Respirazione basale del suolo come metodo per determinare l'influenza della gestione del suolo e dell'attività microbica

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per valutare la respirazione basale del suolo utilizzando un analizzatore di gas a infrarossi (IRGA) che consente un monitoraggio controllato e continuo della dinamica della CO₂ del suolo in condizioni controllate e una valutazione riproducibile dell'attività microbica.

Abstract

La respirazione del suolo rappresenta il trasferimento di CO₂ dal suolo all'atmosfera ed è uno dei maggiori flussi di carbonio terrestri dopo la produzione primaria lorda. Poiché è guidato in gran parte dall'attività metabolica degli organismi del suolo, è ampiamente riconosciuto come un indicatore sensibile dell'attività biologica del suolo, del ricambio del carbonio e degli impatti di disturbi ambientali o legati alla gestione. La respirazione del suolo integra molteplici fonti di CO₂, inclusa la respirazione autotrofa dalle radici delle piante e dai microrganismi della rizosfera, e la respirazione eterotrofa associata alla decomposizione microbica della materia organica. Quando misurata in assenza di substrati esterni o di recenti apporti di nutrienti, la respirazione microbica è chiamata respirazione basale del suolo (SBR).

Questo articolo presenta un protocollo basato su un analizzatore di gas a infrarossi (IRGA) per quantificare la SBR in condizioni di laboratorio controllate. Per isolare la componente eterotrofa attribuibile al solo metabolismo microbico, i flussi di CO₂ derivati dalle piante vengono esclusi utilizzando campioni di suolo precondizionati, setacciati e omogeneizzati incubati in condizioni standardizzate di umidità e temperatura, permettendo la quantificazione dell'evoluzione cumulativa di C-CO₂ nel tempo, fornendo un proxy robusto della biomassa, dell'attività e della salute del suolo microbica. Il protocollo include la preparazione del suolo, la regolazione dell'umidità, l'incubazione con fiale sigillata, la misurazione della CO₂ basata sull'IRGA e il calcolo della respirazione cumulativa.

In questo studio, abbiamo valutato la SBR utilizzando un analizzatore di gas a infrarossi (IRGA), che consente il monitoraggio della dinamica della CO₂ del suolo in condizioni controllate. I risultati rappresentativi hanno mostrato che l'aggiunta di compost ha migliorato la respirazione microbica nei suoli aridi del deserto di Tabernas, indicando una forte stimolazione dei processi microbici dopo l'emendamento organico. Questi risultati evidenziano l'utilità della SBR come indicatore degli effetti della gestione del suolo sull'attività microbica, in particolare in ambienti aridi degradati. Metodologicamente, il protocollo basato sull'IRGA offre uno strumento pratico per applicazioni di ricerca e insegnamento relative alla dinamica del carbonio del suolo.

Introduzione

La respirazione del suolo è un processo biogeochimico centrale che comprende il flusso di anidride carbonica (CO₂) dalla superficie del suolo all'atmosfera. Si stima che sia il secondo più grande flusso di carbonio terrestre dopo la produzione primaria^{lorda 1} e contribuisce in modo significativo al ciclo globale^{del carbonio 2}. Questo processo è fondamentale per il ricambio del carbonio negli ecosistemi terrestri ed è sempre più utilizzato come indicatore sensibile dell'attività biologica del suolo e della dinamica del sequestro del carbonio^{nel suolo 3,4}.

La respirazione del suolo deriva da molteplici fonti ed è generalmente suddivisa in due principali componenti biologiche: la respirazione autotrofa, originata dal metabolismo delle radici delle piante e dai microrganismi associati alla rizosfera, e la respirazione eterotrofa, associata alla decomposizione microbica della materia organica del^{suolo 5,6}. Fonti non biologiche come l'alterazione^{carbonatica 7} e la fotodegradazione⁸ possono contribuire in condizioni specifiche. Per isolare la componente eterotrofa attribuibile solo al metabolismo microbico, devono essere esclusi i flussi di CO₂ derivati dalle piante.

In questo contesto, la respirazione microbica è definita come la produzione di CO₂ o l'assorbimento di O₂ da parte di microrganismi—inclusi batteri, funghi, protozoi e alghe—come risultato di processi metabolici aerobici^{o anaerobici 9}. Quando misurata in assenza di substrati esterni o di recenti apporti di nutrienti, la respirazione microbica è chiamata respirazione^{basale 10}. La respirazione basale riflette l'attività metabolica endogena della comunità microbica nativa ed è spesso impiegata come proxy della biomassa microbica, dell'attività e della sensibilità ai disturbi ambientali o^{antropici 11,12}.

Per valutare accuratamente la respirazione basale, vengono effettuate misurazioni di laboratorio su campioni di suolo precondizionati, setacciati e omogeneizzati. Questo pretrattamento rimuove efficacemente radici e macrofauna, eliminando così la respirazione autotrofa e permettendo di concentrarsi sull'attività microbica eterotrofa. Sebbene il setaccio alteri la struttura originale del suolo, migliora l'omogeneità e la riproducibilità del campione e facilita lo studio dei processi guidati dai microbi in isolamento⁹. L'incubazione viene tipicamente effettuata in condizioni ambientali controllate, come 25 °C e il 60% della capacità del campo del suolo, per ottimizzare l'attività microbica senza favorire gruppi funzionali^{specifici 13,14}. In questo contesto, l'umidità del suolo e la capacità di campo sono parametri critici perché la respirazione microbica è altamente sensibile alla disponibilità d'acqua, che regola la diffusione del substrato, l'apporto di ossigeno e il metabolismo microbico. Per questo motivo, le misurazioni della respirazione basale vengono comunemente eseguite in condizioni standardizzate di umidità espresse in proporzione della capacità di campo. Il C-CO₂ evoluto durante un periodo di incubazione è quantificato come misura della respirazione^{basale 15}.

Questo protocollo è particolarmente adatto per studi di incubazione in laboratorio controllati volti a valutare l'attività microbica tramite respirazione basale in suoli precondizionati. È particolarmente utile per confrontare suoli sottoposti a diverse pratiche di gestione, come l'emendamento organico o altri disturbi, utilizzando campioni omogeneizzati in condizioni standardizzate di temperatura e umidità. Poiché gli apporti di CO₂ derivati dalle piante sono esclusi, il metodo è più adatto per valutare la componente eterotrofa della respirazione del suolo piuttosto che la respirazione totale del suolo in condizioni di campo.

Sono state sviluppate diverse tecniche analitiche per quantificare la respirazione del suolo, ognuna variando in sensibilità, portata e complessità^{operativa 9,16}. Gli approcci classici includono l'assorbimento degli alcali seguito da titolazione, sistemi conduttimetrici, cromatografia dei gas e analisi dei gas a infrarossi. I metodi a base di alcalini sono robusti e relativamente economici, ma offrono una risoluzione temporale limitata e possono essere influenzati da assorbimento o perdita incompleta di CO₂. I metodi conduttimetrici permettono misurazioni continue, anche se possono essere influenzate dalla temperatura e dalla forza ionica. La cromatografia gassogas fornisce una quantificazione precisa della CO₂ nello spazio di testa e consente la determinazione simultanea di altri gas, ma richiede strumenti specializzati e personale addestrato, e la portata può essere limitata. Al contrario, gli analizzatori di gas a infrarossi (IRGA) permettono un monitoraggio rapido e ripetuto della concentrazione di CO₂ in condizioni di incubazione controllate, rendendoli particolarmente utili per misurazioni risolte nel tempo della respirazione microbica. Tuttavia, le misurazioni IRGA richiedono anche una calibrazione adeguata e un attento controllo delle condizioni di incubazione per garantire la riproducibilità, e possono essere influenzate da deriva del segnale, interferenze da vapore acqueo e affidabilità ridotta a concentrazioni elevate di CO₂. Gli sviluppi recenti hanno ampliato la disponibilità di sistemi di respirazione del suolo basati su infrarossi e NDIR, incluse piattaforme a basso costo basate su camere e sensori per applicazioni di laboratorio e ^{sul campo 24,25}. Nelle incubazioni a fiale chiuse, il rapporto tra spazio di testa e suolo e l'intervallo tra le misurazioni devono essere regolati in base alla frequenza respiratoria attesa per evitare un eccessivo accumulo di CO₂ durante l'incubazione. Sono stati pubblicati protocolli recenti basati su IRGA per supportare misurazioni standardizzate di laboratorio della respirazione del suolo in condizioni di incubazione^{controllate 26,27}, e linee guida metodologiche standardizzate per le misurazioni della respirazione del suolo sono state proposte anche nel recente protocollo^{FAO 28.} In questo contesto più ampio, la respirazione basale può essere considerata anche una componente della valutazione della salute del suolo negli esperimenti agricoli a lungo termine. Riflette l'attività metabolica microbica e la mineralizzazione del C, mentre indicatori come il rinaggio della CO₂, il carbonio ossidabile dal permanganato e la cattura del carbonio organico del suolo sono aspetti complementari del^{funzionamento del suolo 29}. In questo studio, abbiamo utilizzato un IRGA perquantificare i tassi di respirazione basale da campioni di suolo incubati. Questo metodo consente un monitoraggio ripetuto dello scarico di CO₂ durante il periodo di incubazione, facilitando la valutazione dell'attività metabolica microbica in condizioni definite di umidità e termica. Il seguente protocollo descrive la procedura di laboratorio utilizzata per misurare la respirazione basale del suolo in suoli sottoposti a diverse condizioni di gestione.

Protocollo

1. Preparativi

1. Collezione di campioni:
   1. Raccogliere campioni per orizzonte del suolo o tra 0 e 10 cm in caso di studi superficiali.
      NOTA: Utilizzare strumenti e guanti disinfettati per evitare contaminazioni microbiche.
   2. Mettere i campioni in sacchi isotermici e trasportarli in laboratorio in una scatola refrigerata.
   3. Se la pre-lavorazione del suolo non può essere effettuata immediatamente, mantenere i campioni a 4ºC (preferibilmente non più di 48 ore).
   4. Lasciare che i campioni si equilibrino a temperatura ambiente per almeno 2 ore prima della lavorazione e dell'incubazione.
2. Preparazione del materiale e pre-lavorazione del suolo:
   1. Disinfetta i materiali da laboratorio immergendoli in candeggina al 10% o etanolo al 70% per 30 minuti, poi risciacqua accuratamente con acqua distillata e lasciali asciugare all'aria prima dell'uso.
      ATTENZIONE: Usa guanti, camice da laboratorio e occhiali quando usi queste sostanze chimiche.
   2. Lascia i campioni a temperatura ambiente per 2 ore per stabilizzarli.
   3. Setaccia i campioni fino a 2 mm. Scarta radici e detriti grossolani usando una pinzetta.
   4. Pulisci il setaccio dopo ogni campione con le soluzioni disinfettanti e asciuga con un asciugamano di carta.
3. Determinare l'umidità del suolo (quantità d'acqua presente) e la capacità del campo (acqua che può trattenere il suolo⁾¹⁷.
   1. Calcolo dell'umidità del suolo: Determinare l'umidità del suolo essiccando in forno (105ºC) 20 g di campione in una capsula di ceramica durante 24^{ore 18} [Eq 1].
      [Equalizzazione 1]
   2. Determinare la capacità di campo utilizzando un apparato a membrana di pressione^{"Richards" 19}.
      1. Posiziona i campioni di terreno sulle lastre ceramiche del dispositivo delimitate da anelli di plastica.
      2. Aggiungi acqua distile fino a saturazione e lascia almeno 24 ore. Successivamente, applicare una pressione di −0,33 bar (−33 kPa) per altre 24 ore. Poi determina nuovamente l'umidità del suolo secondo l'Equazione 1.
4. Determinare la densità del suolo (g·^mL-1). Riempi un barattolo tarizzato e con il volume noto con il campione di terreno essiccato al forno e annota il peso del terreno. La densità del suolo è il rapporto peso/volume del barattolo.
5. Preparazione del campione per l'incubazione:
   1. Imposta la temperatura dell'incubatrice a 25 °C. Lo standard UNE-EN ISO 16072:2002 (Qualità del suolo: metodi di laboratorio per la determinazione della respirazione microbica, https://www.iso.org/standard/32096.html) suggerisce che la temperatura sia per la comparabilità tra studi).
   2. Stima delle condizioni di umidità: Calcola il volume di distillato necessario affinché ogni campione raggiunga il 60% della capacità di campo dal suo contenuto iniziale di umidità^{del suolo 20,21}. Questo sarà il livello di umidità all'inizio dell'esperimento e non è necessario aggiustamento dell'acqua durante il periodo di incubazione.
   3. Selezione della quantità di suolo: La quantità di terreno utilizzata può variare a seconda del contenuto di materia organica (più alto è il contenuto di materia organica, meno terreno è necessario per l'esperimento⁾²¹. Tuttavia, si suggerisce 20 g come quantità di riferimento.
   4. Posizionare i campioni in fiale di vetro da 100 mL e aggiungere acqua distile fino alla percentuale di umidità del 60% della capacità del campo. Sigilla le fiale con un septaum e mettile nell'incubatrice.

2. Misurazioni della concentrazione di_CO2

1. Intervallo di misurazione:
   1. Eseguire misurazioni di_CO2 a intervalli selezionati in base alla frequenza respiratoria attesa del suolo per evitare l'eccessiva accumulazione di CO₂ nel paesaggio del flaco.
   2. Evitare concentrazioni superiori al 10% (100.000 ppm) per prevenire l'inibizione dell'attività microbica. Accorciare gli intervalli di misura se le concentrazioni superano questa soglia. Esegui misurazioni quotidiane durante la prima settimana e ogni 3 o 4 giorni successivi nell'esempio rappresentativo mostrato più avanti.
2. Misurazioni delle concentrazioni di CO2 (%) con un Analizzatore di Gas a Infrarossi Headspace (IRGA)
   1. Calibrare l'IRGA prima di ogni sessione di misura secondo le istruzioni del produttore o utilizzando uno standard zero (aria o azoto priva di CO₂) e almeno uno standard di span con concentrazione nota di CO₂ all'interno dell'intervallo di misurazione. Verifica la stabilità dello strumento e correggi la deriva di base secondo le istruzioni del produttore. Registra i parametri di calibrazione prima delle misurazioni del campione.
   2. Nel dispositivo IRGA descritto nella lista dei materiali, collegare un ago con un capillare allo strumento...
   3. Inserire il neddle attraverso il setto nella fiala per estrarre un'aliquota di gas e registrare la concentrazione di CO₂ (%).
   4. Esegui letture ripetute per campione finché il segnale non si stabilizza.
3. Ricondizionamento del campione
   1. Lasciare le fiale aperte in un'area pulita protetta da polvere e flussi d'aria (preferibilmente in una camera a flusso laminare) per mezz'ora dopo ogni misurazione, per rinnovare l'aria e prevenire condizioni anaerobiche. Non mescolare o agitare il terreno durante questa fase di aerazione.
   2. Richiude le fiale usando il setto e riportale nella camera di incubazione.
4. Correzione CO₂
   1. Aggiungi una fiala senza terra ma con le stesse condizioni operative per compensare un vuoto.
   2. Sottrai i valori del blank ai campioni per rimuovere le condizioni ambientali di CO₂ .
      NOTA: Fai attenzione a non espirare vicino alle fiale aperte. Questo può influenzare i risultati.

3. Calcolo della respirazione basale del suolo (SBR)

1. Determinare il volume di spazio di testa nella fiala (Vhs) sottraendo il volume occupato dal suolo (densità globale) e l'aggiunta di acqua dal volume totale della fiala [Eq 2].
2. Stima il volume del suolo utilizzando misurazioni di densità complessiva e calcola il volume d'acqua a partire dall'umidità aggiunta. Utilizzare questo volume di headspace corretto in tutti i calcoli successivi.
3. Determinazione del volume di spazio di testa nella fiala (Vhs): Si riferisce al volume della fiala meno il volume del contenuto di terra e acqua [Eq 2].
   [Equalizzazione 2]
4. Stima del volume di CO₂ nella fiala
   1. Ottieni il volume di CO₂ nella fiala dalle letture IRGA della concentrazione di_CO2 (%), considerando la testa effettiva del volume della fiala [Eq 3].
      
      [Equalizzazione 3]
5. Stima delle mole di CO₂ espirate dai campioni di suolo:
   1. Ottenere i moli di CO₂ espirati dai campioni di suolo risolvendo n nell'equazione della legge dei gas ideali (P ∙ V = n ∙ R ∙ T) [Eq 4], dopo aver sostituito il V precedentemente calcolato in [Eq 3].
      [Equalizzazione 4]
6. Stima del flusso di CO₂ (mg_{C-CO 2} ^kg-1 suolo secco ^giorno-1)
   1. Devono essere aggiunte misurazioni individuali di %_CO2 e il flusso finale di_CO2 viene stimato usando [Eq 5] con le seguenti considerazioni: i) peso corretto del campione considerando l'umidità del suolo; ii) considerare che un mol di_CO2 rappresenta 12 g di C (12000 mg C).
      
      [Equalizzazione 5]
      dove:
      P = pressione del gas all'interno della fiala. Questo dovrebbe essere equivalente a atmosferico (atm). Corretti ai tuoi valori di posizione.
      Vhs = volume di spazio di gas nella fiala (L)
      [% CO₂ ]= concentrazione di_CO2 misurata con l'IRGA
      R = costante del gas = 0,082 L·atm· K⁻¹·mol⁻¹
      T = Temperatura di incubazione in Kelvin
      Terreno secco = massa del suolo secco in kg
      t = tempo di incubazione in giorni
      Un flusso di lavoro riassuntivo del protocollo è mostrato nella Figura 1.

Figura 1: Flusso di lavoro del protocollo di respirazione basale basale basato basato su IRGA, dal campionamento e precondizionamento del suolo fino all'incubazione, misurazione IRGA e calcoli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

I risultati mostrati in questo articolo corrispondono a un esperimento in cui suoli a basso contenuto fertile sono stati modificati con compost per aumentare i parametri di fertilità e l'attività microbiologica. I suoli originali furono rilevati nel "deserto delle Tabernas" (sud-est della Spagna), una regione dal clima semiarido e con suoli povero^sviluppati. Circa 40 kg dei 30 cm superiori di un campo agricolo furono campionati, portati in laboratorio e setacciati...

Discussione

La respirazione del suolo è un indicatore sensibile dell'attività microbica e della decomposizione della materia organica, fornendo informazioni rilevanti sugli effetti della gestione del ^{suolo 23,24}. L'approccio sperimentale descritto in questo articolo fornisce un quadro semplice e potente per quantificare l'attività microbica del suolo attraverso misurazioni di emissione di CO₂ in condizioni di laboratorio^con...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2 mm sieve
Flaconi o fiale ermetiche con setti (100 mL)
Bilancia analitica
Estrazione a piastra di pressione bar	Soil Moisture Equipment Corp, Goleta, CA, USA	1600F1	Per calcolare la capacità di campo
Acqua deionizzata o acqua distillata sterilizzata
Attrezzatura per incubatore	VWR Inc. Radnor, PA, USA	IL 250R PREMIUM
Pennarello indelebile
Misuratore di concentrazione IRGA CO2	Ametek Inc. Berwin, PA, USA	CheckMate 4	https://www.ametekmocon.com/products/headspacemapgasanalyzers/checkmate-4
Borse e scatole isotermiche			Per trasportare i terreni al laboratorio
Forno da laboratorio			Deve consentire un insieme di 105ºC
Camera di flusso laminare	CRUMA	HZ-1	Opzionale nel passaggio 2.3
Tappo con setto per sigillare ermeticamente i flaconi
Campioni di suolo			Raccolti in modo rappresentativo dall'area da studiare.
Reagenti sterilizzanti			Si può usare candeggina (10%) o etanolo (70%)