Articolo metodologico

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

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DOI:

10.3791/70512

⸱

13 marzo 2026

 ,  ,  ,  , 
1Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research: Hubrecht Institute, 2Oncode Institute, 3Royal Netherlands Academy of Arts and Science (KNAW), 4University Medical Center Utrecht

In questo articolo

Sommario

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Abstract

La tecnologia organoide fornisce una piattaforma sperimentale in vitro per studiare la fisiologia umana in ambito sanitario e malattioso. Rispetto ad altri sistemi in vitro , come le linee cellulari derivate dal cancro o gli expianti, gli organoidi derivati da cellule staminali tissutali (TSC) offrono vantaggi chiave: possono essere espansi indefinitamente mantenendo la stabilità genomica e sono adatti alla modifica CRISPR. Poiché questi organoidi sono generati da TSC normali, contengono i tipi cellulari del loro tessuto di origine. Questo rende gli organoidi particolarmente preziosi per studiare le interazioni tra batteri e cellule umane differenziate e non tumorali. Gli organoidi intestinali vengono coltivati come monostrati polarizzati bidimensionali su inserti di coltura cellulare rivestiti con estratto di membrana basale (BME) o invasina, un'alternativa priva di animali ed economica, e possono essere differenziati nei principali tipi di cellule epiteliali intestinali per infezioni da E. coli patogeno invasivo aderente. I dati chiave delle infezioni includono il monitoraggio dell'espressione genica epiteliale tramite PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR), la visualizzazione delle interazioni batteri-epitelio tramite microscopia confocale e la quantificazione della rottura della barriera epiteliale. Il protocollo può essere facilmente adattato per studiare altri organi e specie batteriche, offrendo una piattaforma versatile per indagare le interazioni ospite-microbo negli organoidi.

Introduzione

L'epitelio intestinale costituisce la prima linea di difesa contro i batteri patogeni presenti nel lumen intestinale. I modelli in vitro dell'epitelio intestinale sono stati ampiamente utilizzati per studiare come i batteri interagiscono con le cellule epiteliali, come queste cellule rispondono all'infezione e come i batteri rompano la barrieraepiteliale 1. Questi modelli sono particolarmente preziosi per l'indagine di patogeni specifici per l'uomo in un contesto controllato e riduzionista. Storicamente, la biologia delle infezioni in vitro si è basata su linee cellulari derivate dal tumore, ad esempio cellule Caco-2, o su expianti derivati dal paziente mantenuti ex vivo 2,3. Più recentemente, gli organoidi intestinali generati da cellule staminali tissutali umane sono emersi come uno strumento potente che combina i vantaggi di entrambi gli approcci: come le linee cellulari, gli organoidi possono essere trasportati, espansi, criopreservati, scongelati e manipolati geneticamente; e, come gli expianti, derivano da cellule staminali non tumorali capaci di differenziarsi in tutti i principali tipi cellulariepiteliali 4,5.

Quando sono inseriti in una matrice come Matrigel o Estratto di Membrana Basale (BME), gli organoidi intestinali umani tipicamente si auto-organizzano in strutture sferiche e polarizzate con una superficie apicale rivolta verso l'interno e una superficie basale rivolta verso l'esterno. Poiché la maggior parte dei patogeni intestinali accede alle cellule epiteliali dal lato apicale, sono state sviluppate diverse strategie per esporre questa superficie ai batteri presenti negliorganoidi 4. Un approccio consiste nel micro-iniezione di batteri direttamente nel lumenorganoide 6. Un'altra consiste nell'invertire la polarità degli organoidi rilasciandoli dalla matrice extracellulare, generando organoidi "apical-out" insospensione 7. Una terza strategia consiste nel dissocere gli organoidi in singole cellule e inserirli su inserti di coltura cellulare per formare monostrati bidimensionali polarizzati (fogli organoidi 2D) con il lato apicale rivolto verso il compartimentosuperiore 8. I primi due metodi presentano limitazioni importanti: la micro-iniezione richiede tempo e richiede molta manodfa, limitando la produttività, e gli organoidi con l'apical-out sopravvivono solo pochi giorni senza supporto matriciale e non possono esseredifferenziati 1. Al contrario, i fogli organoidi 2D supportano esperimenti ad alta produttività (i batteri possono semplicemente essere aggiunti al compartimento superiore) e possono essere mantenuti per più settimane mentre si differenziano nei principali tipi di cellule epitelialiintestinali 9.

A differenza delle linee cellulari immortalate che si attaccano facilmente alle superfici plastiche, le cellule derivate da organoidi necessitano di un rivestimento a placche per un'adesione efficiente. Il rivestimento può essere eseguito utilizzando BME10 diluito, oppure in alternativa utilizzando l'invasina, una proteina batterica che lega le integrine sulle celluleorganoidi 11. L'invasina è facile da produrre in laboratorio, è sostanzialmente più conveniente rispetto a BME o Matrigel e completamente priva di animali.

Questo protocollo descrive l'istituzione e la differenziazione degli organoidi intestinali come monostrati polarizzati bidimensionali su inserti di coltura cellulare rivestiti con invasina o Estratto di Membrana Basale (BME). I fogli organoidi differenziati sono successivamente infettati da Escherichia coli (AIEC), un ceppo patogeno associato alla malattia infiammatoriaintestinale 12. Vengono delineati molteplici indicatori di infezione a valle per valutare le risposte epiteliali e la traslocazione batterica. Dato che l'AIEC invade le cellule epiteliali e viola l'epitelio intestinale — un meccanismo ritenuto contribuisca alla sua patogenicità — la rottura epiteliale viene quantificata mettendo i batteri che raggiungono la camera basolaterale dell'inserto in coltura cellulare dopo la conferma dell'integrità della barriera tramite misurazione della resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER) 13. Sono inoltre previste procedure per fissare e immaginare i monostrati infetti per visualizzare l'AIEC intra- ed extracellulare, nonché per l'estrazione di RNA per valutare le risposte trascrizionali epiteliali all'infezione. Il protocollo completo può essere eseguito in meno di due settimane e richiede solo apparecchiature di laboratorio comunemente disponibili, inclusi un armadio BSL-2, un microscopio confocale e uno strumento PCR quantitativo.

Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo economico, versatile e accessibile per studiare l'infezione batterica dell'epitelio intestinale umano differenziato in vitro. Può essere facilmente adattato ad altri sistemi organoidi e ad altre specie microbiche, rendendolo un utile modello per studi di biologia delle infezioni in vitro .

Protocollo

Gli organoidi intestinali umani sono stati generati a partire dai materiali di scarto di pazienti sottoposti a interventi di oncologia colorettale presso il Centro Medico Universitario di Utrecht (UMCU). I pazienti hanno fornito il consenso informato per la generazione dei loro organoidi, in conformità con il protocollo UPORT Cancer Biobank 21-042, approvato dal comitato etico locale per la biobanca. La Figura 1A illustra le 8 sezioni del protocollo . I dettagli sui reagenti e sulle attrezzature sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Rivestimento dell'inserto per coltura cellulare

  1. Rivestimento con invasina
    1. Esegui tutte le procedure all'interno di un cappuccio per coltura tissutale in condizioni sterili.
    2. Prepara una soluzione da 5 μg/mL di invasina in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
    3. Aggiungere 100 μL di questa soluzione al compartimento superiore di ogni inserto di cultura cellulare poliesterese da 3 μm inserito in una piastra a 24 pozzi.
    4. Assicurati che la membrana sia completamente coperta.
    5. Incubare durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Evita di generare bolle durante la dispensazione, poiché le bolle impediscono un rivestimento uniforme.
  2. Rivestimento con estratto per membrana del seminterrato (Alternativa)
    1. Scongelare Estratto di membrana del seminale su ghiaccio.
    2. Prepara una soluzione al 10% in DMEM ghiacciato.
      NOTA: Mantenere la soluzione fredda per prevenire la polimerizzazione prematura.
    3. Aggiungere 100 μL della soluzione diluita nel compartimento superiore di ogni inserto di coltura cellulare da poro da 3 μm.
    4. Assicurati di coprire completamente la superficie della membrana.
    5. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.

2. Semina delle cellule organoidi

  1. Preparazione degli organoidi
    1. Rimuovere il substrato di coltura dalle placche organoidi mantenute in condizioni di espansione (3-5 giorni dopo la scissione).
    2. Sospensa gli organoidi in 1 mL di DMEM14 gelido.
    3. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 mL contenente 4 mL di DMEM gelato.
      NOTA: Utilizzare circa 1 pozzo pieno da una piastra a 12 pozzi per seminare 4 inserti di coltura cellulare.
  2. Organoidi di pelleting
    1. Centrifugare per 5 minuti a 500 × g a 4 °C.
    2. Rimuovi completamente il soprantantante.
  3. Organoidi dissocianti
    1. Risospendere la pellet in 3 mL di sostituto ricombinante della tripsina.
    2. Pipetta su e giù usando una pipetta P1000 per disturbare meccanicamente gli organoidi.
    3. Incubare a 37 °C per 15-20 minuti fino a ottenere cellule singole o piccoli gruppi (3-4 cellule).
      NOTA: Non superare i 20 minuti di incubazione. Pipetta ogni 5 minuti per facilitare la dissociazione. Inserire una punta P10 all'interno di una punta P1000 se è necessaria ulteriore forza meccanica.
  4. Lavaggio delle celle
    1. Aggiungi 5 mL di DMEM ghiacciato.
    2. Centrifugare per 5 minuti a 500 × g a 4 °C.
    3. Rimuovi il soprannatante.
  5. Preparare la sospensione della cella
    1. Sospendere le cellule nel mezzo di espansione (100 μL per inserto di coltura cellulare; vedi Tabella 1 per la composizione del mezzo di espansione).
      NOTA: Non includere antibiotici. Includere un inibitore della Rho chinasi per prevenire anoikis.
    2. Contare le cellule usando un contatore cellulare o un emocitometro.
    3. Regola a circa 2 × 106 cellule/mL.
  6. Semina degli inserti in coltura cellulare
    1. Rimuovi la soluzione di rivestimento dagli inserti.
    2. Aggiungere 100 μL di sospensione delle celle (2 × 105 celle) nel compartimento superiore.
    3. Aggiungere 500 μL di mezzo di espansione nel compartimento inferiore.

3. Coltura cellulare, inserto coltura e differenziazione

  1. Incubare a 37 °C con il 5% diCO2 fino al raggiungimento della confluenza (circa 3 giorni).
    NOTA: Rinfresca il mezzo in entrambi i compartimenti ogni 4-5 giorni se necessario.
  2. Una volta confluente, lavare entrambi i compartimenti con DMEM preriscaldato.
  3. Aggiungere un mezzo di differenziazione da 500 μL (Tabella 2) al compartimento inferiore.
  4. Aggiungere 100 μL di DMEM/F12 avanzato integrato con HEPES e Glutamax (AdvDMEM++) (Tabella 3) nel compartimento superiore.
  5. Incubare per 5 giorni a 37 °C con il 5% diCO2.
  6. Sostituisci il supporto in entrambi i compartimenti ogni 2 giorni.

4. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER)

  1. Sterilizza gli elettrodi TEER al 70% di etanolo per 15 minuti.
  2. Risciacquare gli elettrodi in PBS sterile.
  3. Inserire l'elettrodo corto nel compartimento superiore e l'elettrodo lungo nel compartimento inferiore.
    NOTA: Non toccare il monostrato con la punta dell'elettrodo.
  4. Registra i valori di resistenza.
  5. Misurare la resistenza del blank utilizzando un inserto senza celle contenente PBS (100 μL superiore, 500 μL inferiore).
  6. Calcola TEER: TEER = (inserto di coltura R_cell − R_blank) × superficie (cm²)
    NOTA: Per inserti a 24 pozzi, area superficiale = 0,33 cm².

5. Infezione da AIEC

  1. Prepara la coltura batterica
    1. Inoculare l'AIEC fluorescentein mezzo 15 da 3 mL LB.
    2. Incubare durante la notte a 37 °C con scuotere.
      ATTENZIONE: Esegui tutte le procedure batteriche in un cappuccio BSL-2.
  2. Prepara l'inoculo
    1. Centrifugare la coltura da 500 μL per 5 minuti a 1500 × g.
    2. Risospendere in 1 mL AdvDMEM++.
    3. Misurare la densità ottica (OD).
    4. Diluire a circa 1 × 10⁸ CFU/mL in AdvDMEM++.
      NOTA: OD = 1 corrisponde a circa 1 × 10⁹ CFU/mL.
  3. Infettare i monolayer
    1. Sostituisci il materiale in entrambi i compartimenti.
    2. Aggiungere un mezzo di differenziazione da 500 μL al compartimento inferiore.
    3. Aggiungi 100 μL di sospensione batterica nel compartimento superiore per la condizione infetta.
    4. Aggiungere 100 μL di AdvDMEM++ al compartimento superiore per la condizione non infetta.
    5. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.

6. Valutazione della rottura dell'epitelio

  1. A 2,5 ore dall'infezione, raccogliere 100 μL dal compartimento inferiore.
  2. Diluire in PBS e impiattare su LB agar.
  3. Aggiungere 100 μL di mezzo di differenziazione fresco nel compartimento inferiore.
  4. Incubare le piastre durante la notte a 37 °C.
  5. Ripetizione del campionamento a 5 ore dall'infezione.
  6. Contare l'Unità Formativa di Colonie (CFU) il giorno seguente.
  7. Calcolare le CFU per inserto di coltura cellulare: CFU/inserto di coltura cellulare = colonie × 5 × fattore di diluizione

7. Infezione da immagine

  1. A 5 ore dall'infezione, rimuovere il substrato e fissare con il 4% di paraformaldeide.
    ATTENZIONE: Il paraformaldeide è tossico e volatile. Maniglia all'interno di una cappa fumifera indossando i guanti.
  2. Riparare per 30 minuti.
  3. Lava tre volte con PBS.
  4. Rimuovere l'inserto di membrana e posizionare le cellule rivolte verso l'alto in una piastra di pozzo.
  5. Tingere con falloidina fluorescente per 1-2 ore.
  6. Lava tre volte con PBS.
  7. Colora i nuclei con DAPI per 10 minuti.
  8. Lava tre volte con PBS.
  9. Monta su una slitta di vetro con un mezzo di montaggio e applica un slip di copertura.
  10. Sigillare con lo smalto.
  11. Acquisire immagini confocali di DAPI, actina e canali batterici.
  12. Acquisire uno stack z che copre le superfici basale fino ad apicali con intervalli di 1 μm.
  13. Immagini aperte nelle Figi.
  14. Seleziona immagine → Z progetto → intensità media.
  15. Seleziona le pile di → immagini → le viste ortogonali per visualizzare le sezioni trasversali.

8. Analisi della risposta epiteliale

  1. A 5 ore dall'infezione, rimuovere il substrato.
  2. Aggiungi un buffer di lisi di 350 μL nel compartimento superiore.
  3. Pipette per lisare le cellule e trasferirlo in un tubo senza RNasi su ghiaccio.
  4. Esegui l'estrazione dell'RNA secondo le istruzioni del kit.
  5. Misura la concentrazione di RNA e normalizza i campioni.
  6. Esegui la trascrizione inversa.
  7. Eseguire una PCR quantitativa seguendo le istruzioni del produttore (le sequenze di primer per TNFα e il gene di riferimento β-actin sono fornite nella Tabella 4).

Risultati

Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule intestinali sull'inserto di coltura cellulare mostravano un pattern simile a un mosaico (Figura 1B) senza spazi visibili nel monostrato. Dopo la differenziazione, la strettezza epiteliale è stata valutata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) (Figura 1C). I valori TEER superiori a 500 Ω·cm² erano coerenti con la formazione di un monostrato epiteliale stretto¹⁶.

La quantità di AIEC rilevata nel compartimento basolaterale è aumentata nel tempo, riflettendo la rottura batterica della barriera epiteliale (Figura 2A,B). L'assenza di AIEC nel compartimento inferiore indicherebbe un fallimento della traslocazione batterica.

Il flusso di lavoro per visualizzare l'infezione è riassunto nella Figura 3A. L'imaging confocale ha dimostrato la formazione di un monostrato polarizzato, con nuclei localizzati alla base e un arricchimento apicale della rete di actine (Figura 3B). Un ingrandimento più elevato ha rivelato sia AIEC intracellulari sia batteri extracellulari attaccati alla membrana apicale (Figura 3C).

L'analisi RT-qPCR ha mostrato una regolazione all'alza dell'espressione di TNFα in risposta all'infezione da AIEC (Figura 4A,B), confermando l'attivazione di una risposta infiammatoria epiteliale.

figure-results-1
Figura 1: Panoramica del protocollo. (A) Schemi del protocollo. (B) Immagine in campo luminoso delle cellule organoidi intestinali coltivate e differenziate su un inserto di coltura cellulare rivestita da invasina. Barra della scala: 50 μm. (C) Resistenza elettrica transepiteliale/transendoteliale (TEER) degli organoidi intestinali cresciuti e differenziati su inserti di coltura cellulare rivestiti da invasina. Ogni puntino mostra un esperimento indipendente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Valutazione della rottura dell'epitelio (A) Schemi del protocollo. (B) Quantificazione delle Unità Costitutrici di Colonie (CFU) di AIEC nel tempo nel compartimento inferiore dell'inserto di coltura cellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Infezione per imagin. (A) Schemi del protocollo. (B) Imaging confocale di organoidi intestinali infettati da AIEC fluorescente per 5 ore. Grigio: DAPI. Magenta: falloida. Cyan: AIEC. Barra della scala: 50 μm. Le viste ortogonali dell'immagine unita sono visualizzate in alto e a destra. (C) Ingrandimento elevato del quadrato bianco in B. Grigio: DAPI. Magenta: falloida. Cyan: AIEC. Barra di scala: 10 μm. Le viste ortogonali sono mostrate a destra. Vengono evidenziate le AIEC intracellulari (*) e le AÏEC extracellulari attaccate alla membrana apicale delle cellule epiteliali ($). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Analisi della risposta epiteliale. (A) Schemi del protocollo. (B) Espressione di TNFα da parte degli organoidi intestinali dopo 5 ore di infezione con AIEC (verde) rispetto al controllo non infetto (grigio). L'espressione di TNFα è stata normalizzata in espressione di B-actina utilizzando la formula 2-(Cq(TNFα)-Cq(β-actina)). n=4 replica. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un test Student's t non abbinato. P < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ComponenteConcentrazione 
DMEM avanzato1X finale
HEPES1% contro valore
Glutamax1% contro valore
Surrogato Wnt0,5 nM
R-spo1 UPE2% v/v
Noggin UPE1% contro valore
B27 senza vitamina A2% v/v
N-acetilcisteina1,25 mM
Nicotinamide10 μM
hEGF50 ng/mL
A83-01 (inibitore TGF-β)0,5 μM
SB202190 (inibitore di p38)3 μM
Prostaglandina E21 μM
Inibitore della rho chinasi10 μM

Tabella 1: Mezzo di espansione per organoidi intestinali umani. Composizione del mezzo di espansione utilizzato per il mantenimento e la proliferazione degli organoidi intestinali umani.

ComponenteConcentrazione
DMEM avanzato1X finale
HEPES1% contro valore
Glutamax1% contro valore
R-spo1 UPE2% v/v
Noggin UPE1% contro valore
B27 senza vitamina A2% v/v
NAC1,25 mM
hEGF50 ng/mL

Tabella 2: Mezzo di differenziazione per organoidi intestinali umani. Composizione del mezzo di differenziazione utilizzato per promuovere la maturazione epiteliale dei monostrati organoidi intestinali umani.

ComponenteConcentrazione
DMEM avanzato1X finale
HEPES1% contro valore
Glutamax1% contro valore

Tabella 3: ADV DMEM++ per infezione. Composizione del mezzo avanzato DMEM/F12 integrato con HEPES e Glutamax (Adv DMEM++) utilizzato durante i saghi di infezione batterica.

NomeSequenza
TNFα FCTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG
TNFα RATGGGCTACAGGCTTGTCACTC
β-actina FTGACGTTGACATCCGTAAAG
β-actina RGAGGAGCAATGATCTCTCT

Tabella 4: Primer per qPCR di TNFα. Mostra le sequenze di primer utilizzate per l'analisi quantitativa PCR del TNFα utilizzando β-actina come gene di riferimento.

Discussione

Questo studio ha stabilito un protocollo per indagare l'infezione batterica delle cellule epiteliali intestinali umane utilizzando organoidi derivati dal TSC coltivati su inserti di coltura cellulare. Gli inserti con pori da 3 μm permettevano un'efficiente attaccamento cellulare e una traslocazione batterica, mentre i pori da 0,4 μm non permettono il passaggio AIEC, coerente con la dimensione approssimativa di 1 μm di E. coli. Non è stata osservata alcuna traslocazione di cellule organoidi attraverso pori a 3 μm, probabilmente a causa del loro fenotipo epiteliale e non invasivo.

Diverse variabili sperimentali erano fondamentali per la riproducibilità, tra cui l'efficiente attacco cellulare, la densità di semina adeguata e la confluenza completa prima dell'infezione. Le cellule epiteliali derivate dagli organoidi non aderiscono alla plastica non rivestita, rendendo essenziale il rivestimento. BME ha fornito un'efficienza di attacco costantemente elevata. Il rivestimento invasin ha prodotto risultati comparabili e rappresenta un'alternativaeconomica 11, anche se deve essere prodotto internamente. Il rivestimento al collagene è stato anche proposto come alternativa17.

Le condizioni di crescita batterica influenzano fortemente l'efficienza delle infezioni. I ceppi di E. coli crescono bene nel DMEM; tuttavia, gli antibiotici residui possono inibire la proliferazione. In condizioni ottimali, le colture infette di solito mostrano una torbidità aumentata rispetto ai controlli, e la crescita batterica può essere confermata dal contenimento del compartimento apicale.

La strategia di imaging ha permesso la visualizzazione sia di batteri intracellulari che extracellulari indirizzando AIEC che esprime un fluoroforo sotto un promotore costitutivo (ad esempio, utilizzando il plasmide pMB1-spect-PthrC-eGFP). Metodi alternativi consentono la rilevazione selettiva dei batteri intracellulari, inclusa la colorazione immunofluorescenzadifferenziale 18 o i reporter espressi in determinati stadi di invasione19. I saggi di protezione sulla gentamicina forniscono un approccio quantitativoaggiuntivo 20.

Questo modello è intenzionalmente riduzionista e si concentra sulle interazioni dirette tra batteri ed epitelio intestinale. Consente di indagare l'infezione in uno strato epiteliale monostrato differenziato senza ulteriori tipi cellulari in vivo. Il mezzo di differenziazione ha prevalentemente indotto la differenziazione di enterociti e cellulecalicili 21, ma può essere modificato per alterare la composizione epiteliale22,23. La complessità del sistema può essere aumentata co-coltivando cellule immunitarie o stromali nel compartimentobasale 24.

Il sistema non riproduce l'architettura tridimensionale della mucosa intestinale. Le piattaforme organ-on-chip superano alcune limitazionistrutturali 25 ma richiedono maggiore complessità tecnica e risorse. Inoltre, il modello è più adatto alle infezioni acute, poiché la sovracrescita batterica limita gli esperimenti a circa 8 ore. Sistemi più complessi, come piattaforme microfluidiche che permettono uno scambio continuo di medi, sono necessari per studiare le infezioni croniche invitro 26.

Sistemi simili di infezione organoide a base di colture cellulari sono stati applicati su molteplici tessuti e patogeni, inclusi organoidi stomacici infettati da Helicobacter pylori27,28, organoidi intestinali infettati da Shigella29, organoidi delle vie aeree infettati da Pseudomonas aeruginosa10 e organoidi uroteliali infettati da Enterococcus faecalis30. Questo protocollo, quindi, fornisce un quadro versatile per indagare le interazioni epiteliali-batteriche tra i sistemi d'organo, a condizione che vengano considerati i requisiti di crescita specifici del patogeno.

La tecnologia organoide fornisce modelli umani fisiologicamente rilevanti per indagare le interazioni ospite-patogeno nelle cellule epiteliali nontrasformate 4,5. Dato il crescente carico delle infezioni resistenti agli antibiotici e la loro associazione con malattie infiammatorie croniche e cancro, tali sistemi in vitro rappresentano strumenti preziosi per la ricerca meccanicistica e traslazionale.

Dichiarazioni

H.C. è inventore di diversi brevetti relativi alla tecnologia organoide. La piena divulgazione di H.C. è fornita al https://www.uu.nl/staff/JCClevers/.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Utrecht Portal for Organoid Technology (UPORT), in particolare Anneta Brousali, Jorieke Salij e Arnold Binda, così come i pazienti e i chirurghi del University Medical Center Utrecht per aver fornito tessuti per il colon. Gli autori ringraziano anche Nicolas Barnich per aver condiviso il ceppo AIEC LF82. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione CRUK OPTIMISTIC (C10674/A27140). TG è stato finanziato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie 101107988. Gli schemi venivano creati utilizzando BioRender (https://www.biorender.com/).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A83-01 (inibitore TGF-& beta)Tocris2939
Escherichia coli LF82 aderente-invasivageneroso dono di Nicolas Barnich
DMEM/F12 avanzatoInvitrogen12634-010
B27 senza vitamina AInvitrogen12587010
Kit cDNABiosistemi applicati4387406Il manuale è disponibile qui: https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN
0017977_highcap_cDNA_RT_UG.pdf
Contatore cellulariDeNovixH2796
Contatore cellulariLeicaStellaris
Spallini 24 mm x 50 mmMenzel-Glä Zer.BB024050S1
Estratto di membrana basale Cultrex (BME)R& D Systems, Bio-Techne3533-001-02
DAPISigma-Aldrich10236276001
Bisturi usa e getta Sterile N° 10Swann Morton3033838
DMEMGibco11965092
FigiFigiFiji è ad accesso aperto e può essere scaricata qui: https://imagej.net/software/fiji/downloads
GlutamaxGibco35050-061
hEGFPeprotechAF-100-15
HEPESGibco15630-080
Invasinasu misura secondo Wijnakker et al. PNAS 2024
LBThermofisherCM0996
LB AgarThermofisherCM1116
Camera MalassezKOVA87144E
Vedute per microscopioSkycraft18901
Voltohmmetro a celle di Milli (misurazione TEER)MerckMERS00002
Mezzo di montaggioLaboratori VectorsVectashield H-1000-10
N-acetilcisteinaSigma-AldrichA9165
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Noggin UPEIPA TherapeuticsN002
Soluzione di paraformaldeide 4%Sigma-Aldrich1.00496
Faloidina 647Sigma-Aldrich65906-10NMOL
plasmide pMB1-spect-PthrC-eGFPAddgene107408
Prostaglandina E2Tocris2296
Macchina qPCRBioradC1000-Touch
Inibitore della rho chinasiAbMoleM1817
Kit di estrazione RNAQiagen74534Il manuale è disponibile qui: https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=bf60203
F-291D-48AE-8206-86B0696B28C0&
lang=en
R-spo3 UPEIPA TherapeuticsR001
SB202190 (inibitore di p38)Sigma-AldrichS7076
SpectinomicinaSigma-AldrichS9007
Piastra di sospensione per la coltura organoideGreiner665102
SYBR verdeBiorad170-8887Il manuale è disponibile qui: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4106212.pdf
TermociclatoreBioradT100
Inserto per coltura cellulareTranswells 24w 3 & micro; m pores, Greiner662631
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
TripleGibco, Thermo Fisher Scientific12605-010
Surrogato WntU-Protein ExpressOrdine personalizzato  https://www.life-sciences-europe.com/organisation/protein-express-immunoprecise-group-utrecht-netherlands-west-europe-2001-30404.html

Riferimenti

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