Isolamento e caratterizzazione di piccole vescicole extracellulari da cuscinetti adiposi infrapatulari di pazienti con osteoartrite

Summary

SOMMARIO: Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per isolare e caratterizzare piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatulare di pazienti con osteoartrite.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV), in particolare piccole vescicole extracellulari (sEV) definite come vescicole inferiori a 200 nm, fungono da mediatrici essenziali della comunicazione intercellulare e vengono rilasciate da quasi tutti i tipi cellulari in vari fluidi biologici. Il cuscinetto adiposo infrapatellare (IPFP) è strettamente associato allo sviluppo e alla progressione dell'osteoartrite (OA) del ginocchio. Tuttavia, i metodi standardizzati per isolare direttamente i sEV dagli espiantili IPFP rimangono limitati. Presentiamo un protocollo riproducibile per l'isolamento e la caratterizzazione delle sEV derivate da tessuti IPFP ottenuti da pazienti con OA. Il mezzo condizionato raccolto dalle colture tissutali IPFP viene eliminato sequenzialmente da cellule e detriti tramite centrifugazione a bassa velocità, seguita da ultracentrifugazione per arricchire vescicole nell'intervallo di dimensioni del sEV. Le vescicole risultanti sono caratterizzate secondo informazioni minime per studi sulle raccomandazioni delle vescicole extracellulari (MISEV2023) utilizzando un insieme di marcatori proteici rappresentativi in diverse categorie funzionali: CD63 come tetraspanina associata alla membrana, ALIX e TSG101 come proteine citosoliche coinvolte nella biogenesi mediata dalla macchina Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT), e Calnexin come proteina residente nel reticolo endoplasmatico per monitorare il potenziale Contaminazione non vescicolare. Questo flusso di lavoro produce preparazioni sEV ben definite, adatte ad applicazioni a valle come saggi funzionali o profilazione proteomica nella ricerca sull'osteoartrite.

Introduction

Le vescicole extracellulari piccole (sEV) sono un sottotipo eterogeneo di vescicole extracellulari che, secondo la classificazione operativa proposta dalla International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) nelle linee guida sulle informazioni minime per studi sulle vescicole extracellulari (MISEV2023), sono definite come vescicole tipicamente inferiori a 200 nm di^{diametro 1}. Le sEV vengono rilasciate da praticamente tutti i tipi cellulari nei fluidi biologici e hanno attirato sempre più attenzione grazie al loro ruolo essenziale come mediatori della comunicazione intercellulare sia in contesti fisiologici....

Protocol

L'uso di tessuti IPFP da pazienti con osteoartrite in questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Primo Ospedale dell'Università Medica di Hebei (Approvazione n. [2024] 018). La raccolta del campione è stata effettuata entro il periodo approvato e il consenso informato scritto di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima dell'acquisizione del tessuto.

1. Preparazione del mezzo e delle soluzioni

1. Prepara 500 mL di mezzo DMEM/F12 completo impoverito da esosomi mescolando 445 mL di mezzo basale DMEM/F12, 50 mL di siero bovino fetale privo di esosomi (10%) e 5 mL di Peni....

Results

Il successo dell'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatelaro umano (IPFP) è stato confermato tramite caratterizzazione multimodale.

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha rivelato che le vescicole isolate presentavano la caratteristica morfologia a coppa con membrane bistrato lipidiche chiaramente definite, coerente con le caratteristiche strutturali delle sEV (Figura 1)¹¹

Discussion

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile e pratico per isolare piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatelo umano (IPFP) tramite coltura expiantata, seguita da ultracentrifugazione differenziale. Le vescicole isolate sono state validate tramite metodi di caratterizzazione complementari, tra cui microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e rilevamento da Western blot dei mar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi centrifughe PET da 40 mL	Himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Tereftalato di polietilene, 26 x 90 mm
70 & micro; m Filtro cellulare	Tecnologia Lanjieke di Pechino	560049	Per la rimozione dei detriti tissutali
Anticorpo anti-Alix	Shanghai Abways Biotecnologia	CY7215	Marcatore positivo sEV
Anticorpo anti-Calnexina	Shanghai Abways Biotecnologia	CY5839	Marcatore negativo (contaminazione da ER)
Anticorpo antiCD63	Bioscienze dell'affinità	DF2305	Marcatore tetraspanin
Anticorpo anti-TSG101	Shanghai Abways Biotecnologia	CY5985	Marcatore positivo sEV
Kit per il test proteico BCA	Shanghai YaMei Biotecnologia	ZJ102	Per la quantificazione delle proteine
Fiaschetta di coltura cellulare (T175)	Biotecnologia NEST	560229	Per la coltura di espiantimenti IPFP
Tubo centrifuga (50 mL)	BIOFIL	560041	Per i passaggi iniziali a bassa velocità
Siero bovino fetale impoverito di esosomi	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Per la coltura tissutale
HRP Capra anti-Coniglio IgG	Shanghai Abways Biotecnologia	AB0101	Anticorpo secondario per il globulo bianco
Buffer di caricamento istantaneo di proteine (Denaturante, Riducente, 5 volte;)	Shanghai YaMei Biotecnologia	LT101	Per la denaturazione delle proteine
Kit per il test delle proteine Micro BCA	Thermo Scientific	23235	Per la quantificazione delle proteine
Unità di filtro Millex-GP (0,22 & micro; m)	Tecnologia Lanjieke di Pechino	560360	Sterile, per la filtrazione delle vescicole
Analizzatore di tracciamento di nanoparticelle	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Per l'analisi di dimensioni e concentrazioni
Buffer di trasferimento rapido senza ghiaccio Omni-Flash	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS201S	Per il trasferimento proteico Western blot
Acido fosfotungstico (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Per la colorazione negativa TEM
Buffer di carico proteico (denaturante, non riducente, 5×)	Shanghai YaMei Biotecnologia	LT103	Per la denaturazione delle proteine
Tampone Rapido Bloccante Privo di Proteine (5 e volte)	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS108	Per bloccare le membrane
Buffer di lisi RIPA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Per l'estrazione delle proteine sEV
TBS (20 volte e volte)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Per preparare il tampone di lavaggio
Microscopio elettronico a trasmissione	Hitachi	HT7800	Per la caratterizzazione morfologica
Buffer di elettroforesi Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS120	Per la separazione delle proteine
Preadolescente-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Per preparare il tampone di lavaggio
Ultracentrifuga	Himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Sistema di isolamento ad alta velocità
Kit di rilevamento chemiluminescente ultra-sensibile	Shanghai YaMei Biotecnologia	SQ201	Per la visualizzazione delle bande proteiche
Buffer universale di diluizione degli anticorpi	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS119L	Per anticorpi primari/secondari