Isolamento e caratterizzazione di piccole vescicole extracellulari da cuscinetti adiposi infrapatulari di pazienti con osteoartrite

Summary

SOMMARIO: Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standardizzato per isolare e caratterizzare piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatulare di pazienti con osteoartrite.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV), in particolare piccole vescicole extracellulari (sEV) definite come vescicole inferiori a 200 nm, fungono da mediatrici essenziali della comunicazione intercellulare e vengono rilasciate da quasi tutti i tipi cellulari in vari fluidi biologici. Il cuscinetto adiposo infrapatellare (IPFP) è strettamente associato allo sviluppo e alla progressione dell'osteoartrite (OA) del ginocchio. Tuttavia, i metodi standardizzati per isolare direttamente i sEV dagli espiantili IPFP rimangono limitati. Presentiamo un protocollo riproducibile per l'isolamento e la caratterizzazione delle sEV derivate da tessuti IPFP ottenuti da pazienti con OA. Il mezzo condizionato raccolto dalle colture tissutali IPFP viene eliminato sequenzialmente da cellule e detriti tramite centrifugazione a bassa velocità, seguita da ultracentrifugazione per arricchire vescicole nell'intervallo di dimensioni del sEV. Le vescicole risultanti sono caratterizzate secondo informazioni minime per studi sulle raccomandazioni delle vescicole extracellulari (MISEV2023) utilizzando un insieme di marcatori proteici rappresentativi in diverse categorie funzionali: CD63 come tetraspanina associata alla membrana, ALIX e TSG101 come proteine citosoliche coinvolte nella biogenesi mediata dalla macchina Endosomal Sorting Complex Required for Transport (ESCRT), e Calnexin come proteina residente nel reticolo endoplasmatico per monitorare il potenziale Contaminazione non vescicolare. Questo flusso di lavoro produce preparazioni sEV ben definite, adatte ad applicazioni a valle come saggi funzionali o profilazione proteomica nella ricerca sull'osteoartrite.

Introduction

Le vescicole extracellulari piccole (sEV) sono un sottotipo eterogeneo di vescicole extracellulari che, secondo la classificazione operativa proposta dalla International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) nelle linee guida sulle informazioni minime per studi sulle vescicole extracellulari (MISEV2023), sono definite come vescicole tipicamente inferiori a 200 nm di^{diametro 1}. Le sEV vengono rilasciate da praticamente tutti i tipi cellulari nei fluidi biologici e hanno attirato sempre più attenzione grazie al loro ruolo essenziale come mediatori della comunicazione intercellulare sia in contesti fisiologici che^{patologici 2,3}.

La membrana delle sEV è arricchita da molteplici proteine funzionali. Tra queste, tetraspanine come CD63 sono associate all'organizzazione della membrana vescicoloare e alla^{fusione 4}. Inoltre, proteine citosoliche associate al complesso endosomale di selezione necessario per il trasporto (ESCRT), come ALIX e TSG101, sono fondamentali per la biogenesi e la secrezione del sEV. Di conseguenza, servono come marcatori affidabili per confermare l'origine endosomica delle vescicole^{isolate 5,6}.

Il cuscinetto adiposo infrapatulare (IPFP) è stato riconosciuto come un tessuto attivo associato all'articolazione, strettamente legato all'inizio e alla progressione dell'osteoartrite (OA^)7,8. In condizioni infiammatorie e degenerative, si ipotizza che le sEV derivate dall'IPFP trasportino mediatori infiammatori e segnali patogenici, contribuendo così all'infiammazione sinoviale e alla degradazione^{della cartilagine 9}. Caratterizzare le sEV rilasciate dai tessuti IPFP da pazienti con OA può quindi fornire informazioni fondamentali sulle reti di comunicazione intercellulare associate alla malattia.

Dato il crescente interesse per le sEV come mediatori molecolari e potenziali agenti terapeutici, è essenziale l'istituzione di un approccio di isolamento ad alta ressa, alta purezza e riproducibile. Sebbene l'ultracentrifugazione differenziale rimanga una delle strategie di purificazione più utilizzate¹⁰, i protocolli ottimizzati per supernatanti in coltura cellulare o biofluidi potrebbero non essere direttamente applicabili a tessuti solidi derivati dall'adiposo come l'IPFP. L'elevato contenuto lipidico, la matrice extracellulare densa e le condizioni digertive enzimatiche variabili possono influenzare il recupero e la purezza delle vescicole.

La coltura espiantante tissutale offre un approccio fisiologicamente rilevante che preserva l'architettura cellulare nativa e le interazioni cellula-cellula, minimizzando al contempo un eccessivo disagio enzimatico, consentendo così la raccolta delle sEV rilasciate in condizioni quasi native. Tuttavia, attualmente manca un flusso di lavoro standardizzato specificamente pensato per isolare i sEV dalle colture di impianti IPFP.

Qui descriviamo un protocollo passo dopo passo per isolare e caratterizzare piccole vescicole extracellulari da colture di expiantito a base di cuscinetto adiposo infrapatelaro di pazienti con osteoartrite tramite ultracentrifugazione differenziale, fornendo un quadro metodologico riproducibile per studi funzionali e traslazionali a valle.

Protocol

L'uso di tessuti IPFP da pazienti con osteoartrite in questo studio è stato approvato dal Comitato Etico del Primo Ospedale dell'Università Medica di Hebei (Approvazione n. [2024] 018). La raccolta del campione è stata effettuata entro il periodo approvato e il consenso informato scritto di tutti i partecipanti è stato ottenuto prima dell'acquisizione del tessuto.

1. Preparazione del mezzo e delle soluzioni

1. Prepara 500 mL di mezzo DMEM/F12 completo impoverito da esosomi mescolando 445 mL di mezzo basale DMEM/F12, 50 mL di siero bovino fetale privo di esosomi (10%) e 5 mL di Penicillina/Streptomicina/Anfotericina B (rispettivamente 100 U/mL, 100 μg/mL e 0,25 μg/mL). Sterilizza il filtro attraverso un filtro da 0,22 μm.
2. Prepara il tampone di corsa western blot mescolando 950 mL di acqua distillata (_{dH 2}O) con 50 mL di tampone di 20x (Tris/MOPS/SDS).
3. Prepara il tampone di trasferimento western blot mescolando 800 mL di_dH2Ocon 100 mL di tampone di trasferimento 10x e 100 mL di etanolo assoluto.
   NOTA: Questo buffer di trasferimento rapido è stato specificamente ottimizzato per il trasferimento umido ad alta corrente (400 mA) a temperatura ambiente. A causa della sua bassa generazione di calore, non è necessario un bagno di ghiaccio per durate di trasferimento inferiori a 45 minuti, che ha dimostrato mantenere un'elevata efficienza di trasferimento per proteine nell'intervallo 10–250 kDa.
   ATTENZIONE: L'etanolo assoluto è infiammabile. Maneggia in un'area ben ventilata e evita fonti di calore.
4. Prepara il tampone di lavaggio mescolando 50 mL di 20 x TBS (200 mM Tris e 3 M NaCl a pH 7,5–7,6) e 2 mL Tween-20 con 950 mL di_{dH 2}O.
5. Prepara la soluzione di lavoro chemiluminescente mescolando volumi uguali di soluzione di luminolo/potenziatore e tampone di perossido (sono necessari circa 0,1 mL di soluzione di lavoro per centimetro quadrato di membrana).
   ATTENZIONE: I substrati chemiluminescenti possono essere irritanti. Indossa guanti e protezione per gli occhi. Smaltire i rifiuti chimici secondo le normative istituzionali locali.

2. Preparazione del tessuto IPFP e raccolta del mezzo condizionato

1. Lavare il tessuto IPFP appena ottenuto (circa 10 g) tre volte con 50 mL di PBS pre-raffreddato per ogni lavaggio, agitandolo manualmente delicatamente nel tubo della centrifuga per rimuovere completamente il sangue residuo.
2. Trita il tessuto IPFP in pezzi circa 2mm x 2mm x 2mm usando forbici sterili o un bisturi.
3. Trasferire i pezzi di tessuto IPFP in fiaschette T175. Aggiungi 50 mL di mezzo completo DMEM/F12 impoverito di esosomi. Incubare a 37 °C con il 5% di CO₂ per 48 ore con agitazione delicata.
4. Raccogli il mezzo completo DMEM/F12 (cioè mezzo condizionato) in tubi da 50 mL su ghiaccio. Filtrare attraverso un colino da 70 μm per rimuovere i detriti tissutitori.

3. Isolamento degli sEV tramite ultracentrifugazione differenziale

NOTA: Esegui tutti i passaggi seguenti a 4 °C o sul ghiaccio.

1. Centrifugazione iniziale a bassa velocità per rimuovere i detriti tissutali
   1. Centrifuga il mezzo condizionato a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogli con cura il surnante e trasferiscilo in nuovi tubi centrifughe da 50 mL.
   2. Centrifugare il soprandanante a 3.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Raccogli il soprandanante e trasferiscilo in nuovi tubi, assicurandoti che il pellet non venga disturbato.
2. Centrifugazione e filtrazione intermedie.
   1. Centrifuga il soprantantante a 10.000 x g per 30 minuti a 4 °C.
   2. Raccogli il soprandanante e filtralo attraverso un filtro a vuoto da 0,22 μm per rimuovere vescicole più grandi e contaminanti.
3. Prima ultracentrifugazione: pelleting sEV.
   1. Trasferire il surnante filtrato in tubi centrifughe in policarbonato da 40 mL.
   2. Ultracentrifugare i campioni a 110.000 x g per 70 minuti a 4 °C utilizzando un rotore ad angolo fisso (fattore k = 70). Rimuovere con attenzione il soprandante usando una pipetta.
   3. Risospendere il pellet in 10 mL di PBS sterile pre-raffreddato. Filtrare la soluzione sospesa attraverso un filtro a siringa da 0,22 μm per garantire la rimozione di eventuali aggregati rimanenti.
4. Seconda ultracentrifugazione: purificazione del sEV
   1. Ultracentrifugare nuovamente la sospensione a 110.000 x g per 70 minuti a 4 °C utilizzando il rotore ad angolo fisso (fattore k = 70).
   2. Scartare con cura il soprantantante, lasciando il pellet sEV sul fondo del tubo. Sospensa il pellet finale di sEV a 200 μL di PBS sterile.
   3. Dividere la sospensione sEV in aliquote da 20 μL per prevenire danni dovuti a cicli ripetuti di congelamento-disgelo. Conserva le aliquote a -80 °C per un uso a lungo termine.

4. Caratterizzazione delle sEV tramite analisi western blot

1. Prepara i campioni di proteine del sEV.
   1. Mescola il pellet di sEV (dal passaggio 3.5.2) con 80–120 μL di tampone di lisi RIPA integrato con inibitori della proteasi.
      NOTA: Punta a un rapporto di circa 1 μL di tampone RIPA per 0,5–1,0 μg di proteina stimata. Si raccomanda una concentrazione finale di proteine di almeno 1,0 μg/μL per garantire una separazione elettroforetica efficiente e una rilevazione del segnale di alta qualità durante l'analisi western blot.
      ATTENZIONE: Il buffer RIPA contiene detersivi e irritanti. Usa dispositivi di protezione individuale.
   2. Vortice brevemente la miscela e incubare i campioni sul ghiaccio per 15–30 minuti con un leggero dondolo.
      NOTA: Una miscelazione approfondita in questa fase è fondamentale per una completa rottura della membrana e un rilascio ottimale delle proteine. Un vortici insufficiente può portare a una lisi incompleta e a concentrazioni proteiche incoerenti tra le repliche.
   3. Centrifugare il lisato a 12.000–14.000 x g per 10–15 minuti. Raccogli con cura il soprannatante.
   4. Determinare la concentrazione totale di proteine del lisato di sEV utilizzando un saggio di proteina ad alta sensibilità dell'acido bicinconinico (BCA).
      NOTA: Un saggio BCA ad alta sensibilità è raccomandato rispetto al test BCA standard per campioni di vescicole extracellulari a causa del suo intervallo di rilevamento più basso (0,5–20 μg/mL), che consente una quantificazione accurata delle concentrazioni tipicamente basse di proteine ottenute da preparati purificati di sEV. Esegui il test secondo il protocollo del kit.
2. Analisi del Western Blot.
   1. Mescola i campioni proteici con 5 x buffer di caricamento campioni SDS-PAGE.
      NOTA: Per il rilevamento del CD63, preparare i campioni utilizzando un buffer di carico 5x non riducente (senza β-mercaptoetanolo) e incubare a 70 °C per 10 minuti. Queste condizioni preservano gli epitopi conformazionali e impediscono l'aggregazione indotta dal calore di questa proteina tetraspanina. Per altri marcatori, tra cui ALIX (proteina interagente ALG-2 X), TSG101 (gene di suscettibilità tumorale 101) e Calnesina, prepara campioni utilizzando un tampone di carico riducente 5x contenente il 10% di β-mercaptoetanolo e riscalda a 95 °C per 5 minuti per garantire la completa denaturazione proteica.
   2. Carica i campioni preparati (tipicamente 20–40 μg di proteina totale) in un gel gradiente prefabbricato (4%–12%).
   3. Caricare il marcatore di peso molecolare della proteina nel pozzo assegnato secondo le raccomandazioni del produttore.
   4. Fai passare il gel in un buffer di funzionamento a una tensione costante di 100 V.
   5. Continuare la corsa per 1–1,5 ore, oppure finché il colorante di carico non raggiunge il fondo del gel.
      NOTA: Il tempo di esecuzione può variare a seconda del sistema di elettroforesi e della percentuale di gel.
   6. Trasferire le proteine dal gel alle membrane PVDF utilizzando un sistema di trasferimento umido a 400 mA per 30 minuti.
      NOTA: La durata del trasferimento può variare a seconda della marca del buffer di trasferimento utilizzato.
   7. Bloccare le membrane in un tampone bloccante privo di proteine preparato in soluzione salina tris-buffer contenente 0,2% Tween-20 (TBS-T) per 30 minuti a temperatura ambiente con una lieve agitazione. Il tampone bloccante è formulato senza proteine sieriche, biotina o proteine fosforilate per minimizzare il legame aspecifico e le interferenze di fondo.
   8. Incubare la membrana con anticorpi primari specifici diluiti in un tampone di diluizione senza siero contenente stabilizzatori a base proteica e additivi che preservano gli anticorpi a 4 °C durante la notte (12–16 ore) con una leggera agitazione.
   9. Lava le membrane in un tampone di lavaggio (TBST contenente 0,2% Tween-20) con una delicata agitazione su un shaker.
   10. Incubare le membrane con gli anticorpi secondari appropriati a temperatura ambiente per 1 ora con una leggera agitazione.
   11. Lava di nuovo le membrane con un tampone di lavaggio sotto una delicata agitazione su uno shaker.
   12. Visualizza le bande proteiche usando substrato chemiluminescente.
       ATTENZIONE: I substrati chemiluminescenti possono essere irritanti per la pelle e gli occhi. Indossa guanti e occhiali di sicurezza appropriati. Smaltire il substrato secondo le linee guida istituzionali sui rifiuti pericolosi.

5. Caratterizzazione delle sEV tramite Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

1. Accendi l'analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle e il modulo della pompa della siringa secondo le istruzioni del produttore, e lascia che il sistema si equilibri per almeno 30 minuti prima della misurazione.
2. Scongelare delicatamente i campioni EV sul ghiaccio e diluirli in soluzione salina fosfatata sterile e priva di particelle (PBS) per ottenere una concentrazione ottimale di particelle entro il range di misurazione raccomandato (circa 1 x^{10 8} a 1 x^{10 9} particelle/mL).
3. Carica 1 mL del campione diluito in una siringa sterile e inietta lentamente il campione nella camera di misura, assicurandoti che non vengano introdotte bolle d'aria.
4. Regola il livello della fotocamera e la messa a fuoco per visualizzare chiaramente le singole particelle che mostrano il movimento browniano.
5. Registra tre video di 60 secondi di durata per ogni campione in condizioni di flusso costante utilizzando la pompa della siringa per garantire una distribuzione coerente delle particelle.
6. Analizza i video registrati usando il software NTA con una soglia di rilevamento impostata a 12, la dimensione della sfocatura impostata su Auto e la distanza massima di salto impostata su Auto.
7. Genera profili di distribuzione e concentrazione delle dimensioni delle particelle utilizzando la funzione di analisi automatizzata del software.
8. Esporta i dati grezzi, i grafici di distribuzione delle dimensioni delle particelle e le misurazioni di concentrazione per ulteriori analisi statistiche.
9. Pulire accuratamente la camera di misura con acqua sterile priva di particelle seguita dal 70% di etanolo, e risciacquo nuovamente con acqua sterile senza particelle per evitare contaminazioni incrociate tra campioni.

6. Caratterizzazione degli sEV tramite microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

1. Usa griglie di rame da 200 mesh rivestite al carbonio. Esegui la scarica luminosa sulle griglie per 30 secondi utilizzando un sistema a scarica a luce luminosa, se disponibile.
2. Applicare 10 μL della sospensione sEV (risosspesa in PBS sterile e filtrato) sulla griglia e incubare per 2–5 minuti a temperatura ambiente.
3. Rimuovere il liquido in eccesso toccando delicatamente il bordo della griglia con carta filtrante.
4. Lava la griglia posizionando sequenzialmente la superficie carica di campione su tre gocce separate di acqua ultrapura.
5. Applicare 10 μL di soluzione di acido fosfotongstico al 2% (pH 7,0) sulla griglia e incubare per 1–2 minuti a temperatura ambiente.
   ATTENZIONE: L'acido fosfotongstico è un reagente acido corrosivo che può causare irritazioni alla pelle, agli occhi e alle vie respiratorie. Maneggiare secondo le linee guida di sicurezza istituzionali indossando l'attrezzatura di protezione individuale adeguata, inclusi guanti e protezione oculare. Smaltire i rifiuti macchianti e i materiali contaminati seguendo procedure approvate per i rifiuti chimici pericolosi.
6. Rimuovere la macchia in eccesso con carta filtrante e lasciare asciugare completamente la griglia all'aria a temperatura ambiente per almeno 10 minuti.
7. Esaminare le griglie utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione azionato a una tensione di 80 kV.
8. Acquisire immagini rappresentative con ingranditi appropriati per valutare la morfologia delle vescicole.

Results

Il successo dell'isolamento di piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatelaro umano (IPFP) è stato confermato tramite caratterizzazione multimodale.

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) ha rivelato che le vescicole isolate presentavano la caratteristica morfologia a coppa con membrane bistrato lipidiche chiaramente definite, coerente con le caratteristiche strutturali delle sEV (Figura 1)¹¹

Discussion

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile e pratico per isolare piccole vescicole extracellulari (sEV) dai tessuti del cuscinetto adiposo infrapatelo umano (IPFP) tramite coltura expiantata, seguita da ultracentrifugazione differenziale. Le vescicole isolate sono state validate tramite metodi di caratterizzazione complementari, tra cui microscopia elettronica a trasmissione (TEM), analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) e rilevamento da Western blot dei mar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubi centrifughe PET da 40 mL	Himac (Eppendorf Himac Technologies)	5720411148	Tereftalato di polietilene, 26 x 90 mm
70 & micro; m Filtro cellulare	Tecnologia Lanjieke di Pechino	560049	Per la rimozione dei detriti tissutali
Anticorpo anti-Alix	Shanghai Abways Biotecnologia	CY7215	Marcatore positivo sEV
Anticorpo anti-Calnexina	Shanghai Abways Biotecnologia	CY5839	Marcatore negativo (contaminazione da ER)
Anticorpo antiCD63	Bioscienze dell'affinità	DF2305	Marcatore tetraspanin
Anticorpo anti-TSG101	Shanghai Abways Biotecnologia	CY5985	Marcatore positivo sEV
Kit per il test proteico BCA	Shanghai YaMei Biotecnologia	ZJ102	Per la quantificazione delle proteine
Fiaschetta di coltura cellulare (T175)	Biotecnologia NEST	560229	Per la coltura di espiantimenti IPFP
Tubo centrifuga (50 mL)	BIOFIL	560041	Per i passaggi iniziali a bassa velocità
Siero bovino fetale impoverito di esosomi	Cyagen Biosciences	FBSNE-01061	Per la coltura tissutale
HRP Capra anti-Coniglio IgG	Shanghai Abways Biotecnologia	AB0101	Anticorpo secondario per il globulo bianco
Buffer di caricamento istantaneo di proteine (Denaturante, Riducente, 5 volte;)	Shanghai YaMei Biotecnologia	LT101	Per la denaturazione delle proteine
Kit per il test delle proteine Micro BCA	Thermo Scientific	23235	Per la quantificazione delle proteine
Unità di filtro Millex-GP (0,22 & micro; m)	Tecnologia Lanjieke di Pechino	560360	Sterile, per la filtrazione delle vescicole
Analizzatore di tracciamento di nanoparticelle	Malvern Panalytical	NanoSight NS300	Per l'analisi di dimensioni e concentrazioni
Buffer di trasferimento rapido senza ghiaccio Omni-Flash	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS201S	Per il trasferimento proteico Western blot
Acido fosfotungstico (2%)	Sigma-Aldrich	P4006	Per la colorazione negativa TEM
Buffer di carico proteico (denaturante, non riducente, 5×)	Shanghai YaMei Biotecnologia	LT103	Per la denaturazione delle proteine
Tampone Rapido Bloccante Privo di Proteine (5 e volte)	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS108	Per bloccare le membrane
Buffer di lisi RIPA	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010	Per l'estrazione delle proteine sEV
TBS (20 volte e volte)	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1080	Per preparare il tampone di lavaggio
Microscopio elettronico a trasmissione	Hitachi	HT7800	Per la caratterizzazione morfologica
Buffer di elettroforesi Tris/MOPS/SDS	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS120	Per la separazione delle proteine
Preadolescente-20	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T8220	Per preparare il tampone di lavaggio
Ultracentrifuga	Himac (Eppendorf Himac Technologies)	CP100NX	Sistema di isolamento ad alta velocità
Kit di rilevamento chemiluminescente ultra-sensibile	Shanghai YaMei Biotecnologia	SQ201	Per la visualizzazione delle bande proteiche
Buffer universale di diluizione degli anticorpi	Shanghai YaMei Biotecnologia	PS119L	Per anticorpi primari/secondari