Articolo metodologico

Riprogrammazione delle linee di cellule staminali pluripotenti indotte da campioni di rivestimento buffy congelato

DOI:

10.3791/70522

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10 aprile 2026

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1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Interdisciplinary Neuroscience, University of Georgia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 4Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, 5Division of Pediatric Endocrinology, Emory University School of Medicine, 6Dysautonomia Center, New York University Langone Health, 7Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Emory University School of Medicine, 8Stem Cell Core, Columbia Stem Cell Initiative, Columbia University, 9Department of Cellular Biology, University of Georgia

In questo articolo

Sommario

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L'attuale protocollo dettaglia i passaggi per la risoluzione di problemi della derivazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) di campioni di pazienti che sono state difficili da riprogrammare seguendo le istruzioni del produttore. Questo protocollo è specifico per campioni di buffy coat congelato, ma può essere applicato anche alla riprogrammazione di PBMC purificati.

Abstract

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Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono uno strumento prezioso per la modellizzazione delle malattie. Ulteriori cellule staminali possono essere riprogrammate da cellule somatiche adulte, chiamate cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). La tecnologia iPSC consente la valutazione di partecipanti e popolazioni specifiche allo studio e si avvicina alla medicina personalizzata. Il sangue viene prelevato di routine e criopreservato per scopi di ricerca. Questi campioni vengono processati o come buffy coat, un campione di sangue contenente globuli bianchi e piastrine, oppure come cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), che rappresentano una popolazione più purificata di globuli bianchi senza eosinofili, basofili, piastrine o globuli rossi. Entrambi sono una fonte facilmente reperibile e relativamente non invasiva per cellule somatiche riprogrammabili. Diversi rapporti descrivono la riprogrammazione dai PBMC, mentre solo uno descrive questo processo da pellicole buffy congelate. Esperienze recenti hanno rivelato che i protocolli di riprogrammazione PBMC disponibili in letteratura e dai produttori non hanno avuto successo quando applicati a campioni di buffy coat congelati, rendendo necessarie le strategie di adattamento e risoluzione dei problemi descritte qui. Per molti ricercatori che impiegano tecnologie iPSC, è fondamentale avere protocolli approfonditi con un alto tasso di successo, specialmente nei casi in cui i campioni del paziente possono contenere poche cellule, vengono ottenuti in intervalli di tempo molto limitati, provengono da un pool limitato di partecipanti o sono comunque molto preziosi. Qui vengono identificati checkpoint e strategie di troubleshooting per aumentare la probabilità di riprogrammare pellicole buffy congelate umane o PBMC purificati. In definitiva, questo protocollo permetterà ai ricercatori di identificare predittori del successo della riprogrammazione e di elaborare strategie alternative per migliorare le probabilità di riuscita derivazione di iPSC.

Introduzione

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La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) è una fonte facilmente scalabile e rinnovabile di cellule umane che può essere differenziata in qualsiasi tipo cellulare del corpo, permettendo ai ricercatori di indagare tipi cellulari e tissuti difficili da ottenere o inaccessibili nei pazienti. Inoltre, le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono essere derivate direttamente dalle cellule somatiche del paziente1. Ciò consente la differenziazione dei tipi cellulari specifici di interesse per il paziente, uno strumento prezioso per la modellazione delle malattie e la scoperta di farmaci. Pertanto, metodi rigorosi, riproducibili e efficaci per riprogrammare cellule somatiche in iPSC sono fondamentali.

I fibroblasti, le cellule urinarie e le cellule del sangue 2,3, ciascuno con le proprie limitazioni, sono alcune delle fonti di cellule somatiche più frequentemente utilizzate per la derivazione delle iPSC. I fibroblasti, storicamente la scelta più popolare per lariprogrammazione 3, non sono facilmente reperibili, richiedendo una biopsia cutanea piuttosto invasiva. Le cellule riprogrammabili possono essere ricamate da campioni di urina, che sono facili da ottenere e non invasive, ma il processo di riprogrammazione deve iniziare con campioni freschi fino a 48 ore dopo laraccolta 4. Il sangue offre un'ottima fonte di cellule riprogrammabili, poiché è minimamente invasivo da ottenere e facilmente reperibile. Sono disponibili molti protocolli di riprogrammazione provenienti dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), dalle cellule del sangue con un singolo nucleo, inclusi linfociti, monociti e cellule naturalkiller 5. Poiché i PBMC sono meno densi rispetto ad altre cellule del sangue, possono essere isolati/purificati da campioni di sangue intero appena isolati tramite centrifugazione a gradientedi densità 5. In alternativa, al momento della centrifugazione, il sangue intero si divide in tre strati distinti: plasma, pelle buffy e globuli rossi6. I mantelli buffy contengono PBMC, piastrine e alcuni eritrociti. Tuttavia, i PBMC sono meno facilmente reperibili nella maggior parte delle biobanche, mentre i PBMC sono abbondanti e accessibili7. Nonostante la disponibilità di buffy coats nelle biobanche e la presenza di PBMC riprogrammabili in questi campioni, pochissimi protocolli dettagliano la riprogrammazione da buffycoats 8 congelati, lasciando questa risorsa inesplorata.

Attualmente, sono stati pubblicati molti protocolli1, 8, 9 e i kit10 disponibili in commercio per semplificare la riprogrammazione; Tuttavia, non approfondiscono come massimizzare il successo delle cellule donatrici dei pazienti difficili da riprogrammare. È comunemente accettato che alcune cellule semplicemente non si riprogrammino, e quando ciò accade, molti ricercatori possono provare con un altro tipo di cellula donatrice o con un paziente diverso. Tuttavia, questa potrebbe non essere un'opzione valida per molti ricercatori o popolazioni di pazienti. A differenza dei protocolli8 e 9 precedentemente pubblicati, questo protocollo include una guida con punti di controllo e criteri, sulla base dei quali prevedere il successo della riprogrammazione e adotta un approccio unico purificando i rivestimenti buffy congelati con centrifugazione a gradiente di densità al momento dello scongelamento.

Il processo inizia con il prelievo di sangue dagli individui selezionati e l'isolamento di PBMC o di mantelli buffy. Per i nuovi esperimenti, questo probabilmente includerà il reclutamento di nuovi donatori che verranno sottoposti a nuovi prelievi di sangue con l'approvazione dell'IRB e con un adeguato modulo di consenso. Il passo successivo è l'espansione delle cellule somatiche, in cui le cellule del sangue congelate vengono scongelate e coltivate in condizioni che favoriscono la proliferazione delle cellule staminali ematopoietiche e dei progenitori eritroidi, le cellule del sangue che sono i migliori candidati per lariprogrammazione 11. Dopo 10–14 giorni, le cellule dovrebbero essere pronte per la riprogrammazione, come dimostrato da una morfologia distinta non discussa nei protocolli precedenti, e vengono poi trasdotte tramite inoculazione con un virus Sendai che porta i fattori Yamanaka Oct4, Sox2, c-Myc eKlf4 1. Dopo la trasduzione, le cellule inizieranno a esprimere i fattori di trascrizione Yamanaka e torneranno a uno stato pluripotente, nuovamente indicato da un cambiamento morfologico distinto e una proliferazione in colonie di cellule staminali. Le colonie emergenti vengono poi selezionate singolarmente, espanse e criopreservate. Dopo dieci passaggi, la caratterizzazione tramite conferma dell'espressione dei marcatori di stelo e del potenziale di differenziazione nei tre strati germinali convalida una linea iPSC riprogrammata con successo.

Questo protocollo funziona meglio per i giacci buffy criopreservati, che sono stati conservati per < 1 mese, o per PBMC criopreservati conservati fino a 2 anni con almeno 1 milione di cellule vitali al momento dello scongelamento. Tuttavia, i checkpoint descritti possono aiutare a guidare la risoluzione della riprogrammazione da qualsiasi campione di sangue di qualità. Inoltre, dettagli sull'adattamento degli iPSC riprogrammati a condizioni prive di alimentatori possono essere applicabili a qualsiasi flusso di lavoro di riprogrammazione degli iPSC, indipendentemente dal tipo di cellula somatica iniziale.

Questo protocollo, stabilito tramite risoluzione pratica dei problemi, dettaglia la riprogrammazione degli iPSC da buffy coats congelati e identifica indicatori morfologici del successo della riprogrammazione, fornendo una guida praticabile per riprogrammare campioni difficili. In definitiva, l'implementazione di queste strategie porta a risparmiare tempo, denaro, reagenti e campioni.

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Protocollo

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Questo protocollo segue le linee guida del comitato etico sulla ricerca umana dell'Università della Georgia. Tutti gli studi su soggetti umani sono stati condotti secondo le linee guida della Dichiarazione di Helsinki dell'Associazione Medica Mondiale. Secondo l'auto-referenza, i volontari non hanno sofferto delle seguenti malattie: fibrosi cistica, broncopneumopatia cronica ostruttiva, tubercolosi, asma, diabete o infezioni acute delle vie aeree. Sono stati reclutati volontari di età compresa tra i 18 e i 50 anni e di entrambi i sessi. Le donne in gravidanza sono state escluse dallo studio.

1. Estrazione e crioconservazione con Buffy Coat o PBMC

Criteri decisionali: Se i campioni saranno conservati a lungo, è meglio scegliere l'opzione 2. Se i reagenti per la purificazione del PBMC non sono disponibili, o i campioni saranno conservati per un breve periodo, l'opzione 1 è adatta.

  1. Opzione 1: Estrazione del Buffy Coat
    1. Esegui una flebotomia (puntura venosa per prelevare sangue) secondo le migliori pratichedell'OMS 12 e preleva 7–10 mL di sangue intero in tubi di raccolta del sangue rivestiti di anticoagulante. Conserva i campioni nel ghiaccio.
    2. Trasferire 7–10 mL di sangue intero in un tubo conico da 15 mL. Centrifuga il sangue usando una centrifuga a secchio oscillante a 200 x g per 15 minuti a 4 °C con i freni staccati. Questo dovrebbe formare 3 strati con plasma giallo in alto, lo strato bianco di mantello buffy al centro e gli eritrociti rossi in basso.
    3. Raccogli il plasma usando una pipetta sierologica sterile senza disturbare lo strato di rivestimento buffy. Scarta il plasma. Trasferire lo strato bianco color beige in un tubo conico fresco da 15 mL (circa 1–2 mL).
      ATTENZIONE: Smaltire il plasma nel bidone appropriato dei rifiuti biopericolosi.
      NOTA: Una parte della contaminazione da plasma del mantello buffy è accettabile perché aiuta a recuperare dopo lo scongelamento.
    4. Aggiungi DMSO al mantello buffy in modo che la composizione finale sia al 10% DMSO v/v e congela immediatamente in cryovial (1 mL/fiala) a -80 °C. Il giorno dopo, trasferire le fiale all'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Ad esempio, per 2 ml di buffy coat, aggiungi 200 μl di DMSO, mescola bene, poi aliquota in 2 fiale. Questo tipicamente si traduce in 1–3 fiale congelate per campione.
  2. Opzione 2: Purificazione PBMC
    1. Eseguire una flebotomia (puntura venosa per prelevare sangue) secondo le migliori pratichedell'OMS 12 e prelevare 7–10 mL di sangue intero in tubi di raccolta del sangue rivestiti di anticoagulante. Conserva i campioni nel ghiaccio.
    2. Aggiungere 4 mL di soluzione gradiente di densità 1 in un nuovo tubo conico da 15 mL. Strati con cura 4 mL di sangue sopra la soluzione 1 del gradiente di densità.
    3. Centrifuga usando una centrifuga a secchio oscillante a 400 x g a RT per 30 minuti, spegnendo i freni. Questo porterà a plasma nello strato superiore, PBMC nello strato intermedio e il resto del sangue in quello inferiore.
    4. Raccogli la frazione PBMC in un tubo conico fresco da 15 mL, poi lavalo 2–3 volte con 1 PBS centrifugandolo in una centrifuga a secchio oscillante a 350 x g a RT per 5 minuti con il freno inserito. Scartate il soprannatante. Per saltare la crioconservazione e iniziare immediatamente la riprogrammazione, procedere al passo 2.3.4.
      ATTENZIONE: Smaltire il surnadante nel cassonetto dei rifiuti biopericolosi appropriato.
    5. Sospendere il pellet in mezzo crioconservatore (90% siero e 10% DMSO) e congelare immediatamente in cryovial (1 mL/fiala) a -80 °C. Il giorno dopo, trasferire le fiale all'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: Possono essere utilizzati tubi di raccolta del sangue isolanti PBMC invece della centrifugazione a gradiente di densità per la purificazione PBMC dal sangue fresco. È anche possibile crioconservare utilizzando medi di congelamento alternativi disponibili in commercio. La resa tipica è di 1–4 fiale congelate per campione.

2. Preparare campioni per l'espansione delle cellule somatiche

  1. Preparazione ai media
    1. Preparare il Supporto di Espansione (EM)9 allicitando 45 mL di base EM. Aggiungi 127,8 μL di L-ascorbico (50 μg/mL da 100 mM di stocco) e 450 μL di penicillina-streptomicina (100 volte la stiva).
    2. Preparare EM + citochineda 13 a 4 ml EM, aggiungere 2 μL di fattore di cellule staminali (SCF) (50 ng/mL da stock da 100 μg/ml), 2 μL di interleucina-3 (IL-3) (10 ng/mL da stock da 20 μg/mL), 16 μL di eritropoietina (EPO) (2 U/mL da stock da 500 U/mL), 4 μL fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF1) (40 ng/mL da stock da 40 μg/ml), e 4 μL di desametasone (1 μM da 1 mM di stock). Usa EM + citochine lo stesso giorno in cui viene preparata.
      NOTA: Possono essere utilizzati sistemi alternativi di mezzi di espansione commerciali.
  2. Opzione 1: Purificazione PBMC da Frozen Buffy Coat
    Criteri decisionali: se è stata scelta l'opzione 1 nel passo 1 (cioè estrazione del mantello buffy), allora si sceglie l'opzione 1 nel passaggio 2 (cioè purificazione PBMC dal buffy coat congelato).
    1. Recuperare la soluzione 2 del gradiente di densità e lasciarla raggiungere la temperatura ambiente. Mescola bene invertendo la bottiglia. Trasferire asetticamente la soluzione 2 del gradiente di densità di 3 mL in un tubo conico da 15 mL.
    2. Prepara un altro tubo conico da 15 mL con 12 mL di soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS).
    3. Recupera la fiala di giallo buffy congelato dall'azoto liquido. Tieni sul ghiaccio fino a quando non sei pronto a scongelare. Scongelare delicatamente il campione facendolo ruotare in un bagno d'acqua a 37 °C. Rimuovi quando rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio.
    4. Trasferisci con attenzione (a goccia) il contenuto della fiala nel tubo conico contenente DPBS. Risciacquare la fiala con 1 mL di DPBS e aggiungerla al tubo conico contenente le cellule recuperate.
    5. Centrifuga usando una centrifuga a secchio oscillante a 200 x g a RT per 10 minuti. Rimuovere con cura il soprandanante e risospendere il pellet cellulare in 4 mL di DPBS con siero bovino fetale (FBS) all'1%.
    6. Sovrapponi delicatamente la miscela di strato buffy sopra la soluzione a gradiente di densità, facendo attenzione a non permettere la miscelazione. Centrifuga in una centrifuga a secchio oscillante a 800 x g per 20 minuti a RT con il freno staccato.
    7. Con una pipetta, rimuovere e scartare lo strato superiore di plasma senza disturbare l'interfaccia plasma:gradiente. Con una pipetta, rimuovere lo strato PBMC all'interfaccia (Figura 1A) e trasferire in un tubo pulito da 15 mL.
      ATTENZIONE: Smaltire gli altri strati nel cassonetto dei rifiuti biopericolosi appropriato.
    8. Lavare i PBMC con 3 mL EM centrifugando a 200 x g per 10 minuti a RT. Rimuovere con attenzione il soprantantante e risospendere il pellet in 2 mL EM + citochine. Piastra in 1 pozzetto di una piastra a 12 pozzi.
    9. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 e 20%O2.
  3. Opzione 2: Scongelare i PBMC surgelati
    Criteri decisionali: se è stata scelta l'opzione 2 del primo passo (cioè la purificazione del PBMC), o se c'è il preoccupo che i rivestimenti buffy congelati abbiano una bassa vitalità (cioè in conservazione per più di 1 mese) (Figura 1B), allora si sceglie l'opzione 2 nel secondo passo (cioè scongelare i PBMC congelati).
    1. Prepara un tubo conico da 15 mL con 12 mL di DPBS.
    2. Recupera la fiala di PBMC congelati dall'azoto liquido. Tieni sul ghiaccio finché non sarà pronto a scongelarsi. Scongela delicatamente il campione facendolo roteare in un bagno d'acqua a 37 °C. Rimuovi quando rimane solo un piccolo cristallo.
    3. Trasferisci con attenzione (a goccia) il contenuto della fiala nel tubo conico. Assicurati di recuperare tutte le cellule dalla fiala risciacquando la fiala con 1 mL di DPBS.
    4. Centrifuga in una centrifuga a secchio oscillante a 200 x g a RT per 10 minuti. Rimuovere con cura il sovrantantante e risospendere il pellet (Figura 1C) in 2 mL EM, poi prendere 10 μL per eseguire il test di esclusione del blu di tripano per la vitalità cellulare e ottenere il conteggiocellulare di 14.
      ATTENZIONE: Smaltire il surnadante nel cassonetto dei rifiuti biopericolosi appropriato.
    5. Placca 1,0 x 106–2,0 x 106 celle/mL in 2 mL EM + citochine in un pozzetto di una piastra a 12 pozzi. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 e 20%O2.

3. Espansione delle cellule somatiche (1 giorno dopo lo scongelamento)

  1. Rimuovere con attenzione 1 mL di materiale esaurito da ogni pozzo. Il materiale esaurito può essere raccolto in un altro pozzo o tubo centrifuga e controllato per assicurarsi che non siano state perse cellule.
  2. Sostituisci il materiale esaurito con 1 mL di EM + citochine fresche.
  3. Ripetere i passaggi 3.1 e 3.2 e scattare foto dei PBMC a giorni alterni fino a osservare un cambiamento significativo nella morfologia, con cellule luminose e rotonde di dimensioni grandi e piccole (Figura 2A, freccia arancione e blu, rispettivamente), che sono gli eritroblasti, il tipo cellulare da riprogrammare. Questo richiederà circa 10–14 giorni.
    NOTA: Le celle che non mostrano queste morfologie, tipicamente privi delle celle rotonde più grandi (Figura 2B), difficilmente si riprogrammano con successo e possono essere morte (Figura 2C).

4. Trasduzione (10–14 giorni dopo lo scongelamento)

  1. Prepara il virus Sendai
    1. Utilizzando il valore del titolo specifico per lot, calcola il volume di ciascun virus necessario per la trasduzione di 2,0 × 105 cellule usando KOS: c-Myc: Klf4 con una molteplicità di infezione (MOI) di 5:5:3, come raccomandato dal produttore. L'equazione per questo calcolo si trova nei documenti del prodotto forniti dal produttore.
    2. Recupera i virus dal congelatore, tenendoli sul ghiaccio fino al momento dello scongelamento. Uno dopo l'altro, scongelare delicatamente i virus avvolgendoli in un bagno d'acqua a 37 °C.
    3. Preparare aliquote in cui tutti e tre i virus sono miscelati al volume appropriato per la trasduzione di 2,0 × 105 cellule a MEI di 5:5:3. Congelare le aliquote a -80 °C fino a quando non sono pronte all'uso.
      ATTENZIONE: Assicurati di sbiancare accuratamente tutti i rifiuti che hanno contattato il virus Sendai.
      NOTA: Le istruzioni del produttore raccomandano un conteggio effettivo delle cellule con calcolo MOI per determinare il volume del virus aggiunto, ma l'approssimazione di 2.0 × 105 è stata valida ai fini di questo protocollo. L'allicitazione può essere più conveniente e riduce il numero di cicli di congelamento/disgelo per i virus.
  2. Giorno della Trasduzione (d0)
    1. Se i PBMC non sono stati nutriti il giorno prima, rimuovere 1 mL di substrato esausto e sostituirlo con 1 mL di EM + citochine fresche. Scongelare il virus su ghiaccio, poi aggiungerlo direttamente nel pozzo e far roteare il substrato.
    2. Avvolgi la piastra in parafilm e centrifuga la piastra in una centrifuga a secchio oscillante a 350 x g a RT per 90 minuti. Posiziona la piastra nell'incubatrice a 37 °C, 5% diCO2 e 20% diO2 durante la notte.
      ATTENZIONE: Assicurati di sbiancare accuratamente tutti i rifiuti che hanno contattato il virus Sendai.
  3. 1 giorno dopo la trasduzione (d1)
    1. Raccogli le cellule in un tubo conico da 15 mL. Risciacqua bene con 2 mL di elettromagno elettromagnetico e controlla al microscopio che tutte le cellule siano state raccolte. Centrifuga a 300 x g a RT per 10 minuti.
    2. Rimuovere con attenzione il soprantantante e risospendere 2 mL EM + citochine. Inserire in un pozzo fresco di una piastra a 12 pozzi e riportare la piastra nell'incubatrice a 37 °C, 5% diCO2 e 20% diO2.
      ATTENZIONE: Assicurati di sbiancare accuratamente tutti i rifiuti che sono entrati a contatto con il virus Sendai.

5. Riplaccare le cellule trasdotte sulle celle alimentatrici

  1. Prepara la cella di alimentazione
    1. A 43,5 mL il mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco aggiungono 5 mL di FBS (concentrazione finale 10%), 0,5 mL di soluzione minima, mezzo essenziale non essenziale di amminoacidi non essenziali (MEM-NEAA) (da 100 volte la serie), 50 μL di 2-mercaptoetanolo (55 μM da 55 mM) e 0,5 mL di antibiotico-antimicotico (da 100 volte la sta).
    2. Preparare piastre a 6 pozzi rivestite di gelatina aggiungendo 600 μL di gelatina (0,1% dal 2% di stock) a 12 mL DPBS e distribuendo 2 mL per pozzo. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti.
    3. Recuperare la fiala congelata di fibroblasti embrionali (MEF) irradiati e scongelare delicatamente avvolgendola in un bagno d'acqua a 37 °C.
    4. Aggiungi a goccia a 15 mL di tubo conico contenente 10 mL di DPBS e risciacqua la fiala con un ulteriore 1 mL di DPBS. Centrifuga a 200 x g a RT per 5 minuti.
    5. Rimuovere con cura il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un mezzo fibroblastico di 1 mL. Rimuovere 10 μL per eseguire il test di esclusione blu di tripano per la vitalità cellulare e ottenere il conteggiocellulare di 14.
    6. Rimuovere la soluzione di gelatina dalle piastre a 6 pozzetti e placcare MEF irradiati a 2,5 × 104 cellule/cm 2. Incubare in incubatrice a 37 °C, 5% diCO2 e 20%O2 per 6–48 ore.
      NOTA: Le piastre delle celle di alimentazione devono essere preparate prima della riplaccatura delle celle trasdotte. I migliori risultati si sono osservati quando i MEF irradiati vengono incubati per circa 2 giorni prima di riplaccare, ma un'incubazione per almeno 6 ore può essere sufficiente.
  2. Cellule trasdotte a riplaccatura
    1. Preparare mezzi iPSC 90 mL DMEM/F12 con 10 mL FBS (concentrazione finale del 10%), 1 mL mem-neaa (da stock 100x), 1 mL di L-glutamina (2 mM da stock da 200 mM), 1 mL di penicillina-streptomicina (da stock 100x), 100 μL 2-mercaptoetanolo (55 μM da stock da 55 mM) e 100 μL fattore di crescita fibroblastico 2 (FGF2) (10 ng/mL da stock da 10 μg/mL). Aggiungi acido L-ascorbico (50 μg/mL) fresco ad ogni poppata.
    2. Il terzo giorno dopo la trasduzione, raccogliere tutti i mezzi e le cellule dal pozzo trasdotto in un tubo conico da 15 mL. Risciacqua bene con almeno 1 mL aggiuntivo di EM e centrifuga in una centrifuga a secchio oscillante a 300 x g a RT per 10 minuti.
    3. Risospendere il pellet in un supporto iPSC da 6 mL. Aspira il substrato da 3 pozzi della lastra con MEF irradiati.
    4. Le cellule trasdotte dalla piastra su questi 3 pozzi di MEF irradiato (2ml/pozzo). Incubare in incubatrice a 37 °C, 5% diCO2 e 20%O2.

6. Manutenzione fino all'emergere della colonia

  1. Nei giorni 4, 5 e 6 dopo la trasduzione, aggiungi 1 mL di substrato iPSC fresco in ciascun pozzo ogni giorno. Questo limita il disturbo inutile delle cellule appena riprogrammate mentre si depositano sui nutritori, fornendo anche loro nutrienti freschi.
  2. Il giorno 7 dopo la trasduzione, rimuovere tutti i substrati vecchi e sostituirlo con 2 mL di substrato iPSC fresco per ogni pozzo. Continuare a nutrirti con substrati iPSC a giorni alterni finché non inizieranno a emergere colonie.
  3. Prepara substrati hES 78 mL DMEM/F12 con 20 mL di integratore senza FBS (20%), 1 mL mem-neaa (100x), 1 mL di L-glutamina (2 mM da scorta da 200 mM), 1 mL di penicillina-streptomicina (100x), 100 μL di 2-mercaptoetanolo (55 μL da scorta da 55 mM) e 100 μL di FGF2 (10 ng/mL da scorta da 10 μg/ml). Aggiungi acido L-ascorbico (50 μg/mL) fresco ad ogni poppata.
  4. Una volta che le piccole colonie hanno iniziato a emergere, si continua a mantenere le cellule trasdotte alimentandole a giorni alterni con substrati hES (Figura 3A).
    NOTA: Le colonie inizieranno ad apparire già 7 giorni dopo la trasduzione. Se nessuna colonia è emersa entro tre settimane dalla trasduzione, è improbabile che emergano mai.

7. Scegliere le colonie una volta che sono cresciute a dimensioni maggiori (Figura 3B)

NOTA: A volte le cellule trasdotte subiscono un cambiamento morfologico che non porta a una colonia simile a celle staminali (Figura 3C). Questa non è considerata una colonia che potrebbe portare a una linea iPSC di successo.

NOTA: Dall'emergenza della colonia, le linee iPSC dovranno essere adattate alle condizioni di coltivazione hPSC preferite dal laboratorio. Questo protocollo dimostrerà come le linee iPSC siano state adattate a condizioni prive di alimentazione, coltivate su piastre rivestite con vitronectina (VTN), alimentate con mezzi hPSC definiti chimicamente e disponibili commercialmente. Se le colonie non si adattano bene alle nuove condizioni, potrebbero aver bisogno di una transizione più dolce, come essere prelevate su cellule nutritive con substrati hES.

  1. Prepara le piastre rivestite di VTN scongelandole e mescolando accuratamente il VTN. Per una piastra da 24 pozzi, preparare 12 mL di DPBS con 120 μL di VTN (5 μg/mL da 500 μg/mL) e distribuire 0,5 mL di soluzione/pozzo di VTN. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
  2. Prepara il medium hPSC scongelando 1 bottiglia di integratore hPSC a 4°C durante la notte. Una volta scongelato, aggiungi 10 mL di integratore hPSC a una bottiglia da 500 mL di medium basale hPSC.
  3. Preparare le piastre per la selezione rimuovendo la soluzione VTN dai pozzi della piastra a 24 pozzi e aggiungendo 0,5 mL di mezzo hPSC con 0,5 μL di Y-27632 (10 μM da 10 mM) a ciascun pozzo.
  4. Porta la nuova piastra a 6 pozzi contenente le cellule/colonie trasdotte, aghi sterili per siringa e una pipetta p200 e punte a un microscopio dissezionale in condizioni sterili.
  5. Posizionare la lastra contenente le cellule trasdotte e le colonie emergenti sul microscopio dissezionale e usare il microscopio per individuare una colonia da selezionare. Solleva il coperchio della piastra per esporre il pozzo.
  6. Apri asepticamente la siringa ed esponi l'ago. Guidata dal microscopio, usa la punta dell'ago per staccare la colonia da eventuali cellule alimentari circostanti tracciando il contorno della colonia con l'ago.
  7. Usa la punta dell'ago per tagliare la colonia in pochi pezzi di dimensioni uguali. Se i pezzi della colonia non si sono già staccati dalla placca, usa il lato dell'ago per raccoglierli o raschiarli dalla piastra in modo che fluttuino.
    ATTENZIONE: Getta l'ago nel contenitore appropriato per oggetti taglienti.
  8. Con il p200, usa il microscopio per riposizionare la colonia selezionata. Aspirare la colonia galleggiante con la pipetta e trasferire in un pozzo della piastra preparata a 24 pozzi. Cerca di far entrare l'intera colonia nel pozzo senza prendere altre colonie o cellule nutritrici.
  9. Posizionare la piastra nell'incubatrice a 37 °C, 5% CO2 e 20%O2.
  10. Nutrire le colonie prelevate con 1 mL di substrato hPSC ogni giorno finché non diventano confluenti.
    NOTA: Le colonie hanno il potenziale di essere geneticamente distinte tra loro. Ogni pozzo della lastra a 24 pozzi deve contenere solo una colonia selezionata. A ogni colonia selezionata viene assegnato un identificativo distinto e da qui in poi viene trattata come una linea cellulare diversa dalle altre colonie selezionate. Per un rigoroso ciclo di riprogrammazione, scegli almeno 24 colonie ed espandi e caratterizza almeno 3.

8. Espandere

  1. Manutenzione hPSC
    1. Le colonie raccolte sono pronte a dividersi quando sono grandi e rotonde con bordi luminosi (Figura 4A). Le colonie si spezzano in più pezzi quando vengono raccolte. Se ci sono più colonie in un pozzo, dividile prima che crescano abbastanza da entrare in contatto e iniziare a differenziarsi.
    2. Preparare una piastra a 6 pozzi rivestita con VTN: per una piastra a 6 pozzi, preparare 12 mL di DPBS con 120 μL di VTN (5 μg/mL da 500 μg/mL) e distribuire 1 mL di soluzione/pozzo di VTN. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora. La soluzione di VTN può essere sostituita con DPBS e conservata a 37 °C, 5% di CO2 per un mese. Nei pozzi che verranno suddivisi, aspirare DPBS e sostituirlo con un mezzo da 1 mL hPSC.
    3. Aspira il substrato dal pozzo per farlo spaccare, poi risciacqua una volta con 1 mL di DPBS. Aspirare il DPBS e aggiungere 500 μL di 0,5 mM di dissociazione EDTA (preparato in 500 mL DPBS con 0,9 g di NaCl e sterilizzato con filtro)15. Incubare a 37 °C, 5% di CO2 per 2 minuti, finché le colonie iniziano ad allentarsi e le cellule all'interno di ciascuna colonia iniziano a radunarsi e staccarsi tra loro.
    4. Rimuovere la piastra dall'incubatrice, aspirare il buffer di dissociazione EDTA. Utilizzando una pipetta p1000, raccogli le cellule con un mezzo hPSC da 1 mL pipettando delicatamente su e giù finché le colonie non sono completamente staccate e leggermente spezzate. Trasferire 1 mL di mezzo e celle nel nuovo 6-pozzo contenente 1 mL di mezzo fresco hPSC. Questa prima divisione avviene con un rapporto di suddivisione 1:1, tutte le celle della piastra originale vengono trasferite alla nuova piastra di divisione.
    5. Posizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C, 5% diCO2 e 20% diO2. Nutri gli iPSC ogni giorno finché il pozzo non è confluente e pronto per la divisione.
      NOTA: La scarsa morfologia delle cellule staminali (Figura 4B) può essere mitigata regolando il protocollo di scissione come la divisione anticipata, usando un tempo di incubazione EDTA più breve o regolando il rapporto di scissione.
    6. Espandi in un piatto da 10 cm.
      1. Una volta che le cellule sono confluenti in ciascun pozzo delle piastre a 6 pozzi, ricoprire una piastra da 10 cm con VTN (7 mL DPBS con 70 μL VTN (5 μg/mL da 500 μg/mL), incubata per 1 ora a RT).
      2. Ripeti il protocollo di scissione, questa volta espandendosi dal pozzo a 6 al piatto di coltura tissutale da 10 cm (rapporto di divisione 1:1). Usa 7–10 mL di medium hPSC per piatto da 10 cm.
      3. Una volta che le cellule nella piatto da 10 cm sono confluenti, si ripete questo processo di scissione (passaggio). Ad ogni passaggio, annota il numero del passaggio. Il rapporto di suddivisione dipende dalla morfologia e densità cellulare. Un rapporto tipico è 1:10, dove un decimo delle celle della piastra originale viene trasferito alla nuova piastra di piastra originale.
  2. Freezeback e preparazioni per le scorte
    1. Dopo circa 3 passaggi, espandi in quattro piastre di coltura tessutale da 10 cm per i primi passaggi. Una volta che le cellule nei piatti da 10 cm sono confluenti, sono pronte per essere congelate.
    2. Prepara i cryovials e mettili nel congelatore per farli raffreddare. Assicurati che l'etichetta includa la linea cellulare, il clone, il numero di passaggio e la data del congelamento.
    3. Prepara il mezzo congelante: 90% medium hPSC e 10% DMSO, ti servirà 1 mL/fiala (3 fiale congelate per piatto da 10 cm).
    4. Eseguire il protocollo di divisione come al solito, utilizzando un buffer di dissociazione EDTA da 4 mL 0,5 mM per ogni parabola da 10 cm.
    5. Dopo l'incubazione con EDTA, aspirare EDTA. Aggiungi delicatamente 10 mL di medium hPSC al piatto.
    6. Lava delicatamente le cellule dal piatto pipettando il substrato. Le cellule si staccano facilmente dal fondo della piastra e si mescolano nel substrato. Pipetta solo 2–5 volte per rompere delicatamente le colonie ma evitare la dissociazione in singole cellule.
    7. Centrifugare per 5 minuti a 200 x g a RT. Aspirare il soprantantante e risospendere la pellet cellulare nel mezzo congelante.
    8. Isolare e congelare immediatamente a -80 °C. Trasferire le fiale congelate nella vasca di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    9. Congela altre scorte allo stesso modo una volta completata la caratterizzazione.

9. Caratterizzazione degli iPSC:

  1. Espressione dei marcatori di stelo. Dopo aver espanso per almeno 10 passaggi, quando le colonie in un 24-pozzo sono pronte per essere divise, fissare con paraformaldeide al 4% e colorare tramite immunoistochimica per il marcatore di stelo NANOG. Ci vorranno almeno 10 passaggi perché le colonie siano negative al virus Sendai (SeV), cosa che può essere confermata tramite immunofluorescenza (Figura 4C).
  2. Capacità di pluripotenza di test: tre differenziazioni dello strato germinale. La pluripotenza dell'iPSC è confermata da una differenziazione riuscita in ciascuno dei tre strati germinali. Ogni differenziazione parte da una piatto confluente di 10 cm che mostra una buona morfologia hPSC (Figura 4A).
    1. Ectoderm16
      1. Il giorno prima dell'inizio della differenziazione (giorno-1): Seminare iPSC su piastre a 24 pozzi rivestite da matrice a una densità di 2,6 × 105 cellule/cm 2 in medio hPSC con Y-27632 (concentrazione finale di 10 μM) e XAV-939 (concentrazione finale di 2 μM).
      2. Giorno 0–giorno 1: Alimentazione con 1 mL/base di differenziazione del pozzo con LDN (concentrazione finale di 100 nM), SB (concentrazione finale di 10 μM) e XAV (concentrazione finale di 2 μM).
      3. Giorno 2–giorno 7: Alimentazione con 1 mL/base di differenziazione del pozzo con LDN (concentrazione finale di 100 nM) e SB (concentrazione finale di 10 μM). Dal d3, nutri a giorni alterni.
      4. Giorno 8: correggere con il 4% di paraformaldeide e colorare tramite immunoistochimica per il marcatore ectodermicoPAX6 17 e confermare la perdita del marcatore di pluripotenza NANOG (Figura 4D).
    2. Mesoderma18:
      1. Il giorno prima dell'inizio della differenziazione (giorno -1): Seminare iPSC su piastre rivestite da matrice a 24 pozzi a una densità di 2,5 × 105 cellule/cm 2 in mezzo hPSC con Y-27632 (concentrazione finale di 10 μM).
      2. Giorno 0: Alimentazione con DMEM/F12 con acido L-ascorbico (concentrazione finale di 64 μg/mL), selenite di sodio (concentrazione finale di 13,6 ng/mL), olotransferrina (concentrazione finale di 10 μg/mL), concentrato lipidico definito chimicamente (100x) e CHIR (concentrazione finale di 5 μM).
      3. Giorno 1: Alimentazione con DMEM/F12 con acido L-ascorbico (concentrazione finale di 64 μg/mL), selenite di sodio (concentrazione finale di 13,6 ng/mL), olotransferrina (concentrazione finale di 10 μg/mL), concentrato lipidico definito chimicamente (100x) ed eparina (concentrazione finale di 0,6 U/mL).
      4. Giorno 2: Correggere con paraformaldeide al 4% e colorare tramite immunoistochimica per BRACHYURY-T19 e confermare la perdita del marcatore di pluripotenza NANOG (Figura 4E).
    3. Endoderm20
      1. Il giorno prima dell'inizio della differenziazione (giorno -1): Seminare iPSC su piastre a 24 pozzi rivestite da matrice a una densità di 1,0 × 105 cellule/cm 2 in medio hPSC con Y-27632 (concentrazione finale di 10 μM).
      2. Giorno 0–giorno 4: Al giorno 0, lavare con DPBS e nutrire con RPMI con sostituto di L-glutamina (100x), FBS (0,5% concentrazione finale) e Activin A (concentrazione finale di 100 ng/mL). Da d0, nutri ogni giorno con gli stessi media.
      3. Giorno 5: Correggere con paraformaldeide al 4% e colorare tramite immunoistochimica per il marcatore endodermico SOX1721 e confermare la perdita del marcatore di pluripotenza NANOG (Figura 4F).
        NOTA: Le differenziazioni sono state effettuate secondo protocolli precedentemente pubblicati. Secondo la nostra esperienza, i rivestimenti a matrice possono essere intercambiabili.

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Risultati

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Il successo di questo protocollo può essere monitorato in varie fasi. La Tabella 1 offre un riassunto degli esempi su cui è stato eseguito questo protocollo. I campioni iniziali, che sono o coat buffy criopreservati conservati per una settimana o PBMC criopriservati, che presentano buona qualità del campione al momento dello scongelamento e l'aspetto morfologico distinto dopo l'espansione cellulare, sono stati riprogrammati con successo 6 volte su 7 (Tabella 1, c...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnologia iPSC ha un enorme potenziale nel campo biomedico per quanto riguarda la scoperta dei meccanismi delle malattie, la medicina personalizzata e le "sperimentazioni cliniche in un piatto"22,23. Protocolli efficienti e adattabili per la riprogrammazione degli iPSC da campioni di sangue sono fondamentali per sbloccare il grande potenziale della tecnologia iPSC, poiché sono facili da raccogliere e spesso facilmente reperib...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichiariamo che la ricerca è stata condotta senza relazioni commerciali o finanziarie che potessero essere considerate un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sono stati reclutati soggetti umani e forniti il consenso informato per la donazione di sangue secondo il protocollo IRB UGA# 2012-10769-06, NYU# s21-01701, Emory# 2024P008659 ed Emory# 000002114. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of General Medical Sciences del National Institute of Health con il numero di premio 5T32GM142623 a J. Art, R01MH115174 a V. Michopoulos e R01NS114567 a N. Zeltner. Il contenuto è esclusivamente di responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piatti standard di coltura tessutale da 10 cmFalcon353003
Piastre a 12 pozziFalcon353043
Tubi conici da 15 mLFisher7200886
Piastre a 24 pozziCorning7200740
Soluzione paraformaldeide al 4%Thermo ScientificJ19943-K2
Piastre a 6 pozziFisher ScientificFB012927
accuSpin1RFisher Scientific75003449
Activin ABio-techne338-AC
AF488-asino e alfa; CaprainvitrogenA11055
AF555-asino e alfa; RBTinvitrogenA31572
AF647-asino e alfa; minvitrogenA31571
AF647-asino e alfa; RBTinvitrogenA31573
Antibiotico-Antimicotico (100X)Fisher15 240 096 
Pipete sierologiche di polistirene BasixFisher14955233
14955234
14955235
14955236
Siringhe di tubercolina BDFisher14-826-87
Tubi di preparazione a celle mononucleari in vetro in vetro BD (CPT)Fisher Scientific02-685-125Tubi di raccolta del sangue isolanti PBMC
BD  Tubi di raccolta del sangue in plastica Vacutainer con K2EDTA: Chiusura HemogardFisher Scientific02-657-32Tubi di raccolta del sangue rivestiti di anticoagulante
B-MercaptoetanoloFisher21 985 023 
Gelatina bovinaSigmaG1393
IgG policlonale di capra con anticorpi Brachyury-TR& DAF2085
CellDrop BFDenovixCellDrop BF
Centrifuga 5702EppendorfEP022628102-1EA
concentrato lipidico definito chimicamenteFisherNC9022744
Chir 99021 R& D4423
Incubatore CO2SanyoMCO-20AIC
Sistema di stoccaggio criopreservativoSistemi biogenici personalizzatiV-1500AB
CryoStor CS10Tecnologie delle cellule staminali100-1061Mezzo di congelamento alternativo
Kit di riprogrammazione Sendai CytoTune-iPS 2.0FisherA16517
DesametasoneSigmaD2915
DMEMFisher11965118
DMEM/F12Fisher11330057
DMSOFisherBP231-1
DPBS 1X SENZA CA MG FisherMT21031CM
EDTAFisherAM9262
Eritropeitina (EPO)Bio-Techne287-TC-500
Essenziale 6 Media (E6)FisherA1516401Base 
Medium Essential 8 (E8)FisherA1517001Mezzo basale hPSC
Microscopio EVOS FLThermoAMF4300
Siero bovino fetaleVWR45000-734
FGF base (FGF2)Bio-techne233-FB/CF 
GeltrexFisherA1413202Rivestimento a matrice
Soluzione di amminoacidi non essenziali Gibco MEM (100X)Fisher11140050
GlutamaxFisher35050061Sostituto della L-glutamina  
EparinaTecnologie delle cellule staminali7980
Istopaque 1077Sigma10771Soluzione gradiente di densità 1 
OlotransferrinaSigmaT0665
Fattore delle Cellule Staminali Umane (SCF)Peprotech300-07-100UG
Fattore di crescita simile all'insulina 1 (IGF1)Peprotech100-11-100UG
Interleuchina-3 (IL-3)Peprotech200-03-2UG
Isotemp 210 bagno-mariaFisher Scientific210
Sostituzione del Siero Knockout (KSR)Fisher10828028Supplemento gratuito FBS & nbsp;
L-Acido AscorbicoSigmaA4544-100G
LDN193189Stemgent04-0074
L-GlutamminaFisher25030081
LymphoprepTecnologie delle cellule staminali7801Soluzione del gradiente di densità 2
MatrigelCorningCB-40234Rivestimento a matrice
Fibroblasti embrionali del topoFisherA34964 
Capra policlonale Nanog IgGR& DAF1997-SP
Nunc Biobanca e Tubi Criogenici per Colture CellulariFisher Scientific12-565-163N
Penicillina/StreptomicinaFisher15140122
IgG policlonale purificato anti-Pax-6 anticorpoBiolegend901301
QBSF-60 Medium Siero LiberoQualità Biologica160-204-101Base EM
Mezzo di congelamento per colture cellulari di recuperoThermo Fisher Scientific12648010Mezzo di congelamento alternativo
rhVitronectin (VTN)FisherA31804
RPMI 1640 MediumFisher11875093
SB431542R& D1614
Sendai virus HN Anticorpo monoclonale Topo IgG2aInvitrogen14649482
Selenite di sodioSigmaS5261
Sox17 Anticorpi IgG policlonale di capraR& Daf1924
Supplemento StemSpan per l'espansione eritroideTecnologie delle cellule staminali2692Supplemento alternativo per mezzo di espansione commerciale
Medium StemSpan SFEM IITecnologie delle cellule staminali9605Mezzo alternativo di espansione commerciale
Congelatore a ultra bassissima temperaturaThermo Fisher ScientificTSX60086A
Punte universali per pipette - FiltrateVWR76322-132
76322-134
76322-150
76322-156
XAV939Bio-techne3748/10
Y-27632 DicloridratoBioGemme1293823

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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