Articolo metodologico

Elucidazione della base materiale della formula di Yiqi Qingjie contro la nefropatia IgA utilizzando UHPLC-Q-Orbitrap HRMS integrato con la farmacologia di rete

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DOI:

10.3791/70541

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19 maggio 2026

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1Department of Nephrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences., 2Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences., 3Department of New Drug Research and Development, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences.

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso della cromatografia liquida ad ultra-alte prestazioni abbinata alla spettrometria di massa ibrida quadrupolo-Orbitrap ad alta risoluzione (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS), combinata con farmacologia di rete e aggancio molecolare, per prevedere e convalidare la base materiale della formula di Yiqi Qingjie (YQQJ) per il trattamento della nefropatia da IgA (IgAN).

Abstract

Questo studio utilizza UHPLC-Q-Orbitrap HRMS per caratterizzare i costituenti estratti dall'acqua e assorbiti dal sangue dello YQQJ. La farmacologia di rete e il docking molecolare sono ulteriormente applicati per prevedere e verificare la base materiale alla base degli effetti terapeutici dello YQQJ contro l'IgAN. I campioni di estratto acquoso e siero di YQQJ sono stati analizzati utilizzando UHPLC-Q-Orbitrap HRMS per caratterizzare i costituenti chimici e identificare i composti assorbiti dal sangue. L'identificazione dei composti è stata effettuata sulla base di database di riferimento, letteratura pubblicata e una valutazione completa del tempo di ritenzione, della precisione della massa degli ioni precursori, dei modelli di frammentazione MS/MS e della distribuzione isotopica. I potenziali bersagli dei composti prototipo assorbiti dal sangue sono stati previsti utilizzando database di previsione dei bersagli, mentre i bersagli correlati all'IgAN sono stati raccolti da piattaforme bioinformatiche integrate. I target principali sono stati selezionati tramite analisi della rete PPI. È stata costruita una rete "composto–bersaglio–percorso–malattia" per identificare i componenti chiave e è stata effettuata una docking molecolare per valutare le interazioni tra composti core e bersagli. Un totale di 185 composti sono stati identificati nell'estratto acquoso di YQQJ. Tra questi, 28 composti sono entrati nel flusso sanguigno nelle loro forme prototipi. L'IPP ha identificato 42 bersagli principali associati agli effetti terapeutici dello YQQJ nell'IgAN. Le analisi di arricchimento KEGG e GO hanno mostrato un coinvolgimento nella proliferazione cellulare, infiammazione e apoptosi, e nell'arricchimento in diverse vie chiave come PI3K-Akt, MACK e JAK-STAT. L'analisi dell'aggiustamento molecolare ha previsto interazioni di legame favorevoli tra sei bersagli critici (CASP3, IGF1R, JUN, STAT3, PRKCB e PIK3CA) e tre principali composti assorbiti dal sangue—acido Deacetilasperulosidico, acido geniposidico e Dioscina—con energie di legame costantemente basse, suggerendo potenziali interazioni. Questa analisi integrata rivela che la YQQJ esercita effetti terapeutici contro l'IgAN attraverso molteplici componenti e diversi bersagli. Si suggerisce che l'acido deacetilasperulosidico sia l'acido geniposidico e la Dioscina siano costituenti attivi chiave che contribuiscono a questi effetti.

Introduzione

La nefropatia IgA (IgAN) è una delle glomerulonefrite primarie più comuni nel mondo. Le sue manifestazioni cliniche sono altamente eterogenee, tipicamente presentate come ematuria microscopica o grossola, spesso accompagnate da diversi gradi di proteinuria, ipertensione e deficit renale. Studi precedenti suggerivano che fino al 40% dei pazienti progredisce in insufficienza renale entro 20 anni dalladiagnosi 1; Tuttavia, evidenze più recenti indicano una prognosi nettamente più peggiore, con la maggior parte dei pazienti che sviluppa insufficienza renale entro 10–15 anni, e solo una piccola percentuale mantiene la funzione renale per tutta la vita senzaprogressione 2,3,4. Sebbene le terapie mirate abbiano recentemente raggiunto progressi clinici nella gestione dell'IgAN, il loro alto costo e l'efficacia relativamente lenta rimangono sfide importanti, e l'equilibrio beneficio-rischio clinico resta oggetto didibattito 5,6.

La medicina tradizionale cinese (MTC) dimostra vantaggi distintivi nel trattamento di malattie complesse. È caratterizzata da un'efficacia terapeutica stabile, una frequenza relativamente bassa di reazioni avverse e effetti sinergicimulti-bersaglio 7. A differenza degli agenti farmacologici a singolo bersaglio, le formule della MTC tipicamente contengono molteplici componenti bioattivi che possono modulare simultaneamente diverse vie biologiche. Questa modalità d'azione multicomponente e multi-bersaglio offre un potenziale vantaggio terapeutico nel trattamento di malattie complesse comel'IgAN 8. Nella teoria della MTC, l'IgAN non ha un nome specifico della malattia ma viene generalmente classificata come "ematuria", "edema", "mal di schiena", "vento renale" e "malattia consumptiva". La maggior parte degli studiosi considera che la patogenesi centrale coinvolga la carenza di Qi polmonare e milza, che porta a una perdita di controllo sul Qi difensivo e, di conseguenza, all'invasione di vento, umidità, calore e tossine, danneggiando infine i reni. Sebbene il rene sia l'organo principale coinvolto, anche cuore, fegato, milza e polmoni possono essere colpiti9. Sulla base di questa comprensione, numerose ricerche si sono concentrate sull'identificazione di medicine e formule erboristiche con proprietà tonificanti del Qi, consolidanti esterni, purificanti del calore, disintossicanti e di risolvimento dell'umidità per il trattamento clinico dell'IgAN10,11.

La Formula Yiqi Qingjie (YQQJ) è una prescrizione empirica efficace utilizzata nel Dipartimento di Nefrologia del nostro ospedale per il trattamento dell'IgAN. La formula comprende sette erbe, tra cui Astragalus membranaceus (Huangqi), Lonicera japonica Thunb. (Jinyinhua), Rheum palmatum L. (Dahuang), Hedyotis diffusa Willd. (Baihuasheshecao), Dioscorea nipponica Makino (Chuanshanlong), Spatholobus suberectus Dunn (Jixueteng) e Plantago asiatica L. (Cheqiancao). La YQQJ esercita funzioni terapeutiche di tonificazione del Qi, consolidamento dell'esterno, eliminazione del calore, disintossicazione, attivazione della circolazione sanguigna e favore delladiuresi 12. Studi clinici hanno dimostrato che YQQJ riduce significativamente proteinuria ed ematuria nei pazienti con IgAN, migliora la funzione renale e allevia i sintomi immunitari mucosi, mostrando al contempo un profilo di sicurezzafavorevole 12,13.

Sebbene questa formula abbia dimostrato un'efficacia clinica favorevole, la base farmacologicamente attiva del materiale rimane difficile da chiarire perché le formule della MTC contengono numerosi costituenti chimici. La profilazione chimica basata esclusivamente su analisi cromatografica o spettrometrica di massa può rivelare la composizione chimica complessiva di una formula; tuttavia, non può determinare quali composti vengano assorbiti nella circolazione sistemica e contribuiscono direttamente agli effettiterapeutici 14. Inoltre, gli studi convenzionali di farmacologia di rete si basano in gran parte su previsioni basate su database e tipicamente selezionano i candidati composti utilizzando parametri come la biodisponibilità orale e la somiglianza con il farmaco. Questo approccio può trascurare composti che esercitano effettivamente attività farmacologica invivo 15.

Per affrontare queste limitazioni, studi recenti adottano sempre più strategie analitiche integrative che combinano cromatografia liquida ad altissima prestazione abbinata a spettrometria di massa ibrida quadrupole-Orbitrap ad alta risoluzione (UHPLC-Q-Orbitrap HRMS) e farmacologia dei sistemi nella ricercaTCM 16,17. La farmacochimica sierica identifica i composti che entrano nella circolazione sistemica dopo la somministrazione, fornendo così prove farmacocineticamente rilevanti per lo screening dei potenziali costituentibioattivi 18. Nel frattempo, UHPLC-Q-Orbitrap HRMS consente una rilevazione e caratterizzazione strutturale altamente accurata dei costituenti chimici all'interno di matricierboristiche complesse 19.

Rispetto ad approcci basati esclusivamente su profilazione chimica o previsione teorica dei bersagli, il flusso di lavoro integrativo applicato in questo studio—che comprende l'identificazione dei componenti basata su UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, lo screening della farmacochimica sierica, l'analisi della farmacologia delle reti e la validazione del docking molecolare—offre diversi vantaggi metodologici. L'HPM UHPLC-Q-Orbitrap consente un'identificazione completa e precisa dei costituenti chimici complessi. La farmacochimica sierica limita i composti candidati a quelli effettivamente assorbiti nella circolazione sistemica, migliorando così la plausibilità biologica delle analisi successive della rete. L'analisi farmacologica di rete basata su composti assorbiti confirmati sperimentalmente consente l'esplorazione a livello di sistema dei meccanismi multi-bersaglio e riflette meglio le caratteristiche farmacologiche olistiche delle formule della MTC. L'aggancio molecolare fornisce inoltre una validazione computazionale preliminare delle interazioni composto-bersaglio previste e supporta la priorità razionale delle molecole candidate per una successiva verifica sperimentale. Collettivamente, questo flusso di lavoro integrativo fornisce una strategia affidabile, efficiente e fisiologicamente rilevante per chiarire la base materiale e i meccanismi di formule erboristiche complesse come la YQQJ.

Questo flusso di lavoro è particolarmente adatto per indagare la base farmacologicamente attiva dei materiali e i meccanismi di complesse formule erboristiche quando dati di assorbimento in vivo possono essere ottenuti da studi farmacocinetici su animali o uomini. È particolarmente applicabile a formule con efficacia clinica consolidata ma con componenti attivi poco chiari. Tuttavia, vanno riconosciute diverse limitazioni. Innanzitutto, l'accuratezza della previsione dei target dipende dalla qualità e completezza dei database pubblici. In secondo luogo, il flusso di lavoro si concentra sui composti prototipo rilevati in circolazione e non tiene conto dei metaboliti bioattivi generati in vivo. In terzo luogo, le previsioni derivate da analisi farmacologiche di rete richiedono ulteriori validazioni sperimentali. Nonostante queste limitazioni, il flusso di lavoro fornisce un approccio efficiente e affidabile per la generazione di ipotesi e la prioritizzazione dei target negli studi meccanicistici delle formule della MTC.

Pertanto, questo studio utilizza UHPLC-Q-Orbitrap HRMS per caratterizzare sistematicamente sia i componenti dell'estratto acquoso sia i composti circolanti dello YQQJ, stabilendo così un database relativamente completo di potenziali costituenti attivi. Sulla base di questo dataset, l'analisi farmacologica di rete, combinata con la validazione del docking molecolare, prevede i potenziali componenti farmacologicamente attivi dello YQQJ per il trattamento dell'IgAN e fornisce una base per successive indagini meccanicistiche.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali che coinvolgono gli animali rispettavano le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio emesse dal Comitato per il Benessere Animale della Cina. Tutte le procedure di questo studio sono state approvate dal Comitato per la Cura e l'Uso Istituzionale degli Animali (IACUC) del Centro Sperimentale Animale dell'Ospedale Guang'anmen.

1. Amministrazione per animali e farmaci

  1. Utilizzare dodici maschi di ratti Sprague–Dawley (SD) di 6 settimane dal peso di 200–230 g.
  2. Ospita tutti gli animali nel Centro Animali Sperimentali.
    NOTA: Mantieni la temperatura dell'abitazione tra 20 e 26 °C e l'umidità relativa tra il 40 e il 70%. Usa un ciclo chiaro/scuro di 12 ore per simulare i ritmi circadiani naturali.
  3. Acclimatare gli animali per 7 giorni in condizioni standard con libero accesso a cibo e acqua prima dell'esperimento. Dividere casualmente i ratti in due gruppi (n = 6 per gruppo): un gruppo di controllo e un gruppo trattato con farmaci.
  4. Fare riferimento alla dose equivalente convertita in superficie corporea tra esseri umani eanimali 20. Somministrare estratto concentrato di YQQJ tramite gavage orale a 24,68 mL/(kg·day) al gruppo trattato con il farmaco. Somministrare simultaneamente un volume uguale di acqua distillata al gruppo di controllo per garantire un trattamento sincrono.
  5. Continuare la somministrazione per 1 giorno. Dividere la dose giornaliera totale in tre somministrazioni uguali (ad esempio, alle 08:00, 13:00 e 18:00) per garantire la dose completa entro 1 giorno.
    NOTA: Animali veloci per 12 ore prima dell'ultimo sbarco, con accesso libero all'acqua.
  6. Prelevare i campioni di sangue a 2 e 8 ore dopo l'amministrazione finale. Anestetizzare i ratti con iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodio al 1% (50 mg/kg). Raccogli sangue dall'aorta addominale.
  7. Lasciare i campioni di sangue in verticale a temperatura ambiente per 1 ora, poi centrifugare a 450 × g per 5 minuti a 4 °C. Controlla che il soprannatante (siero) sia pulito e privo di emolisi. Trasferire il siero soprantantante e conservarlo a –80 °C per ulteriori analisi.

2. Preparazione delle soluzioni

  1. Preparazione delle soluzioni di prova
    1. Raccogli tutte le erbe grezze di YQQJ secondo la formula. Aggiungi 4 volumi di acqua purificata nella pentola di decocto e lascia in ammollo per 20 minuti.
      NOTA: Acqua purificata è stata aggiunta alle erbe con un rapporto 4:1 (v/w).
    2. Portate il composto a ebollizione, poi continuate la decoczione per 30 minuti a fuoco basso. Filtra attraverso la garza e raccogli il filtrato. Ripeti la decoction dei residui con 4 volumi d'acqua per altri 30 minuti e filtra di nuovo.
    3. Combina i due filtrati. Concentrarsi la soluzione combinata utilizzando un evaporatore rotativo impostato a una temperatura a bagno d'acqua di 60 °C fino a raggiungere una concentrazione di 3 g/mL (p/v, equivalente a materiali medicinali grezzi).
    4. Verifica che l'estratto concentrato sia un liquido scuro e viscoso senza precipitazioni visibili. Conserva a 4 °C per un uso successivo.
  2. Preparazione di soluzioni di riferimento
    1. Pesare con precisione i seguenti composti di riferimento: acido deacetilasperulosidico, acido geniposidico, acido loganico, morroniside, acido clorogenico, sweroside, acido plantagoguanidinico, Rhein-8-O-β-D-glucopiranosido, genistilina, apigenina-7-glucoside, Diosmetina-7-O-β-D-glucopiranoside, calicosina, protodioscina, genisteina, diometina, pseudoprotodioscina, formononetina, 3-idrossi-9,10-dimetossipterpampano, aloeemodina, Rhein, Dioscina.
    2. Sciogliere ogni composto nel metanolo, far vorticere la miscela per 1 minuto, poi sonicare a temperatura ambiente per 10 minuti per garantire la completa dissoluzione.
    3. Diluire ogni soluzione con metanolo per raggiungere una concentrazione finale di 10 μg/mL per ogni standard.

3. Preparazione del campione

  1. Preparazione di campioni di estratto YQQJ
    1. Pipetta 100 μL dell'estratto acquoso YQQJ in un tubo centrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 300 μL di metanolo e vortice per 1 minuto. Centrifuga a 1800 × g, 4 °C per 10 minuti. Assicurarsi che il sovrantantante risultante sia chiaro e privo di particelle sospese.
    2. Prendi 100 μL di surrenatante e mescola con 100 μL di acqua ultrapura per ottenere una diluizione 1:1. Vortice delicatamente e trasferisci in una fiala autocampionatore per l'analisi.
  2. Preparazione di campioni di siero contenenti farmaci
    1. Pipetta 100 μL di siero in un tubo centrifuga da 1,5 mL. Aggiungi 300 μL di metanolo e lascia il vortice per 10 minuti per garantire la precipitazione proteica. Centrifugare a 1800 × g., 4 °C per 10 minuti.
    2. Raccogliere 270 μL del sovrantante e trasferirlo in un tubo pulito. Evaporare il soprandanante fino a renderlo secco usando un concentratore centrifugo a vuoto impostato a 120 × g., 37 °C per 4 ore finché non si forma un residuo solido visibile.
    3. Ricostituire il residuo con 90 μL di soluzione acquosa al 50% di metanolo. Vortice per 1 minuto per sciogliere completamente il residuo, poi centrifugare di nuovo a 1800 × g., 4 °C per 10 minuti.
    4. Raccogliere 80 μL del supernatant trasparente finale e trasferirlo in una fiala autocampionatore per l'analisi.

4. Condizioni analitiche

  1. Condizioni cromatografiche
    1. Eseguire la separazione cromatografica utilizzando un sistema UHPLC dotato di una colonna cromatografica.
    2. Usa una fase mobile binaria (Fase A: acqua con acido formico allo 0,1%; Fase B: acetonitrile). Applica un programma di eluzione a gradiente come mostrato nella Tabella 1, a una portata di 0,3 mL/min. Imposta la temperatura della colonna a 40 °C e il volume di iniezione a 6,0 μL.
      NOTA: Le specifiche della colonna sono 2,1 mm × 100 mm, dimensione particellare di 1,8 μm.
  2. Condizioni della sclerosi multipla
    1. Analizzare i campioni utilizzando uno spettrometro di massa quadrupolo-orbitrap equipaggiato con una sonda spray a ionizzazione elettrospray riscaldata (HESI).
    2. Impostare i parametri come segue: tensione di ionizzazione: 3,7 kV (modalità positiva) / 3,5 kV (modalità negativa); temperatura capillare: 320 °C; Pressione del gas nella guaina: 30 psi; pressione ausiliaria del gas: 10 psi; temperatura di desolvazione: 300 °C; gas di guaina e gas ausiliario: azoto; Gas di collisione: azoto, 1,5 mTorr.
    3. Acquisire dati in modalità Full Scan/dd-MS 2 . Imposta i parametri di scansione completa come segue: risoluzione 70000, obiettivo di controllo automatico del guadagno 1×106, tempo massimo di isolamento 50 ms e intervallo m/z 100 – 1500.
    4. Raccogliere i dati dd-MS2 con i parametri di risoluzione 17500, obiettivo di controllo automatico del guadagno 1×105, tempo massimo di isolamento 50 ms, selezionare i primi n (n≤10) ioni genitori più intensi per la frammentazione abbinati a un meccanismo dinamico di esclusione, finestra di isolamento di m/z 2, energia di collisione 10 V, 30 V, 60 V e soglia di intensità 1×105.

5. Elaborazione dei dati MS

  1. Elabora i dati MS acquisiti utilizzando software specializzati per l'elaborazione dati. Naviga al modulo Importa Data e carica i file di dati grezzi.
  2. Esegui il modulo Peak Picking ed esegui la deconvoluzione dei picchi per raggruppare gli ioni addotti e generare caratteristiche composte.
  3. Cerca nei database di riferimento dei composti, nei database di previsioni di obiettivi e nella letteratura pubblicata rilevante per l'identificazione dei candidati.
  4. Identificare i composti utilizzando due strategie di identificazione complementari basate su dati di SM ad alta risoluzione.
    1. Identificazione basata sul matching degli standard di riferimento. Confermare i composti confrontandolo con standard di riferimento autentici. Accettare identificazioni solo quando sono soddisfatti tutti i seguenti criteri:
      1. Accuratezza di massa: L'errore di massa sia degli ioni precursori che degli ioni frammenti deve essere entro ±5 ppm.
      2. Somiglianza spettrale: Il punteggio di somiglianza coseno tra lo spettro sperimentale MS/MS e quello MS/MS dello standard di riferimento deve essere ≥ 0,85.
      3. Distribuzione isotopica: Il punteggio di corrispondenza del pattern isotopico deve essere ≥ 90%.
      4. Comportamento cromatografico: La deviazione temporale tra il composto rilevato e lo standard di riferimento deve essere < 0,2 min.
        NOTA: I composti che soddisfano tutti i criteri sopra descritti sono annotati come MSI Livello 1, rappresentando un'identificazione strutturale confermata.
    2. Identificazione basata su dati MS ad alta risoluzione e previsione spettrale in silico. Per i composti senza standard di riferimento disponibili, eseguire un'identificazione presunta basata su misurazioni accurate di massa e previsione spettrale computazionale. Accettare annotazioni solo quando sono soddisfatti i seguenti criteri:
      1. Accuratezza di massa: L'errore di massa degli ioni precursori deve essere entro ±5 ppm, e l'errore di massa degli ioni frammenti deve essere entro ±10 ppm.
      2. Similarità spettrale: Confrontare lo spettro sperimentale MS/MS con lo spettro MS/MS teorico generato dalla struttura composta SMILES utilizzando l'algoritmo Progenesis QI. Accettare corrispondenze con punteggio di similarità coseno ≥ 0,60.
      3. Distribuzione isotopica: Il punteggio di corrispondenza del pattern isotopico deve essere ≥ 90%.
      4. Previsione del comportamento cromatografico: La deviazione tra il tempo di ritenzione sperimentale e il tempo di ritenzione previsto dal machine learning deve essere < 1,0 min.
        NOTA: Il modello di previsione del tempo di ritenzione è stato addestrato utilizzando dati cromatografici sperimentali provenienti da oltre 2000 composti di riferimento analizzati nelle stesse condizioni cromatografiche. I composti che soddisfano questi criteri sono annotati come MSI Livello 2, rappresentando composti identificati presuntamente con alta fiducia strutturale.

6. Farmacologia delle reti

  1. Identificazione di componenti assorbiti dal sangue e bersagli correlati all'IgAN
    1. Importare i prototipi identificati di componenti assorbiti dal sangue di YQQJ nei database di previsione dei bersagli. Seleziona "Homo sapiens" come specie target e ottieni i potenziali bersagli. Registra questi come insieme target di composti assorbiti dal sangue nella YQQJ.
    2. Usa la parola chiave "Nefropatia IgA" per recuperare i target di malattie correlate all'IgAN dalle piattaforme bioinformatiche integrate. Consolidare i risultati provenienti da più fonti per minimizzare il bias.
      NOTA: Utilizzare un database proteico per convertire tutti i target recuperati nel formato Gene Symbol per coerenza.
  2. Costruzione della rete di interazione proteina-proteina (PPI) e identificazione dei target principali
    1. Unire il set target di composti assorbiti dal sangue YQQJ con il set target della malattia IgAN ed estrarne l'intersezione.
    2. Carica gli obiettivi che si intersecano sulla piattaformaPPI 21. Configura le impostazioni: imposta l'organismo come Homo sapiens, il punteggio di fiducia a 0,90, e scarta tutti i nodi disconnessi.
    3. Importa i dati PPI nel softwaredi visualizzazione 22. Avvia il plugin per l'analisi topologica. Calcolare la centralità del grado (DC)23, la centralità di intermedietà (BC)24 e la centralità di vicinanza (CC)25.
    4. Seleziona i principali obiettivi terapeutici di YQQJ contro IgAN filtrando i nodi con valori topologici (DC, BC e CC) superiori alla mediana.
  3. Costruzione e analisi della rete integrata "YQQJ–componenti assorbiti nel sangue–bersagli–percorsi–malattie"
    1. Prepara il file attributo del nodo: crea un foglio di calcolo con due colonne. Etichetta la prima colonna Nome del Nodo e la seconda Tipo di Nodo. Assegna una delle cinque categorie (Formula, Componente Assorbita dal Sangue, Bersaglio di Intersezione, Percorso o Malattia) a ogni nodo.
    2. Prepara il file di interazione di rete (edge): crea un foglio di calcolo che definisce le connessioni tra i nodi (ad esempio, Componente Assorbito dal Sangue al Target di Intersezione). Assicurati che tutti i nomi dei nodi corrispondano a quelli nel file degli attributi del nodo per evitare errori di mappatura.
    3. Importare e costruire la rete: avviare il software di visualizzazione della rete. Naviga su File > Importa > Network per caricare il file edge. Nella finestra di anteprima, mappa le colonne come Nodo Sorgente e Nodo Target e clicca su OK per generare il grafico iniziale.
    4. Mappare gli attributi del nodo e imposta gli stili visivi: Importa il file degli attributi del nodo tramite File > Importa > Tabella. Apri il pannello Stile e mappa la colonna Tipo di Nodo a proprietà visive specifiche, inclusi forma del nodo, colore di riempimento e dimensione.
    5. Esegui analisi topologiche: naviga su Strumenti > Analisi della rete per eseguire calcoli topologici. Filtrare e identificare i composti attivi principali e i principali target terapeutici in base ai valori di grado.
      NOTA: Utilizzare gli stessi parametri topologici descritti nel passaggio 6.2 per garantire la coerenza nell'identificazione dei nodi centrali.
    6. Esporta l'immagine di rete: Finalizza il layout di rete. Naviga su File > Esporta > Rete in Immagine per salvare la visualizzazione ottimizzata.
  4. Arricchimento GO e analisi del percorso KEGG
    1. Invia la lista dei geni: Apri la piattaforma di annotazione funzionale basata sul web. Accedi al Passaggio 1: Invia l'area Lista Genica e carica la lista genica coretarget precedentemente filtrata 26.
    2. Seleziona specie: Nei menu a tendina per il Passo 2: Inserisci come Specie e Passo 3: Analisi come Specie, seleziona H. sapiens. (umano) per assicurarti che l'analisi venga eseguita nel corretto contesto biologico.
    3. Configura l'analisi personalizzata: Seleziona la modalità Analisi Personalizzata . Nella categoria Arricchimento , controlla i seguenti database: Gene Ontology (GO) Molecular Function (MF), GO Biological Process (BP), GO Cellular Component (CC) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathway.
    4. Stabilisci soglie di significatività: imposta il cutoff del valore P a < 0,01, l'Enrichment Minimo a ≥ 1,5 e la sovrapposizione Minima a ≥ 3. Mantieni tutti gli altri parametri alle impostazioni predefinite.
    5. Esegui l'analisi: clicca sul pulsante Analisi di Arricchimento per inviare il compito e attendi che il calcolo venga completato.
    6. Recupera ed esporta i risultati: accedi alla pagina del report di analisi generata. Clicca sul pulsante download per esportare i dati dettagliati di arricchimento in formato foglio di calcolo, insieme ai corrispondenti grafici a barre e heatmap.

7. Verifica dell'aggancio molecolare

  1. Scarica le strutture proteiche 3D ad alta risoluzione (< 2,50 Å) dei bersagli centrali e le strutture chimiche 2D dei componenti assorbiti dal sangue centrale dai database di biologiastrutturale 27.
  2. Avvia il software di docking molecolare e importa le strutture scaricate.
  3. Esegui i seguenti passaggi di preprocessing in sequenza: Naviga per Modifica > Rimuovi l'acqua per eliminare le molecole d'acqua; seleziona Modifica > Rimuovere eteroatomi per eliminare residui non standard.
  4. Vai su Modifica > Idrogeni > aggiungi > Solo Polare per aggiungere atomi di idrogeno polare. Salva le strutture elaborate in formato PDBQT tramite File > Salva > scrivi PDBQT.
  5. Definisci il sito di attracco usando lo strumento Grid > Grid Box . Le dimensioni della scatola della griglia sono state regolate in modo adattativo (20–100 Å) per garantire una copertura completa delle regioni di legame previste.
  6. Inizializzare i parametri di docking: selezionare il recettore tramite Docking > Macromolecule > impostare il nome file rigido e aprire il ligando tramite Docking > Ligand > Aperto. I parametri di attracco erano impostati come segue: esaustività = 32, intervallo energetico = 3 kcal/mol, e fino a 10 modalità di legame furono mantenute. Per le proteine con liganti co-cristallizzati, la scatola della griglia di attracco era centrata sul centroide del ligando con un'estensione di 8,0 Å, mentre per le proteine senza liganti co-cristallizzati, le tasche di legame sono state previste utilizzando DoGSiteScorer con una copertura di circa il 90%.
  7. Scegli l'Algoritmo Genetico Lamarckiano (LGA) come strategia di ricerca. Esegui la simulazione tramite Docking > esegui AutoDock.
  8. Valuta l'affinità di legame basandosi sull'energia di legame calcolata (punteggio di attracco)28.
    NOTA: Un'energia di legame più bassa indica una bioattività prevista più forte e una maggiore stabilità strutturale del complesso proteina-ligando. Una soglia di ≤ -5,0 kcal/mol viene tipicamente utilizzata per identificare una stabilità favorevole del legame.

Risultati

Analisi dei costituenti nell'estratto acquoso YQQJ
L'analisi dei componenti dell'estratto acquoso YQQJ è stata effettuata nelle condizioni stabilite nel PROTOCOLLO 4. L'HMS UHPLC-Q-Orbitrap è stato impiegato sia in modalità di scansione completa a ione positiva che negativa per profilare l'estratto acquoso di YQQJ, e il cromatogramma di ioni di picco di base (BPI) ottenuto è mostrato nella Figura 1. Su questa base, un database auto-istituito dei costituenti chimici, combinato con la caratterizzazione spettrale MS/MS, ha permesso l'identificazione con successo di 185 composti dall'estratto acquoso, con informazioni dettagliate riassunte nella Tabella Supplementare 1. I modelli rappresentativi di abbinamento spettrale MS/MS e frammentazione utilizzati per l'identificazione dei composti sono illustrati nella Figura Supplementare 1. L'analisi statistica delle categorie di composti ha rivelato che flavonoidi e terpenoidi erano i costituenti predominanti nello YQQJ, rappresentando 94 composti, la proporzione più abbondante.

Componenti assorbite dal sangue della YQQJ
Per chiarire le sostanze bioattive dirette in vivo, sono stati analizzati i campioni di siero raccolti dopo la somministrazione di YQQJ. Il cromatogramma BPI del siero a vuoto (Figura 2) è stato incluso per confronto e distinguere i composti derivati dal farmaco dai componenti siero endogeni. Sulla base del BPI del siero contenente farmaci (Figura 3), sono stati identificati in totale 28 componenti prototipi assorbiti nel flusso sanguigno, principalmente tra cui flavonoidi, terpenoidi e steroidi. I cromatogrammi ionici (EIC) estratti di composti rappresentativi nell'estratto YQQJ, nel siero bianco e nel siero contenente farmaci hanno ulteriormente confermato la presenza di componenti derivati dal farmaco nella circolazione (Figura Supplementare 2). Tra questi, 10 composti provenivano da Spatholobus suberectus Dunn, 7 da Dioscorea nipponica Makino, 7 da Astragalus membranaceus, 6 da Hedyotis diffusa Willd., 6 da Lonicera japonica Thunb., 4 da Plantago asiatica L. e 4 da Rheum palmatum.L., come riassunto nella Tabella Supplementare 1.

Previsione del bersaglio dei componenti assorbiti dal sangue della YQQJ correlati all'IgAN
Un totale di 28 prototipi identificati che entrano nel flusso sanguigno sono stati inseriti nei database di previsione dei bersagli, fornendo 459 potenziali bersagli. Nel frattempo, 2779 bersagli correlati all'IgAN sono stati recuperati da piattaforme bioinformatiche integrate. L'analisi delle intersezioni ha identificato 247 obiettivi sovrapposti tra YQQJ e IgAN (Figura 4).

Costruzione e analisi della rete PPI
I 247 bersagli intersecanti sono stati caricati sulla piattaforma PPI e il software di visualizzazione è stato utilizzato per selezionare i target principali basandosi su tre parametri topologici: DC, BC e CC. Un totale di 42 obiettivi sono stati infine identificati come nodi centrali. Il flusso di lavoro utilizzato per selezionare questi obiettivi fondamentali è riassunto nella Figura Supplementare 3. Nella rete PPI, la dimensione e il colore dei nodi variavano con i valori dei parametri (Figura 5), tra cui TP53, SRC, AKT1, ESR1 e STAT3 si sono classificati tra i primi cinque obiettivi principali.

"Formula – componenti assorbiti nel sangue – bersagli centrali – vie – malattia" rete YQQJ
Per rivelare sistematicamente i meccanismi multi-componente e multi-bersaglio di YQQJ contro IgAN, è stata costruita una rete di interazione "Formula–Componenti Assorbiti dal Sangue–Bersagli Centrali–Pathways–Malattia" utilizzando software di visualizzazione. La rete era composta da 96 nodi e 459 archi, dove ogni arco rappresentava una relazione o un'interazione tra due nodi (Figura 6).

Analisi di arricchimento GO e KEGG
L'analisi di arricchimento GO dei 42 target principali ha rivelato 1162 termini BP, 52 termini CC e 92 termini MF. La Figura 7 mostra i 10 termini GO più significativamente arricchiti nelle categorie BP, CC e MF. L'analisi di arricchimento KEGG ha inoltre identificato 182 vie associate a questi target centrali. La Figura 8 illustra i primi 20 percorsi significativamente arricchiti strettamente correlati alla patogenesi dell'IgAN. In questi grafici, i colori rossi più intensi indicano una maggiore significatività statistica, mentre bolle di dimensioni maggiori o lunghezze di barra più lunghe rappresentano un numero maggiore di bersagli arricchiti all'interno di ciascun percorso.

Valutazione dell'aggancio molecolare
In questo studio, basandosi sulla precedente analisi dei target chiave e delle vie correlate di YQQJ nel trattamento di IgAN 29,30,31,32, sei bersagli principali, tra cui CASP3 (PDB ID: 6X8I), IGF1R (PDB ID: 1JQH), JUN (PDB ID: 8RPP), STAT3 (PDB ID: 6NJS), PRKCB (PDB ID: 8SE3) e PIK3CA (PDB ID: 5FI4), sono stati selezionati come proteine recettrici per l'aggancio molecolare. Corrispondenti alla patogenesi centrale della MTC di IgAN, definita come "vento patogeno, calore umido e tossine che invadono il rene", sono stati selezionati componenti attivi rappresentativi con proprietà di pulizia del calore, rimozione dell'umidità e disintossicanze, ovvero acido deacetilasperulosidico e acido geniposidico da Hedyotis diffusa Willd., e Dioscina da Dioscorea nipponica. Makino. I risultati dell'attracco sono mostrati nella Figura 9. Tra tutte le combinazioni ligando-recettore, Dioscina ha mostrato energie di legame nettamente inferiori con tutti i bersagli selezionati, suggerendo un'affinità di legame prevista più elevata. Ad eccezione delle interazioni tra JUN e acido Deacetilasperulosidico/acido geniposidico, anche le altre coppie di attracco hanno mostrato attività di legame favorevoli. Conformazioni rappresentative di docking 3D sono visualizzate nella Figura 10.

figure-results-1
Figura 1: Cromatogrammi a ioni di picco di base dell'estratto acquoso YQQJ. (A) Cromatogramma BPI in modalità ionica positiva. (B) Cromatogramma BPI in modalità ionica negativa. I cromatogrammi mostrano il profilo chimico complessivo dell'estratto acquoso YQQJ secondo le condizioni HRMS UHPLC-Q-Orbitrap stabilite. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Cromatogrammi ionici di picco di base del siero in bianco. (A) Cromatogramma BPI in modalità ionica positiva. (B) Cromatogramma BPI in modalità ionica negativa. I cromatogrammi rappresentano il profilo di fondo siero endogeno utilizzato come controllo per il confronto con il siero contenente farmaci per distinguere i componenti derivati dal farmaco dai costituenti endogeni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Cromatogrammi ionici di picco di base del siero contenente YQQJ. (A) Cromatogramma BPI in modalità ionica positiva. (B) Cromatogramma BPI in modalità ionica negativa. I cromatogrammi rappresentano il profilo dei componenti assorbiti dal sangue rilevati nel siero dopo la somministrazione di YQQJ. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Diagramma di Venn dei bersagli sovrapposti tra YQQJ e IgAN. Il diagramma mostra il numero di bersagli YQQJ previsti, bersagli correlati all'IgAN e la loro intersezione, evidenziando i bersagli condivisi potenzialmente coinvolti negli effetti terapeutici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Rete di interazione proteina-proteina (PPI) di target centrali. I nodi rappresentano bersagli proteici, e gli spigoli rappresentano le interazioni tra bersagli. La dimensione dei nodi e l'intensità del colore corrispondono ai valori di grado, con nodi più grandi e più scuri che indicano una maggiore connettività all'interno della rete. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-6
Figura 6: Rete integrata di componenti, bersagli, vie e malattie YQQJ. La rete illustra le relazioni tra la formula, i componenti assorbiti dal sangue, i bersagli centrali, i percorsi e l'IgAN. Il triangolo rappresenta la malattia; il cerchio rappresenta i percorsi; Il nodo a forma di V rappresenta la formula YQQJ; il diamante rappresenta le erbe; l'esagono rappresenta i componenti; Octagon rappresenta componenti prototipi assorbiti dal sangue; Il rettangolo rappresenta i bersagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Analisi di arricchimento GO dei target di carotaggio. Il grafico a barre mostra i 10 termini principali arricchiti di Ontologia Genica nelle categorie BP, CC e MF. L'asse x rappresenta i termini GO, e l'asse y mostra −log10(p-valore), indicando l'importanza dell'arricchimento. Abbreviazioni: BP = Processo biologico; CC = componente cellulare; MF = Funzione molecolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 8: Analisi dell'arricchimento delle vie KEGG dei target centrali. Il grafico delle bolle mostra i primi 20 percorsi KEGG arricchiti. La dimensione del punto indica il numero di geni arricchiti, mentre il gradiente di colore indica −log10 (p-valore), con colori più rossi che indicano una maggiore significatività statistica. L'asse x mostra il rapporto genico, mentre l'asse y elenca i termini delle vie di percorso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 9: Mappa di calore dell'energia di collegamento tramite aggancio molecolare. La heatmap presenta energie di legame (kcal/mol) tra i bersagli centrali e i composti chiave assorbiti dal sangue. Valori di energia di legame più bassi indicano un'affinità di legame prevista più forte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 10: Conformazioni rappresentative di aggancio molecolare. (A) Conformazione di legame dell'acido Deacetilasperulosidico con CASP3. (B) Conformazione di legame di Dioscin con STAT3. (C) Conformazione di legame dell'acido geniposidico con PIK3CA. Le immagini mostrano le interazioni previste ligando-proteina e le orientazioni di legame. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Identificazione strutturale di composti rappresentativi tramite MS/MS ad alta risoluzione. (A) Confronto spettrale testa-coda dell'acido Deacetilasperulosidico tra lo spettro sperimentale (in alto, rosso) e quello del database di riferimento (in fondo, blu). (B) Spettro di frammentazione MS/MS ad alta risoluzione dell'acido Deacetilasperulosidico. (C) Confronto spettrale testa-coda dell'acido geniposidico con il database di riferimento. (D) Spettro sperimentale di frammentazione MS/MS dell'acido geniposidico. (E) Confronto spettrale testa-coda di Dioscina con il database di riferimento. (F) Spettro di frammentazione MS/MS ad alta risoluzione di Dioscin. Questi pannelli illustrano l'abbinamento spettrale utilizzato per l'identificazione dei composti. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Cromatogrammi ionici (EIC) estratti di composti rappresentativi tra campioni. (A) EIC dell'acido deacetilasperulosidico. (B) EIC dell'acido geniposidico. (C) EIC di Diocin. Per ogni pannello, la traccia superiore rappresenta l'estratto acquoso YQQJ (ZY), la traccia centrale rappresenta il siero di controllo a vuoto (KBX) e la traccia inferiore rappresenta campioni di siero contenenti componenti assorbiti dal sangue dopo la somministrazione YQQJ (GYX). Il confronto evidenzia la presenza di composti derivati da farmaci nel siero. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Flusso di lavoro per lo screening degli obiettivi principali. Il diagramma di flusso illustra il processo a passo per passo di identificazione dei bersagli, inclusa la previsione dei target composti, la raccolta di obiettivi legati all'IgAN, l'analisi delle intersezioni, la costruzione della rete PPI e lo screening dei core target basati su parametri topologici. Clicca qui per scaricare questo file.

Tempo (min)Fase mobile
A (v%)B (v%)
0982
1.0982
14.07030
25.00100
28.00100
28.1982
30.0982

Tabella 1: Programma di eluzione a gradiente UHPLC. La tabella presenta la composizione delle fasi mobili e le condizioni di gradiente utilizzate per la separazione cromatografica, inclusi i punti temporali e le corrispondenti proporzioni di solventi acquosi (Fase A) e organici (Fase B).

Tabella supplementare 1: Costituenti chimici identificati dell'estratto acquoso YQQJ. La tabella elenca i composti identificati dall'UHPLC-Q-Orbitrap HRMS, inclusi i prototipi di componenti assorbiti dal sangue (A1–A28), insieme alla loro classificazione e origine erboristica. Abbreviazioni: BHSSC = Hedyotis diffusa Willd.; CSL = Dioscorea nipponica Makino; DH = Reume palmato L.; JXT = Spatholobus suberectus Dunn; HQ = Astragalus membranaceus.; CQC = Plantago asiatica L.; JYH = Lonicera japonica. Grazie. Le classi composte includono A = alcaloidi; Ald = Aldeidi; F = Flavonoidi; N = Nucleosidi; O = Altri; OA = Acidi organici; P = Fenoli; PA = Acidi fenolici; Phe = Fenilpropanoidi; Q = Quinones; S = Saccharidi; STE = Steroidi; T = Terpenoidi; Tan = Tanini. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Nel presente studio, è stata impiegata una strategia integrata che combina "identificazione UHPLC-Q-Orbitrap HRMS – analisi della farmacochimica sirica – previsione della farmacologia di rete – validazione del docking molecolare" per chiarire sistematicamente la base materiale potenziale e i meccanismi dello YQQJ nel trattamento dell'IgAN. A differenza delle ricerche precedenti che si basavano principalmente sulla SM per analizzare i costituenti chimici delle formule erboristiche e poi prevedevano i meccanismi usando solo la farmacologia di rete16, la farmacochimica sierotica segue un flusso di lavoro di "costituenti erboristici complessi – componenti assorbiti dal sangue – sostanze attive in vivo dirette – base di materiale farmacodinamico". Identificando i componenti che entrano nella circolazione sistemica dopo l'somministrazione, questo approccio è ampiamente considerato una strategia efficace per identificare la base farmacodinamica delle formule della MTC.

In questo studio, l'analisi HRMS di UHPLC-Q-Orbitrap ha inizialmente identificato 185 costituenti nello YQQJ, tra cui 28 sono stati confermati come composti prototipo assorbiti dal sangue, fornendo così una base chimica affidabile per studi meccanicistici successivi. L'accuratezza di questa identificazione dipendeva dall'abbinamento completo del tempo di ritenzione, della massa esatta e delle informazioni di frammentazione MS/MS 14. Basandosi sulla strategia farmacochimica del siero, questi composti prototipi assorbiti dal sangue sono stati utilizzati come punto di partenza per la costruzione di reti, che ha aumentato la rilevanza tra i componenti erboristici e l'effettiva efficacia invivo 33. Integrando bersagli che intersecano composto-malattia con uno screening basato su PPI dei nodi centrali, seguito da analisi di arricchimento GO e KEGG, sono statiidentificati 15 principali percorsi di segnalazione associati all'IgAN. I risultati dell'aggancio molecolare suggerirono che i principali componenti assorbiti dal sangue derivavano da Hedyotis diffusa Willd. e Dioscorea nipponica Makino.può interagire con i bersagli principali in base alle affinità di legame previste piuttosto che su attività funzionale confermata sperimentalmente. Questi risultati supportano l'ipotesi che l'acido deacetilasperulosidico, l'acido geniposidico e la diocina possano rappresentare i potenziali componenti farmacodinamici chiave dello YQQJ, in attesa di ulteriori convalide sperimentali.

Da un punto di vista tecnico, il pretrattamento del campione era cruciale. A causa della complessità del siero e della presenza di proteine endogene (ad esempio, ormoni ed enzimi), l'interferenza nel rilevamento dei componenti assorbiti dal sangue è inevitabile. In questo studio, la precipitazione del metanolo è stata applicata per arricchire gli analiti e ridurre l'interferenza di fondo, garantendo sia la sensibilità che l'accuratezza dell'analisi MS34. Per quanto riguarda i momenti temporali del prelievo ematico, diversi costituenti nelle formule erboristiche possono mostrare distinti schemi di assorbimento e trasformazione in vivo, che possono influenzarne la rilevabilità nel siero. Pertanto, sulla base di studi preliminari, i campioni di siero sono stati raccolti tra 2 e 8 ore dopo la somministrazione finale per massimizzare la copertura dei costituenti circolanti.

Diversi passaggi procedurali si sono rivelati particolarmente critici per l'implementazione efficace di questo flusso di lavoro. L'identificazione accurata del composto si basa fortemente sulla valutazione combinata del tempo di ritenzione, dell'accuratezza di massa ad alta risoluzione e degli ioni diagnostici di frammenti MS/MS. Inoltre, sono essenziali momenti adeguati per il prelievo siero per catturare i componenti assorbiti dal sangue che possono comparire nella circolazione in diverse fasi dopo l'somministrazione. È quindi necessaria un'attenta ottimizzazione del pretrattamento del campione e delle condizioni di separazione cromatografica per garantire una rilevazione affidabile dei composti prototipo in matrici biologiche complesse.

Potenziali sfide analitiche possono sorgere durante la preparazione del campione e l'analisi della MS. Ad esempio, una precipitazione incompleta delle proteine può causare effetti matriciali che sopprimono l'efficienza di ionizzazione, mentre un rumore di fondo eccessivo può ridurre la sensibilità di rilevamento. Questi problemi possono essere mitigati ottimizzando i rapporti dei solventi durante la precipitazione delle proteine, migliorando le condizioni di separazione cromatografica e regolando i parametri di acquisizione della MS. Durante l'elaborazione dei dati, possono verificarsi annotazioni composte falsi positivi quando si fa affidamento esclusivamente sul matching del database; pertanto, si raccomanda la verifica manuale dei modelli di frammentazione MS/MS e del comportamento di ritenzione per migliorare l'affidabilità dell'identificazione.

In questo lavoro furono incorporate diverse considerazioni metodologiche. Innanzitutto, invece di applicare criteri convenzionali come la biodisponibilità orale e la somiglianza con il farmaco, sono stati utilizzati solo componenti assorbiti dal sangue verificati sperimentalmente per la previsione dei bersagli. Questo approccio evitava la possibile omissione di composti attivi a causa di soglie di filtraggio prestabilite ed eliminava costituenti irrilevanti che non erano biodisponibili in vivo, rafforzando così la rilevanza fisiologica della previsionedella rete 16. In secondo luogo, la selezione di liganti attivi per l'attracco si concentrava specificamente sui principali componenti originati da erbe con funzioni di "dissipare l'umidità del vento e eliminare la tossina del calore" (Hedyotis diffusa Willd. e Dioscorea nipponica Makino), stabilendo un ponte meccanicistico tra il concetto patologico della MTC di "tossina del vento-umidità-calore che invade il rene" e le caratteristiche patologiche moderne dell'IgAN. Questo fornisce prove preliminari a sostegno della teoria della MTC sulla correlazione formula–schema. In terzo luogo, considerando le potenziali differenze nella dimensione e qualità dei dati tra i database, sono state integrate più piattaforme per ampliare la copertura target e ridurre il bias introdotto da un singolo database35.

Rispetto alle strategie convenzionali che applicano direttamente la farmacologia di rete a tutti i costituenti chimici rilevati, l'attuale flusso di lavoro enfatizza la priorità dei composti guidati dalle evidenze basandosi sui componenti assorbiti dal sangue rilevati sperimentalmente. Questo processo di filtraggio a passo a passo riduce il numero di composti candidati che entrano nell'analisi computazionale e migliora l'interpretabilità delle reti di interazione composto–bersaglio. Inoltre, a differenza degli studi orientati alla metabolomica che catturano principalmente perturbazioni metaboliche endogene, la strategia attuale si concentra su composti prototipi esogeni derivati da medicine erboristiche, consentendo così un'attribuzione più diretta dell'attività farmacologica a specifici costituenti erboristici.

Da un punto di vista metodologico pratico, questo flusso di lavoro offre diversi vantaggi per l'indagine di formulazioni erboristiche complesse. L'integrazione della HRMS con la farmacochimica sierica consente l'identificazione affidabile dei costituenti biodisponibili, mentre la successiva combinazione di farmacologia di rete e docking molecolare stabilisce un quadro analitico gerarchico che collega le prove chimiche alla previsione meccanicistica. Inoltre, limitare la costruzione della rete a composti verificati sperimentalmente riduce la complessità della rete e facilita un'identificazione più chiara delle interazioni composto-bersaglio centrali.

Anche questo studio presenta dei limiti. Innanzitutto, la farmacologia delle reti e l'aggancio molecolare sono approcci computazionali predittivi. Una forte affinità di legame non si traduce necessariamente in regolazione biologica in vivo, poiché il docking molecolare non tiene conto della dinamica proteica, del contesto cellulare o della segnalazione a valle. Inoltre, l'attuale protocollo di attracco non includeva la validazione del ri-aggancio utilizzando liganti co-cristallizzati né il benchmarking con inibitori noti, il che potrebbe limitare la valutazione della precisione dell'attracco. Studi futuri che incorporeranno validazione basata su RMSD, simulazioni di dinamica molecolare e sagaggi sperimentali rafforzeranno ulteriormente l'affidabilità di queste previsioni. Attualmente, il nostro gruppo ha completato la validazione meccanicistica dimostrando che Dioscina agisce tramite la via JAK2/STAT3, rafforzando in una certa misura la credibilità della previsione e fornendo supporto sperimentale parziale per i target chiave identificati in questo studio, anche se altre interazioni componente–bersaglio richiedono ancoraconferma 36. In secondo luogo, le influenze della compatibilità proporzionale e delle relazioni di dosaggio tra le erbe non sono state incorporate nell'analisi attuale. Futuri lavori potrebbero introdurre modelli di rete ponderati dose-effetto per riflettere meglio le pratiche cliniche diprescrizione 37.

In conclusione, l'attuale flusso di lavoro—identificazione ad alta risoluzione basata su SM dei costituenti assorbiti dal sangue, analisi basata su bersagli e percorsi basati su farmacia di rete, e validazione del docking molecolare—consente un restringimento efficiente della base del materiale attivo e degli obiettivi d'azione da una formula erboristica complessa. Questo fornisce una chiara direzione sperimentale per la verifica biologica di follow-up e accelera le indagini meccanicistiche sulle formule della MTC. In futuro, l'integrazione della metabolomica spaziale, dei modelli organoidi e delle tecnologie multi-omiche potrebbe consentire una validazione dinamica e tridimensionale e l'estensione dei risultati attuali in sistemi che riproducono più da vicino condizioni fisiologiche e patologiche, fornendo così prove più solide per chiarire la base scientifica delle formule della MTC.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No.81973675), dal Progetto di Promozione degli Ospedali Medici Cinesi di Alto Livello (Grant No. HLCMHPP2023039), e la Fondazione per le Scienze Naturali di Pechino (Grant n. 7252259).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AutoDock 4.2.6L'Istituto di Ricerca sugli Scripti-
Colonna cromatograficaWaters Corp.ACQUITY UPLC HSS T3
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàTecnologia del laboratorio HettichMikro 220R
Piattaforme integrate di bioinformaticaWeizmann  Istituto  of  Scienza-Database GeneCards (https://www.genecards.org/)
Piattaforme integrate di bioinformaticaThe  Johns  Hopkins  Università  Scuola  of  Medicina-Database OMIM (https://omim.org/).
LC-MS/4 L AcetonitrileThermo Fisher ScientificA955-4
LC-MS/4 L MetanoloThermo Fisher ScientificA456-4
LC-MS/4 L AcquaThermo Fisher ScientificW6-4
LC-MS/50 mL Acido formicoThermo Fisher ScientificA117-50
Software per l'elaborazione dati di spettrometria di massaWaters Corp.-Software Progenesis QI 3.0
Software di docking molecolareLaboratorio OlsonAutoDock 4.2.6
Piattaforma PPIAzienda di database STRING-La piattaforma online STRING (https://string-db.org)
Database proteicoIstituto Europeo di Bioinformatica; l'Istituto Svizzero di Bioinformatica; Risorsa informativa sulle proteine-Piattaforma UniProt (https://www.uniprot.org/)
Spettrometro di massa a quadrupole orbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZR
Banche dati di compound di riferimentoTCM Pro 2.0, Beijing Hexin Technology Co., Ltd.-
Evaporatore rotativoShanghai Titan Scientific Co., LtdTR-3L
Database di biologia strutturale.Laboratorio Nazionale di Brookhaven-Il database RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)
Database di biologia strutturale.Centro Nazionale per l'Informazione Biotecnologica-Il database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
Banche dati di previsione di obiettiviSIB Istituto Svizzero di Bioinformatica-Database SwissTargetPrediction (https://www.swisstargetprediction.ch)
Banche dati di previsione di obiettiviShanghai & nbsp; Istituto  of  Materia  Medica-Database TCMSP (https://www.tcmsp-e.com/tcmsp.php)
Plugin per l'analisi topologica--plugin Centiscape 2.2; Analizzatore di rete
Sistema UHPLCVanquish Flex-
Cromatografo liquido ad altissima prestazioneThermo Fisher ScientificVanquish Flex UHPLC
Estrattore a ultrasuoniKunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.KQ3200D
Concentratore centrifugo a vuotoNingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd.SCIENTZ-1LS
Software di visualizzazione--Cytoscape 3.10.4
Piattaforma di annotazione funzionale basata sul web.Broad  Istituto-La piattaforma online Metascape (https://metascape.org)

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