Articolo metodologico

Isolamento e applicazione terapeutica di vescicole extracellulari derivate da aggregati di cellule staminali mesenchimali autoassemblate

DOI:

10.3791/70534

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24 aprile 2026

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1State Key Laboratory of Oral & Maxillofacial Reconstruction and Regeneration, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 2Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3Department of Stomatology, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 4The second Department of Surgery, Jiuquan Satellite Launch Center Hospital, 5Military Medical Innovation Center, The Fourth Military Medical University, 6School of Basic Medicine, Shaanxi University of Chinese Medicine, 7Department of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of The Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo dettaglia l'isolamento efficiente di grandi vescicole extracellulari (LEV) da aggregati di cellule staminali autoassemblate e la loro applicazione terapeutica per la rigenerazione ossea mandibolare.

Abstract

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Le vescicole extracellulari (EV) sono mediatrici vitali della comunicazione intercellulare e promettenti agenti cellulari liberi per la medicina rigenerativa. Tra le sottopopolazioni di EV, le grandi vescicole extracellulari (LEV) sono particolarmente adatte alla riparazione dei tessuti grazie al loro carico arricchito di pro-rigenerazione. Tuttavia, i metodi standardizzati e riproducibili per generare LEVs funzionali derivati dalle cellule staminali dentali per caratterizzazione a valle e valutazione terapeutica rimangono limitati. Sfruttando l'eccezionale potenziale osteogenico delle cellule staminali provenienti dalla papilla apicale (SCAP), abbiamo sviluppato un modello di coltura 3D in condizioni di bassa adesione per indurre aggregati SCAP autoassemblati. Questo modello imita la condensazione mesenchimale fisiologica, potenziando significativamente le interazioni cellula-cellula e aumentando la secrezione di LEV. Sono forniti parametri chiave di coltura e note di gestione per migliorare la consistenza aggregata e massimizzare l'output LEV mantenendo la vitalità della cella. Qui presentiamo un protocollo standardizzato per la produzione efficiente di LEVs funzionali derivati da SCAP, comprendendo la generazione di aggregati 3D, l'isolamento tramite centrifugazione differenziale, l'analisi della distribuzione e concentrazione delle particelle basate sull'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA), e la somministrazione terapeutica tramite idrogel termicamente reticolato per la riparazione dei difetti ossei mandibolari. Questo approccio semplifica la produzione di LEV per studi meccanicistici a valle e valutazioni precliniche nella rigenerazione craniofacciale. Questo flusso di lavoro ottimizzato garantisce la preparazione riproducibile di LEV bioattivi con rese costanti e carico pro-osteogenico arricchito, facilitando la ricerca fondamentale e accelerando la traduzione clinica della ricostruzione craniofacciale mediata da EV. Nelle applicazioni rappresentative, i LEV carichi con idrogel forniscono un deposito localizzato nei siti difettosi e facilitano una gestione comoda durante l'impianto. Collettivamente, questo metodo fornisce una piattaforma scalabile per preparare LEV derivati da SCAP e evidenzia le considerazioni chiave per la rendicontazione standardizzata e la progettazione di studi traslazionali. Questo approccio supporta un'adozione più ampia nei laboratori craniofacciali di veicoli elettrici.

Introduzione

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Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle legate alla membrana rilasciate dalle cellule che mediano la comunicazione intercellulare attraverso il trasferimento di carichi bioattivi come proteine, miRNA e lipidi 1,2,3. Tra le sottopopolazioni di EV, le grandi vescicole extracellulari (LEV) si distinguono per il loro rilascio diretto dalla membrana cellulare e per l'arricchimento intrinseco di molecole pro-rigenerative, rendendole particolarmente adatte alla riparazione e alle esigenze di rigenerazionedei tessuti 4,5. In medicina rigenerativa, le EV derivate dalle cellule staminali mesenchimali (MSC) sono sempre più riconosciute come un'alternativa valida senza cellule alla terapia a cellule intere 6,7,8. Essi riproducono gli effetti rigenerativi paracrini delle MSC parentali evitando limitazioni del trapianto cellulare diretto, come bassa efficienza di ingerto, immunogenicità e variabilità dellotto 7,8,9,10. Tra le fonti MSC, le cellule staminali della papilla apicale (SCAP) mostrano un potenziale di differenziazione osteogenico e odontogenicosuperiore 11,12,13, rendendo le EV derivate dallo SCAP particolarmente interessanti per la riparazione orofacciale ossea e del tessuto dentale 8.

In particolare, la biogenesi e la funzionalità dei veicoli elettrici sono profondamente influenzate dal microambientecellulare 14,15. Le colture monostrato bidimensionali (2D) convenzionali si discostano significativamente dal contesto tissutalenativo 16,17, produendo frequentemente EV con capacità rigenerativacompromessa 18. Al contrario, gli aggregati MSC autoassemblati tridimensionali (3D) replicano aspetti chiave della condensazione fisiologica mesenchimata, una fase di sviluppo caratterizzata da alta densità cellulare, contatto intensivo cellula-cellula e matrice extracellulare arricchita (ECM), che fornisce supporto strutturale e fornisce segnali biochimici e meccanici che regolano l'adesione, la migrazione e le decisioni di destinocellulari 19,20,21 . Questo microambiente biomimetico 3D non solo migliora la comunicazione intercellulare e la segnalazione paracrina22,23, ma favorisce anche la secrezione di veicoli elettrici con una resa più elevata e profili di carico bioattivimigliorati 24,25,26. L'utilizzo di aggregati MSC autoassemblati 3D emerge quindi come una strategia altamente promettente per ottenere EV funzionalmente potenti per applicazionirigenerative 18.

Nonostante i chiari vantaggi dei veicoli elettrici derivati da aggregati, i protocolli standardizzati per il loro isolamento e caratterizzazione rispetto ai sistemi 3D restano poco sviluppati. Le attuali metodologie di isolamento EV, come la centrifugazione differenziale, sono ben consolidate e offrono un quadro scalabile per la produzionedi EV 27. Analogamente, sono stati riportati metodi per generare aggregati MSC, spesso basati su un curling cellulare indotto dalla vitamina C e sull'aggregazione da cellule coltivatein 2D. Tuttavia, l'architettura ECM all'interno di questi aggregati indotti dalla vitamina C può comunque differire dal microambiente spazialmente organizzato, simile a una condensazione, dei tessuti mesenchimali nativi. Al contrario, l'autoassemblaggio senza impalcature in condizioni di bassa adesione facilita la formazione di aggregati compatti e sferici che approssimano le caratteristiche chiave della condensazionemesenchimale 19,29. Attualmente, manca un flusso di lavoro sistematico e riproducibile per isolare e applicare i veicoli elettrici da aggregati SCAP 3D indotti da bassa adesione. Da un punto di vista pratico, la produzione di LEV da colture SCAP 2D convenzionali si colloca tipicamente nell'intervallo di ~10 11 particelle/mL secondo l'analisi di tracciamento nanoparticellare (NTA), e l'aggregazione 3D a bassa adesione dovrebbe aumentare la produzione LEV di diverse volte mantenendo la riproducibilità per applicazioni a valle. Per colmare questa lacuna, qui dettagliamo un protocollo completo che sfrutta la funzionalità osteogenica/odontogenica intrinseca degli SCAP e ottimizza il microambiente MSC tramite aggregazione 3D a bassa adesione. Questo protocollo consente la produzione affidabile di LEV di alta qualità, fornendo uno strumento standardizzato per promuovere le terapie rigenerative senza cellule nella medicina craniofacciale.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali della Quarta Università Medica Militare e sono stati condotti in conformità con le linee guida ARRIVE. La raccolta e l'uso di campioni umani furono approvati dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare (approvazione n. IRB-REV-2022187). Il consenso scritto informato di tutti i donatori è stato ottenuto prima della raccolta del campione; Per i donatori minorenni o in grado di fornire il consenso, veniva ottenuto un consenso informato scritto dai loro tutori legali. Tutti i reagenti erano filtrati sterili e le procedure di coltura cellulare venivano condotte in un armadietto di biosicurezza per mantenere la sterilità (vedi Tabella dei Materiali). Trattare tutti i materiali di origine umana (denti, tessuti, cellule primarie, mezzi condizionati e preparati per EV) come potenzialmente infettivi. Eseguire tutte le procedure che coinvolgono campioni umani in un armadietto di biosicurezza certificato utilizzando l'attrezzatura di protezione individuale (DPI) appropriata, inclusi camice da laboratorio, guanti e protezione oculare. Per la biosicurezza e lo smaltimento dei rifiuti, seguire le linee guida istituzionali BSL-2: Maneggiare tutti i materiali di origine umana e i materiali contaminati usa e getta come rifiuti biologici BSL-2; Decontaminare superfici/attrezzature con un disinfettante approvato dall'istituzione dopo l'uso. Raccogli i rifiuti liquidi biologici in contenitori etichettati e inattivali utilizzando metodi approvati prima dello smaltimento. Smaltire immediatamente gli oggetti pungenti in contenitori approvati per oggetti taglienti (senza ricappucchi). Trattare tessuti/carcasse animali e residui anestetici/chimici come rifiuti biologici/chimici regolamentati e smaltirli tramite servizi istituzionali secondo le normative applicabili.

1. Isolamento e cultura degli SCAP umani

NOTA: P/S è una miscela di antibiotici bioattivi e può causare irritazione della pelle/occhi o reazioni allergiche. Maniglia in un armadietto di biosicurezza BSL-2 all'apertura; indossare guanti e protezione per gli occhi; evitare la generazione di aerosol; e smaltire i rifiuti in conformità con le linee guida istituzionali sui rifiuti chimici. La collagenasi di tipo I (soluzione) è un enzima bioattivo e può causare irritazione della pelle/occhi o reazioni allergiche. Maniglia in un armadietto di biosicurezza BSL-2; indossare guanti e protezione per gli occhi; evitare schizzi e generazione di aerosol durante la pipettatura; e decontaminare tempestivamente le fuoriuscite secondo le procedure istituzionali. Proteggere la collagenasi di tipo I dalla luce durante la conservazione e l'uso (vedi la Tabella dei Materiali).

  1. Raccogliere i terzi molari con apice immaturi da donatori sani (16–21 anni) e risciacquare accuratamente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) (vedi Tabella dei Materiali).
  2. Dissezionare il tessuto della papilla apicale dall'apice radicale usando pinzette e forbici oftalmiche sterili, quindi tritarlo in piccoli frammenti (<1mm 3).
  3. Trasferire tutti i frammenti di tessuto in un tubo centrifuga da 15 mL. Digerisci i frammenti con 2 mg/mL di collagenasi tipo I a 37 °C per 1 ora, con una lieve scuotita ogni 15 minuti.
  4. Fermare la digestione aggiungendo un volume uguale di mezzo essenziale completo α-minimo (α-MEM) (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: Il tempo di digestione della collagenasi di tipo I non è fisso e dipende dallo stato digestionale dei tessuti. Monitorare attentamente, interrompere la digestione quando i tessuti si erodono in modo semi-eroso aggiungendo il substrato. L'eccessiva digestione può compromettere la vitalità cellulare.
  5. Centrifugare la sospensione della cella a 100 × g per 5 minuti a 4 °C, scartare il surnatant e risospendere il pellet in 2 mL di α-EM completo.
  6. Semina la sospensione tissutale digerita in una piastra di Petri da 10 cm e aggiungi 8 mL di α-MEM completa a un volume finale di 10 mL per piattola.
  7. Coltivare gli SCAP a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂.
    NOTA: Monitorare continuamente le colture, le cellule solitamente migrano fuori dai frammenti di tessuto e si attaccano al piatto in un percorso radiale entro 3–7 giorni. Se la vitalità tissutale è scarsa o non si osserva migrazione cellulare entro 5 giorni, si passa al α-MEM completo integrato con siero al 20%.
  8. Per il passaggio cellulare, le cellule sono state lavate con 5 mL di PBS per rimuovere il mezzo residuo una volta raggiunta l'80–90% di confluenza. Successivamente, sono stati incubati con 2 mL di tripsina-1 mM EDTA allo 0,25% a 37 °C per 2 minuti (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: La tripsina–EDTA è un irritante e può danneggiare pelle e occhi. Maneggiare con guanti e protezione per gli occhi, evitare schizzi e formazione di aerosol, e risciacquare immediatamente con molta acqua se si verifica il contatto. Smaltire i rifiuti liquidi contenenti tripsina secondo le linee guida istituzionali.
  9. Quando le cellule si arrotondano con giunzioni intercellulari interrotte al microscopio, si staccano delicatamente le cellule dalla piastra senza danni strutturali eccessivi. Neutralizza la tripsina aggiungendo 4 mL di α-MEM completo.
  10. Raccogli le celle con pipetazioni delicate e ripetute in un tubo centrifuga fresco da 15 mL. Dopo centrifugazione a 100 × g per 5 minuti, si elimina il sovrantato e si risospende la pellet della cella in completa α-MEM. Semina le cellule risospese in vasi di coltura fresca o piatti per pozzi. Sostituisci il medium ogni due giorni.
    NOTA: Assicurarsi che gli SCAP utilizzati per la cultura aggregata si trovino nel passaggio 5. La capacità di stelo e aggregazione diminuisce con l'aumento del numero dipassaggi 30,31, il che può ridurre l'efficienza della formazione aggregata e le prestazioni funzionali.

2. Autoassemblaggio degli aggregati SCAP

  1. Prelevato 3–5 SCAP tramite tripsinizzazione, centrifuga a 100 × g per 5 minuti e risospensione in α-MEM integrato con 10% di siero fetale impoverito di EV (FBS) e 1% P/S (vedi Tabella dei Materiali).
    NOTA: Prepara FBS esaurito EV centrifugando FBS a 150.000 × g a 4 °C durante la notte per rimuovere EV e altre impurità32.
  2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 1 × 105 cellule per pozzo in piastre a 24 pozzi a attacco ultra-basso. Regolare il volume medio a 500 μL per pozzo per mantenere uno stato di sospensione.
  3. Incubare le piastre a 37 °C con il 5% di CO₂ per 72 ore e sostituire il mezzo di coltura ogni 48 ore.
  4. Monitorare quotidianamente la formazione degli aggregati sotto un microscopio ottico rovesciato. Raccogliere i veicoli elettrici quando gli aggregati raggiungono un diametro di 200–400 μm e presentano una struttura compatta e dai bordi lisci.
    NOTA: Definire un "lotto" di produzione come LEVs isolati dal mezzo condizionato aggregato raccolto da aggregati SCAP seminati lo stesso giorno dallo stesso passaggio cellulare e mantenuti in condizioni di coltura identiche all'interno di un'unica finestra di raccolta (72 ore). Processare ogni lotto indipendentemente tramite centrifugazione. Sostituisci il substrato di coltura a 48 ore dopo la semina e rifornisci con lo stesso volume di substrato fresco. Per la produzione di LEV, raccogliere il substrato condizionato a 48 ore e di nuovo a 72 ore dopo la semina, e mettere in comune il substrato raccolto (0–48 h e frazioni 48–72 h) in un unico lotto. Mantieni il mezzo condizionato in pool a 4 °C e analizalo per l'isolamento dei LEV.

3. Isolamento e caratterizzazione degli EV da aggregati SCAP

  1. Centrifugazione differenziale per l'isolamento di grandi LEV
    1. Raccogliere il mezzo di coltura contenente aggregati SCAP in tubi centrifughe da 15 mL.
    2. Centrifugare a 800 × g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere aggregati intatti e detriti cellulari di grandi dimensioni.
    3. Trasferire il soprandanante in nuovi tubi da 15 mL e centrifugare a 2.500 × g per 15 minuti a 4 °C per eliminare piastrine residue e frammenti cellulari piccoli.
    4. Trasferire con attenzione il surnatante in tubi conici sterili da 1,5 mL e centrifugare a 16.800 × g per 30 minuti a 4 °C per mettere i LEV a pellet.
      NOTA: Utilizzare 1,5 mL di tubi conici per aumentare la resa dei LEV.
    5. Scartare il sovrandante, risospendere il pellet in 1 mL di PBS sterile e centrifugare nuovamente a 16.800 × g per 30 minuti a 4 °C utilizzando un rotore ad angolo fisso (compatibile con una centrifuga standard da banco) per pelletare i LEV.
    6. Imposta la decelerazione/freno su una modalità "lenta" o "bassa" (tipicamente freno Livello 1 o 2) per evitare la risospensione del LEV durante la fase finale di decelerazione.
    7. Scartare il soprantantante e risospendere l'ultimo pellet LEV in 50 μL di PBS sterile. Usa subito la sospensione (entro 24 ore) o conservala a 4 °C. Evita il congelamento per minimizzare la perdita di bioattività.
      NOTA: Preparare circa 80 pozzi di aggregati per ottenere LEV sufficienti per esperimenti tipici a valle. I campioni di LEV sono raccomandati per una caratterizzazione immediata o un'applicazione terapeutica piuttosto che per una conservazione a lungo termine. Se è richiesta una conservazione più lunga, si può aliquotare la sospensione LEV (ad esempio, 5–10 μL per tubo) per evitare fluttuazioni ripetute di temperatura e cicli di congelamento-disgelo. Congelare rapidamente le aliquote su ghiaccio secco e conservarle a −80 °C per una conservazione prolungata a breve termine (ad esempio, fino a 1–3 mesi). Scongela una volta sul ghiaccio e usalo subito. Si noti che il congelamento può ridurre la bioattività e alterare il recupero/distribuzione delle dimensioni delle particelle; pertanto, ogni volta che è possibile, eseguire studi funzionali utilizzando LEV appena preparati. Per il controllo qualità dopo lo stoccaggio, rimisurare la concentrazione e la distribuzione delle dimensioni delle particelle usando NTA, procedendo solo se i valori rimangono all'interno dell'intervallo di accettazione predefinito. Inoltre, in questo protocollo, la concentrazione di particelle NTA è utilizzata come metodo principale di quantificazione per evitare la perdita di vescicole associate a saghi a base proteica come il BCA, massimizzando così la resa per applicazioni a valle.
  2. NTA per dimensione e concentrazione delle particelle
    NOTA: L'NTA viene eseguita utilizzando un analizzatore di tracciamento delle nanoparticelle disponibile in commercio (vedi Tabella dei Materiali) per valutare la distribuzione delle dimensioni e la concentrazione delle particelle.
    1. Diluire 1 μL della sospensione LEVs (dalla Sezione 3.1, Passo 6) in 1.499 μL di PBS sterile in un tubo conico sterile da 1,5 mL e mescolare accuratamente.
    2. Avvia il software compatibile e riempi la cella campione con 10 mL di acqua ultrapura. Confermare che il conteggio di particelle di fondo sia < 10 per fotogramma per garantire che il sistema sia pulito (vedi Tabella dei Materiali).
    3. Calibrare lo strumento con una soluzione standard preparata. Imposta i parametri software su: Sensibilità 70, Otturatore 70, Area minima 5 e Luminosità minima 20. Esegui l'"AutoAlignment" per assicurarti che il laser sia messo a fuoco. Regolare la diluizione standard finché il conteggio di particelle mostrato nel software non è 50–400 (preferibilmente ~200) e poi eseguire il programma di calibrazione.
      NOTA: Preparare la soluzione standard ricostituendo 1 μL di sfere di calibrazione in 1 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione primaria. Diluire 100 μL della soluzione primaria in 25 mL di acqua distillata (diluizione 1:250.000) e conservare a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
    4. Risciacquare la cella campione con 5 mL di acqua distillata prima dell'analisi.
    5. Lavare il canale con 1 mL di acqua distillata e confermare che il conteggio delle particelle sull'interfaccia di rilevamento sia <10.
    6. Iniettare 1 mL del campione diluito di LEVs a una velocità costante di 0,5 mL/s usando una siringa sterile da 1 mL.
      ATTENZIONE: Controlla manualmente la siringa per mantenere una velocità di iniezione costante.
    7. Esegui analisi delle particelle e genera rapporti. Nel software, crea una nuova misura e seleziona modalità Dimensione/Concentrazione. Imposta l'acquisizione a 3 registrazioni, 60 secondi per registrazione, a 25 °C usando gli stessi parametri di rilevamento del Passo 3 (Sensibilità 70, Scatturatore 70, Area minima 5, Luminosità minima 20).
    8. Iniziare l'acquisizione e verificare che il conteggio delle particelle sullo schermo rimanga entro 50–400 particelle/frame (preferibilmente ~200); se si è fuori da questo intervallo, fermarsi e regolare la diluizione del campione, poi ripetere il Passo 6. Dopo l'acquisizione, eseguire l'analisi per ottenere la dimensione media, la dimensione della modalità D10/D50/D90 e la concentrazione delle particelle (particelle/mL). Poi esporta i risultati e i grafici di distribuzione delle dimensioni come .csv e .pdf (o formati di report equivalenti) e salva il file di misurazione per la registrazione.

4. Applicazione terapeutica delle LEV nella rigenerazione ossea mandibolare

  1. Preparazione dell'idrogel caricato con LEV
    1. Prepara la calciata Pluronic F-127 (20% w/v). Aggiungere polvere di F-127 pluronica a PBS sterile fino a una concentrazione finale del 20% (p/v) e mescolare a 4 °C durante la notte fino a quando non sarà completamente sciolta e omogenea (vedi Tabella dei materiali). Mantenere la soluzione a 4 °C durante tutta la preparazione per evitare gelificazioni precoce.
      NOTA: il 20% (p/v) di F-127 pluronico è liquido a 4 °C e subisce termogelazione a ~20–25 °C (dipendente da tubo/stanza); diventa un gel stabile a 37 °C.
    2. Carica i LEV in condizioni di freddo. Preraffredda i tubi, le punte delle pipette e l'idrogel a 4 °C. Mescolare LEV da 50 μg (equivalenti ai LEV di due piastre da 24 pozzi di aggregati) con 1 mL di Pluronic F 127 al 20% tramite pipettura delicata e breve vortice a bassa velocità per garantire una distribuzione uniforme. Mantenere la miscela sul ghiaccio o a 4 °C fino all'impianto.
    3. Guida per la maneggiazione/uso (per la riproducibilità). Esegui rapidamente il caricamento e il caricamento con siringhe/punta sul ghiaccio. Se la miscela si riscalda oltre ~20–25 °C, la viscosità aumenta e può iniziare la gelificazione; in tal caso, si torna a 4 °C finché il materiale non diventa completamente fluido prima dell'uso. Dopo la collocazione nel difetto, si permette di verificare la gelificazione in situ alla temperatura corporea (37 °C).
  2. Stabilimento del modello di difetto osseo mandibolare murino
    1. Anestetizzare topi di 8 settimane di C57Bl/6 (maschi o femmine) tramite iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio (50 mg/kg) (vedi Tabella dei materiali).
      ATTENZIONE: Il pentobarbital sodio è un potente sedativo/anestetico ed è tossico per gli esseri umani se viene iniettato, ingerito o inalato accidentalmente. Preparare e somministrare con pratiche sicure per i prodotti taglienti (non ricapire gli aghi; gettarli immediatamente in un contenitore per oggetti pungenti), indossare guanti e protezione per gli occhi, evitare il contatto con la pelle e conservare/registrare l'uso secondo le politiche istituzionali sulle droghe controllate. Confermare l'anestesia corretta nei topi controllando l'assenza del riflesso corneale e l'assenza di ritiro degli arti in caso di pizzicamento del cuscinetto dei piedi. Applica una pomata oftalmica protettiva per prevenire l'essiccazione corneale.
    2. Radere il pelo sulla regione mandibolare sinistra e disinfettare alternativamente con 10% di povidone-iodio e 75% etanolo.
      ATTENZIONE: l'etanolo al 75% è altamente infiammabile; Usalo lontano dalle fonti di accensione e assicurati una buona ventilazione. Il povidone-iodio può causare irritazione della pelle/occhi o reazioni allergiche; Indossa i guanti, evita il contatto con occhi/mucosa e pulisci tempestivamente le macchie.
    3. Effettuare un'incisione longitudinale di 1 cm lungo il bordo mandibolare e sezionare in modo contundente i tessuti molli per esporre l'angolo mandibolare.
    4. Crea un difetto osseo circolare (2 mm di diametro) utilizzando un trapano dentale con irrigazione salina continua per prevenire danni termici (vedi Tabella dei materiali).
      ATTENZIONE: monitorare attentamente il sanguinamento intraoperatorio, controllare l'emorragia con piccoli batuffoli di cotone per mantenere il campo chirurgico pulito e ridurre il rischio di infezione. Evita di entrare in contatto con i tessuti molli circostanti con il trapano per evitare l'impigliamento.
  3. Impianto di idrogel caricato con LEV
    1. Carica la miscela LEV-idrogel in una siringa sterile e iniettala nel difetto osseo, assicurando un completo otturamento.
      NOTA: Somministrare ~10 μg di LEV per mouse. Sono necessarie due piastre da 24 pozzi di aggregati SCAP per ottenere LEV sufficienti per un esperimento con n = 5 topi.
    2. Per il gruppo di controllo, iniettare un volume uguale di idrogel pluronico F-127 senza LEV.
    3. Sutura l'incisione con suture assorbibili 4-0 e somministra analgesia sottocutanea (Carprofene, 5 mg/kg) per alleviare il dolore post-operatorio (vedi Tabella dei Materiali).
      ATTENZIONE: Il Carprofen è un FANS farmacologicamente attivo e può essere dannoso se iniettato accidentalmente o se entra in contatto con la pelle o gli occhi. Indossare i guanti, evitare ferite da tagliente, gettare aghi/siringhe in un contenitore per articoli appuntiti e smaltire farmaci inutilizzati e materiali contaminati secondo le procedure istituzionali di rifiuti farmaceutici.
    4. Metti i topi su una coperta riscaldante fino al recupero dall'anestesia, poi trasferisci in gabbie individuali con libero accesso a cibo e acqua.
      NOTA: Non lasciare i topi incustoditi finché non hanno recuperato abbastanza coscienza per mantenere la posizione stronale. Riportare i topi in alloggio di gruppo solo dopo la completa guarigione.

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Risultati

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Secondo il flusso di lavoro sperimentale, sono stati eseguiti con successo passaggi chiave tra cui l'isolamento SCAP, la formazione degli aggregati, l'estrazione dei LEV e l'impianto terapeutico (Figura 1). I terzi molari impattati clinicamente di donatori hanno mostrato apidi immaturi con tessuto apicale papillano intatto attaccato attorno agli orifizi del canale radicolare aperti, confermando la fonte adatta dello SCAP (Figura 2A

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Discussione

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Il crescente interesse per le terapie rigenerative senza cellule ha posizionato i LEV derivati da cellule staminali mesenchimali come alternative promettenti al trapianto di cellule intere, grazie alla loro capacità di fornire molecole bioattive senza i rischi associati agli approcci cellulari. Tuttavia, la traduzione clinica delle terapie basate su LEV è stata ostacolata dalla mancanza di sistemi di coltura fisiologicamente rilevanti in grado di preservare e migliorare pienamente la fun...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Key Research and Development Program della Cina (2021YFA1100600), della National Natural Science Foundation of China (82471011, 82401201), del Progetto del Laboratorio Chiave di Stato per la Ricostruzione e Rigenerazione Orale e Maxillofacciale (2024MS04), della China Postdoctoral Science Foundation (BX20230485) e del Partner Laboratory Cooperation and Exchange Program Project della Fourth Military Medical University (2024HB014).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 mL di siringa con agoBD300841Anestetizzazione
Piatto per coltura cellulare da 10 cmCorning353003Coltura cellulare
Tubo centrifuga in polistirene da 15 mLCorning352095Coltura cellulare
Disinfettante a etanolo al 75%Hai Shi Hai NuoHS-750Funzionamento
Sutura assorbibile 4-0Jinhuan MedicalR413Funzionamento
Centrifuga da bancoWIGGENSCE187Isolamento EV
Incubatore a CO2, 150 L, tipo universaleThermoFisher51032874Coltura cellulare
Collagenasi di tipo IThermoFisher17100017Coltura cellulare
Palline di cotoneDeroyal30-033Funzionamento
Forbici Operative CurbateStrumento chirurgico JZJ21040Funzionamento
Unità Dentale a Turbina MobileKaVoS609CFunzionamento
Bilanciamento elettronicoZhi KeZK-DSTColtura cellulare
Tubo di EppendorfEppendorf3810XIsolamento EV
Pinza, va beneStrumento chirurgico JZJD1020Funzionamento
Crema depilatoriaVeet1.00097E+11Funzionamento
Bur a palla ad alta velocitàDentsply SironaE0123Funzionamento
Portamano ad alta velocitàKaVoKV-1-008-1644Funzionamento
Microscopio RovesciatoMshotMF53-NColtura cellulare
MEM & alpha; (Medium Essenziale Minimo α)ThermoFisher12561056Coltura cellulare
Microscopio video per tracciamento di nanoparticelle PMX-120Particle MetrixZetaView PMX120Analisi del tracciamento delle nanoparticelle
Penicillina-Streptomicina (P/S)ThermoFisher15140122Coltura cellulare
Pentobarbital sodioSigma-Aldrich57-33-0Anestetizzazione
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)ThermoFisher10010023Coltura cellulare
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443Impianto EV
Soluzione di iodio di povidoneBaxter PROSL500Funzionamento
Siero Fetale Speciale Bovino (FBS)ThermoFisher12664025Coltura cellulare
Blocco di garza sterileVittoria10-000-681Funzionamento
Microcentrifuga ad alta velocità da tavoloHitachiCT15EIsolamento EV
Trapano TrephineMicrofissazione Biomet01-9182Funzionamento
Tripsina-EDTAThermoFisher25200072Coltura cellulare
Piastra di attacco ultra-basso a 24 pozziCorning3473Coltura cellulare
Genio Miscelatore a VorticeIndustrie scientificheSI0425Impianto EV

Riferimenti

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