Articolo metodologico

Valutazione di sferoidi 3D per studi di trasduzione con AAV

81 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/70517

⸱

14 agosto 2026

 , 
1Office of Gene Therapy, Office of Therapeutic Products, Center for Biologics Evaluation and Research

In questo articolo

Sommario

I sistemi di coltura tridimensionali a sferoide rappresentano un miglioramento rispetto ai modelli convenzionali in 2D per lo sviluppo della terapia genica con AAV. Questa metodologia consente un rilevamento sensibile della trasduzione da parte di AAV a basse dosi, una maggiore rilevanza fisiologica e un monitoraggio a lungo termine robusto. La piattaforma supporta la valutazione della potenza, lo screening ad alto rendimento e l'ottimizzazione del vettore in diverse linee cellulari e sierotipi di AAV.

Abstract

I virus adeno-associati (AAV) sono vettori potenti utilizzati per il trasferimento genico nei prodotti di terapia genica. Il loro sviluppo richiede sistemi in vitro  in grado di rilevare in modo affidabile le differenze nella progettazione del vettore, nelle prestazioni del sierotipo, nella forza degli elementi regolatori e nella cinetica dell'espressione. Tali sistemi devono inoltre supportare applicazioni come la valutazione della potenza e l'ottimizzazione del vettore. In questo studio descriviamo una piattaforma semplificata in tre dimensioni, basata su sferoidi, ottimizzata per valutare la potenza degli AAV, la cinetica dell'espressione del transgene e l'efficacia di trasduzione specifica per sierotipo in diverse linee cellulari. Sferoidi uniformi vengono generati utilizzando piastre con adesione ultra-bassa e mantenuti in condizioni che ne preservano l'architettura stabile e consentono un'analisi mediante imaging a lungo termine. Dopo la trasduzione con AAV, i segnali fluorescenti o luminescenti vengono monitorati in tempo reale mediante sistemi di imaging su cellule vive. Questo approccio permette una valutazione quantitativa del segnale del reporter, della risposta alla dose, dell'attività degli elementi regolatori e del tempo di insorgenza, grazie a un imaging cinetico continuo. La piattaforma è in grado di discriminare efficacemente tra progettazioni di genoma vettoriale potenti e deboli, nonché tra diversi sierotipi di AAV. Questo metodo dimostra prestazioni solide sia in linee cellulari a divisione lenta che rapida. Questi risultati ne confermano l'utilità come sistema scalabile e fisiologicamente rilevante per la valutazione e lo sviluppo preclinico della terapia genica.

Introduzione

I vettori AAV sono diventati uno dei sistemi preferiti per il trasferimento genico in applicazioni in vivo grazie al loro profilo di sicurezza e alla capacità di indurre un'espressione genica persistente1. La terapia genica con AAV sta ottenendo successo nel trattamento di numerose malattie rare, con centinaia di prodotti attualmente in fase di sviluppo2. Inoltre, tra le nuove applicazioni vi è il rilascio in vivo di componenti per la modifica del genoma, come Cas9, che ha un notevole potenziale nel supportare il trattamento di patologie difficili da curare3. Tra le principali sfide dello sviluppo vi sono i costi elevati di produzione e la capacità limitata delle attuali prove in vitro di prevedere la qualità del prodotto e l'efficacia clinica4.

L'avanzamento delle terapie basate sui virus adeno-associati (AAV) è fondamentalmente limitato dalla mancanza di saggi di attività predittivi e standardizzati in grado di prevedere con precisione le prestazioni cliniche4,5. Questi saggi rappresentano un componente critico del processo di sviluppo, poiché vengono utilizzati per diversi scopi, tra cui lo screening di librerie di vettori ingegnerizzati, l'ottimizzazione delle modifiche del capside per un migliore indirizzamento e la valutazione del tropismo tissutale specifico. Inoltre, consentono di caratterizzare l'influenza delle sequenze regolatorie sull'espressione del transgene6. Oltre alla selezione dei candidati, i saggi di trasduzione AAV supportano anche fondamentali controlli di qualità nella produzione, attraverso saggi di potenza utilizzati per il rilascio dei lotti, gli studi di comparabilità tra lotti e le valutazioni di stabilità6,7.

La sfida scientifica consiste nello sviluppare saggi in grado di catturare la complessità delle interazioni vettore-ospite mantenendo al contempo una fattibilità pratica per l'uso routinario7,8. Gli approcci attuali includono l'utilizzo di linee cellulari immortalizzate che rappresentano l'organo bersaglio in colture tradizionali in monocstrato bidimensionale. Queste condizioni di coltura presentano una scarsa rilevanza fisiologica e richiedono dosi elevate di farmaco, creando un divario significativo tra le previsioni ottenute in laboratorio e la traslazionalità clinica. Linee cellulari ingegnerizzate di nuova generazione, come sistemi con sovraespressione di AAVR o attivati mediante CRISPR, rappresentano progressi importanti ma non riescono a riprodurre l'architettura tridimensionale e le interazioni con la matrice extracellulare tipiche dei tessuti nativi9,10,11. Modelli di nuova generazione in grado di simulare meglio i microambienti in vivo potrebbero colmare questa lacuna traslazionale12,13,14.

Di recente abbiamo sviluppato un sistema in sferoidi 3D ottimizzato per la trasduzione con AAV, al fine di migliorare la traslabilità dei saggi di trasduzione con AAV. Questo sistema aumenta significativamente l'efficienza di trasduzione con AAV in molteplici linee cellulari e sierotipi di AAV rispetto ai saggi 2D considerati standard di riferimento. Oltre al miglioramento della sensibilità e al risparmio del prodotto utilizzato nel saggio, questi modelli superano i monociti 2D fornendo interazioni cellula-cellula realistiche che variano in base alla posizione cellulare all'interno del sferoide. Inoltre, permettono un'indagine significativa sulla penetrazione dei farmaci, simulando condizioni organiche reali11,15,16. Inoltre, questo approccio basato su sferoidi offre vantaggi pratici rispetto a sistemi più complessi come organoidi o colture cellulari miste, poiché utilizza attrezzature di laboratorio standard ed evita l'impiego di mezzi specializzati o supporti specifici. Questa semplicità garantisce riproducibilità e scalabilità, rendendolo particolarmente adatto per test di routine nella terapia genica e per i flussi di lavoro di sviluppo di vettori17.

Questa piattaforma di sferoidi 3D è particolarmente adatta per applicazioni che richiedono una rilevazione sensibile della trasduzione da parte di AAV a basse dosi e la valutazione comparativa di progetti di genoma virale. Consente inoltre la valutazione del tropismo dipendente dal sierotipo. È particolarmente vantaggiosa per linee cellulari con efficienza di trasduzione relativamente bassa, che richiedono alte dosi di AAV nelle colture convenzionali in 2D. In questi contesti, la sensibilità aumentata e la maggiore rilevanza fisiologica della piattaforma 3D risultano fondamentali. Tuttavia, questo sistema potrebbe essere meno adatto per studi che richiedono componenti immunitari, somministrazione vascolare o complessità tissutale completa. Ciò avviene perché i sferoidi non riproducono pienamente l'ambiente in vivo .

Pertanto, presentiamo un protocollo semplice per sferoidi tridimensionali ottimizzato per saggi di trasduzione AAV, con due letture critiche e complementari: efficienza di trasduzione (definita qui come segnale totale del reporter per sferoide) e cinetica di trasduzione. Questo metodo fornisce una piattaforma informativa, fisiologicamente rilevante ed economicamente vantaggiosa per la valutazione della potenza degli AAV, la progettazione di vettori e i saggi di neutralizzazione.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato linee cellulari umane consolidate (HEK293T, HeLa, Huh7, HEP3B, HEPG2 e A375) ottenute da fonti commerciali o precedentemente pubblicate. Non sono stati utilizzati campioni primari umani o animali, e pertanto non è stata richiesta alcuna approvazione etica.

1. Impostazione sterile dell'esperimento e preparazione iniziale della cappa

  1. Attivare la cappa biologica.
  2. Accendere la cappa microbiologica a flusso laminare di Classe II almeno 15 minuti prima dell'inizio delle operazioni, per consentire un tempo sufficiente alla stabilizzazione del flusso d'aria.
  3. Spruzzare tutte le superfici interne della cappa con etanolo al 70% (v/v).
  4. Preparare una soluzione disinfettante al 5% (v/v) di candeggina in un becher di vetro da 500 mL per lo smaltimento del surnatante cellulare e dei detriti cellulari.
  5. Pulire le attrezzature disinfettando accuratamente tutte le micropipette e le scatole dei puntali utilizzando etanolo al 70% (v/v).

2. Preparazione del mezzo di coltura cellulare

  1. Preparare 500 mL di mezzo base di Dulbecco modificato (DMEM) ad alto contenuto di glucosio.
  2. Integrare il mezzo base con 10 mL di siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente, 1 mL di soluzione di penicillina/streptomicina (100 unità/mL di penicillina e 100 µg/mL di streptomicina) e 5 mL di L-glutammina 2 mM.
    NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni asettiche. È necessario preparare un mezzo fresco per ogni esperimento. Si prega di consultare la Tabella dei Materiali per le specifiche dettagliate dell'equipaggiamento.

3. Preparazione degli sferoidi

  1. Preparare il mezzo DMEM completo come descritto in precedenza.
  2. Riscaldare il mezzo di coltura in un bagno d'acqua a 37 °C per 10–15 min.
  3. Rimuovere le linee cellulari di interesse dal serbatoio di azoto liquido.
  4. Scongelare rapidamente le cellule criopreservate HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa ponendole in un bagno d'acqua a 37 °C.
  5. Rimuovere immediatamente dal bagno d'acqua non appena l'ultimo cristallo di ghiaccio si è sciolto.
  6. Diluire 1 mL di cellule scongelate in 9 mL di mezzo DMEM completo.
    NOTA: Tutte le linee cellulari utilizzate in questo protocollo sono mantenute nello stesso mezzo DMEM e nelle stesse condizioni di coltura.
  7. Centrifugare le cellule a 350 × g per 5 min a temperatura ambiente.
  8. Eliminare il soprannatante.
  9. Risospendere il pellet in 5 mL di mezzo DMEM completo.
  10. Sezionare le cellule in un'ampolla da coltura cellulare T75.
  11. Posizionare le ampolle seminate in un incubatore per colture cellulari mantenuto a 37 °C, 5% CO2 e 95% di umidità.

4. Monitoraggio della crescita cellulare

  1. Aggiungere 15 mL di mezzo di coltura ogni 3 giorni.
  2. Passaggiare le cellule HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa quando raggiungono una confluenza del 70%, aspirando il mezzo DMEM completo dai flaconi T75. 
  3. Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di PBS nei flaconi T75 contenenti le cellule. 
  4. Aspirare i 5 mL di PBS dopo 30 secondi dall'aggiunta ai flaconi T75. 
  5. Ripetere questo passaggio di lavaggio un’altra volta.
  6. Trispanizzare le cellule con 5 mL di tripsina-EDTA 0,05% per 5 minuti. 
  7. Incubare i flaconi in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per consentire il completo distacco delle cellule. 
  8. Aggiungere 5 mL di mezzo DMEM completo per neutralizzare la tripsina. 
  9. Centrifugare le cellule a 350 × g. per 5 minuti per rimuovere la tripsina. 
  10. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di DMEM. 
  11. Dividere le cellule in un rapporto di diluizione 1:10 per il passaggio routinario. 
    NOTA: Si raccomanda di effettuare due passaggi cellulari prima di eseguire esperimenti, in modo che le cellule raggiungano la fase logaritmica e diventino metabolicamente attive. 
  12. Continuare l'incubazione in queste condizioni controllate finché le cellule non raggiungono una confluenza del 70%, quindi procedere con le successive procedure sperimentali.
    NOTA: La morfologia cellulare e i modelli di crescita devono essere monitorati regolarmente. Assicurarsi un corretto posizionamento dei flaconi per uno scambio gassoso ottimale. Le condizioni sterili sono essenziali per tutta la durata dell'incubazione.

5. Raccolta delle cellule e preparazione iniziale delle cellule

  1. Rimuovere il mezzo di coltura aspirando il mezzo presente dalle provette T75.
  2. Lavare le cellule HEK293T, Huh7, HEP3B, A375, HEPG2 e HeLa per 3 volte con PBS per rimuovere il mezzo residuo e i detriti.
  3. Aggiungere 5 mL di soluzione di tripsina 1× preriscaldata a queste cellule per staccare le cellule aderenti dalla superficie della provetta.
    NOTA: Assicurarsi che la tripsina sia preriscaldata per mantenere un'ottimale attività enzimatica. Collocare le provette in un incubatore a 37 °C per 5 minuti per consentire un completo distacco delle cellule. Monitorare attentamente il tempo di tripsinizzazione per evitare un'eccessiva digestione.
  4. Aggiungere 5 mL di mezzo di coltura completo per inattivare l'enzima tripsina.
  5. Pipettare la miscela su e giù per omogeneizzare la soluzione.
  6. Raccogliere ogni sospensione cellulare trasferendo l'intera sospensione cellulare in provette centrifughe etichettate singolarmente.
    NOTA: Le cellule devono essere maneggiate delicatamente durante la risospensione per mantenere la vitalità.
  7. Centrifugare le cellule a 350 × g per 5 minuti a temperatura ambiente per ottenere un pellet cellulare.
  8. Eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 5 mL di mezzo di coltura fresco.

6. Conteggio cellulare e valutazione della vitalità mediante contatore cellulare

  1. Omogeneizzare la sospensione pipettando delicatamente su e giù per assicurare una distribuzione uniforme delle cellule in tutta la provetta da centrifuga.
  2. Preparare le provette per il conteggio per le cellule HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2, A375 e HeLa.
  3. Preparare una diluizione 1:10 del campione in mezzo di coltura DMEM completo. Ad esempio, 40 µL di sospensione cellulare in 360 µL di mezzo DMEM completo.
  4. Pipettare delicatamente la miscela su e giù quattro volte per garantire una diluizione omogenea.
  5. Etichettare il campione nell'accesso e indicare il tipo di cellula utilizzato, la diluizione e il nome del campione.
  6. Caricare il campione sul contatore di cellule e posizionare la provetta contenente la sospensione cellulare diluita nel numero assegnato.
    NOTA: Il contatore di cellule è uno strumento automatico che aspira i campioni cellulari e li mescola con il blu di tripano, riducendo la variabilità tra operatori.
  7. Lasciare sedimentare la sospensione cellulare per 1 minuto prima di contare il campione.
  8. Risospensionare uniformemente le cellule prima del conteggio per ottenere risultati accurati.
  9. Calcolare il numero totale di cellule.
  10. Utilizzare la concentrazione totale di cellule vitali per determinare la semina cellulare negli esperimenti.
  11. Utilizzare cellule vitali con > 90% di vitalità.
  12. Distinguere tra cellule vitali (non colorate) e non vitali (colorate in blu).
    NOTA: I criteri di conteggio devono essere mantenuti costanti per tutti i campioni.

7. Semina degli sferoidi e ottimizzazione della dimensione

  1. Pipettare la sospensione cellulare su e giù per omogeneizzare la soluzione.
  2. Sezionare diverse densità cellulari da cellule HEK293T, Huh7, HEP3B, HEPG2 o HeLa.
  3. Iniziare seminando 1 x 104 cellule in 200 µL in una piastra ULA (ultra-low attachment) a 96 pozzetti con fondo rotondo.
  4. Diluire in serie le 1 x 104 cellule/pozzetto mediante diluizioni 2-fold fino a raggiungere la densità cellulare desiderata per gli esperimenti.
  5. Aggiungere 1 volume di mezzo completo a tutte le righe (1B-1H), tranne che nella riga superiore.
  6. Aggiungere 2 volumi di 1 x 104 cellule/pozzetto nella riga 1A (riga superiore).
  7. Diluire in serie la riga 1A aggiungendo 1 volume della riga 1A nella 1B e così via. Vedere l'esempio di disposizione sperimentale riportato di seguito in Supplementary Figure 1.
    NOTA: Assicurarsi di una risospensione uniforme battendo delicatamente sui lati della piastra.
  8. Centrifugare la piastra ULA a 350 × g per 5 minuti per far sedimentare le cellule al centro e favorire il contatto cellula-cellula.
    NOTA: Se si utilizzano linee cellulari diverse da quelle qui riportate, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione dei parametri, poiché linee cellulari diverse mostrano tassi diversi di crescita e formazione di sferoidi.
  9. Evitare di disturbare le piastre per le prime 24–48 ore per consentire la formazione iniziale dei sferoidi. Lasciare maturare i sferoidi per 3 giorni fino a raggiungere un diametro di circa 400 µm.
  10. Verificare l'uniformità delle dimensioni dei sferoidi. Assicurarsi che le cellule siano risospese uniformemente e che le piastre non siano deformate.
    Nota: Non utilizzare piastre con sferoidi di dimensioni non uniformi. Assicurarsi che i sferoidi abbiano un diametro relativamente uniforme all'interno di ciascun pozzetto.
  11. Monitorare la morfologia dei sferoidi.
    Nota: I sferoidi ben formati appaiono rotondi con margini ben definiti.
  12. Produrre sferoidi maturi che mostrino una marcata adesione cellula-cellula, non aggregati cellulari lenti.
  13. Aumentare la densità di semina o prolungare il tempo di formazione. Se i sferoidi non sono compatti, aumentare la densità di semina o prolungare il tempo di formazione.
  14. Minimizzare la presenza di numerosi aggregati piccoli riducendo la densità di semina o prolungando il passaggio di centrifugazione.

8. Monitoraggio in tempo reale di sferoidi in cellule vive

  1. Dopo aver centrifugato le sospensioni cellulari, trasferire la piastra in un incubatore a 37 °C (5% CO2, 95% di umidità), contenente uno strumento per l'immagine in tempo reale delle cellule vive per l'acquisizione automatizzata.
  2. Impostare i parametri per l'acquisizione in tempo reale degli sferoidi in base alle esigenze dell'esperimento:
    NOTA: I seguenti parametri sono stati utilizzati per tutte le linee cellulari testate.
  3. Accedere al software di acquisizione.
  4. Selezionare i seguenti comandi:|Programma acquisizione | Avvia aggiunta vaso | Scansiona in base al programma | Crea vaso: Nuovo.
  5. |Seleziona tipo di scansione|: Sferoide. |Seleziona i canali di interesse|: Fase + Campo chiaro (per seguire la crescita dello sferoide), Verde/Rosso (per seguire la trasduzione con AAV, tempo di acquisizione rispettivamente 300 ms o 400 ms).
  6. Selezionare l'ingrandimento desiderato: 10x.
  7. Scegliere il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto.
  8. Selezionare le posizioni delle pozzette da acquisire e il numero di immagini desiderato per pozzetta.
  9. Inserire la descrizione dell'esperimento: nome, tipo di cellule, numero di cellule.
  10. Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Posticipa analisi a dopo.
  11. Fare clic con il tasto destro sulla timeline e selezionare l'opzione Imposta intervallo gruppo scansioni selezionato.
  12. Impostare l'aggiunta di scansioni ogni 6 h e scansionare indefinitamente. Impostare l'orario di inizio desiderato (almeno 1 h dopo l'inizio dell'incubazione nell'apparato di imaging automatizzato).
  13. Verificare giornalmente la crescita degli sferoidi accedendo al software di imaging.
  14. Selezionare l'opzione Visualizza scansioni recenti e fare doppio clic sull'esperimento desiderato. |Selezionare Campo chiaro nel pannello dei canali immagine| e quindi utilizzare lo strumento |Misura immagine|  per misurare il diametro degli sferoidi.
    NOTA: Potrebbe essere necessario ottimizzare i tempi di maturazione per ottenere sferoidi compatti dalle cellule di interesse.
  15. Rimuovere la piastra nel giorno in cui si ottiene la formazione ottimale degli sferoidi e utilizzarla per la trasduzione con AAV.

9. Trasduzione con AAV

  1. Acquistare o produrre sierotipi di AAV3 e transgeni di interesse.
  2. Preparare il mezzo DMEM integrato con FBS al 2% per le trasduzioni con AAV aggiungendo 10 mL di FBS a 490 mL di mezzo DMEM.
    NOTA: Per lo screening di capside o elementi regolatori genomici, un transgene GFP è particolarmente efficace, come dimostrato nella sezione dei risultati rappresentativi. Diluire l'AAV di interesse nel mezzo DMEM integrato con FBS al 2%, senza antibiotici.
  3. Diluire in una piastra rotonda da 96 pozzetti designata per diluizioni seriali.
  4. Eseguire diluizioni 1:10 a partire dal MOI iniziale per titolare AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9.
  5. Consultare il layout sperimentale di esempio riportato di seguito nella Figura Supplementare 2. Calcolare il MOI necessario per la trasduzione con AAV, come illustrato nella sezione della Discussione.
  6. Aggiungere 33 µL di stock di AAV a 297 µL di mezzo per ottenere un volume totale di 330 µL con MOI pari a 1 × 106.
  7. Eseguire diluizioni seriali di ordine 10, partendo da un MOI di 1 × 106, aggiungendo 33 µL in 297 µL di mezzo DMEM con FBS al 2%.
    NOTA: Si raccomanda di evitare MOI elevati per prevenire una ridotta vitalità cellulare. Potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione delle condizioni sperimentali per ogni tipo cellulare e sierotipo di AAV, poiché questi fattori possono influenzare notevolmente il MOI ottimale. Non tutti i genomi virali sono infettivi; i titoli funzionali possono differire dal valore di vg/mL.

10. Dosaggio di AAV

  1. Aspirare tutto il mezzo dalla piastra di sferoidi già preparata utilizzando una pipetta multicanale.
  2. Aggiungere 100 µL del MOI desiderato trasferendo questo volume dalla piastra di diluizione alla piastra di trattamento, utilizzando una pipetta multicanale.
  3. Riposizionare le piastre nell'apparato di imaging e iniziare il monitoraggio della trasduzione tracciando l'intensità fluorescente verde per 72 h.
  4. Aggiungere 100 µL di mezzo DMEM completo per pozzetto ogni 3 giorni per reintegrare i nutrienti, se il monitoraggio supera i 3 giorni.

11. Imaging in tempo reale su cellule vive, monitoraggio della trasduzione e analisi dei dati

  1. Rimettere la piastra nell'apparecchio dopo aver aggiunto l'AAV e il MOI desiderati al gruppo di trattamento.
  2. Iniziare a registrare l'efficienza di trasduzione ogni 6 ore.
    NOTA: di solito occorrono tra 3 e 5 giorni per ottenere un'espressione ottimale di GFP. Ciò dipende dal promotore e dalla configurazione del genoma utilizzata.
  3. Analizzare i dati creando una definizione di analisi specifica per le cellule e i geni reporter di interesse.
    NOTA: in alternativa, mantenere la piastra in un incubatore standard a 37 °C e valutare l'efficienza di trasduzione mediante qPCR, western blotting o ELISA.
  4. Definire i parametri di analisi eseguendo un'analisi in campo chiaro per il rilevamento degli sferoidi primari.
  5. Ottimizzare i parametri di segmentazione come segue:
    1. Tipo di analisi: "Spheroid Brightfield."
    2. Metodo di segmentazione: "Adaptive Threshold."
    3. Intervallo di soglia: 0,3–0,8 (si consiglia inizialmente l'adattamento automatico)
    4. Filtro top-hat: 200–500 µm (elimina l'illuminazione non uniforme)
  6. Ottimizzare i parametri in campo chiaro come segue:
    1. Caricare immagini rappresentative da diversi punti temporali.
    2. Verificare l'intervallo di soglia (0,2–0,9) per individuare il rilevamento ottimale.
    3. Regolare i filtri dimensionali in base all'intervallo dimensionale atteso degli sferoidi.
    4. Convalidare la segmentazione mediante ispezione visiva del sovrapposizione.
  7. Ottimizzare il canale verde per la valutazione della trasduzione AAV come segue:
    1. Determinare i livelli di fondo delle pozzette non trattate (MOI=0).
    2. Impostare la soglia a 2–3× al di sopra del rumore di fondo.
    3. Verificare con il campione trattato con il MOI più elevato.
  8. Ottimizzare il tempo di esposizione per evitare la saturazione mantenendo il segnale
    NOTA: per le trasduzioni AAV, riportare il segnale di fluorescenza totale per sferoide come misura dell'efficienza di trasduzione.

12. Analisi dei dati

  1. Selezionare i parametri corretti, regolando i filtri e le maschere, in modo da selezionare le cellule nell'immagine e non il rumore di fondo.
  2. Selezionare un'immagine rappresentativa per addestrare il software.
  3. Applicare i parametri ottimizzati a tutte le immagini dello studio.
  4. Estrarre i dati, sia con valori individuali che raggruppati, e trasferirli a un sistema di analisi statistica per ulteriori presentazioni dei dati.

13. Calcolo del tempo di insorgenza

  1. Calcolare il tempo necessario per rilevare il primo segnale GFP per ogni MOI.
  2. Eseguire l'interpolazione sui valori medi dei pozzetti non trattati (MOI = 0) + 3 Deviazioni Standard (SD).
  3. Copiare l'intensità della fluorescenza verde di ogni sferoide in ogni punto temporale dal software di imaging in tempo reale a un software statistico.
  4. Fare la media delle replicazioni.
  5. Calcolare i segnali medi e le SD di tutti i pozzetti contenenti sferoidi non trattati (MOI = 0).
  6. Utilizzare l'interpolazione con curva sigmoidea asimmetrica a 5 parametri (5PL) per determinare il tempo di insorgenza per ogni MOI.
  7. Ad esempio, i seguenti valori di interpolazione sono stati utilizzati nella Tabella 1:
    1. Per scGFP: 254.955 (media) + 3 × 288.055 (SD) = 1.412.120 (segnale di interpolazione)
    2. Per ssGFP: 2.417.941(media) + 3 × 26.093  (SD) =  3.200.746 (segnale di interpolazione)

14. Misurare la fluorescenza con un lettore di piastre dotato di funzionalità di fluorescenza.

  1. Avviare il software del lettore di piastre a fluorescenza sul computer collegato al lettore di piastre.
  2. Naviga a File > Apri Protocollo e selezionare il tipo di piastra (ad esempio, 96 pozzetti, 384 pozzetti) e verificare che sia stata scelta la disposizione corretta dei pozzetti. 
  3. Impostare il tempo di integrazione per il rilevamento della fluorescenza, che determina per quanto tempo il lettore raccoglie la fluorescenza da ogni pozzetto.
  4. Regolare qualsiasi guadagno o sensibilità impostazioni
    se il saggio richiede più elevato o inferiore segnale rilevamento
  5. Impostare i parametri fluorescenti per la GFP come segue: eccitazione: 485 nm ed emissione: 528 nm.
  6. Fare clic su Esegui nel software per avviare la misurazione.
  7. Misurare fluorescenza da ogni bene.
    NOTA - Al termine della corsa, il software visualizza i valori grezzi di fluorescenza, che possono essere utilizzati per generare grafici calcolando le medie e sottraendo il fondo.
  8. Esporta risultati in il preferito formato per ulteriore analisi o segnalazione.
    NOTA: Se il protocollo del campione è stato modificato, utilizzare File > Salva con nome per creare una versione unica, preservando l'originale per un uso futuro.

15. Trasduzione del transgene luminiscente

  1. Seguire lo stesso protocollo di semina e dosaggio di AAV descritto in precedenza.
  2. Aggiungere 100 µL di AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9 contenenti un transgene codificante per la nano luciferasi con diversi MOI compresi tra 0–106 a 100 µL di sferoidi di HeLa già cresciuti in piastre ULA.
  3. Incubare le piastre in un normale incubatore a 37 °C e valutare l'efficienza di trasduzione dopo 3 giorni di trasduzione.

16. Preparare l'inibitore della luminescenza extracellulare e il substrato per la rilevazione della luminescenza in saggi su cellule vive

  1. Rimuovere le piastre del saggio dall'incubatore al giorno 3 (punto terminale).
  2. Aggiungere direttamente alle cellule l'inibitore della luminescenza extracellulare e il substrato.
    NOTA: Non è necessario rimuovere il mezzo.
  3. Estrarre l'inibitore extracellulare dallo stoccaggio a −20 °C e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente.
  4. Centrifugare brevemente per raccogliere il liquido dalla chiusura e dalle pareti del tubo.
  5. Preparare la quantità desiderata di inibitore della luminescenza extracellulare ricostituito 15X combinando 1 volume di inibitore extracellulare con 14 volumi di mezzo DMEM completo.
    1. Ad esempio, se l'esperimento richiede 1,0 mL di reagente, aggiungere 67 µL di inibitore a 933 µL di DMEM. Per 1 piastra, preparare 1 mL di DMEM e aggiungere 67 µL di inibitore.
  6. Trasferire l'inibitore preparato al passaggio 16.5 in un serbatoio sterile per reagenti.
  7. Utilizzare una pipetta multicanale per dispensare 10 µL di inibitore nei pozzetti trasdotti con AAV.
  8. Estrarre il substrato per cellule vive dallo stoccaggio a −20 °C e mescolare.
  9. Centrifugare brevemente per raccogliere il liquido dalla chiusura e dalle pareti del tubo.
  10. Preparare la quantità desiderata di reagente per cellule vive ricostituito 3,6X.
  11. Preparare 4 mL di DMEM e aggiungere 144 µL di substrato per 1 piastra.
  12. Trasferire il substrato preparato al passaggio 16.11 in un serbatoio sterile per reagenti.
  13. Utilizzare una pipetta multicanale per dispensare 50 µL di substrato negli stessi pozzetti trasdotti con AAV.
    NOTA: Il volume dei reagenti potrebbe dover essere adattato se si eseguono contemporaneamente più piastre per saggio.
  14. Agitare la piastra a 300 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente.
  15. Leggere la piastra con uno strumento di imaging in vivo entro 2 ore dall'aggiunta dei reagenti per il rilevamento della luminescenza.
    NOTA: L'intensità della luminescenza decrescerà gradualmente nel corso di 2 ore.

17. Imaging mediante bioluminescenza

  1. Accendere il sistema di imaging bioluminescente almeno 30 minuti prima dell'acquisizione per permettere al raffreddamento della camera CCD (−90 °C).
  2. Assicurarsi che le piastre siano pronte per l'acquisizione (ad esempio, aggiunto il substrato per imaging cellulare vitale per la lettura della bioluminescenza).
  3. Rimuovere il coperchio della piastra per evitare riflessioni e dispersione della luce.
  4. Pulire il fondo della piastra se si esegue l'imaging dal basso.
  5. Posizionare la piastra nella camera di imaging sullo stage.
  6. Centrare la piastra sotto la camera.
  7. Impostare i parametri di imaging per la luminescenza: esposizione automatica oppure impostare il tempo di esposizione (tipicamente 1–60 s), binning (consigliato medio), f/stop (1 per massima sensibilità).
  8. Acquisire una fotografia come riferimento anatomico.
  9. Acquisire l'immagine luminosa.

18. Analisi dei dati di imaging della bioluminescenza

  1. Utilizzare gli strumenti di ROI per delimitare le pozzette o le aree di interesse.
  2. Assicurarsi che le dimensioni dell'ROI siano costanti tra i campioni per poterli confrontare.
  3. Misurare il flusso totale (fotoni/secondo) per la bioluminescenza.
  4. Misurare l'efficienza radiante.
  5. Esportare i dati in un foglio elettronico per l'analisi statistica.
  6. Salvare i file delle immagini e i risultati dell'analisi.
  7. Esportare le immagini in formato TIFF o JPEG per le presentazioni.

Risultati

Qui, mostriamo che gli sferoidi 3D possono essere utilizzati come strumento per valutare la trasduzione da parte di AAV, distinguere tra progetti di genoma virale come quelli auto-complementari (sc) e a singolo filamento (ss), e analizzare la cinetica della trasduzione. Una panoramica del processo è mostrata in Figura 1. Brevemente, le cellule vengono inizialmente espanse in colture 2D e seminate in piastre a adesione ultra-bassa (ULA) per formare sferoidi compatti (Figura 1A). Successivamente, le piastre vengono centrifugate per favorire l'aggregazione (Figura 1B) e trasferite in un sistema di imaging per cellule vive per il monitoraggio in tempo reale della formazione degli sferoidi (Figura 1C). Al terzo giorno, gli sferoidi vengono trasdotti con AAV a diversi MOI (Figura 1D). La cinetica della trasduzione viene seguita longitudinalmente mediante imaging in tempo reale (Figura 1E), e l'analisi finale viene effettuata utilizzando letture di fluorescenza o luminescenza basate su piastre (Figura 1F).

Figura 2 mostra la morfologia di sferoidi derivati da 6 linee cellulari diverse, dimostrando una gamma di densità, rotondità e forma. Tutte le linee cellulari sono state coltivate in mezzo DMEM completo per alcune passaggi prima di essere utilizzate in qualsiasi esperimento. Una volta raggiunta la fase logaritmica, le cellule HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 e Huh7 sono state raccolte e diluite in serie in piastre a fondo rotondo ULA, partendo da una densità cellulare di 10.000 cellule per pozzetto, con diluizioni seriali effettuate per dimezzamento (schema della piastra incluso in Supplementare Figura 1 e risultati rappresentativi sono mostrati in Figura supplementare 2). La dimensione degli sferoidi può essere piccola quanto 50 µm mantenendo comunque la struttura degli sferoidi e un'eccellente suscettibilità alla trasduzione. Dopo la semina cellulare, la piastra rotonda a fondo piatto ULA è stata centrifugata a 350 × g. per 5 min, favorendo la congregazione delle cellule al centro della pozzetta e l'autoassemblaggio in sferoidi. Questo passaggio è particolarmente utile per cellule che non tendono naturalmente ad aggregarsi. La centrifugazione può essere prolungata da 5 a 15 min per cellule particolarmente resistenti, come i linfociti. Gli sferoidi ben formati presentano un fenotipo rotondo e compatto, come osservato nelle cellule HEK293T e Huh7, mentre gli sferoidi mal formati sono aggregati in modo lasso e soggetti a disintegrazione durante il cambio del mezzo.

Successivamente, la piastra viene trasferita in un incubatore a 37 °C dotato di uno strumento per il monitoraggio in tempo reale delle cellule vive. Le piastre vengono monitorate quotidianamente a intervalli di 6 h per valutare la formazione degli sferoidi per ciascuna delle linee cellulari riportate in questo studio. La maggior parte delle linee cellulari richiede 3 giorni per autoassemblarsi in uno sferoide. Come mostrato in Figura 2, ciascuna linea cellulare ha mostrato caratteristiche morfologiche distinte e diversi livelli di compattazione dopo 3 giorni di semina. Le linee cellulari epatiche (Huh7, HEPG2 e HEP3B) hanno formato sferoidi più compatti e densi rispetto alle altre linee cellulari. HEK293T ha formato un aspetto sferico molto rotondo con un core necrotico ben definito, mentre A375 ha formato un aggregato cellulare di forma irregolare (descritto in precedenza come sferoide deformato)18,19. Si ritiene che queste differenze morfologiche siano indicatori di stati fisiopatologici delle malattie, il che conferma ulteriormente l'utilità dei modelli 3D rispetto ai sistemi di coltura 2D18,19. Il protocollo di assemblaggio degli sferoidi è altamente riproducibile tra le sei linee cellulari testate ed è stato applicato a tutte le trasduzioni mostrate in questo lavoro.

Dopo aver ottimizzato la concentrazione cellulare, il tempo di formazione degli sferoidi e lo stato della fluorescenza autofluorescente verde/rossa (mostrato nella Figura Supplementare 3), siamo passati a testare la trasduzione con AAV negli sferoidi utilizzando un sistema di imaging su cellule vive e un lettore di piastre (un esempio del layout della piastra per la titolazione di AAV è mostrato nella Figura Supplementare 4). Figura 3 mostra il protocollo ottimizzato per gli sferoidi applicato in quattro linee cellulari diverse (HEK293T, Huh7, HEP3B e HEPG2). Al terzo giorno di formazione degli sferoidi, gli sferoidi sono stati trasdotti con due vettori AAV2 contenenti disegni distinti del genoma virale, marcati con GFP, a diverse multiplicità di infezione (MOI). Questi due disegni del transgene AAV rappresentano varianti di GFP ad alta potenza (scGFP) e a bassa potenza (ssGFP). Dopo la trasduzione, le piastre sono state posizionate in un sistema di imaging su cellule vive per il monitoraggio in tempo reale della trasduzione con AAV. Al punto temporale di 72 ore, l'intensità della fluorescenza verde è stata rilevata mediante un software di imaging su cellule vive. In Figura 3, le linee blu rappresentano i genomi sc-GFP, mentre le linee rosse rappresentano i genomi ss-GFP. Gli sferoidi si sono dimostrati altamente suscettibili alla trasduzione con AAV, con una trasduzione intensa rilevata a titoli molto bassi di AAV e in diverse linee cellulari per scGFP. Video rappresentativi della trasduzione con AAV in diverse linee cellulari e MOI, acquisiti in tempo reale, sono mostrati nei Video Supplementare 1, Video Supplementare 2, Video Supplementare 3, Video Supplementare 4, Video Supplementare 5 e Video Supplementare 6. D'altro canto, la trasduzione degli sferoidi con AAV ssGFP è stata osservata a livelli più bassi, confermando la prevista trasduzione più debole/lenta di questo tipo di elemento regolatorio20,21. Questo dimostra l'utilità degli sferoidi tridimensionali per studiare trasduzioni con AAV forti e deboli, nonché per discriminare tra geni ad alta trasduzione, come sc-GFP, e geni meno potenti, come ss-GFP. Abbiamo osservato una differenza di 100 volte nell'intensità di fluorescenza relativa tra i transgeni sc e ss a un MOI di 106 nelle cellule HEK293T, e una differenza di 3 volte in linee cellulari più difficili da trasdurre, come HEP3B.

Siamo quindi passati a testare la trasduzione AAV di diversi sierotipi in maniera dose-dipendente sia negli sferoidi HEK293T che negli sferoidi Huh7. Come mostrato nella Figura 4, gli sferoidi tridimensionali si sono dimostrati suscettibili alla trasduzione mediante AAV-scGFP con quattro diversi sierotipi. Dopo 72 ore di trasduzione, lo scGFP è stato misurato utilizzando un lettore a piastra fluorescente (Figura 4A,B) e un software di imaging cellulare in tempo reale (Figura 4C,D). Tutti e quattro i sierotipi sono stati rilevati con successo utilizzando questi due strumenti. Il sistema di imaging cellulare in tempo reale ha mostrato un rapporto segnale-rumore maggiore rispetto al lettore a piastra fluorescente, sebbene il segnale normalizzato non abbia evidenziato differenze significative. Abbiamo riscontrato che l'AAV2 presentava l'efficacia di trasduzione più elevata in entrambe le linee cellulari, seguito dall'AAV1, mentre l'AAV5 e l'AAV9 mostravano una trasduzione significativamente inferiore.

Successivamente, abbiamo valutato la trasduzione mediante luminescenza utilizzando il protocollo per sferoidi. A tal fine, le cellule HeLa sono state coltivate in sferoidi tridimensionali seguendo il protocollo ottimizzato descritto in questo lavoro. Al terzo giorno, i sferoidi di cellule HeLa sono stati trasdotti con 5 diversi sierotipi di AAV che codificano per un gene reporter nano luciferasi. Dopo 72 ore di trasduzione con AAV, le cellule sono state trattate con il substrato per cellule vive e incubate per 5 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, la luminescenza è stata misurata e acquisita mediante un sistema di imaging bioluminescente (Figura 5A). È stata osservata una trasduzione efficiente per tutti i sierotipi di AAV utilizzando questo sistema. È stata rilevata una discriminazione sensibile tra l'efficacia di trasduzione dei diversi sierotipi di AAV, indicando che il protocollo non è limitato a letture di fluorescenza. In accordo con le tendenze osservate in Figura 5, la trasduzione con AAV-nano luciferasi nelle cellule HeLa ha mostrato che AAV2 è il sierotipo più potente, come già osservato con i vettori AAV-GFP. Analogamente, l'efficacia di trasduzione più bassa è stata osservata per il sierotipo AAV9, come dimostrato sia dai vettori fluorescenti che da quelli luminescenti (Figura 4 e 5). Un'immagine rappresentativa della trasduzione con AAV-nano luciferasi è mostrata in Figura 5B.

Oltre all'intensità della trasduzione, i protocolli con sferoidi 3D permettono il monitoraggio cinetico della trasduzione. Figura 6 mostra risultati rappresentativi delle cinetiche di trasduzione di sferoidi 3D di HEK293T mediante AAV2-scGFP e AAV2-ssGFP, quando trasdotti a diversi MOI (0-106) (Figura 6A-G). Abbiamo osservato che la trasduzione con AAV2-scGFP è rilevabile già a MOI pari a 101, con un aumento del segnale GFP rilevabile dopo circa 34 h rispetto alle cellule non trattate, utilizzando un sistema di imaging su cellule vive. Il segnale di AAV2-ssGFP è molto più debole e lento rispetto a quello di AAV2-scGFP. Per confrontare ulteriormente la velocità di trasduzione, abbiamo calcolato il tempo di insorgenza, ovvero il momento in cui il segnale GFP diventa rilevabile. Abbiamo osservato che scGFP trasduce le cellule in media 4 volte più velocemente di ssGFP. I tempi di insorgenza individuali sono riportati in Tabella 1. Queste misurazioni cinetiche evidenziano un ulteriore aspetto dell'efficacia della trasduzione, utile per l'ottimizzazione dei saggi.

Diagramma del flusso di lavoro della coltura cellulare: formazione di sferoidi, transduzione e analisi mediante IncuCyte.
Figura 1: Panoramica delle transduzioni con AAV utilizzando colture tridimensionali. (A) Le cellule vengono espanse in coltura bidimensionale e seminate in piastre a adesione ultra-bassa (ULA) per formare sferoidi. (B) Le piastre vengono centrifugate per favorire l'aggregazione e successivamente trasferite a un (C) sistema IncuCyte S3 per il monitoraggio in tempo reale della formazione dei sferoidi. (D) Al terzo giorno, i sferoidi vengono transdotti con AAV a diversi MOI. (E) La cinetica della transduzione viene monitorata longitudinalmente mediante imaging su cellule vive, e (F) l'analisi finale può essere eseguita utilizzando letture di fluorescenza o luminescenza basate su piastre. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 

Confronto tra sferoidi in coltura cellulare; immagine al microscopio di sei linee cellulari diverse nel contesto dell'esperimento.
Figura 2: Caratterizzazione morfologica dei sferoidi in diverse linee cellulari. Le immagini rappresentative dei sferoidi ottenuti dalle linee cellulari HEP3B, HEK293T, A375, HeLa, HEPG2 e Huh7 mostrano variabilità per dimensione, morfologia e compattezza, pur garantendo un'elevata riproducibilità tra i replicati (barra della scala, 50 µm). Tutte le linee cellulari sono state seminate a una densità di 1 x 104 cellule/pozzetto per 3 giorni. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi dell'espressione genica in cellule marcate con GFP; MOI rispetto alla fluorescenza, linee cellulari multiple, grafico, immagini.
Figura 3: Confronto dell'efficienza di trasduzione di AAV tra vettori self-complementari (scGFP) e a filamento singolo (ssGFP) in diverse linee cellulari. Sferoidi tridimensionali di (A) HEK293T, (B) Huh7, (C) HEP3B e (D) HEPG2 sono stati assemblati autonomamente e trasdotti con diversi MOI di AAV2-scGFP (blu) e AAV2-ssGFP (rosso). L'intensità totale di fluorescenza verde è stata quantificata a 72 h dalla trasduzione. Immagini rappresentative di sferoidi trattati al MOI più elevato per ciascun AAV, acquisite dopo 72 h mediante un sistema di imaging su cellule vive. Le barre della scala corrispondono a 200 µm. Le barre di errore indicano la DS. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura. 

Grafici di intensità della fluorescenza per sierotipi di AAV in cellule HEK293T e Huh7; MOI, variabile temporale.
Figura 4: La trasduzione da AAV in sferoidi 3D distingue l'attività di diversi sierotipi di AAV. Sferoidi 3D derivati da (A,C) cellule HEK293T e (B,D) Huh7 sono stati trasdotti con AAV1, AAV2, AAV5 e AAV9, contenenti il transgene scGFP, in un intervallo di MOI. Le unità di intensità fluorescente sono state misurate a 72 h mediante un lettore di piastre basato sulla fluorescenza (A,B) e un sistema di imaging su cellule vive (C,D). Le barre di errore rappresentano la DS. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Grafico dell'efficienza di trasduzione di AAV e mappa termica; MOI rispetto al flusso totale; analisi del vettore virale.
Figura 5: Trasduzione di AAV in sferoidi 3D con reporter luminiscenti. Sferoidi di HeLa sono stati trasdotti con AAV1, AAV2, AAV5, AAV8 e AAV9 che codificano per un transgene reporter nanoluciferasi a MOI crescenti. La luminescenza è stata visualizzata e misurata mediante una lettura finale utilizzando un sistema di imaging luminiscente 72 h dopo la trasduzione. (A) Valori di Flusso Totale. (B) Lettura rappresentativa a tempo finale con immagini luminiscenti di piastre di sferoidi che mostrano la distribuzione del segnale al variare dei MOI e dei sierotipi. Ogni vettore AAV è stato eseguito in due replicati orizzontali. Le barre di errore rappresentano la DS. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Analisi dell'espressione genica; grafici MOI rispetto al tempo; intensità della fluorescenza di sgGFP; risultati sperimentali.
Figura 6: Valutazione della cinetica di trasduzione in sferoidi 3D. I sferoidi di HEK293T sono stati trasdotti con AAV2-scGFP (blu) e AAV2-ssGFP (rosso) in un intervallo di 7 MOI (A–G). L'intensità verde totale è stata misurata nell'arco di 72 ore, con intervalli di 6 ore, utilizzando il sistema Monitor per la formazione/crescita dei sferoidi. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

MOIscGFP (ore)ssGFP (ore)
1>72 ore>72
1034,2>72
10016,554,2
10005,623,1
100003,313
1000001,98

Tabella 1: Tempo di insorgenza della rilevazione della GFP.

Figura supplementare 1: Disposizione delle piastre per la titolazione degli sferoidi. (A) Disposizione rappresentativa della piastra che mostra lo schema di diluizione per gli sferoidi di HEK293T, Huh7, HEP3B e HEPG2, ottenuti da densità iniziali di semina comprese tra 10.000 e 78 cellule. Cliccare qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Formazione di sferoidi in un intervallo di densità di semina. Immagini microscopiche rappresentative di sferoidi di HEK293T e Huh7 ottenuti da densità iniziali di semina comprese tra 10.000 e 78 cellule al giorno 3. La barra delle scale corrisponde a 50 µm.Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 3: Informazioni sulle linee cellulari per la formazione di sferoidi 3D.Cliccare qui per scaricare il file.

Figura supplementare 4: Schema della piastra per le diluizioni seriali di AAV. (A) Schema rappresentativo della disposizione sulla piastra che mostra lo schema di diluizione seriale di AAV utilizzato per AAV1, AAV2, AAV5 e AAV9, a partire da un MOI di 106. Il controllo negativo è indicato nella riga H e rappresenta sferoidi non trattati.Cliccare qui per scaricare questo file.

Filmato supplementare 1: Acquisizione in tempo reale dell'immagine di cellule vive durante la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi di HEK293T a un MOI di 106.Cliccare qui per scaricare il file.

Filmato supplementare 2: Immagini in tempo reale di cellule vive durante la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi di Huh7 a un MOI di 106.Cliccare qui per scaricare il file.

Filmato supplementare 3: Imaging in tempo reale di cellule vive per la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi HEP3B a MOI 106.Cliccare qui per scaricare il file.

Filmato supplementare 4: Acquisizione in tempo reale dell'immagine di cellule vive durante la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi HEK293T a MOI 106, come parte di uno studio sulla dipendenza dalla dose.Cliccare qui per scaricare il file.

Filmato supplementare 5: Acquisizione in tempo reale di cellule vive durante la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi di HEK293T a un MOI di 104.Cliccare qui per scaricare il file.

Filmato supplementare 6: Immagini in tempo reale di cellule vive durante la trasduzione di AAV2-scGFP in sferoidi di HEK293T a un MOI di 101.Cliccare qui per scaricare il file.

File Supplementare 1: Calcolo del MOI necessario per la trasduzione con AAV.Cliccare qui per scaricare questo file.

Discussione

Presentiamo qui una piattaforma tridimensionale in vitro  semplificata per lo sviluppo e il test dell'efficacia degli AAV. Questa piattaforma sfrutta un'efficienza di trasduzione maggiore, un'elevata sensibilità e una previsione traducibile migliore, utilizzando colture cellulari tridimensionali che riproducono più fedelmente l'architettura del tessuto umano. Il sistema riesce a distinguere con successo l'efficacia di trasduzione tra diversi sierotipi di AAV ed elementi regolatori, inclusi vettori a singolo filamento e auto-complementari, in molteplici linee cellulari. Si osserva che, a differenza dei saggi convenzionali in 2D, in cui l'efficienza di trasduzione è spesso definita come la percentuale di cellule positive per il transgene, il sistema di sferoidi 3D non consente facilmente una quantificazione con risoluzione a livello cellulare singolo. Pertanto, in questo studio l'efficienza di trasduzione è definita come l'intensità complessiva del segnale del reporter (fluorescente o luminescente), che riflette il contributo combinato della proporzione di cellule trasdotte e del livello di espressione del transgene per cellula. L'elevata sensibilità dei sferoidi riduce notevolmente la necessità di elevate quantità di prodotto, rendendo il sistema economico, versatile e fisiologicamente rilevante per la ricerca e lo sviluppo degli AAV.

Questo approccio affronta le principali sfide associate ai tradizionali saggi di coltura cellulare in 2D, che si basano sull'adesione a superfici artificiali e mancano di organizzazione cellulare, il che potrebbe portare a previsioni inaccurate dell'efficacia dei vettori in ambito clinico. Il sistema di sferoidi in 3D riproduce meglio la struttura del tessuto e i modelli di distribuzione dei farmaci, fornendo dati sul comportamento dei vettori che rispecchiano più fedelmente le reali condizioni biologiche22,23. Il protocollo utilizza piastre semplici a bassissimo attaccamento, rendendolo facilmente riproducibile in condizioni di laboratorio standard.

Questo sistema versatile potrebbe essere utilizzato per saggi di neutralizzazione di AAV, per studiare la penetrazione di AAV e per sviluppare esperimenti di co-coltura più complessi al fine di indagare gli effetti di diversi ambienti cellulari sulla trasduzione mediata da AAV. Inoltre, piattaforme ad alto rendimento per lo screening di farmaci e vettori possono essere facilmente integrate con la piattaforma di sferoidi, consentendo l'automazione e la riduzione dei costi nei flussi di lavoro per la scoperta di vettori, al fine di sviluppare prodotti più mirati.

Un importante vantaggio pratico degli sferoidi è la loro capacità di crescere ininterrottamente per settimane senza passaggi cellulari, consentendo studi prolungati dell'attività dei virus AAV. Questo sistema di coltura stabile mantiene importanti interazioni tra le cellule e componenti della matrice, evitando le interruzioni causate dai ripetuti prelievi cellulari necessari nelle colture in 2D24. L'ambiente cellulare preservato supporta l'organizzazione naturale delle proteine e le strutture della membrana, essenziali per valutare il legame e l'ingresso dei virus AAV nelle cellule25.

Sebbene gli sferoidi 3D mostrino un notevole potenziale per le valutazioni della trasduzione da parte dei virus adeno-simili (AAV), presentano anche alcune limitazioni rispetto ai modelli in vivo , principalmente a causa della loro struttura semplificata rispetto ai tessuti nativi. Gli sferoidi non includono componenti fisiologici essenziali, come la vascolarizzazione per il rilascio del vettore, le cellule immunitarie per la valutazione dell'immunogenicità e le barriere specifiche dei tessuti, ad esempio la barriera emato-encefalica, che potrebbero influenzare in modo significativo l'efficacia degli AAV26. Queste limitazioni indicano che, nonostante gli sferoidi offrano un livello intermedio di complessità tra le colture convenzionali in 2D e i modelli animali in vivo, rimangono insufficienti a riprodurre completamente il microambiente fisiologico necessario per una valutazione completa degli AAV.

Il protocollo degli sferoidi presentato qui descrive un singolo tipo cellulare alla volta. Questo protocollo può essere sviluppato per includere da 2 a 3 tipi cellulari aggiuntivi che si aggregano in una struttura tridimensionale di base. Modelli 3D più complessi, come gli organoidi o i sistemi microfluidici, sono sistemi multicellulari che riproducono la diversità cellulare e l'organizzazione di organi specifici, contenenti 10 o più tipi cellulari distinti disposti secondo schemi simili a quelli dei tessuti. Tali organoidi 3D avanzati possono includere colture di cellule multiple27, colture incorporate in idrogel, tecniche a goccia sospesa e piattaforme microfluidiche11,27,28. Sebbene questi metodi offrano un'architettura tissutale più complessa che potrebbe contribuire a una migliore comprensione della biologia dei virus AAV, richiedono in genere reagenti e attrezzature più specializzati e una notevole competenza tecnica. Al contrario, gli sferoidi 3D formati in piastre con adesione ultra-bassa sono notevolmente più semplici e risultano adatti a molti laboratori grazie al loro basso costo e alla riproducibilità.

Tra i passaggi critici per l'implementazione corretta di questo protocollo vi è il mantenimento di un'elevata vitalità cellulare, poiché cellule compromesse possono alterare la formazione degli sferoidi e l'efficienza di trasduzione. L'uso di piastre a adesione ultra-bassa e l'ottimizzazione della centrifugazione sono altrettanto fondamentali per ottenere sferoidi compatti. È essenziale ottimizzare il MOI per ogni tipo cellulare e sierotipo di AAV al fine di evitare segnali deboli o fenomeni di saturazione. La scelta del metodo di rilevamento appropriato è anch'essa cruciale, in particolare per analisi cinetiche, nelle quali è richiesta la compatibilità con sistemi di imaging cellulare vitale continuo. Diversi aspetti tecnici sono importanti per un'interpretazione accurata della trasduzione AAV in sferoidi tridimensionali.

Un segnale di trasduzione scarso o assente può derivare da una titolazione virale bassa, da un MOI subottimale o da un tempo di incubazione insufficiente; questo problema può essere risolto verificando i titoli virali, ottimizzando l'MOI e prolungando il tempo di incubazione (tipicamente 3–5 giorni). Segnali di fluorescenza o luminescenza deboli possono indicare un'espressione bassa del transgene o una penetrazione limitata del reagente all'interno della struttura tridimensionale, aspetti che possono essere migliorati ottimizzando le impostazioni di esposizione o concedendo ulteriore tempo per la diffusione del substrato. Una difficoltà significativa in alcune linee cellulari, come le cellule HeLa, è l'autofluorescenza, che può causare un segnale di fondo elevato e una sensibilità ridotta nei saggi basati sulla fluorescenza. Per affrontare questa limitazione, abbiamo implementato un sistema di reporter basato sulla nanoluciferasi luminescente, che garantisce un rapporto segnale-rumore migliore e consente un rilevamento più accurato della trasduzione in presenza di sfondi autofluorescenti. Inoltre, il segnale di fondo può derivare da una soglia impostata in modo errato o da fluorescenza legata al mezzo; pertanto, va controllato utilizzando pozzetti non trattati (MOI = 0) per definire i livelli di base. Infine, la saturazione del segnale a valori elevati di MOI può verificarsi a causa di un eccesso di virus o di limitazioni del rilevatore; tale fenomeno può essere attenuato riducendo l'intervallo di MOI e ottimizzando le impostazioni di esposizione del rilevatore per mantenere le misurazioni entro il range dinamico lineare.

Nel complesso, questa metodologia basata su sferoidi 3D fornisce un sistema semplificato e riproducibile per valutare la trasduzione, la potenza e la cinetica dei vettori AAV. Colmando il divario tra i saggi convenzionali in 2D e gli studi in vivo, essa consente uno sviluppo dei vettori più informato e supporta il progresso di strategie di terapia genica clinicamente rilevanti.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano Morten Seirup e Trish Hoang per aver fornito il plasmide per la produzione di nanoluciferasi AAV e i reagenti del substrato vivente. Questo progetto è stato sostenuto da un'assegnazione al Programma di Partecipazione alla Ricerca ORISE presso il CBER, U.S. Food and Drug Administration, gestito dall'Istituto Oak Ridge per la Scienza e l'Istruzione nell'ambito di un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e la FDA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Incubatrice a 37 °CThermoFisher Scientific#51025983Condizioni standard di coltura
Cellule A375ATCCCRL-1619Linea cellulare
Plasmide AAV1Addgene112862Plasmide AAV
Plasmide AAV2Addgene104963Plasmide AAV
Plasmide AAV5Addgene104964Plasmide AAV
Plasmide AAV8Addgene112864Plasmide AAV
Plasmide AAV9Addgene112865Plasmide AAV
Lettore di piastre BioTek GEN5Agilent TechnologiesNARilevazione finale di fluorescenza o luminescenza
CentrifugaThermoFisher Scientific#TSO-MX1RMantenere la sospensione degli sferoidi
Corning™ Soluzione salina tamponata al fosfato per colture cellulari (1X)Fisher Scientific#MT21040CMXPBS per risciacquare le cellule
DMEM ad alto contenuto di glucosio, integrato con GlutaMAX e piruvatoThermoFisher Scientific#10569010Mezzo di crescita completo
Inibitore Extracellular NanoLuc PromegaN235BElimina qualsiasi segnale di Nanoluc® proveniente dall'ambiente extracellulare  
Serum bovino fetale (FBS)Sigma-Aldrich#F4135-500mLFornire fattori di crescita
Cellule HEK293TATCCCRL-3216Linea cellulare
Cellule HeLaATCCCRM-CCL-2Linea cellulare
Cellule HEP3BATCCHB-8064Linea cellulare
Cellule HEPG2ATCCHB-8065Linea cellulare
Cellule Huh7ABMT8973Linea cellulare
Microscopio invertito IncuCyte S3SartoriusNAMonitoraggio della formazione e crescita degli sferoidi
Imager IVIS SpectrumSpectralinvivoNARilevazione finale della luminescenza
Saggio cellulare vivente Nano-Glo® PromegaN2013Reagente substrato luminescente per il rilevamento in cellule vive
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific# 15140122Prevenire la contaminazione batterica
Flaconi per colture tessutali T75 con ventilazioneFisher Scientific#NC0509296 Flaconi per la crescita delle cellule
Tripsina-EDTA (0,05%)ThermoFisher Scientific#25300120Distacco enzimatico delle cellule
Piastre con attaccamento ultra-bassoCorning#7007Impedire l'adesione cellulare per favorire la formazione di sferoidi

Riferimenti

  1. Mendell JR, et al. Current Clinical Applications of In Vivo Gene Therapy with AAVs. Mol Ther. 2021;29(2):464-88.
  2. Byrne BJ, et al. Current clinical applications of AAV-mediated gene therapy. Mol Ther. 2025;33(6):2479-516.
  3. Najera SS, et al. AAV2 delivery of the saCas9 gene results in presentation of an HLA-A*02:01-restricted T cell epitope potent to induce T cell cytotoxicity. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101506.
  4. Alhakamy NA, Curiel DT, Berkland CJ. The era of gene therapy: From preclinical development to clinical application. Drug Discov Today. 2021;26(7):1602-19.
  5. Arutyunyan IV, et al. Gene Expression Profile of 3D Spheroids in Comparison with 2D Cell Cultures and Tissue Strains of Diffuse High-Grade Gliomas. Bull Exp Biol Med. 2023;175(4):576-84.
  6. Cashen P, Manser B. Quality by design (QbD) for adeno-associated virus (AAV): A framework for a QbD assessment for AAV products within the chemistry manufacturing and controls (CMC) documentation [Internet]. Port Washington (NY): Pall Corporation; 2021. Available from: https://www.pall.com/
  7. Center for Biologics Evaluation and Research. Potency Assurance for Cellular and Gene Therapy Products: Draft Guidance for Industry [Internet]. Silver Spring (MD): U.S. Food and Drug Administration; 2023. Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/potency-assurance-cellular-and-gene-therapy-products
  8. Fu Q, Polanco A, Lee YS, Yoon S. Critical challenges and advances in recombinant adeno-associated virus (rAAV) biomanufacturing. Biotechnol Bioeng. 2023;120(9):2601-21.
  9. Martinez RA, et al. A versatile cell line for establishing potency of cell type-specific AAV transgenes. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101401.
  10. Zengel J, et al. Development of cell lines with increased susceptibility to diverse adeno-associated viral vectors to enable in vitro potency assays. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(1):101416.
  11. Marconi GD, et al. Three-Dimensional Culture System: A New Frontier in Cancer Research, Drug Discovery, and Stem Cell-Based Therapy. Biology (Basel). 2025;14(7):875.
  12. Bialkowska K, Komorowski P, Bryszewska M, Milowska K. Spheroids as a Type of Three-Dimensional Cell Cultures-Examples of Methods of Preparation and the Most Important Application. Int J Mol Sci. 2020;21(17):6225.
  13. Ducker M, Millar V, Ebner D, Szele FG. A Semi-automated and Scalable 3D Spheroid Assay to Study Neuroblast Migration. Stem Cell Reports. 2020;15(3):789-802.
  14. Hiller T, et al. Generation of a 3D Liver Model Comprising Human Extracellular Matrix in an Alginate/Gelatin-Based Bioink by Extrusion Bioprinting for Infection and Transduction Studies. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3129.
  15. Jakeman PG, et al. Improved in vitro human tumor models for cancer gene therapy. Hum Gene Ther. 2015;26(5):249-56.
  16. Kapalczynska M, et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 2018;14(4):910-9.
  17. Gunti S, Hoke ATK, Vu KP, London NR Jr. Organoid and Spheroid Tumor Models: Techniques and Applications. Cancers (Basel). 2021;13(4):874.
  18. McRobb LS, Lee VS, Faqihi F, Stoodley MA. A Simple Model to Study Mosaic Gene Expression in 3D Endothelial Spheroids. J Cardiovasc Dev Dis. 2024;11(10):305.
  19. Ohguro H, et al. 3D Spheroid Configurations Are Possible Indicators for Evaluating the Pathophysiology of Melanoma Cell Lines. Cells. 2023;12(5):759.
  20. Casey G, et al. Self-complementarity in adeno-associated virus enhances transduction and gene expression in mouse cochlear tissues. PLoS One. 2020;15(11):e0242599.
  21. Hutt JA, et al. Scientific and Regulatory Policy Committee Points to Consider: Nonclinical Research and Development of In Vivo Gene Therapy Products, Emphasizing Adeno-Associated Virus Vectors. Toxicol Pathol. 2022;50(1):118-46.
  22. El Harane S, et al. Cancer Spheroids and Organoids as Novel Tools for Research and Therapy: State of the Art and Challenges to Guide Precision Medicine. Cells. 2023;12(7):1001.
  23. Najera SS, et al. Targeting NAD+ Metabolism Vulnerability in FH-Deficient Hereditary Leiomyomatosis and Renal Cell Carcinoma with the Novel NAMPT Inhibitor OT-82. Mol Cancer Ther. 2025;24(2):200-13.
  24. Huang HL, et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J Biomed Sci. 2010;17(1):36.
  25. Ripa I, Andreu S, Lopez-Guerrero JA, Bello-Morales R. Membrane Rafts: Portals for Viral Entry. Front Microbiol. 2021;12:631274.
  26. Habanjar O, Diab-Assaf M, Caldefie-Chezet F, Delort L. 3D Cell Culture Systems: Tumor Application, Advantages, and Disadvantages. Int J Mol Sci. 2021;22(22):12200.
  27. Kaiser VM, Gonzalez-Cordero A. Organoids - the future of pre-clinical development of AAV gene therapy for CNS disorders. Gene Ther. 2025;Mar 27. Epub ahead of print. PMID: 40148593.
  28. Ramamurthy RM, Atala A, Porada CD, Almeida-Porada G. Organoids and microphysiological systems: Promising models for accelerating AAV gene therapy studies. Front Immunol. 2022;13:1011143.

Ristampe e permessi

Tag

Sferoidi 3DConsegna di geniPiattaforma per sferoidiEspressione del transgenePrestazioni del sierotipoValutazione della potenzaImaging di cellule viveSegnale reporterOttimizzazione del vettore
Video in arrivo
Contattaci
Raccomanda alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.