Articolo metodologico

Indagine dei meccanismi a livello di rete della stimolazione pallidale profonda del cervello utilizzando array di microelettrodi ad alta densità

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DOI:

10.3791/70507

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16 giugno 2026

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1Oscar Langendorff Institute of Physiology, University Medical Center Rostock, 2Institute of General Electrical Engineering, University of Rostock, 3Institute for Pharmacology, Pharmacy and Toxicology, University of Leipzig, 4Institute of Applied Microelectronics and Computer Engineering, University of Rostock

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per registrazioni ex vivo di array di microelettrodi ad alta densità da fette cerebrali cerebellari acute di un modello distonico di criceto ricevuto in vivo. Stimolazione cerebrale pallidale profonda continua per 11 giorni.

Abstract

La distonia è un disturbo neurologico del movimento caratterizzato da un controllo muscolare anomalo che influenza i movimenti volontari e le posture sostenute. Sebbene la distonia sia associata a una disfunzione dei gangli della base, le evidenze crescenti suggeriscono che il cervelletto sia coinvolto nella sua fisiopatologia. Questo protocollo presenta la stimolazione cerebrale pallidale profonda ( DBS) in vivo in un modello distonico di criceto (cricetodt sz ) combinato con registrazioni ex vivo di array di microelettrodi ad alta densità (HD-MEA) per indagare l'attività cerebellosa. Il protocollo include (1) chirurgia DBS per l'impianto di elettrodi e stimolatori, (2) preparazione acuta della fetta cerebellosa, (3) registrazioni elettrofisiologiche ad alta risoluzione e (4) analisi dei dati. I risultati rappresentativi indicano che 11 giorni di DBS pallidale hanno ripristinato l'attività dello spike a livelli normali negli strati molecolare, di Purkinje e granulari, coerente con il coinvolgimento della rete cerebellare nella distonia. Questo protocollo consente un'analisi dettagliata dell'attività cerebellare e della sua modulazione tramite DBS, fornendo una piattaforma per indagare i meccanismi a livello di rete alla base delle terapie di neuromodulazione.

Introduzione

La distonia è il terzo disturbo del movimentopiù comune 1, caratterizzato da segni e sintomi clinicidistinti 2,3, anche se a volte può essere scambiato per altri disturbimotori 4,5,6. Le caratteristiche cliniche più evidenti includono contrazioni muscolari involontarie, movimenti ripetitivi e postura anomala e/odistorta 7. Queste caratteristiche possono essere accompagnate da sintomi come dolore, prestazioni motorie compromesse e affaticamento, che possono peggiorare durante periodi di stress, ansia o stanchezzafisica 8,9,10,11. La fisiopatologia della distonia rimane ancora non del tuttocompresa 12,13. Sebbene gli studi si siano tradizionalmente concentrati sui gangli della base, ogni numero di evidenze supporta un concetto a livello di rete del disturbo, che coinvolge molteplici regioni cerebrali, inclusi ilcervelletto 14,15,16,17. Questo protocollo mira a indagare l'attività della rete extracellulare attraverso strati distinti della corteccia cerebellare per chiarire il loro ruolo nella fisiopatologia della distonia e comprendere i meccanismi a livello di rete della stimolazione cerebrale profonda (DBS).

La stimolazione cerebrale profonda (DBS) che prende di mira il globo pallido interno (GPi) o il nucleo subtalamico (STN) è spesso utilizzata per trattare alcune forme di distonia18,19, in particolare quelle resistenti ai farmaci. Inoltre, l'esito del trattamento è eterogeneo e imprevedibile, poiché i pazienti con manifestazioni cliniche simili possono rispondere in modo diverso allo stesso approccioterapeutico 20. Una comprensione più completa della rete neurale alla base della distonia potrebbe migliorare gli esiti del trattamento21. Pertanto, sono necessari approcci su larga scala e sperimentali, che possono essere raggiunti solo attraverso studi preclinici su modelli animali. Combinare esperimenti DBS in vivo con registrazioni ex vivo di array di microelettrodi ad alta densità (HD-MEA) consente un monitoraggio ad alta risoluzione dell'attività della rete neuronale (quasi) fisiologica per comprendere meglio la fisiopatologia della distonia e i meccanismi della DBS.

I gangli della base e il cervelletto influenzano ciascuno il controllo motorio, almeno in parte, attraverso le loro connessioni con la corteccia motoria primaria (M1)22. Uno studio anatomico con una lesione striatale e la rimozione chirurgica del cervelletto supporta questa idea23. Nel nostro studio utilizziamo il modello animale del criceto dtsz distonico 24,25, che presenta anomalie cerebellari associate alla distonia26. Utilizzando array di microelettrodi ad alta densità (HD-MEA), abbiamo indagato l'attività della rete corticale cerebellosa in criceti distonici e sani. Tuttavia, gli approcci elettrofisiologici convenzionali mancano della risoluzione spaziale per catturare dinamiche di rete specifiche per strato, mentre questo metodo affronta questa limitazione. D'altra parte, abbiamo indagato l'effetto della stimolazione cerebrale profonda nel globo pallido interno sulle reti corticali cerebellari.

Il sistema HD-MEA offre il vantaggio di registrazioni elettrofisiologiche dettagliate in parallelo, permettendo l'analisi attraverso gli strati della corteccia cerebellare (granulare, Purkinje e molecolare), con ciascuno strato che svolge un ruolo essenziale nell'elaborazione delle sequenze dimovimento 27. Lo strato granulare, densamente impacchiato di cellule granularie, riceve e trasmette informazioni sensoriali e motorie dalle fibre muschiose, permettendo l'integrazione iniziale del segnale prima di un ulterioreelaboramento 27. Lo strato di Purkinje, che contiene cellule di Purkinje, trasmette segnali inibitori ai nuclei cerebellari profondi, dove gli strati granulari e molecolari modulano il segnale in uscita. Lo strato molecolare, ricco di dendriti e interneuroni, supporta una modulazione complessa attraverso interazioni sinaptiche con le cellule di Purkinje, affinando l'outputmotorio 28. HD-MEA, a differenza di altre tecniche di registrazione, non è limitata dalla risoluzione spaziale o dall'area di campionamento, permettendo di catturare i contributi unici di ciascun strato nella dinamica neurale alterata osservata nella distonia15. Questo approccio offre una risoluzione spaziale superiore e capacità di registrazione parallela rispetto ai metodi a singolo elettrodo o a bassa densità. Esistono sistemi HD-MEA basati sulla tecnologia complementare metal-ossido-semiconduttore (CMOS)29,30, combinata con il concetto di Active Pixel Sensor (APS), che forniscono imaging funzionale per visualizzare l'attività elettrica di grandi popolazioni di neuroni neltempo 31,32. Con questa tecnica, la dinamica di ogni strato della corteccia cerebellosa può essere monitorata e processi specifici di trasmissione sinaptica possono essere investigati lavando con varie sostanze. Questo metodo è particolarmente adatto per studi che indagano l'attività complessa delle reti neuronali e le alterazioni specifiche per strati nei modelli di malattie neurologiche.

Questo lavoro affronta sfide tecniche riguardanti l'incapsulamento del sistema di stimolazione, nonché la preparazione dei tessuti, l'acquisizione di dati e l'analisi di un ampio dataset elettrofisiologico. Con questo lavoro, presentiamo un'opzione per l'indagine in vitro del processamento neuronale altamente complesso che, nel nostro caso, da un lato, contribuisce a una comprensione più differenziata della dinamica fisiopatologica nelle reti neuronali distoniche e, dall'altro, fornisce conoscenze sul meccanismo terapeutico d'azione della DBS.

Protocollo

Usa criceti dtsz distonici e controlla i criceti dorati siriani perl'esperimento 26. In totale, sono stati esaminati quattro gruppi sperimentali nel presente studio: (1) criceti controllati non distonici (tipo selvatico, WT), (2) criceti nativi dtsz non trattati, (3) dt sz-Sham (sottoposta a impianto ma senza stimolazione attiva) e (4) dtsz-DBS (con DBS continuo in vivo per 11 giorni prima della preparazione della fette). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la Direttiva UE 2010/63/UE e le leggi federali per la protezione degli animali, ai sensi della licenza 7221.3-1-029/20.

1. Animali

  1. Alloggiare gli animali nelle condizioni standard di GV Solas33 con un ciclo di luce di 14 ore e 10 ore di oscurità, e con libero accesso ad acqua e cibo (criceto a dieta standard, Altromin).
  2. Seleziona i criceti mutanti dtsz per sintomi distonici usando la tecnica della triplastimolazione 26, all'età di 20 ± 1 e 27 ± 4 giorni
    NOTA: Questa procedura standardizzata per stress lieve consiste nel rimuovere il criceto dalla sua gabbia di casa e trasferirlo in una nuova gabbia vuota, seguito da un'iniezione intraperitoneale o sottocutanea di soluzione salina e una privazione del sonno a breve termine. Questa sequenza di stimoli lievi che provocano ansia induce in modo affidabile attacchi distoni con latenza riproducibile ed è quindi utilizzata per lo screening fenotipico prima dell'inclusione nei gruppi sperimentali. I criceti di controllo non distonici sottopongono la stessa procedura per garantire condizioni sperimentali comparabili tra i gruppi.
  3. Per l'analgesia, trattare gli animali dei gruppi dt, sz-Sham e dt sz-DBS con metamizolo perorale (p.o.) a 100 mg·kg-1. Impiantare entrambi i gruppi secondo la procedura chirurgica descritta di seguito.

2. Incapsulamento del sistema di stimolazione STELLA

  1. I sistemi di stimolazione STELLA sono incapsulati utilizzando un approccio biocompatibile per proteggere i dispositivi dalla penetrazione di liquidi durante l'impianto cronico. L'elettronica è alloggiata in una capsula PETG stampata in 3D personalizzata.
    1. Sigilla tra il coperchio e la capsula usando silicone.
    2. Inoltre, sigilla la carcassa con silicone all'uscita del cavo.
    3. Se dopo l'asciugatura sono visibili degli spazi nel silicone, ripeti i passaggi 1 e 2.
    4. Dopo la completa solidificazione del silicone, preparare la resina epossidica a un rapporto di miscelazione di 100:35 (peso).
    5. Rimuovere le bolle d'aria dalla resina sotto vuoto (Vevor RS-1.5).
    6. Prima dell'assemblaggio dello stampo, applica uno strato sottile di vaselina sulla superficie di accoppiamento dello stampo in silicone personalizzato per migliorare la sigillatura e facilitare la deformazione dopo l'indurimento a resina epossidica. Inserire la capsula dello stimolatore nello stampo in silicone e riempire lentamente lo stampo con resina epossidica finché lo stimolatore e le giunzioni del cavo non saranno completamente coperte. Evita le bolle d'aria durante il riempimento del riempimento.
    7. Una volta che la resina è stata indurita, rimuovere la capsula dallo stampo e lisciare la superficie epossidica usando una lima fine o uno strumento lucidante per eliminare i bordi affilati.
    8. Applica un sottile rivestimento finale in silicone sopra la capsula epossidica polimerizzata immergendola in silicone liquido. Usa una pipetta di plastica per applicare ulteriore silicone intorno al cavo vicino all'area di giunzione. L'eccesso di silicone accumulato deve essere rimosso con un bastoncino prima di indurire, per evitare lo spessore del rivestimento.
    9. Infine, eseguire un test di funzionalità post-incapsulamento per verificare la corretta stimolazione prima dell'impianto o dell'uso sperimentale. Inserire il sistema di stimolazione STELLA nella soluzione di Ringer e attivare la funzione magnetica BIST. Confermare il corretto schema di lampeggiamento del LED (2 × 2), che indica la corretta stimolazione e l'assenza di cortocircuiti, circuiti aperti o condizioni di batteriabassa 34.

3. Procedura chirurgica per l'impianto di un sistema di stimolazione

  1. Preparare strumenti chirurgici (Figura 1) e il sistema di stimolazione STELLA (piattaforma modulare impiantabile definita tramite software) 34.
    1. Sterilizza gli strumenti metallici della Figura 1 per circa 5 minuti a 200 °C, ad esempio con lo Sterilizzatore FST 250. Nota che gli strumenti sono caldi quando li rimuovi.
    2. Disinfettare il sistema di stimolazione STELLA con i due elettrodi DBS con etanolo al 70%. Inserire il sistema di stimolazione asciutto in un Falcon (tubo conico da 50 mL) riempito con soluzione di Ringer durante la notte.
  2. Preparare l'animale (tra i 25 e i 32 giorni)
    1. Metti la camera di anestesia (fatta da casa) nella gabbia per criceti. Il criceto entrerà volontariamente nel tubo dopo poco tempo (Figura 2A).
    2. Quando il criceto è nel tubo, chiudi il tubo all'estremità e collega il tubo all'output di isoflurano volatile per 1-2 minuti (induzione di anestesia con isoflurano al 4%) (Figura 2B).
    3. Togli delicatamente l'animale dal cilindro. Metti l'animale sul sistema a temperatura controllata
      superficie (circa 38 °C) e con maschera respiratoria (GM-4; mantenimento dell'anestesia con isoflurano al 3%; profondità di test dell'anestesia con riflesso interdigitale).
    4. Radere l'area chirurgica della testa con un apposito tagliacapelli (Figura 2C). Pulire l'area con un tampone umido e iniettare 500 μL di bupivacaina allo 0,25% sottocutaneo (s.c.) sul cuoio capelluto per un'anestesia locale aggiuntiva del periostio. Aspetta almeno 5 minuti prima di aprire il cuoio capelluto.
    5. Trasferire l'animale con cura nel telaio stereotassico e fissarlo con le barre auricolari in modo che bregma e lambda siano alla stessa altezza (ridurre l'isoflurano all'1,5–2,5% per mantenere l'anestesia).
    6. Proteggi gli occhi con un sostituto lacrimale (TVM Ocry-Gel).

4. Impiantare il sistema di stimolazione STELLA

  1. Fai un'incisione cutanea lunga 2 cm medialmente sul cuoio capelluto. Un retrattore (Figura 1, n. 14 e Figura 2D) tira via la pelle. Prepara il cranio rimuovendo localmente il periosto con la lama grattandola. Fermare eventuali sanguinamenti con i tamponi.
  2. Applica il 3% diH 2O2 con un applicatore a punta di cotone per la ruvida.
  3. Prendi il sistema di stimolazione dalla soluzione di Ringer e proteggi gli elettrodi DBS con parafilm.
  4. Inserisci un paio di forbici smussate attraverso l'incisione cutanea appena fatta sulla testa e forma una tasca cutanea di 5 cm sottocutaneamente verso collo e fianco.
  5. Inserisci lo stimolatore, che è stato rimosso dal Falcon e immerso nella disinfezione dermica.
  6. Applicare circa 500 μL di antibiotico (10 mg·g-1 acido fusidico) sulla tasca cutanea con un applicatore a punta di cotone.
  7. Forare due fori da 7 mm (con FST#19007-07) nel cranio per gli elettrodi DBS a AP: −0,6 mm e ML: ± 2,2 mm secondo il bregma.
  8. Forare altri due fori (9 mm; FST#19007-09) lateralmente su ciascun foro per elettrodo. Avvita quattro viti (DIN 84 A2 M1x2) nei fori preparati (Figura 2D).
  9. Impiantare due elettrodi DBS (SNEX-100) con DV: 6,0 mm secondo il bregma. Si prega di notare che il portaelettrodo del tuo specifico telaio stereotassico determina quale lato viene impiantato per primo l'elettrodo (la distanza tra gli elettrodi è di 4,4 mm).
  10. Fissa l'elettrodo con un legame di polimerizzazione alla luce UV (Heliobond) alle due viti. Quando entrambi gli elettrodi vengono impiantati, viene applicato tra di essi uno strato finale con legame di polimerizzazione della luce UV. Infine, gli elettrodi vengono cementati con il flusso Compoglass (Figura 2E).
  11. Attivare magneticamente lo stimolatore del gruppo DBS dopo almeno tre giorni di recupero per 11 giorni continui di DBS. In questo studio, abbiamo utilizzato parametri di stimolazione simili a quelli impiegati nelle cliniche (130 Hz, 50 μA e 60 μs).
  12. Controlla il pattern luminoso dello stimolatore passando ogni giorno sul fianco del criceto con un magnete (Figura 2F).

5. Preparazione di fette cerebellari acute

  1. Prepara 1 L di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) e 0,5 L di saccarosio per ogni animale (vedi Tabella 1 e Tabella 2 per i dettagli).
  2. Utilizzare la soluzione di saccarosio a circa 4 °C durante l'estrazione e la tagliatura del cervello, con carbogenazione continua. Inoltre, prepara una saccarosio gelida per mantenere una bassa temperatura tissutale durante la sezionazione rapida.
  3. Prepara il luogo di lavoro con strumenti per la dissezione, soluzione di saccarosio, piastre di Petri e installazione di vibratomi (vedi Figura 3A).
  4. Il sacrificio degli animali deve avvenire entro circa 15 minuti dall'off-DBS, e l'estrazione del cerrebello deve iniziare immediatamente dopo. Decapitare l'animale in anestesia profonda indotta con isoflurano volatile. Metti la testa in una piastra di Petri più alta riempita di saccarosio gelato e saccarosio.
  5. Dissezionare il cervello evitando tagli mediali attraverso il canale spinale per proteggere il tessuto cerebeloso dai danni.
  6. Trasferire il cervello in una nuova piastra di Petri riempita con saccarosio gelato e saccarosio, con una carta filtro sul fondo per evitare che il cervelletto scivoli durante la sezione.
  7. Per prima cosa, rimuovere il cervelletto tramite il taglio coronale del ponte con una lama (Figura 3B). Successivamente, rimuovere gli emisferi cerebellari tramite tagli parasagittali con una lama (Figura 3C).
  8. Prepara la piastra vibratome con una goccia di supercolla. Rimuovere con attenzione il vermis cerebellare dalla piastra di Petri. Tampona la pialla della sezione parasagittale su una carta filtrante per asciugare prima di incollare questo lato (Figura 3D).
  9. Metti la piastra del vibratome nella vaschetta e riempila con abbastanza saccarosio (metà spill, metà soluzione) da immergere completamente i vermi. Non dimenticare di gassare carbogeni (CB).
  10. Tagliare le tagli cerebellari parasagittali con uno spessore di 200 μm a una velocità costante di 0,08 mm·s-1 (Figura 3E). Conservare le fette in ACSF in un becher costantemente gassatto con CB a temperatura ambiente (Figura 3F).
  11. Lasciare che le fette si rigenerino in ACSF gasseggiato a temperatura ambiente per circa 40 minuti prima del trasferimento nell'HD-MEA, che funge da periodo di riscaldamento e stabilizzazione prima della registrazione. Durante questo periodo, mantenere l'ACSF a temperatura ambiente.

6. Preparazione del pozzetto singoloCorePlate TM del sistema BioCAM DupleX MEA per la registrazione

  1. Attiva il sistema di registrazione BioCAM DupleX con il software Brainwave 5 (BW5) almeno 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti.
  2. Prima di posizionare la fetta di tessuto sulCorePlate TM Single-Well per la registrazione, valuta il livello di rumore di fondo inserendo il singolo pozzo nell'impianto di registrazione. Il livello di rumore ottimale per una registrazione di alta qualità dovrebbe essere di 9-20 μV.
  3. Pulire i tamponi placcati in oro con etanolo al 100% (Figura 4A-1), la matrice di elettrodi con il 70% di etanolo e una spazzola morbida (Figura 4A-2). Infine, risciacquare la matrice di elettrodi con acqua MilliQ.
  4. Collega il Single-Well HD-MEA/CorePlate TM al sistema di registrazione (Figura 4D-1).
  5. Pipetta circa 2 mL ACSF nel pozzo. Assicurati che non ci siano bolle d'aria sugli elettrodi o sul terreno (Figura 4D-2).
  6. Inizia l'acquisizione dal vivo e registra per almeno 30 secondi con BW5.

7. Analizzare l'ampiezza picco a picco

  1. Per analizzare l'interfaccia del rumore, si apre il file registrato *.bxr, che contiene 30 secondi di registrazione intrinseca del rumore (generata dai componenti resistivi degli elettrodi e dei circuiti amplificatori).
  2. Seleziona "Activity Map" e, sotto "Metric", scegli Ampiezza picco-picco. La scala è impostata a 500 μV, permettendo la visualizzazione della variabilità del segnale attraverso l'array di elettrodi (Figura 5A).
  3. Nella finestra "Activity Map", posiziona il puntatore del mouse sopra l'elettrodo registrato per visualizzare il valore di ampiezza "Well Wide Medium".
  4. In alternativa, puoi determinare il valore medio dell'ampiezza creando un file Excel (*.xlsx) sotto "Esportazione Grafo." Poi apri quel file Excel e calcola il valore medio di ampiezza [=Media(Number1; Numero 2;...)].

8. Analizzare il rumore di base (deviazione standard del segnale)

  1. Analizza il rumore di base cliccando su "Riproduzione" per generare il file *.brw. Poi, seleziona "Activity Map" e sotto "Metric" seleziona "Deviazione standard". La scala è impostata automaticamente a 30 μV, permettendo la visualizzazione della variabilità del segnale attraverso l'array di elettrodi (Figura 5B).
  2. Nella finestra "Activity Map", passa il puntatore del mouse sull'elettrodo registrato per visualizzare la deviazione standard "Well Wide Mean".
  3. In alternativa, puoi determinare la deviazione standard media usando "Esportazione grafico" e creare il file Excel *.xlsx. Poi, apri il file Excel e calcola la deviazione standard media [=Media(Number1; Numero 2;...)].

9. Per valutare la qualità del segnale:

  1. Calcola il rapporto segnale-rumore (SNR)
    figure-protocol-1
    SNR ≥ 5: Buona qualità
    SNR tra 2 e 5: Qualità moderata
    SNR < 2: Scarsa qualità

10. Posizionamento a slice nel singolo pozzo CorePlate per l'acquisizione dati

  1. Con l'aiuto di una pipetta Pasteur, posizionare la fetta all'array di elettrodi in modo che la regione di interesse sia coperta dagli elettrodi di registrazione (Figura 4 B-1). Rimuovere la soluzione dal pozzo (Figura 4 B-2). Fai una foto con un microscopio verticale.
  2. Fissa il tessuto con l'ancoraggio della fetta (Figura 4C).
  3. Usando una pipetta Pasteur da 3 mL, aggiungi una goccia di ACSF alla fetta.
  4. Rimuovere il liquido usando una pipetta Pasteur con un volume minore. Rimuovere il liquido rimanente con un foglio di carta contorto (ripeti 7-10 volte) (Figura 4C-2).
  5. Per la perfusione durante le registrazioni, usa ACSF a temperatura ambiente e imposta la frequenza a 2 mL·min-1. La posizione di afflusso è sopra la fetta di tessuto, mentre l'uscita è alla parete del pozzo (Figura 4D).
  6. Si raccomanda una messa a terra aggiuntiva dell'afflusso e dell'uscita per minimizzare il rumore indotto dalla perfusione, che può essere ottenuta collegandoli al sistema di registrazione tramite un filo (Figura 4D-1).
  7. Per ridurre i disturbi, spegni il microscopio e le luci della stanza.

11. Registrazioni dell'attività di rete con ilCorePlate TM Single-Well

  1. Imposta i parametri di registrazione a una frequenza di campionamento di 20.000 Hz con un filtro passa-alto a 100 Hz.
    1. Sul software BrainWave 5, vai su File e apri una nuova sessione di registrazione.
    2. Clicca su "Fonte".
    3. Apri: chip pilot e seleziona per le seguenti regolazioni:
      Registrazione dell'attività neurale spontanea a una frequenza di campionamento: 20.000 Hz/elettrodo.
      Taglio hardware del filtro passa-alto: 100 Hz.
      Velocità di compensazione della luce: breve (stimolazione diretta della luce).
  2. Per selezionare il canale di calibrazione del chip e il tipo di traccia grezza.
    1. Apri: Segnale di controllo, e seleziona: Sulla calibrazione interna del chip, seleziona canale di uscita: 1.1.
    2. Clicca su "+" e "Grafico".
    3. Aperto: impostazione grafica.
    4. Seleziona le tracce grezze: grezze e punte.

12. Inserire e allineare l'immagine del microscopio sulla mappa di attività

  1. Clicca su "+".
  2. "Overlays and Annotations" per inserire l'immagine del microscopio nella mappa di attività su BW5:
  3. Vai a livelli di pozzo:
    1. Seleziona la gestione degli strati e l'immagine del cerrebello.
    2. Allinea il livello immagine selezionato: clicca su Start.
    3. Clicca sui quattro angoli dell'immagine seguendo la sequenza numerica e applica.

13. Impostazione della compressione dati prima della registrazione

  1. Per comprimere i dati, vai alla prima pagina di RECORDER:
    1. Modalità cockpit: avanzata
    2. Salva compressa grezzo: compressione wavelet + eventi: picchi.
    3. Riproduci per 10 minuti prima di iniziare la registrazione.
  2. Pulisci i pad placcati in oro con etanolo al 100% dopo aver terminato le registrazioni. Poi, riempi il pozzo con acqua pura e spazzola per 30 secondi.
  3. Successivamente, riempi il pozzo con etanolo al 70% e spazzola delicatamente la matrice di elettrodi per circa 30 secondi. Infine, riempi il pozzo con acqua pura e spazzola delicatamente per 30 secondi (ripeti questo passaggio 2 o 3 volte).
  4. Tieni ilCorePlate TM Single-Well asciutto nel contenitore appropriato.

14. Analisi offline dei dati registrati

  1. Apri il file desiderato con il BW5.
  2. Dividere la corteccia cerebellare in tre gruppi selezionando elettrodi in base all'assegnazione degli strati anatomici (strato molecolare, strato cellulare di Purkinje, strato cellulare granulare).
    NOTA: Il numero di elettrodi all'interno delle regioni di interesse (ROI) per strato dipendeva dall'attività spontanea rilevata in ciascun strato e quindi variava tra le registrazioni. Tipicamente, sono stati analizzati 25-250 elettrodi per ROI da una singola fetta. Gli elettrodi situati in regioni che si estendono su due strati anatomici sono stati esclusi per evitare ambiguità nell'assegnazione degli strati. Solo elettrodi chiaramente attribuibili a uno specifico strato cerebellistico sono stati inclusi per ulteriori valutazioni.
    1. Selezione e raggruppamento: Vai ai gruppi di unità.
    2. Su Gestisci gruppi di unità, clicca su "+" per formare un gruppo e nominarlo.
    3. Per includere altri elettrodi nel gruppo, seleziona gli elettrodi e clicca su "aggiungi o rimuovi unità selezionate".
  3. Analizza le tracce grezze utilizzando il metodo di rilevamento degli spike, noto come rilevamento preciso a temporizzazione (PTSD). Si concentra sul rilevamento di massimi e minimi relativi con ampiezze picco a picco che superano una soglia predefinita, garantendo un'identificazione precisa e accurata degli spike.
    1. Elaborazione dati: vai su Rilevamento picchi e imposta la modalità su avanzata.
    2. Usa i dati da: Raw.
    3. Algoritmo: PTSD (Rilevamento preciso degli spike temporali).
    4. Fattore di deviazione standard: 8,0.
    5. Periodo di massima vita: 2,0 ms.
    6. Periodo refrattario: 1,0 ms.
    7. Assegnazione dello spike: picco negativo.
    8. Durata dell'onda prima del picco: 1,0 ms.
    9. Durata post-picco dell'onda: 1,5 ms.
  4. Vai su Spike sorting e imposta la modalità su avanzata. Regola il seguente parametro:
    1. Durata pre-picco dell'onda: 0,5 ms.
    2. Durata post-picco dell'onda: 1,0 ms.
    3. Algoritmo di estrazione delle caratteristiche: momenti Legendre.
    4. Numero di caratteristiche: 3.
    5. Algoritmo di clustering: K-Means & Silhouette.
    6. Numero minimo di picchi per cluster: 20.
    7. Numero massimo di cluster: 3.
    8. Soglia di scaletta: 2.
  5. Esportazione dei dati in Excel.
    1. Clicca su "Grafica".
    2. Vai su Esportazione Grafico.
    3. Seleziona il foglio di calcolo ed esporta.

Risultati

La DBS pallidale ha aumentato il numero di picchi a livelli normali negli strati corticali tra i gruppi.

Abbiamo analizzato il numero totale di spikes in tre strati della corteccia cerebellare — strato molecolare (ML), strato cellulare di Purkinje (PL) e strato cellulare granulare (GL) — in quattro gruppi sperimentali: wild-type (WT, N = 8), dtsz (N = 8), dtsz-Sham (N = 7) e dtsz-DBS (N = 7), con analisi effettuate su fette ottenute da questi animali.

Mentre il tessuto distonico (dt sz) generava picchi significativamente inferiori, la DBS pallidale ha aumentato il numero di picchi a livelli paragonabili a quelli dei controlli sani (Tabella 3). Il test Kruskal-Wallis H ha ulteriormente confermato ciò, mostrando un aumento statisticamente significativo del numero di picchi nel ML per il gruppo DBS dtsz rispetto sia ai gruppi dtsz che dt sz-Sham (χ2(3) = 20,728, p = 0,001; Figura 6A). Il gruppo dtsz-DBS ha mostrato anche un aumento simile di picchi in PL (χ2(3) = 16,855, p = 0,001; Figura 6B) e GL (χ2(3) = 13.164, p. = 0.004; Figura 6C), raggiungendo valori comparabili a quelli del gruppo WT (Tabella 3).

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Figura 1. Panoramica degli strumenti chirurgici. L'immagine mostra un vassoio disposto contenente un set di strumenti chirurgici e microchirurgici progettati esplicitamente per procedure che prevedono l'impianto di elettrodi profondi e stimolatori. Gli strumenti sono organizzati in ordine sequenziale di utilizzo, migliorando l'efficienza procedurale. Vengono applicate su un tessuto per mantenere la pulizia e garantire un facile accesso durante la procedura. Questo sistema si concentra su precisione, sterilità e prontezza per flussi di lavoro chirurgici complessi. (1) Forbici smussate/smussate, (2) Forbici per sutura, (3) Forbici affilate/affilate, (4) Portaago, (5) Pinze per legare i punti, (6) Pinze scheggiate/curve, (7) Pinze seghettate, (8) Pinza standard corta, (9) Pinza standard, lunga, (10) Micro spatola, (11) Elettrodo riutilizzato, (12) Viti, (13) Accessori per trapano, (14) Punta/morsa del retrattore, (15) Blocco della cavità di vetro da riempire con 0,9% di NaCl e xilocaina. Per maggiori informazioni, consulta la lista dei materiali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Installazione sperimentale per l'anestetizzazione e il posizionamento dell'animale nell'apparato stereotassico per l'impianto degli elettrodi DBS e dello stimolatore. (A) L'animale viene delicatamente collocato all'interno di una camera di induzione su misura per iniziare l'anestesia. (B) La camera di induzione è collegata a una maschera respiratore per garantire una corretta somministrazione dell'anestesia (induzione con isoflurano al 4%) mantenendo la sicurezza durante la manovrazione. (C) Una volta anestetizzato, l'animale viene trasferito su una piastra riscaldante con una maschera respiratoria collegata (mantenimento con isoflurano al 3%) per prevenire l'ipotermia e garantire un'anestesia continua durante la rasatura. (D) L'animale è posizionato con cura nel fotogramma stereotassico. Viene effettuata un'incisione longitudinale e vengono utilizzate pinze per ritrarre la pelle. Quattro punti indicano la posizione delle viti. Le viti vengono inserite nelle aree segnate e due punti aggiuntivi vengono segnati per il posizionamento degli elettrodi. (E) L'elettrodo viene inserito nel GPi e fissato con colla prima che il porta-tasso stereotassico venga rimosso. Per una migliore fissazione, si applica cemento intorno agli elettrodi. Suture longitudinali interrotte sono utilizzate per chiudere il sito chirurgico e (F) lo stimolatore viene posizionato nell'area sottocutanea del fianco dell'animale. L'animale rimane vivo dopo l'intervento chirurgico e la freccia indica la posizione dello stimolatore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Illustrazione della sezione e taglio del cervello. (A) strumenti chirurgici per la procedura di dissezione. (1*) Piastra di Petri d'agar fatta in casa, (2*) piastra di Petri d'agar, (3*) pinza che fissa il tubo di carbogeni, (4*) filtro di carta, (5*) lama, (6*) supercolla, (7*) piastra o porta-vibratome, pinze curve, (9*) forbice, affilata/smussata. (B) Preparazione del campione cerebrale: dopo la dissezione, il cervello viene tagliato e le linee tratteggiate indicano l'orientamento della sezionazione del piano coronale. (C) Sezionamento parasagittale: il cervello viene tagliato lungo il piano parasagittale specificato. (D) Fissazione del tessuto: Il tessuto cerebrale risultante viene fissato a una piastra o supporto con colla per fissarlo e una sezionamento preciso. (E) Sezionamento vibratome: La piastra con tessuto attaccato viene trasferita in un vibratome, dove si ottengono fette ultra-sottili (200 μm). (F) Tagli finali: Vengono prodotti slice parasagittali cerebellari precisi, pronti per la registrazione elettrofisiologica35. Per maggiori informazioni, consulta la lista dei materiali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Esempio dei passaggi per ottenere una buona attività cellulare. (A) Pulizia: Questo passaggio prevede la preparazione dell'HD-MEA pulendo la sua superficie per assicurarsi che nessuno sporco interferisca con l'attacco (touchpad, A-1) o il processo di registrazione (area piatta, A-2). (B) Posizione del taglio: La fetta di tessuto è posizionata con cura sull'HD-MEA (B-1), garantendo un corretto allineamento per un contatto efficace con l'elettrodo (B-2). Una punta sottile della pipetta (freccia) viene utilizzata per rimuovere l'ACSF rimanente, permettendo di inserire l'ancora. (C) Attacco della fette: la fetta è posizionata in modo sicuro sull'HD-MEA usando l'ancoraggio. In questo passaggio, è fondamentale posizionare una goccia di ACSF e poi rimuovere con cura l'eccesso di liquido usando una pipetta (C-1; freccia) e un pezzo di carta di precisione (C-2) attorcigliato. Questo garantisce che la fetta rimanga stabile e ben collegata agli elettrodi per una registrazione accurata. (D) Perfusione: Infine, viene collegato e avviato un sistema di perfusione per mantenere la vitalità della fetta tissutale durante l'esperimento, dove l'afflusso deve essere posizionato sopra la fetta e l'uscita vicino alla parete (D-2). È inoltre essenziale rimuovere tutte le bolle dal terreno per minimizzare il rumore durante la registrazione (indicato dalla freccia). Una messa a terra aggiuntiva è collegata sia al tubo di ingresso che a quello di uscita (D-1). Le barre delle scaglie rosse sono lunghe 1,5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. Metriche per ampiezza e deviazione standard nelle registrazioni HD-MEA utilizzando il software Brain Wave 5 (BW5) per valutare la qualità del segnale. (A) Metrica di ampiezza picco-picco selezionata per estrarre i valori intrinseci dell'ampiezza degli elettrodi (scala: 500 μV). (B) Metrica di deviazione standard selezionata per quantificare il rumore di base tra elettrodi (scala: 30 μV). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Effetti della DBS pallidale sull'attività degli spike attraverso gli strati corticali cerebellari: (A) strato molecolare (ML), (B) strato cellulare di Purkinje (PL) e (C) strato granulare (GL). I grafici Box-Whisker mostrano la media e la mediana con una linea trasversale e orizzontale, rispettivamente, insieme al 25° e 75° percentile. I rispettivi gruppi sono tipo selvaggio (WT, n = 22 fette), dtsz senza intervento chirurgico (n = 20 fette), dtsz DBS inattivo (Sham, n = 20 fette) e dtsz-DBS attivo (n = 20 fette). La significatività statistica è stata determinata utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito dai confronti a coppie di Dunn (*p .< 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

NomePeso molecolare [g/ mol]Concentrazione finale [mol/ l]
NaCl58.440.124
KCl74.550.003
Glucosio180.160.01
CaCl2 (senza acqua)110.980.0025
NaHCO384,0070.026
NaH 2PO4119.980.00125
pH7,35 a 7,40 (regolabile con HCl)
Osmolalità [mosmol/ kg]290 a 300

Tabella 1: Soluzione di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF): Composizione e concentrazioni molari finali dei componenti utilizzate per preparare l'ACSF per esperimenti sulla fetta cerebellare. Il pH è stato regolato a 7,35–7,40 con HCl, e l'osmolalità è stata mantenuta tra 290–300 mOsm·kg-1.

NomePeso molecolare [g/mol]Concentrazione finale [mol/L]
Saccarosio342.300.075
KCl74.550.0025
NaCl58.440.087
CaCl2 (senza acqua)110.980.0005
MgCl295.210.007
Glucosio180.160.01
NaHCO384.010.025
NaH 2PO4119.980.00125
pH7,35 a 7,40 (regolabile con HCl)
Osmolalità [mosmol/ kg]320 a 330

Tabella 2: Soluzione di saccarosio. Composizione e concentrazioni molari finali della soluzione di saccarosio utilizzata durante la preparazione della fetta cerebellosa. Il pH è stato regolato a 7,35–7,40, e l'osmolalità è stata mantenuta tra 320–330 mOsm·kg-1.

Gruppi:WTDTSZ dtsz-ShamDTSZ-DBS
n22202020
Coefficiente di varianza
ML0.530.550.60.35
PL0.570.570.520.46
GL0.480.660.610.51
Numero di punte
ML287240±32605163434±19998234209±31284345915±27113
PL413223±50171194277±24786304568±35692412707±42509
GL390817±40139211274±31193325533±44318373208±42220

Tabella 3: Riepilogo delle metriche di picco tra gli strati cerebellari e i gruppi sperimentali. WT – criceti di tipo selvatico, non distonici controllati; DTSZ - criceti nativi DTSZ; DTSZ-DBS - CRICETI DTSZ stimolati continuamente per 11 giorni; dtsz-Sham - criceti dtsz sottoposti all'intervento, tuttavia, senza DBS attivo; ML – strato molecolare; PL – strato cellulare di Purkinje; GL. – strato cellulare granulare.

Discussione

Abbiamo descritto un approccio metodologico per indagare i meccanismi della stimolazione cerebrale profonda (DBS) nella rete neuronale distonica patofisiologica nel cricetodt-sz . I passaggi critici includono l'impianto preciso di elettrodi, la rapida preparazione della tazza cerebellare e condizioni stabili di registrazione HD-MEA per garantire un'acquisizione affidabile dei dati. Dimostriamo la procedura chirurgica, la preparazione delle tacce cerebellari, le tecniche di registrazione e analisi per esplorare l'attività cerebellare ex vivo e la sua modulazione tramite DBS. Le misurazioni elettrofisiologiche con HD-MEA hanno fornito registrazioni in tempo reale dell'attività spontanea cerebellista con alta risoluzione temporale espaziale 36, che riteniamo necessarie per indagare i meccanismi della stimolazione cerebrale pallidale profonda nel trattamento della distonia.

La distonia è attualmente nota come un disturbo di rete caratterizzato da output motorio anomalo derivante da interazioni disfunzionali tra gangli basali, cerrebelli e circuiticorticali 37,38. È stato dimostrato che le anomalie cerebellari svolgono un ruolo significativo nella distonia, come supportato sia da studi clinici chesperimentali 15,22,39. Inoltre, uno studio anatomico che prevede l'iniezione del virus della rabbia retrograda (RV) nella corteccia cerebella delle scimmie di Cebus mostra che il nucleo subtalamico dei gangli della base ha una sostanziale proiezione verso la cortecciacerebella 40. Questi risultati sottolineano l'importanza di esplorare i circuiti cerebellari insieme alle reti ganggliosi della base nello studio dei meccanismi terapeutici della DBS 40,41,42. Questo metodo è particolarmente adatto per studi che indagano le interazioni neuronali e gli effetti di neuromodulazione nei disturbi del movimento.

Per quanto riguarda i meccanismi a livello di rete della DBS pallidale, studi hanno dimostrato che la DBS del segmento interno del globo pallido (GPi) induce ampi cambiamenti nell'attività cerebrale, non solo all'interno dei gangli basali ma anche attraverso regioni interconnesse come la retecortico-striatale 43, il talamo44 e il cervelletto15. Queste osservazioni supportano l'ipotesi che la DBS pallidale possa modulare l'attività in tutta la rete gangliare-cerebellare basale, contribuendo alla sua efficacia terapeutica nella distonia. Ciò dimostra la necessità di studi preclinici per indagare i meccanismi DBS e il vantaggio delle registrazioni HD-MEA nel catturare cambiamenti elettrofisiologici a livello di rete. Inoltre, lo studio di Kotyra et al. (2025) supporta la presenza di rimodellamento neuroplastico duraturo indotto da GPi-DBS a lungo termine all'interno della rete motoriadistonica 45. I risultati in vivo hanno mostrato che la stimolazione pallidale ha progressivamente ridotto la gravità della distonia nei cricetidt sz e che l'effetto benefico persisteva dopo la sospensione della stimolazione, suggerendo che gli effetti indotti dalla DBS non sono limitati solo alla stimolazioneacuta 45. Inoltre, recenti studi elettrofisiologici hanno dimostrato la modulazione a livello di rete della plasticità sinaptica e dei modelli di picco dopo DBS a lungo termine, inclusa un aumento dell'attivitàcerebellare 15, un input eccitatorio aumentato ai neuroni talamici motori e un input eccitatorio più raggruppato verso la M1 corticalM146.

I risultati rappresentativi indicano un impatto a livello di rete della stimolazione cerebrale profonda (DBS), come dimostrato dalla normalizzazione dell'attività degli spike negli strati molecolare, cellule di Purkinje e cellule granulari della corteccia cerebelosa nei criceti distoni (Figura 6). L'aumento dell'attività di picchi osservato nel gruppo DBS dtsz ha raggiunto livelli paragonabili ai controlli di tipo selvatico. Questa normalizzazione dell'attività dello spike supporta il potenziale terapeutico della DBS nel trattamento della distonia. In particolare, il gruppodt sz-Sham ha mostrato valori intermedi di picco rispetto al gruppo WT su tutti gli strati cerebellari, suggerendo che l'impianto di elettrodi da solo possa influenzare l'attività della rete cerebellosa. Questa interpretazione è coerente con l'effetto della microlesione descritto clinicamente nella distonia, dove l'impianto di elettrodi stesso può migliorare temporaneamente i sintomi prima dell'insorgenza dellastimolazione 47. Sebbene il criceto DTsz riproduca caratteristiche chiave della distonia parossistica generalizzata, non riflette pienamente l'eterogeneità clinica osservata tra le sindromi di distonia umana. Pertanto, bisogna prestare attenzione nel tradurre questi risultati nella distonia umana.

Questo lavoro affronta sfide tecniche legate all'incapsulamento degli stimolatori, alla chirurgia DBS, alla preparazione delle fette e all'analisi su larga scala dei dati elettrofisiologici. La combinazione della tecnologia HD-MEA basata su CMOS fornisce una piattaforma robusta per l'indagine in vitro di interazioni neuronali altamentecomplesse 48. I nostri risultati contribuiscono a una comprensione più sfumata delle dinamiche fisiopatologiche alla base della distonia, offrendo preziose intuizioni sui meccanismi a livello di rete della terapia DBS. Facilitare un'analisi funzionale dettagliata di specifiche regioni cerebrali e delle loro interazioni contribuisce a una comprensione più differenziata delle dinamiche fisiopatologiche nelle reti neuronali distoniche e, d'altra parte, fornisce una comprensione del meccanismo terapeutico d'azione della DBS.

In questo studio, problemi tecnici hanno portato a un aumento del rumore di fondo e hanno interrotto l'acquisizione stabile del segnale durante le registrazioni HD-MEA. I passaggi comuni di risoluzione dei problemi includono l'intervento delle fonti di rumore, l'assicurazione di una corretta messa a terra e il mantenimento stabile del contatto tessuto-elettrodo. In caso di alti livelli di rumore o misurazioni instabili, si dovrebbero prima controllare la messa a terra, le connessioni dei cavi e i dispositivi elettrici vicini. Le bolle d'aria sulla matrice di elettrodi possono anche compromettere il contatto tessuto-elettrodo e la stabilità della registrazione e devono essere rimosse con attenzione (Figura 4). Inoltre, è necessario garantire una trasmissione stabile dei dati dall'amplificatore al computer tramite un cavo USB-C-USB-C di alta qualità. Gli elettrodi con rumore persistente devono essere esclusi da ulteriori analisi. Sebbene la registrazione dei segnali extracellulari con HD-MEA permetta un'elevata risoluzione spaziale dell'attività della rete e, insieme all'immagine microscopica sovrapposta, l'assegnazione ai singoli strati della corteccia cerebellare, non si può escludere che l'attività extracellulare rilevata sia stata generata dall'incrocio degli assoni da uno strato diverso da quello assegnato. Inoltre, sono state effettuate analisi statistiche a livello di fetto, poiché ogni fetta rappresentava una registrazione elettrofisiologica indipendente in condizioni sperimentali standardizzate, anche se alcune fette provenivano dallo stesso animale.

Durante la DBS, possono verificarsi ulteriori problemi dovuti all'allentamento dell'elettrodo o a un difetto tecnico nello stimolatore. Per minimizzare questi problemi, assicurati una corretta fissazione degli elettrodi e mantieni condizioni di manipolazione sterile durante tutta la procedura. Questo è avvenuto nel 5% di tutti gli studi presenti nel presente studio. Per minimizzare l'allentamento degli elettrodi, la superficie del cranio deve essere asciugata prima di fissare l'elettrodo con adesivo o cemento dentale per migliorare l'adesione e prevenire lo scivolamento. Per garantire la sterilità ed evitare contaminazioni meccaniche, lo stimolatore, la punta dell'elettrodo e il filo monofilamento devono essere maneggiati solo con pinze o pinze per emostasi. Inoltre, i guanti devono essere disinfettati con etanolo e asciugati prima di maneggiare l'animale per ridurre al minimo il rischio di infezione. La rapida preparazione delle fette cerebrali cerebellari è essenziale per registrazioni elettrofisiologiche di alta qualità. Tuttavia, ciò significava che la posizione degli elettrodi DBS impiantati non poteva essere verificata post-hoc. In un altro studio che ha indagato l'effetto di diversi parametri di stimolazione sulla gravità della distonia nel dtsz-Hamster, sono stati utilizzati gli stessi elettrodi di stimolazione e tecniche chirurgiche. Qui siamo riusciti a confermare la corretta posizione dell'elettrodo nel 94% delleprove 37.

In conclusione, questo protocollo offre una piattaforma potente per studiare i meccanismi elettrofisiologici della DBS e contribuisce con preziose informazioni sul suo meccanismo d'azione. Il criceto dtsz consente in modo unico studi preclinici sugli effetti pallidali della DBS sul fenotipo distonico, insieme alla registrazione ex vivo ad alta risoluzione dell'attività della rete neuronale. I nostri risultati supportano il concetto di coinvolgimento cerebellare nella distonia e sottolineano l'importanza dell'analisi a livello di rete nella comprensione e ottimizzazione delle terapie di neuromodulazione.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato dalla Fondazione Tedesca per la Ricerca (DFG) all'interno del Centro di Ricerca Collaborativa (SFB 1270/1,2 ELAINE 299150580).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3% H2O2Caelo15301730
50 ml conical tubeGreiner Bio-OneTubo conico tipo Falcon
Agar Petri dishHandmade 
Anaesthesia UnitBioMedical InstrumentsUniventor 1200
BioCam DupleX3BrainBioCAM DupleXPiattaforma CMOS-HD-MEA
Blade (5*)Apollo Herkenrath09-025-056
Brainwave Software 53BrainVersion 5Piattaforma CMOS-HD-MEA
Breathing maskNarishigeGM-4
Bulk Fill Flowable: Compula RefillDentsply Sirona267-0195Per cemento
Capsule Dispenser Gun Dentsply Sirona296-0003Per cemento
CarbogenAir LiquideAir Liqiuide (House system)
Cavity Block GlassAIMAIM40 mm x 40 mm
Clamp (3*)DIEFFENBACH12-1003-04acciaio inossidabile 4cm
ComputerDellPrecission 3431
CorePlateTM 1W 38/603BrainAccura HD-MEAChip CMOS-HD-MEA
Drill accessory (13)FST19007-07Punta: 7mm
Drill accessory (13)FST19007-09Punta: 9mm
Eco wipes - wipe dispenserDr Schumacher00-915SE001 (1x1) 
Eco wipes - wipe rollsDr Schumacher00-915SE001 (6x1)
ELASTOSILWackerRT 601 A/B
ElectrodeMicroprobesSNEX-100
EthanolCarl Roth GmbH + Co. KGArt-Nr. T913.3
Excavator (10)HLW Dental-Instruments GermanyS-10.28-6
Forceps (5)FST18025-10Acciaio inossidabile 10cm
Forceps (6)AesculapBD311R9cm
Forceps (7)FST91100-12Acciaio inossidabile 12cm
Forceps (8)FST11231-20Acciaio inossidabile 11cm
Forceps (8*) Karl Hammacher9.160 160Wironit 10,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Forceps (9)FST11200-33Dumoxel 13,5cm
Heated surgical table+integrated gas exhaustBioMedical InstrumentsBioMedical Instruments
heliobondIvoclar Vivadent42040
Ice MachineScotsmanAF 80 AS / WS
Inflow and outflow needlesBD Microlance 1,25 x70mm
Isathal 10mg/gDechraZul.-Nr. 400216.00.00Fucidin
IsofluraneSedana medicalN001254
Mili-Q Water FilterElgaPURELAB flex 3
Needle Holder (4)FST12501-13Carburi di tungsteno 13cm
OcteniseptSchülke & MayrSoluzione antisettica 
Paper Filter (4*)Carl Roth GmbH + Co. KGAP75.1
ParafilmSigma AldrichHS234526C
Platinum anchor3Brain3Brain
Retractor Tip (14)FST18200-102.5mm
Reused Electrode (11)MicroprobesSNEX-100Per Coordinate
RingerB. Braun3570030
Scissor (1)FST14078-10Acciaio inossidabile 10cm
Scissor (2)AesculapBC144R
Scissor (3)FST14058-09Acciaio inossidabile 9cm
Scissor (9*)FST91401-12Acciaio inossidabile 12cm
Screw (12)Online-Schrauben.deDIN 84 A2 M 1x2
ShaverExactaGT415
STELLA (software defined implantable modular platform) stimulation systemnon-commercial; developement of the University of Rostockopen source (https://github.com/SFB-ELAINE/STELLA)stimolatore DBS a batteria
Sterelizer 250FST18000-45
StereotaxicNarishigeModel SR-AR
Super glueUHU64212
Tear cream (Panthenol Nose Cream)Jenapharm5541249
Vibratome LaicaVT12005
Xylocain Gel 2%Aspen Pharma1138060
Weigh BoatCarl Roth GmbH + Co. KGHYT9.1
WeigherVoltcraftTS-5000/1
Compounds used for solutions preparation
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-Aldrich10043-52-4
D-Glucose(C6H12O6)Sigma-Aldrich50-99-7
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-Aldrich7786-30-3
Potassium Chloride(KCl)Sigma-Aldrich7447-40-7
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-Aldrich144-55-8
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-Aldrich7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-80-7
SucroseSigma

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