Articolo metodologico

Sequenziamento a RNA a singola cellula del tessuto polmonare in un modello ratto della sindrome da difficoltà respiratoria acuta

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DOI:

10.3791/70491

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7 aprile 2026

 ,  , 
1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo standardizzato per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) del tessuto polmonare in un modello ratto di Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS). Dettaglia i passaggi dall'istituzione del modello indotto da LPS all'analisi bioinformatica, identificando 21 cluster cellulari e 6 sottopopolazioni di macrofagi, e mette in evidenza le principali vie infiammatorie coinvolte nella patogenesi dell'ARDS.

Abstract

La Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS) è una grave condizione infiammatoria polmonare con alta mortalità, caratterizzata da risposte immunitarie disregolate e danni alveolari, ma la sua eterogeneità cellulare rimane incompletamente compresa. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) offre una risoluzione senza precedenti per dissezionare meccanismi specifici per tipo cellulare, ma la sua applicazione nell'ARDS è ostacolata dalla variabilità tecnica. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per l'analisi scRNA-seq del tessuto polmonare in un modello di ARDS indotto da lipopolisaccaridi (LPS). Questo metodo include dissociazione tissutale ottimizzata, rigoroso controllo qualità, rimozione dei doppietti, correzione degli effetti batch e pipeline bioinformatiche complete per clustering, annotazione e analisi di espressioni differenziali. Il nostro approccio identifica in modo affidabile 21 popolazioni cellulari distinte e rivela sei sottopopolazioni di macrofagi/monociti con firme trascrizionali uniche nell'ARDS. L'analisi dell'espressione genica differenziale specifica del subcluster e dell'arricchimento funzionale ha ulteriormente identificato geni e vie chiave alla base della patogenesi dell'ARDS. Questo flusso di lavoro riproducibile consente una caratterizzazione approfondita della diversità cellulare, delle vie infiammatorie e dei candidati bersagli terapeutici, fornendo una solida base per studi meccanicistici e traslazionali sull'ARDS.

Introduzione

La Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS) è una malattia respiratoria acuta caratterizzata da infiammazione polmonare diffusa ed edema polmonare non cardiogenico, che si manifesta principalmente come iposemia progressiva e insufficienzarespiratoria 1,2. I meccanismi patologici dell'ARDS coinvolgono cascate infiammatorie disregolate, rotture della barriera alveolare-capillare e attivazione e interazioni anomale di molteplici tipi di celluleimmunitarie 3,4. Durante la progressione dell'ARDS, le cellule immunitarie presenti nel tessuto polmonare alimentano cascate infiammatorie attraverso la secrezione di mediatori infiammatori e la modulazione delle risposte immunitarie, interrompendo così l'endotelio polmonare, attivando la cascata di coagulazione estrinseca e aggravando il danno polmonare 5,6,7. Tuttavia, la comprensione attuale dei meccanismi patologici a livello cellulare nell'ARDS rimane limitata, il che limita lo sviluppo di terapie farmacologiche specifiche, mentre le strategie di gestione attuali consistono principalmente in varie modalità di supporto all'ossigeno e ventilazionemeccanica 1. La caratterizzazione approfondita dell'eterogeneità cellulare e dei cambiamenti dinamici durante la patogenesi dell'ARDS è di fondamentale importanza per identificare nuovi bersagli terapeutici e sviluppare nuove strategieterapeutiche 8,9,10.

L'emergere della tecnologia di sequenziamento a RNA a cellula singola (scRNA-seq) ha portato scoperte rivoluzionarie nella ricerca sul sequenziamento dell'RNA, permettendoci di dissezionare l'eterogeneità cellulare e la dinamica funzionale nella patogenesi delle malattie11,12. Rispetto al tradizionale sequenziamento di RNA di massa, la tecnologia scRNA-seq può identificare sottopopolazioni cellulari rare ma critiche, rivelare processi dinamici di transizione cellulare e scoprire complesse reti di interazione intercellulare, informazioni spesso mascherate nelle analisi a livellodi popolazione 13,14,15. Recenti studi scRNA-seq nell'ARDS hanno raggiunto progressi significativi, tra cui l'identificazione di specifiche firme di espressione genica monociti, la scoperta di modelli anomali di polarizzazione dei macrofagi e l'elucidazione delle reti di comunicazione intercellulareprofibrotiche 16,17,18,19 . Questi risultati non solo approfondiscono la nostra comprensione dei meccanismi fisiopatologici dell'ARDS, ma forniscono anche nuove intuizioni sullo sviluppo dei biomarcatori, la stratificazione delle malattie e la terapia diprecisione 20,21.

Tuttavia, la ricerca attuale sull'ARDS scRNA-seq presenta sfide, tra cui una standardizzazione metodologica insufficiente, differenze sostanziali nei protocolli di elaborazione dei campioni e pipeline di analisi dati incoerenti, che limitano la riproducibilità dei risultati della ricerca e delle loro applicazioni traslazionalicliniche 22,23. Questo protocollo affronta le sfide tecniche associate all'analisi scRNA-seq del tessuto polmonare ARDS ottimizzando le procedure per l'elaborazione dei tessuti, il controllo qualità e l'analisi dei dati, fornendo così una base per studi meccanicistici e sviluppo terapeutico. L'approccio standardizzato garantisce la riproducibilità tra diversi laboratori e facilita studi comparativi nella ricerca ARDS sull'eterogeneità cellulare.

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Protocollo

Dodici maschi specifici di Sprague-Dawley (SD) privi di patogeno specifico (SPF), di età compresa tra 6 e 7 settimane e con un peso di 220 g ± 10 g, sono stati acquistati dalla Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Numero di licenza animale: SCXK (Jing) 2025-0008). I ratti sono stati ospitati presso il Centro per Animali da Laboratorio dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino, in conformità con lo standard nazionale "Animali da laboratorio - Requisiti per l'ambiente e le strutture abitative" (GB 14925-2010, emanato dal Comitato Tecnico Nazionale per la Standardizzazione degli Animali da Laboratorio della Cina). Le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato per il Benessere Animale e l'Etica dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino (Numero di approvazione: 24-54). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Creazione del modello e raccolta dei campioni

NOTA: Prima dell'esperimento, sottoporre tutti i ratti a un periodo di acclimatazione di 1 settimana per minimizzare gli effetti indotti dallo stress.

  1. Dissolvere il lipopolisaccaride di Escherichia coli (LPS) in soluzione salina allo 0,9% per ottenere una soluzione LPS da 0,4 mg/mL.
  2. Dividiamo casualmente 12 maschi di ratti Sprague-Dawley (SD) SPF in due gruppi: un gruppo di controllo (n = 6) e un gruppo modello ARDS (n = 6).
  3. Somministrare soluzione salina allo 0,9% tramite iniezione intratracheale a una dose di 0,5 mL/100g di peso corporeo al gruppo di controllo.
  4. Somministrare la soluzione LPS da 0,4 mg/mL tramite iniezione intratracheale allo stesso volume (0,5 mL/100g) al gruppo modello ARDS e, dopo 16 ore, anestetizzare i ratti usando isoflurano (seguendo i protocolli istituzionalmente approvati).
  5. Raccogli sangue tramite l'aorta addominale, poi centrifuga (4 °C, 1000 × g, 30 minuti) per ottenere il siero.
  6. Apri la cavità toracica ed estrai il tessuto polmonare.
  7. Eseguire lavaggio broncoalveolare tramite il moncone bronchiale utilizzando una siringa per ottenere il Liquido di Lavaggio Broncoalveolare (BALF)24,25.
  8. Preleva il lobo polmonare destro e sciacqualo con PBS per un successivo esame patologico.
  9. Prelevare il lobo polmonare sinistro e sciacquarlo con PBS per i successivi esperimenti di sequenziamento cellulare singola ebiologia molecolare 26,27.

2. Valutazione istopatologica del tessuto polmonare

  1. Immergi il tessuto polmonare destro prelevato dei ratti in paraformaldeide al 4% per fissarlo per 12 ore.
  2. Dopo la fissazione, disidratare il tessuto attraverso una serie gradata di etanolo (70%, 80%, 90%, 95%, 100% e 100%), permettendo 2 ore a ciascuna concentrazione.
  3. Tratta il tessuto disidratato con xilene finché non diventa trasparente.
  4. Infiltra il tessuto trasparente con paraffina fusa in un forno a 60 °C per 2 ore.
  5. Metti il blocco di tessuto infiltrato in uno stampo di incorporazione, versa la paraffina fresca e lascia raffreddare e solidificare in un blocco di paraffina.
  6. Dividere il blocco di paraffina in fette spesse 4 μm usando un microtomo, far galleggiare le sezioni su un bagno d'acqua a 45 °C per spargerle, e poi sollevarle con vetrini rivestiti di poli-L-lisina.
  7. Cuocere i vetri in un forno a 60 °C per garantire una solida adesione delle sezioni ai veglietti.
  8. Deparafinizza le sezioni tramite immersione nello xilene e reidratale attraverso un gradiente discendente di etanolo (100%, 95%, 90%, 80% e 70%).
  9. Risciacquare le sezioni con PBS, eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina (HE) e montare le coperture usando resina neutra.
  10. Valutare la lesione polmonare su sezioni scansionate intere utilizzando un sistema di punteggio standardizzato basato sull'infiltrazione di neutrofili, infiammazione interstiziale, edema e congestione.
    NOTA: Ogni parametro è stato valutato da 0 a 4 in base all'entità del coinvolgimento patologico: 0 (nessuno); 1 (≤25%); 2 (26-50%); 3 (51-75%); 4 (>75%)28,29.

3. Saggio immunoenzimatico legato agli enzimi

NOTA: I campioni possono essere mantenuti a -80 °C se l'analisi non può essere eseguita immediatamente dopo l'acquisizione.

  1. Sciogliere gli standard e lasciarli a temperatura ambiente per 15 minuti, poi eseguire la diluizione seriale secondo le istruzioni del produttore.
  2. Prepara la soluzione di lavoro degli anticorpi biotinilati, la soluzione di lavoro con coniugati enzimatici, e il tampone di lavaggio come indicato nel manuale.
  3. Aggiungere 100 μL di ciascun campione o 100 μL di standard diluiti serialmente ai pozzi rivestiti di anticorpi, e incubare a 37 °C per 90 minuti.
  4. Lava il piatto 4 volte con una rondella per piatti, aggiungi 100 μL di soluzione attiva per anticorpi biotinilati e incuba a 37 °C per 30 minuti.
  5. Lava la piastra 4 volte, aggiungi 100 μL di soluzione lavorativa coniugata enzimatica e incuba a 37 °C per 30 minuti.
  6. Aggiungere 100 μL di soluzione di substrato per pozzo, incubare protetto dalla luce a 37 °C per 10 minuti.
  7. Aggiungi 100 μL di soluzione di stop per pozzo, mescola delicatamente e misura la densità ottica (OD) a 450 nm usando un lettore di microplacche.
  8. Genera una curva standard tracciando i valori OD rispetto alle concentrazioni standard utilizzando il software progettato.
  9. Determinare le concentrazioni del campione basandosi sui valori di OD misurati e sulla curva standard.

4. Preparazione di sospensioni a singola per il sequenziamento

NOTA: Dopo l'ottenimento del tessuto polmonare, deve essere messo sul ghiaccio e processato rapidamente per mantenere la vitalità cellulare.

  1. Lava il tessuto polmonare 3 volte con PBS pre-raffreddato a 4 °C.
  2. Aggiungi 2 mL di PBS pre-raffreddato e tritali ulteriormente in frammenti più piccoli usando forbici sterili fino a farli dimensionare circa 0,5mm 3 .
  3. Usa una pipetta Pasteur per trasferire il tessuto tritato insieme al PBS in un tubo centrifuga da 15 mL.
  4. Aggiungere un ulteriore 1 mL di PBS pre-raffreddato a 4 °C al vaso di coltura, risciacquare e risospendere i frammenti di tessuto rimanenti e trasferire la sospensione nello stesso tubo.
  5. Regolare il volume a 6,5 mL con PBS pre-raffreddato a 4 °C, digerire i frammenti di tessuto in una soluzione enzimatica contenente Collagenasi I (100 U/mL) e Dispase II (1 U/mL), e incubare con lievi scuotiti a temperatura ambiente per 30 minuti.
  6. Quando i frammenti di tessuto diventano traslucidi e non rimangono pezzi solidi distinti, filtrare il tessuto digerito attraverso filtri cellulari da 70 μm e 40 μm, poi centrifugare (4° C, 500 × g, 5 minuti) e scartare il soprantantante.
  7. Sospendi immediatamente il pellet in 3 mL di tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC), mescola delicatamente con pipetto e lisa sul ghiaccio per 10 minuti.
  8. Quando il soprantantante appare giallo pallido o quasi incolore, si aggiungono 7 mL di PBS per terminare la reazione, centrifuga (4 °C, 500 × g, 5 minuti) e si scarta il soprantantante.
  9. Aggiungere 3 mL di PBS per risospendere le cellule e determinare la concentrazione e la vitalità cellulare usando la colorazione con tripano blu.
    NOTA: Se la vitalità cellulare è inferiore al 70%, esegui una procedura di rimozione delle cellule morte.
  10. Lavare le cellule due volte con un tampone di lavaggio contenente albumina sirica bovina (BSA) allo 0,04% preparata in DPBS.
  11. Sospendere le cellule per il conteggio e regolare la concentrazione a 1.000 cellule/μL per il carico e la rilevazione successiva.

5. Controllo qualità per i dati di sequenziamento a singola cella

NOTA: Le librerie di RNA a singola cellula sono state preparate da sospensioni cellulari utilizzando un metodo di costruzione di librerie a singola cellula basata su gocce. Le librerie venivano sequenziate su una piattaforma ad alto rendimento utilizzando la chimica del sequenziamento basata su nanoball di DNA. Circa 21.000 celle sono state caricate per libreria, puntando a un tasso di recupero delle celle del ~60%. Il sequenziamento generava un totale di 5,0 × 108 letture per libreria, con una profondità media di 30.000-40.000 letture per cella. I dati grezzi del sequenziamento sono stati processati utilizzando la corrispondente pipeline di analisi dell'RNA a singola cellula per produrre la matrice di espressione genica per ogni campione.

  1. Costruire la libreria Oligo tramite PCR e marcatura con codici a barre, garantendo concentrazione >10 ng/μL e un picco di 180 pb ±10 pb.
  2. Costruire la libreria di cDNA tramite frammentazione, riparazione dell'estremità, legatura degli adattatori e PCR, assicurando una concentrazione >10 ng/μL e un picco di 350–550 bp.
  3. Genera un oggetto Seurat per ogni campione dalla matrice di espressione genica utilizzando la funzione Read10X nel pacchetto Seurat (v4.3.0) nel software R (v4.2.0).
  4. Rimuovere cellule di bassa qualità filtrando quelle con proporzione genica mitocondriale >10% o proporzione gene dell'emoglobina >5%.
  5. Normalizzare i dati usando il metodo "LogNormalize" con un fattore di scala di 10.000.
  6. Identificare caratteristiche altamente variabili utilizzando il metodo "vst" e mantenere i primi 2.000 geni per l'analisi a valle.
  7. Eseguire la valutazione del ciclo cellulare utilizzando i geni marcatori integrati di Seurat e regredire gli effetti del ciclo cellulare (G2M. Score e S.Score) durante la scalatura dei dati.
  8. Rilevare e rimuovere potenziali doppietti usando DoubletFinder (v2.0.3) con pN = 0,25, pK = 0,09 e un tasso atteso di doppio di 0,06, escludendo questi dall'ulteriore elaborazione.
  9. Effetti batch corretti tra i campioni usando il pacchetto Harmony (v0.1.1) con theta = 2 e max.iter.harmony = 20.
  10. Aggiungi colonne informative per nomi di campioni individuali e dettagli di raggruppamento del gruppo modello ARDS e del gruppo di controllo ai metadati nell'oggetto Serat.

6. Riduzione della dimensionalità, clustering e annotazione dei tipi di cella

  1. Eseguire analisi a componente principale (PCA) su geni altamente variabili utilizzando la funzione RunPCA in Seurat.
  2. Determina il numero ottimale di componenti principali tramite la visualizzazione ElbowPlot.
  3. Identificare i principali cluster di celle applicando l'algoritmo di Leiden tramite la funzione FindClusters e la funzione FindNeighbors di Seurat con una risoluzione di 0,1.
  4. Effettuare la riduzione della dimensionalità UMAP utilizzando i componenti principali selezionati.
  5. Annota i tipi cellulari identificando geni marcatori con la funzione FindAllMarkers.
  6. Visualizza l'espressione genica dei marcatori tra i tipi cellulari usando la funzione DotPlot.
  7. Aggiungi una nuova colonna informativa dei risultati delle annotazioni delle celle ai metadati e visualizza l'annotazione del tipo di cella con Umap.
  8. Calcola la proporzione di ciascun gruppo sperimentale all'interno di ciascun tipo di cellula identificato usando funzioni dplyr per contare le celle e calcolare le percentuali.
  9. Genera grafici a barre impilate con ggplot2 per illustrare la composizione dei gruppi per tipo di cella, inclusi etichetti percentuali e confronti statistici tra gruppi.

7. Analisi delle sottopopolazioni

  1. Estrarre la sottopopolazione delle cellule target utilizzando la funzione sottoinsieme e creare un oggetto Seurat corrispondente per l'analisi a livello di sottopopolazione a valle.
  2. Rinormalizzare e ridimensionare i dati della sottopopolazione mentre si fanno regressioni ai geni mitocondriali, ai geni dell'emoglobina, ai conteggi UMI e ai punteggi del ciclo cellulare.
  3. Eseguire un'analisi PCA secondaria e applicare la correzione batch di Harmony specificamente per la sottopopolazione.
  4. Effettuare ri-clustering utilizzando funzioni FindNeighbors e FindClusters per identificare sottotipi distinti all'interno delle sottopopolazioni di cellule target.
  5. Generare nuovi embeddings UMAP e visualizzare i cluster di sottopopolazione con annotazioni di tipo cellulare seguendo lo stesso approccio descritto in precedenza.

8. Analisi differenziale dell'espressione genica

  1. Identificare geni differenzialmente espressi (DEG) tra il gruppo modello ARDS e il gruppo di controllo per ciascun sottocluster utilizzando il metodo statistico MAST.
  2. Incorporare la regressione delle variabili latenti per controllare gli effetti di profondità di sequenziamento durante i test di espressione differenziale.
  3. Filtrare i DEG basandosi su soglie di cambiamento logaritarim predefinite e valori p regolati usando la funzione FindMarkers.
  4. Genera grafici vulcanici con la funzione ggplot per ogni sottoammasso per visualizzare i modelli differenziali di espressione genica con l'etichettatura di significatività.
  5. Esportare i risultati del DEG e creare tabelle riassuntive complete per facilitare l'arricchimento funzionale e altre analisi a valle.

9. Analisi dell'arricchimento

  1. Mappare i simboli genici agli ID ENTREZ usando l'org. Rn.eg.db database di annotazioni per la compatibilità dell'analisi dei percorsi.
  2. Combinare i DEG di tutti i sottocluster e filtrare geni significativi in base alle soglie di variazione logaritarime e ai valori p aggiustati (test di Wilcoxon rank-sum, logfc.threshold = 0,25, p_val < 0,05).
  3. Eseguire analisi di arricchimento tramite Ontologia Genica (GO) utilizzando la funzione di arricchimento GO con categorie di ontologie di Processo Biologico, Funzione Molecolare, Componenti Cellulari e metodo di correzione di Benjamini-Hochberg.
  4. Condurre l'analisi di arricchimento delle vie della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando la funzione di arricchimento KEGG con il database degli organismi ratti e applicare soglie di significatività statistica.
  5. Genera dot plot per i risultati di arricchimento GO e KEGG utilizzando la funzione dotplot, mostrando i primi 15 termini significativamente arricchiti con rapporti genici e valori p corretti.
  6. Esporta i risultati dell'arricchimento come file CSV e salva grafici di visualizzazione per un'interpretazione completa dell'analisi dei percorsi.

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Risultati

La colorazione HE del tessuto polmonare del ratto ha mostrato strutture alveolari chiare con infiammazione minima nei controlli, mentre il gruppo modello ARDS ha mostrato cavità alveolari distorte, pareti ispessite e significativa infiltrazione cellulare infiammatoria, come mostrato nei corrispondenti punteggi di lesioni polmonari (Figura 1A–E). Livelli elevati di IL-6, TNF-α e IL-1β in BALF e siero hanno confermato un successo nella modella...

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Discussione

Questo protocollo presenta un approccio standardizzato per l'analisi del sequenziamento dell'RNA a cellula singola del tessuto polmonare in un modello ratto della sindrome da difficoltà respiratoria acuta (ARDS). Questi risultati dimostrano l'istituzione con successo del modello ARDS indotto da LPS, come confermato da esame istopatologico, punteggi elevati di lesioni polmonari e livelli elevati di citochine infiammatorie in BALF e siero. L'analisi trascritomica a singola cellula ha rivel...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il sostegno del Progetto Orizzontale dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino (HX-DZM-202114).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione blu di tripano allo 0,4%Gibco, USA15250061
4% di paraformaldeideServicebio, CinaG1101
Albumina sierica bovina (BSA)Sangon Biotech, CinaA600332-0005
Collagenasi IYEASEN, Cina40507ES60
CurveExpertSviluppo di Hyamsv1.4
Dispase IIYEASEN, Cina40104ES60
Escherichia coli lipopolisaccaride (LPS) Sigma, USAL6511
Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)Solarbio, CinaG1120
Sequencer genetico ad alta produttività MGI Tech Co., LtdMGISEQ-2000RS
Inibitore della fosfatasiBeyotime Biotechnology, CinaP1081
Soluzione tamponata a fosfatoSolarbio, CinaP1020
PMSFSolarbio, CinaR0010
R software Lucent Technologies, USAv4.2.0
rat IL-1 e beta; Kit ELISA4abio, CinaCRE0006
kit rat IL-6 ELISA4abio, CinaCRE0005
ratto TNF-& alpha; Kit ELISA4abio, CinaCRE0003
Tampone per la lisi dei globuli rossi (RBC)Solarbio, CinaR1010
Buffer di lisi dei globuli rossiTiangen Biotech, CinaRT122-1
Acqua priva di RNasiAmbion, USAAM9937
TE buffer, pH 8.0Ambion, USAAM9858
Buffer di trasferimento tris-glicinaServicebio, CinaG2017

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