogeneizzazione, la miscela fu centrifugata a 15.000 × g e il soprandanante fu mantenuto per l'analisi. La quantificazione delle proteine è stata effettuata utilizzando il metodo dell'acido bicinconinico. Successivamente, i campioni sono stati combinati con il buffer di carico SDS e denaturati tramite incubazione a 95 °C per 5 minuti. Quantità proteiche equivalenti sono state poi risolte tramite elettroforesi in gel di SDS-poliacrilammide ed elettrotrasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene con poro di 0,45 μm. Dopo il trasferimento, le membrane sono state lasciate asciugare all'aria prima di essere bloccate con il 5% di latte secco scremato in TBST per 1 ora a temperatura ambiente. A seguito di questo passaggio, le membrane sono state risciacquate con TBST e poi incubate durante la notte a 4 °C con anticorpi primari che mirano a AQP3 (RRID: AB_2837708) e AQP8 (RRID: AB_605941). Il giorno successivo, dopo ulteriori lavaggi con TBST, le membrane sono state incubate con l'anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano appropriato per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande immunoreattive sono state infine rilevate e catturate tramite un sistema di imaging.
Immunofluorescenza
La procedura di colorazione immunofluorescenza è stata eseguita su sezioni rettali di ratti trattati con Control, Model e SDPF-M come segue: dopo la criosezionazione, i tessuti sono stati fissati con paraformaldeide al 4%, permeabilizzati con 0,1% di Triton X-100 e bloccati con un tampone bloccante adeguato per prevenire il legame aspecifico. Le sezioni sono state poi incubate durante la notte a 4 °C con una miscela di anticorpi primari contro AQP3 e AQP8, dopo di che gli anticorpi non legati sono stati lavati via e i tessuti incubati per 1 ora a temperatura ambiente al buio con una miscela di anticorpi secondari—in particolare, IgG anti-coniglio coniugato ad Alexa Fluor 594 (rosso) per marchettare AQP3 e IgG anti-topo di capra coniugato con Alexa Fluor 488 (verde) per etichettare AQP8. Dopo l'incubazione secondaria degli anticorpi e i successivi lavaggi, i nuclei cellulari sono stati controcolorati con DAPI e le vetrine sono state coperte con un mezzo di montaggio acquoso prima della visualizzazione e acquisizione dell'immagine tramite microscopio a fluorescenza o confocale.
Sequenziamento 16S rRNA del microbiota fecale
Per ogni gruppo sperimentale (n = 8), il DNA genomico batterico è stato isolato da materiale fecale di ratto utilizzando un kit commerciale di estrazione del DNA del suolo, seguendo tutte le procedure rigorosamente il protocollo del fornitore. L'amplificazione PCR mirata alle regioni ipervariabili V3–V4 del gene 16S rRNA è stata eseguita su un thermal cycler utilizzando la coppia di primer 338F/806R. Il sequenziamento con amplicon è stato eseguito sulla piattaforma Illumina MiSeq secondo le linee guida del produttore, generando una profondità di sequenziamento sufficiente per raggiungere la saturazione della curva di rarefazione e garantire un'analisi affidabile della diversità microbica. Al termine della sequenziazione, le letture grezze venivano filtrate per qualità, rimosse dall'adattatore e unite utilizzando Trimmomatic e FLASH. Sequenze di alta qualità sono state successivamente raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) con una soglia di somiglianza del 97% utilizzando UPARSE, e potenziali sequenze chimeriche sono state identificate e rimosse tramite UCHIME. L'assegnazione tassonomica delle sequenze rappresentative è stata effettuata utilizzando il classificatore RDP rispetto al database di riferimento SILVA, con una soglia di confidenza del 70%. Per valutare la diversità alfa all'interno delle comunità microbiche, sono stati calcolati lo stimatore di ricchezza di Chao1 e l'indice di diversità di Shannon utilizzando il pacchetto software Mothur (v.1.30.2). Per l'analisi beta-diversità, è stata eseguita l'analisi delle coordinate principali per visualizzare le disuguaglianze composizionali tra i gruppi. È stato costruito un diagramma di Venn per illustrare la distribuzione di OTU uniche e condivise tra diverse condizioni sperimentali. L'identificazione dei taxa differenzialmente abbondanti tra le coorti è stata effettuata utilizzando l'analisi discriminante lineare della dimensione dell'effetto. Infine, è stata effettuata una profilazione predittiva delle funzioni della comunità microbica utilizzando PICRUSt2, che ha inferito potenziale funzionale dalle annotazioni ortologiche KEGG.
Statistiche
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS 23.0 e GraphPad Prism 8.0. I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). La normalità della distribuzione dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro–Wilk. Per confronti tra due gruppi, il test t di Student a campioni indipendenti è stato utilizzato per dati normalmente distribuiti, mentre il test U di Mann–Whitney è stato utilizzato per dati non distribuiti normalmente. Per confronti che coinvolgono tre o più gruppi, è stata impiegata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Tukey per dati normalmente distribuiti, mentre per dati normalmente distribuiti è stato utilizzato il test di Kruskal–Wallis seguito dal test post-hoc di Dunn. Per le analisi del microbioma, sono stati identificati taxa differenzialmente abbondanti utilizzando l'analisi discriminante lineare dimensione dell'effetto (LEfSe) con la soglia predefinita (punteggio LDA > 2,0), e la correzione multitest è stata applicata utilizzando il metodo del tasso di falsa scoperta (FDR) di Benjamini–Hochberg. Le analisi statistiche del microbioma sono state effettuate utilizzando Mothur (v.1.30.2), LEfSe (strumento online, laboratorio Huttenhower) e PICRUSt2 (v.2.5.0). Un p-valore inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Estrazione e liofilizzazione SDPF
La SDPF è una formulazione multi-erbatica composta da cinque piante medicinali: Radix Paeoniae Alba (Baishao), Curcuma longa (Jianghuang), Rhizoma cibotii (Tanggouji), Siegesbeckia orientalis L. (Xixiancao) e Clematis chinensis Osbeck (Weilingxian) (Figura 1A). La miscela è stata estratta con acqua purificata e liofilizzata in polvere per ulteriori analisi (
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La stitichezza cronica è un disturbo multifattoriale che coinvolge complesse interazioni tra la disbiosi del microbiota intestinale, la compromissione della funzione neuromuscolare e l'alterazione della secrezione intestinale. Queste manifestazioni persistono per più di sei mesi e compromettono significativamente la qualità della vita deipazienti 19. La stitichezza può essere classificata in diversi sottotipi, tra cui slow-transit, normal-transit, disturbo della d...
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Finanziamento: Questa ricerca è stata sostenuta dal Shenzhen Science and Technology Program (grant n. JCYJ20220531092203007).
Siamo profondamente grati al dottor Liqun Qu dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese dello Shandong per aver fornito una guida tecnica nell'introduzione del modello della stitichezza dei ratti.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macinacaffè automatico | Omogeneizzatore tessuti ad alta produttività per la macinazione del campione | JXFSTPRP-48 | |
| Sistema LC-MS | Thermo Fisher Scientific | Q Sistema LC-MS HF Exactivo | Cromatografia liquida ad altissima prestazione – Sistema di spettrometria di massa |
| Spettrometro di massa | Thermo Fisher Scientific | Q HF esattivo | Spettrometro di massa Orbitrap ad alta risoluzione |
| Colonna C18 | Tecnologie Agilent | Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 e volte 100 mm, 1,8 e mu; m) | Colonna a fase inversa per separazione composta |
| Sistema di scansione per immagini | GE Healthcare | ImageQuant LAS 4000 | Sistema di imaging gel e blot |
| Termociclatore | Biosistemi applicati (Thermo Fisher Scientific) | Sistema PCR GeneAmp 9700 | Strumento di amplificazione PCR |
| Kit di estrazione del DNA del suolo | Omega Bio-Tek | D5625 | Kit per l'estrazione del DNA microbico da campioni fecali/suolo |
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