Un protocollo standardizzato per la valutazione della tossicità del cadmio negli organoidi colorettali umani tramite un test di viabilità basato sulla luciferasi

Summary

Il protocollo mira a stabilire organoidi colorettali umani e a valutare un saggio di bioluminescenza ATP basato sulla luciferasi per rilevare la tossicità indotta dal cadmio. Valuta la fattibilità e la sensibilità del saggio quantificando le variazioni dipendenti dalla dose e dal tempo nella vitalità organoide.

Abstract

Il cadmio (Cd) è classificato come cancerogeno di Gruppo 1 e costituisce un grave problema ambientale globale. Questo studio mirava a stabilire un modello organoide colorettale umano e a valutare la fattibilità e la sensibilità di un saggio di bioluminescenza ATP basato sulla luciferasi per rilevare risposte tossiche degli organoidi colorettali (CO) all'esposizione al CD. Le cellule staminali sono state isolate dal tessuto colorettale umano e coltivate in una matrice tridimensionale della membrana basale per generare CO. Gli organoidi sono stati trattati con una serie graduata di concentrazioni di Cd per diverse durate di esposizione. Un reagente di vitalità luminescente è stato aggiunto a un rapporto di volume uguale, miscelato delicatamente dondolando a temperatura ambiente per favorire la lisi e la penetrazione del reagente, e poi incubato per permettere il proseguimento della reazione bioluminescente. La luminescenza veniva registrata in modalità luminescenza su un lettore di micropiastre multimodale. L'adattamento della curva dose-risposta è stato utilizzato per calcolare la concentrazione inibitoria mezza massimale e per valutare i cambiamenti nella vitalità o nella vitalità relativa. Le cellule staminali primarie sono state isolate con successo dal tessuto colorettale umano e utilizzate per generare CO. L'esposizione al CD ha prodotto diminuzioni dell'attività metabolica organoide dipendente dalla dose e dal tempo; L'analisi dose-risposta ha prodotto curve di sopravvivenza e valori IC50 per gli organoidi. Questo studio fornisce indicazioni metodologiche e intuizioni pratiche per l'utilizzo dei COs umani negli studi ambientali di tossicologia dei metalli pesanti.

Introduction

Il CD è un metallo pesante naturale classificato come cancerogeno di Gruppo 1 ed è diventato una preoccupazione ambientale^{globale 1}. L'esposizione umana al Cd avviene principalmente tramite inalazione e assunzione alimentare. Sebbene l'esposizione cronica a basse dosi sia associata a una serie di esiti negativi per la salute, ridurne sostanzialmente l'uso e il rilascio ambientale rimane una^{sfida 2,3}. Le colture bidimensionali tradizionali crescono su substrati piatti e privano di architettura tissutale, polarità cellulare e microambiente tumorale. Di conseguenza, possiedono una capacità limitata di ricapitolare l'eterogeneità in vivo e risposte tossicologiche autentiche all'esposizione al^{cadmio 4}. Tali sistemi non possono modellare adeguatamente le interazioni cellula-cellula, la crescita dipendente dalla matrice o i processi biologici alla base dello sviluppo della resistenza ai farmaci⁵. I sistemi organoidi tridimensionali derivati dai tessuti del paziente offrono una piattaforma fisiologicamente più rilevante rispetto alle linee cellulari bidimensionali^{convenzionali 6}. Gli organoidi mantengono le caratteristiche genomiche, l'organizzazione istologica e gli stati funzionali del tessuto primario. Ciò consente una modellazione più accurata della crescita, evoluzione e sensibilità tumorale alla tossicità del cadmio, offrendo chiari vantaggi per la modellazione delle malattie e la ricerca^{tossicologica 7}. I CO possiedono un'architettura tridimensionale complessa, eterogeneità cellulare e capacità intrinseche di auto-rinnovamento e auto-organizzazione ^8,9. Il trapianto di COs in topi riceventi può favorire l'auto-rinnovamento delle cellule staminali intestinali e modulare il microambiente immunitario dell'ospite, producendo effetti^{protettivi 4}. Nel 2009, Sato et al. hanno dimostrato per la prima volta che una singola cellula staminale intestinale adulta Lgr5⁺ può auto-organizzarsi e differenziarsi spontaneamente formando strutture cripto-villosità che comprendono tutte le linee cellulari^{intestinali 10}.

L'epitelio intestinale costituisce la prima linea di difesa contro la tossicità da Cd dopo l'ingestione. Infatti, la biodisponibilità orale del Cd è tipicamente inferiore al 5%. La tossicità intestinale indotta da Cd è caratterizzata dalla rottura delle giunzioni intercellulari, dall'aumento della permeabilità paracellulare e dall'induzione di risposte infiammatorie. Inoltre, il Cd perturba la funzione immunitaria intestinale e altera la composizione e l'omeostasi del microbiota^{intestinale 11}. A seconda della dose e della durata dell'esposizione, il Cd può causare disregolazione del ciclo cellulare, favorendo fenotipi oncogenici in alcuni contesti mentre inducendo apoptosi in altri. Il Cd può stimolare indirettamente la produzione di ROS (specie reattive dell'ossigeno), scatenando stress ossidativo e squilibrio redox. La funzione di recettori, chinasi, fosfatasi, proteasi, molecole di adesione e fattori di trascrizione può essere modulata tramite segnalazione redox. Cd perturba anche le cascate di segnalazione, alterando lo stato di attivazione di ERK1/2, JNK (chinasi c-Jun N-terminale) e p38 MAPK (proteina chinasi attivata da mitogeno p38) in più tipi^{cellulari 12}. Attivando ERK1/2 all'interno della cascata MAPK, Cd può promuovere la proliferazione e la sopravvivenza cellulare, sopprimere la morte cellulare programmata e contribuire all'iperproliferazione^{aberrante 13}. La Cd può regolare direttamente o indirettamente l'espressione e l'attività delle proteine effettrici chiave. Ad esempio, regola al ribasso il soppressore tumorale p53 e aumenta la regolazione delle proteine anti-apoptotiche come Bcl-2 e Bcl-xL, interrompendo infine l'apoptosi e l'omeostasi^{del ciclo cellulare 14}.

Nei modelli di CO utilizzati per valutare gli effetti citotossici del Cd, la misurazione del contenuto di ATP è ampiamente impiegata per valutare la vitalità dell'organoide. L'ATP, la molecola centrale del metabolismo energetico, riflette direttamente lo stato metabolico complessivo e la vitalità degli organoidi. A causa dell'esposizione al cadmio nei CO, il Cd induce principalmente disfunzioni mitocondriali, aggrava lo stress ossidativo e interrompe l'omeostasi dell'energia organoide. Questi eventi compromettono collettivamente la produzione di ATP e, in ultima analisi, riducono la vitalità degli organoidi. Pertanto, le variazioni nei livelli di ATP rappresentano una lettura funzionale robusta della citotossicità indotta dal cadmio. I saghi convenzionali di citotossicità includono saghi colorimetrici MTT/CCK-8, colorazione Live/Dead e analisi basate su citometria a flusso. Rispetto a questi metodi, i saggi basati su ATP offrono vantaggi distinti nei sistemi organoidi tridimensionali. A causa della complessità strutturale e della marcata eterogeneità spaziale degli organoidi, gli approcci tradizionali di colorazione e imaging sono spesso limitati da una penetrazione tessutale inadeguata e da una ridotta accuratezza quantitativa. Al contrario, gli saggi ATP si basano su una reazione bioluminescente mediata dalla luciferasi, consentendo una quantificazione diretta senza disturbare la struttura organoide. La misurazione dell'ATP mostra un'elevata sensibilità e un ampio intervallo dinamico. Ciò consente il rilevamento di risposte biologiche continue, che vanno dalla soppressione metabolica precoce alla morte organoide, facilitando analisi dose-risposta accurate tra concentrazioni variabili di cadmio. I livelli di ATP riflettono in modo completo lo stato funzionale complessivo degli organoidi, superando gli approcci dipendenti dalla valutazione morfologica o da singoli marcatori molecolari. Di conseguenza, questo saggio è particolarmente adatto per lo screening di tossicità ad alto rendimento, offrendo maggiore stabilità e riproducibilità.

Il principio fondamentale alla base dell'uso della bioluminescenza ATP per valutare la sensibilità dei COs all'esposizione al Cd è che la luciferasi delle luciole catalizza l'ossidazione della D-luciferina in presenza di ATP, Mg²⁺ e O₂ per produrre ossiluciferina ed emettere fotoni. L'intensità della luce emessa è proporzionale al contenuto misurabile di ATP nel campione all'interno di un intervallo lineare definito. Pertanto, la luminescenza funge da surrogato quantitativo indiretto per l'attività metabolica cellulare o la vitalità. Gli organoidi sono incorporati in una matrice extracellulare e possiedono una struttura tridimensionale multistrato. Per gestire ciò, i reagenti per il saggio ATP presentano composizioni e procedure ottimizzate per lisi-buffer. Queste ottimizzazioni migliorano la disgregazione delle cellule organoidi interne, promuovono il rilascio di ATP e stabilizzano il segnale^{bioluminescente 15}. È importante sottolineare che la bioluminescenza dell'ATP riporta l'attività metabolica piuttosto che un conteggio cellulare esatto. Ad esempio, gli inibitori mitocondriali possono ridurre notevolmente i livelli di ATP cellulare in brevi intervalli anche mentre le cellule rimangono vitali. Al contrario, alcune forme precoci di morte cellulare possono mantenere temporaneamente livelli relativamente alti di ATP.

Nonostante dimostrino una rilevanza fisiologica superiore nelle valutazioni della tossicità del cadmio (Cd), i modelli organoidi colorettali presentano diverse limitazioni pratiche. Rispetto alle tradizionali linee cellulari bidimensionali (2D), la coltivazione degli organoidi è più dispendiosa in termini di tempo e costosa. Inoltre, la loro dipendenza da matrici derivate da animali introduce variabilità da batch a batch, limitandone l'utilità nello screening di tossicità su larga scala e ad alta produttività. Sebbene questi modelli siano altamente appropriati per valutare gli effetti tossicologici diretti dei metalli pesanti sull'epitelio intestinale, non possono ancora sostituire completamente i modelli in vivo per valutare la tossicità sistemica o processi tossicocinetici complessi.

In questo studio, il tessuto colorettale umano è stato utilizzato come materiale di origine per isolare le cellule staminali colorettali e stabilire le COs in vitro. Gli organoidi sono stati esposti al Cd a varie concentrazioni e per diverse durate di esposizione. La luminescenza veniva quindi misurata utilizzando il lettore multi-modalità micropiastra in modalità di rilevamento della luminescenza. La vitalità della cella o i valori IC50 sono stati calcolati e visualizzati utilizzando software operativo per un lettore specifico di microplacche.

Protocol

L'esperimento è stato approvato dal Comitato Etico del Suzhou Vocational Health College (Approvazione n. SWYXLL202516) e si svolgeva in conformità con gli standard etici medici. Tutti i soggetti coinvolti in questa ricerca hanno fornito un consenso scritto e informato.

1. Isolamento del tessuto colorettale umano e stabilimento di CO

1. Trasporto e conservazione dei campioni di tessuto
   1. Prima dell'esperimento, scongelare lentamente la matrice della membrana basale a 4 °C ed equilibrare il mezzo di coltura richiesto alla temperatura ambiente.
   2. Inserire immediatamente il tessuto colorettale umano ottenuto da procedure cliniche in una soluzione di conservazione del tessuto pre-raffreddata (2–8 °C).
      NOTA: Assicurarsi che il tessuto rimanga completamente sommerso durante il trasporto. Trasferire i campioni in laboratorio.
2. Sotto un armadietto di biosicurezza, posizionare il tessuto in una ciotola di coltura da 6 cm per la valutazione. Rimuovere con cura il tessuto adiposo visibile e gli strati muscolari usando bisturi e pinze, mantenendo i componenti epiteliali.
3. Trasferire il tessuto in una piastra da 6 cm contenente 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con 300 μL di antibiotici. Taglia il tessuto in frammenti da 2 mm × 5 mm.
4. Trasferire i frammenti di tessuto in un tubo centrifuga da 50 mL.
5. Aggiungere 10 mL di PBS pre-raffreddato e 200 μL di 0,5 M EDTA (concentrazione finale ~10 mM) al tubo.
6. Posiziona il tubo su uno shaker a temperatura ambiente e agitalo delicatamente a 0,072 g per 15 minuti.
7. Usa le pinze per trasferire il tessuto nella vasca di coltura ed esaminarlo al microscopio. Procedere al passo successivo una volta che le strutture della cripta diventano visibili o iniziano a staccarse.
   NOTA: Quando le strutture criptografiche diventano visibili sotto osservazione microscopica dopo il trattamento con EDTA, la digestione ha generalmente raggiunto un livello sufficiente per l'isolamento della cripta, e le cripte iniziano a staccarsi dai frammenti di tessuto epiteliale allentati. Le cripte intate tipicamente conservano una morfologia ghiandolare o tubolare ben definita con un lumen centrale riconoscibile, mentre una digestione eccessiva produce un gran numero di cellule singole dissociate e detriti necrotici.
8. Terminare la digestione non appena numerose cripte intatte diventano visibili e i frammenti di tessuto appaiono sciolti e traslucidi, permettendo a una pipettura delicata di liberare facilmente le cripte.
   NOTA: L'incubazione prolungata dell'EDTA altera l'integrità della cripta, aumenta l'accumulo di detriti cellulari e riduce la vitalità delle cellule staminali intestinali, diminuendo così l'efficienza della successiva formazione di organoidi.
9. Aggiungi 15 mL di PBS integrato con antibiotici per fermare la digestione dell'EDTA. Mescola delicatamente.
10. Centrifuga il campione a 300 × g per 3 minuti a 4 °C.
11. Rimuovi il soprannatante.
12. Aggiungi 1 mL di mezzo cellulare completo e trasferisci la sospensione su un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
13. Centrifuga la sospensione a 300 × g per 3 minuti e scarta il sovrantante.
14. Aggiungi 500 μL della matrice della membrana basale a un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e mescola bene.
15. Minimizzare l'esposizione alla temperatura ambiente durante la miscelazione e mantenere la matrice della membrana del basale sul ghiaccio per prevenire una solidificazione prematura.
16. Aggiungi 25 μL della miscela goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzi per formare una goccia.
17. Inverti la piastra a 24 pozzi e incubala a 37 °C con il 5% di CO₂ per 20 minuti.
18. Aggiungi 600 μL di substrato di coltura di CO in ciascun pozzo.
19. Ottenere il mezzo organoide colorettale e i reagenti di dissociazione da fonti commerciali e utilizzarli in rigorosa conformità alle istruzioni dei produttori.
20. Per preparare il mezzo cellulare completo, si integra 500 mL di mezzo basale DMEM con 50 mL di siero bovino fetale (FBS) e 5 mL di penicillina-estreptomicina. Mescola la soluzione accuratamente con una delicata inversione.

2. Saggio di sensibilità dei COs esposti al Cd

1. Placcatura e coltura delle COs in piastre a 96 pozzi
   1. Scartare il mezzo di coltura da ogni pozzo e aggiungere 500 μL di soluzione di dissociazione organoide. Pipetta delicatamente su e giù per disperdere la matrice della membrana basale.
   2. Inserire la piastra trattata in un incubatore a 37 °C e 5% di CO₂ per la digestione, con un tempo di digestione iniziale di 10 minuti.
   3. Raccogliere la soluzione digertiva da ciascun pozzo della piastra a 24 pozzi in un tubo centrifuga da 15 mL e aggiungere 10 mL di mezzo cellulare completo.
   4. Centrifugare a 300 × g per 3 minuti per raccogliere l'organoide e scartare il surnatante.
   5. Aggiungere 1 mL di mezzo completo per coltura cellulare, mescolare accuratamente tramite pipetto e trasferire la sospensione in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
   6. Centrifuga a 300 × g per 3 minuti, poi scarta il soprantantante.
   7. Aggiungi 100 μL della matrice della membrana basale e mescola accuratamente tramite pipetta.
   8. Dissociare gli organoidi e stimare il numero di singole cellule al microscopio prima di seminare circa 3.000–5.000 singole cellule per pozzo.
   9. Mantenere una densità di semina relativamente costante in tutti i gruppi sperimentali per garantire una crescita organoide riproducibile e risultati sperimentali.
   10. Regolare l'intervallo di semina basandosi sulla valutazione microscopica dopo la dissociazione organoide e sulle condizioni precedentemente segnalate comunemente utilizzate negli studi sulla coltura organoide.
   11. Aggiungere 6 μL della miscela al centro di ogni pozzo di una piastra da 96 pozzi. Utilizzare in totale 30 pozzi, con tre repliche tecniche.
   12. Inverti la piastra e incubala a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 15 minuti.
   13. Aggiungere 100 μL di mezzo per la coltura organoide a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzi.
   14. Inizia il trattamento al cadmio esattamente 7 giorni dopo la semina.
       NOTA: Questo periodo di coltura di 7 giorni permette alle singole cellule di svilupparsi completamente in COs strutturalmente intatti.
2. Diluizione della concentrazione di CD
   1. Sciogliere 3,67 mg di polvere di cloruro di cadmio in 2 mL di acqua sterile ultra-pura per preparare una soluzione di stocco da 10 mM con un volume finale di 2 mL.
   2. Sterilizza i 2 mL di soluzione di cadmio da 10 mM passandoli attraverso un filtro da 0,22 μm.
   3. Aliquota la soluzione di cadmio sterilizzata in tubi centrifughe da 1,5 mL e conservali a 4 °C, protetti dalla luce.
   4. Indossare l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) adeguata, inclusi camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali di sicurezza, durante tutto l'esperimento.
   5. Esegui tutte le operazioni correlate all'interno di una cappa chimica per minimizzare i rischi di esposizione.
   6. Classificare e gestire tutti i rifiuti contenenti Cd, inclusi mezzi di coltura integrati con cadmio, punte di pipetta, tubi centrifughe e vasche di coltura, come rifiuti chimici pericolosi.
   7. Scartare questi materiali in contenitori designati per la raccolta di liquidi o residui solidi per metalli pesanti.
   8. Smaltire tutti i rifiuti rigorosamente secondo le linee guida istituzionali e le normative ambientali locali.
   9. Non trattare mai i rifiuti del CD come spazzatura di laboratorio o versarli nel lavandino.
   10. Etichetta il coperchio di una piastra a 24 pozzi come 4, 3, 2, 1 e 0.
       NOTA: Trattare gli organoidi con Cd a concentrazioni finali di 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM e 0 μM. La diluizione della soluzione di stock di cadmio è stata calcolata utilizzando la formula standard:
               C₁ V₁ = C₂ V₂
3. Per preparare 4 mL della concentrazione operativa di 20 μM, si aggiungono 8 μL della soluzione stock da 10 mM a 3992 μL di mezzo di coltura completo. Mescola la soluzione accuratamente per garantire una distribuzione uniforme.
   1. Aggiungere 1,4 mL di mezzo colturale al pozzo 4 e aggiungere 700 μL di mezzo colturale a ciascuno dei pozzi rimanenti.
   2. Rimuovere 5,6 μL di mezzo colturale dal pozzo etichettato 4 e aggiungere 5,6 μL di soluzione di cadmio. Mescola bene.
   3. Trasferire 700 μL della soluzione dal pozzo etichettato '4' a quello marcato '3' e mescolare accuratamente.
   4. Ripeti il processo di trasferimento e miscelazione da ogni pozzo al pozzo con numeri più bassi (da '3' a '2', '2' a '1' e '1' a '0'), miscelando accuratamente a ogni fase.
      NOTA: Non eseguire alcuna operazione nel pozzo etichettato 0.
   5. Rimuovi la piastra da 96 pozzi dall'incubatrice e scarta il mezzo di coltura esistente.
   6. Etichetta il coperchio della piastra a 96 pozzi da sinistra a destra come 40 μM, 20 μM, 10 μM, 5 μM e 0 μM.
   7. Aggiungere 100 μL di mezzo di coltura contenente cadmio a ciascun pozzo etichettato corrispondente.
   8. Metti il piatto nell'incubatrice.

3. Aggiunta del reagente di vitalità luminescente

1. Rimuovi il reagente luminoso di vitalità dal congelatore a −20 °C e lascialo scongelare a temperatura ambiente. Aggiungi il reagente di vitalità luminescente in un rapporto volumetrico 1:1.
2. Aggiungi 2,5 mL di reagente di vitalità luminescente a un serbatoio usa e getta.
3. Aggiungi 2,5 mL di mezzo organoide colorettale e mescola accuratamente tramite pipetta.
4. Utilizzare un sistema di aspirazione di rifiuti per rimuovere il mezzo di coltura organoide da ciascun pozzo della piastra a 96 pozzi. Evita di aspirare la matrice della membrana basale dai pozzi.
5. Trasferire 200 μL della soluzione dal serbatoio del reagente usa e getta in ciascun pozzo della piastra da 96 pozzi contenente CO, e mescolare accuratamente tramite pipettamento vigoroso. Evita di introdurre bolle d'aria durante la pipettatura.
6. Incubare il piatto a temperatura ambiente per 25 minuti. Incubare a temperatura ambiente, protetto dalla luce.

4. Misurazione del reagente di vitalità luminescente

1. Apri il software operativo per il lettore specifico di micropiastre (Figura supplementare 1A).
2. Clicca su Leggi Ora (Figura Supplementare 1B).
3. Clicca su Nuovo (Figura Supplementare 1B).
4. Clicca su Read (Figura Supplementare 1C).
5. Seleziona Luminescenza (Figura supplementare 1D).
6. Seleziona la fibra di luminescenza (Figura supplementare 1D).
7. Clicca su OK (Figura supplementare 1D).
8. Seleziona la targa completa (Figura supplementare 1E).
9. Clicca su Cancella tutto (Figura supplementare 1F).
10. Seleziona le posizioni corrispondenti sulla piastra target da 96 pozzi, per un totale di 15 pozzi (Figura supplementare 1G).
11. Clicca su OK (Figura supplementare 1G).
12. Inserire la piastra a 96 pozzi nello strumento (Figura supplementare 1H).
13. Seleziona Usa Coperchio (Figura Supplementare 1I).
14. Clicca su OK per iniziare la misurazione (Figura Supplementare 1I).
15. Dopo aver completato la misura, clicca su Esporta per esportare i dati in Excel (Figura Supplementare 1J).

5. Elaborazione e analisi dei dati

1. Software aperto di analisi dei dati statistici in grado di regressione non lineare. (Figura supplementare 2A).
2. Seleziona una tabella dati XY (Figura supplementare 2A).
3. Imposta X a numeri (Figura supplementare 2A).
4. Imposta Y per inserire i valori delle repliche in sottocolonne affiancate e inserisci 3 repliche (Figura supplementare 2A).
5. Inserite i dati (Figura supplementare 2B).
6. Analisi a click (Figura supplementare 2C).
7. Clicca su analisi XY (Figura supplementare 2D).
8. Clicca su regressione non lineare (adattamento della curva) (Figura supplementare 2D).
9. Clicca OK. (Figura supplementare 2D).
10. Seleziona dose–risposta – inibizione (Figura supplementare 2E).
11. Seleziona log(inibitore) vs. risposta normalizzata – pendenza variabile (Figura supplementare 2E).
12. Clicca su OK per eseguire l'analisi (Figura Supplementare 2E).
13. Clicca su File (Figura Supplementare 2F).
14. Clicca su Esporta (Figura Supplementare 2F).
15. Clicca su OK (Figura supplementare 2G).

Results

Istituzione di agenti umani
Abbiamo isolato con successo le strutture criptografiche colorettali da campioni di tessuto, e la morfologia tipica delle cripte è stata chiaramente osservata sia in microscopia a basso che ad alto ingrossamento. Durante la coltura in vitro, le cripte isolate si espansero gradualmente e mostrarono un processo ordinato di maturazione morfologica (Figura 1A,B). Al terzo e al sesto giorno di coltura, si erano formati organoidi colorettali strutturalmente intatti, predominanti con strutture sferiche o simili a gemmi precoci (Figura 1C,D).

Sensibilità dei COs all'esposizione al CD
I COs sono stati seminati in piastre da 96 pozzi e coltivati per altri 5 giorni, seguiti da un trattamento con cadmio a concentrazioni di 0, 5, 10, 20 e 40 μM. Dopo 72 ore di esposizione, è stato eseguito un test di luminescenza basato su ATP per misurare le unità relative di luminescenza (RLU), e i dati sono stati analizzati e visualizzati. I risultati hanno dimostrato un significativo calo della vitalità organoide dipendente dalla dose con l'aumento delle concentrazioni di cadmio (Figura 2A). I COs esposti a cadmio di 10 μM, 20 μM e 40 μM hanno mostrato valori RLU marcatamente ridotti (Figura 2B). Non abbiamo osservato tossicità significativa negli organoidi colorettali esposti a 5 μM Cd. In linea con i dati di vitalità, l'analisi morfologica ha rivelato pronunciate alterazioni strutturali negli organoidi colorettali trattati con cadmio, inclusa riduzione delle dimensioni organoidi, grave interruzione dell'architettura epiteliale e frammentazione strutturale progressiva (Figura 2C). Questi risultati indicano che gli organoidi colorettali sono altamente sensibili alla citotossicità indotta dal cadmio.

Figura 1: Isolamento delle cripte colorettali umane e stabilimento di colture organoidi colorettali. (A) Immagine rappresentativa di cripte colorettali umane isolate. (10×). (B) Vista ad alto ingrandimento di una singola cripta (20×). (C) Immagine rappresentativa dei CO dopo 3 giorni in coltura (4×). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Alterazioni citotossiche e morfologiche indotte da CD nei CO. (A) Curva dose-risposta relativa dei COs esposti a concentrazioni variabili di Cd. L'asse x rappresenta le concentrazioni di Cd e l'asse y indica la vitalità relativa dell'organoide. (B) Valori relativi di RLU dei COs dopo il trattamento con concentrazioni variabili di Cd. L'asse X rappresenta le concentrazioni di Cd, mentre l'asse Y indica i valori relativi dell'RLU. ANOVA unidirezionale *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. (C) Immagini rappresentative in campo chiaro di COs non trattati (0 μM) e trattati con Cd a 5 μM, 10 μM, 20μM, 40μM. Clicca qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare 1: Un flusso di lavoro dettagliato in 16 fasi per il rilevamento delle RLU utilizzando il software operativo di uno specifico lettore di microplacche. (A) Icona software. (B) Interfaccia di lancio software. (C) Menu delle impostazioni. (D) Interfaccia di selezione del saggio. (E) Menu di configurazione della disposizione delle targhe. (F) Disposizione predefinita delle piastre. (G) Configurare le posizioni dei pozzi secondo la disposizione sperimentale delle piastre. (H) Caricamento della microplacca. (I) Lo strumento avvia la misurazione RLU. (J) Esportazione dati. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Dopo l'esportazione dei dati, l'elaborazione dei dati e l'analisi statistica vengono eseguite in software di analisi statistica. (A) Schermata principale. (B) Tabella di inserimento dati. (C) Dialogo di analisi. (D) Menu parametri di analisi. (E) Menu di configurazione per la regressione non lineare. (F) Menu opzioni file. (G) Dialogo di esportazione dati. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Questo studio stabilisce un protocollo standardizzato per i test di esposizione al cadmio e di viabilità ATP utilizzando i CO per valutare l'impatto del cadmio sulla vitalità organoide. Questo protocollo ottimizza specificamente le fasi di dissociazione organoide e di placcatura a 96 pozzi per aumentare la riproducibilità sperimentale e la stabilità delle successive letture dei test ATP. Sebbene l'attuale protocollo sperimentale si concentri principalmente sull'istituzione di un modello organoide 3D del cancro colorettale per la valutazione della tossicità da CD, ricerche approfondite hanno dimostrato che le colture cellulari 2D tradizionali e i modelli organoidi 3D differiscono significativamente nelle risposte farmacologiche, nelle interazioni cellulari, nell'architettura tissutale e nei profili tossicologici. Rispetto ai monostrati 2D, gli organoidi riproducono più fedelmente l'architettura spaziale, l'eterogeneità cellulare e il microambiente in vivo dei tumori, offrendo una rilevanza fisiologica superiore. A causa dell'assenza di interazioni complesse cellula-cellula e matrice extracellulare (ECM), la risposta delle colture 2D all'esposizione ai metalli pesanti potrebbe non catturare accuratamente i veri processi tossicologici in vivo¹⁶. Al contrario, il modello CO stabilito in questo studio simula efficacemente la dinamica tridimensionale della crescita dei tessuti tumorali, fornendo una piattaforma altamente rilevante dal punto di vista fisiologico per valutare la tossicità indotta da Cd.

Durante il passaggio organoide, il tempo di dissociazione è stato mantenuto rigorosamente a circa 10 minuti. Questa ottimizzazione previene la dissociazione incompleta, che porta a aggregati cellulari eccessivamente grandi, evitando al contempo la sovradissociazione, che produce un numero eccessivo di singole cellule. Controllando con precisione l'entità della dissociazione, abbiamo ottenuto strutture organoidi relativamente uniformi, migliorando la coerenza dei successivi trattamenti farmacologici e dei saggi di vitalità ATP.

Abbiamo impiegato un sistema di coltura ad alta produttività con 96 pozzi e standardizzato il volume di placcatura della matrice della membrana del basale a 6 μL per pozzo. Questa standardizzazione minimizza la variabilità tra pozzi garantendo una densità organoide e caratteristiche di crescita coerenti in tutti i pozzi, migliorando infine la riproducibilità sperimentale e la comparabilità dei dati. Accoppiando saggi di luminescenza ATP con analisi della curva dose–risposta utilizzando software di analisi statistica dei dati, abbiamo ottenuto una solida valutazione quantitativa delle variazioni nella vitalità organoide dopo l'esposizione al CD. Collettivamente, questo studio stabilisce un protocollo sperimentale altamente riproducibile per l'applicazione di modelli organoidi nella tossicologia ambientale e nell'esposizione ai metalli pesanti.

Durante la coltura dei CO, una miscelazione accurata del pellet della cripta con la matrice della membrana basale è un passaggio fondamentale per garantire una corretta formazione dei CO e una crescita stabile. La proporzione della matrice della membrana basale dovrebbe essere mantenuta sopra il 70% (il volume della matrice della membrana basale > 70%). I volumi raccomandati della matrice membrana del basale sono 6 μL per pozzo per piastre da 96 pozzi, 20 μL per pozzo per piastre da 48 pozzi e 25 μL per pozzo per piastre da 24 pozzi. Dopo la polimerizzazione matriciale, si aggiungono i seguenti volumi ai pozzi: 100 μL per pozzo per piastre da 96 pozzi, 300 μL per pozzo per piastre da 48 pozzi e 500 μL per pozzo per piastre da 24 pozzi. Bisogna fare attenzione a evitare il pipetto diretto del mezzo sulle cupole della matrice della membrana del basamento, poiché ciò potrebbe disturbare l'architettura tridimensionale. Per preservare la stabilità fenotipica e genetica, questo studio ha limitato l'uso degli organoidi colorettali a un massimo di 4 passaggi.

Quando cripte o CO raggiungono un diametro di circa 600 μm o mostrano oscuramento e arresto della crescita, il passaggio deve essere eseguito tempestivamente per consentire analisi di sensibilità successive. Durante la dissociazione enzimatica dei CO, la digestione deve essere monitorata al microscopio. Se i COs non sono sufficientemente dissociati in piccoli cluster cellulari o singole cellule, il tempo di digestione può essere gradualmente esteso in base alla dimensione organoide e allo stato di dissociazione. Una digestione prolungata in un solo passaggio dovrebbe essere evitata per minimizzare il rischio di sovradigestione e perdita di vitalità cellulare.

Calcola la fattibilità relativa per ogni pozzo usando la seguente equazione e utilizza la percentuale media dei pozzi replicati come valore di risposta per ogni concentrazione

 

Il saggio di bioluminescenza ATP si basa sull'ossidazione catalizzata di luciferasi da lucciola di D-luciferina, che porta all'emissione di fotoni. Grazie alla sua elevata sensibilità, alla compatibilità con formati ad alta produttività basati su lastre e alla disponibilità di kit commerciali standardizzati, questo metodo è stato ampiamente applicato per lo screening preliminare della tossicità nei modelli^{organoidi 17}.

Devono essere considerati diversi fattori di confusione. Alcune sostanze chimiche possono inibire direttamente la reazione enzimatica della luciferasi tramite interferenza chimica o soppressione enzimatica, portando all'estinzione del segnale. La luminescenza di fondo dalla matrice extracellulare tridimensionale, l'eterogeneità nella dimensione e densità dell'organoide e la lisi incompleta possono introdurre una notevole variabilità tra pozzi e tra lotti. La luminescenza basata su ATP da sola non può distinguere accuratamente le modalità di morte cellulare né chiarire i meccanismi tossicologici^{sottostanti 18}.

Per aumentare l'affidabilità metodologica, si raccomandano misure sistematiche di controllo della qualità. utilizzando buffer di lisi raccomandati dal produttore o precedentemente validati, e cicli di lisi estesi, dissociazione meccanica o congelamento-discongelamento quando necessario per migliorare l'efficienza della lisi cellulare all'interno della matrice. In secondo luogo, eseguire esperimenti di recupero con spik-in ATP durante l'ottimizzazione del saggio per valutare la possibile inibizione diretta della reazione luminescente da parte dei composti di prova o dell'ambiente di lisi. In terzo luogo, confermare il range di rilevamento lineare utilizzando una curva standard ATP e controllare rigorosamente il tempo tra aggiunta del reagente, incubazione e lettura della piastra per minimizzare la variabilità tecnica. Infine, includere i controlli in blank, veicoli e negativi in ogni saggio e incorporare repliche tecniche sufficienti per valutare e correggere gli effetti di bordo e le variazioni legate al lotto. Recentemente, sono stati sviluppati diversi saggi di vitalità ottimizzati per organoidi con chimica della lisi migliorata e maggiore stabilità del segnale, e queste formulazioni hanno generalmente dimostrato prestazioni superiori negli saghi di tossicità^{tridimensionale 19}. In sintesi, questo studio ha utilizzato CO umani come modello in vitro della tossicologia ambientale dei metalli pesanti e ha stabilito un saggio ad alto rendimento e sensibile basato su bioluminescenza ATP per valutare la suscettibilità agli organidi all'esposizione al Cd. Questo lavoro fornisce un riferimento sperimentale pratico e una guida metodologica per la valutazione della tossicità nei sistemi di ricerca basati su organoidi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Il software operativo per specifico lettore di micropiastre.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Reagente di vitalità luminescente in rapporto volumetrico 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	La matrice della membrana basale
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Soluzione di dissociazione degli organoid
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Il software operativo per specifico lettore di micropiastre.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S