Method Article

Decodifica dell'Epitrastrastoma: Intuizioni in Silico sulla rete regolatoria m6A nel cancro al seno

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta un approccio per condurre analisi genetiche, molecolari e prognostiche in silico dei regolatori della modifica m6A integrando profili di mutazione, alterazioni del numero di copie, espressione genica ed esiti clinici utilizzando dataset pubblicamente disponibili dal Cancer Genome Atlas (TCGA), dal progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e dalle piattaforme microarray.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La N6-metiladenosina (m6A) è la modifica interna dell'RNA più abbondante nei tralciati eucariotici e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo dell'RNA, nell'espressione genica e nell'omeostasi cellulare. La disregolazione dei regolatori m6A, inclusi "scrittori", "gomme" e "lettori", è stata sempre più implicata nella biologia del cancro; tuttavia, il loro ruolo globale nel cancro al seno resta da comprendere. L'obiettivo principale di questo articolo sui metodi è fornire ai principianti in bioinformatica un quadro passo dopo passo per utilizzare dataset oncologici pubblici al fine di effettuare analisi mutazionali, valutare alterazioni nell'espressione genica ed esaminarne le associazioni con la sopravvivenza del paziente. Come studio di caso, i regolatori m6A nel cancro al seno sono stati analizzati utilizzando dataset del Cancer Genome Atlas (TCGA), del progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e di piattaforme microarray. I profili trascritomici sono stati analizzati sistematicamente per dimostrare i flussi di lavoro che valutano la rilevanza prognostica dei componenti regolatori m6A nel cancro al seno. Utilizzando questo quadro analitico, sono stati identificati distinti modelli di alterazioni genetiche ed espressione differenziale tra i principali regolatori m6A. Diversi regolatori, tra cui METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 e RBMX, sono stati associati a una migliore sopravvivenza dei pazienti, mentre YWHAG è stato associato a una scarsa sopravvivenza complessiva. Questo studio offre una panoramica completa della genomica dei sistemi sui geni regolatori m6A nel cancro al seno, dimostrando al contempo un flusso di lavoro pratico e riproducibile in bioinformatica basato sul web. Questi risultati avanzano nella comprensione della regolazione epitrastrastromica nel cancro al seno e offrono una base per lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche basate sull'm6A.

Introduction

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Le modifiche epitrascrivomiche rappresentano un importante strato di regolazione genica post-trascrizionale e contribuiscono a diversi processi cellulari e stati patologici. Tra oltre 170 modifiche di RNA identificate finora, la N6-metiladenosina (m6A) è la più diffusa e meglio caratterizzata negli mRNAeucariotici 1. Installato da complessi "scrittori" tra cui METTL3/METTL14, rimosso da "gomme" tra cui FTO e ALKBH5, e interpretato da proteine "lettore" tra cui membri delle famiglie YTH e IGF2BP, m6A orchestra lo splicing, la stabilità, il trasporto e la traduzione dell'RNA, influenzando così processi biologici chiave tra cui sviluppo, differenziazione e risposta allostress 2,3.

Sono state segnalate alterazioni nei componenti regolatori di m6A in un ampio spettro di neoplaze. In molti tumori, l'attività aberrante di m6A genera fenotipi maligni; ad esempio, l'espressione elevata di METTL3 favorisce l'inizio e la progressione del tumore alla prostata modulando la via del riccio e lametilazione 5,6 dell'RNA MYC. Inizialmente risultata implicata nell'esercitazione di effetti oncogenici nella leucemia mieloide acuta, la FTO ha dimostrato di guidare la progressione tumorale nei tumori epatici, polmoni ecolorettali 7,8,9,10. Tuttavia, sono stati identificati ruoli dipendenti dal contesto di FTO e ALKBH5 che illustrano la doppia natura della regolazione mediata da m6A, che può promuovere sia la segnalazione oncogenica che quella tumoralesoppressiva 11,12,13,14. I lettori di M6A, inclusi YTHDF1/2/3, ribonucleoproteine nucleari eterogenee (hnRNP) e proteine leganti mRNA simili a fattori di crescita insulino-2 (IGF2BP1-3), sono stati anch'essi associati allacarcinogenesi 15,16,17.

Nel cancro al seno, evidenze crescenti suggeriscono che i regolatori m6A sono frequentemente disregolati e potrebbero essere associati a sottotipi tumorali, caratteristiche immunitarie e esiticlinici 18,19. Numerosi studi meccanicistici posizionano METTL3 come un fattore pro-oncogenico frequentemente aumentato nel cancro al seno. L'installazione di m6A mediata da METTL3 può stabilizzare o migliorare la traduzione di trascritti che promuovono proliferazione, transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), metastasi echemioresistenza 20. È stato inoltre dimostrato che METTL3 promuove la progressione del tumore al seno attraverso il targeting diBcl-22. ALKBH5 è stato implicato nella regolazione dei programmi di stem oncologico tramite NANOG e altre molecole correlate alla stamina, ma il suo impatto può variare a seconda del contestotumorale 22.

Con l'aumento continuo degli ultimi anni di regolamentazione dell'm6A, è necessario un aggiornamento su come i nuovi regolatori identificati potrebbero essere disregolati nel cancro al seno. La Tabella 1 fornisce un elenco dei regolatori m6A che includono autori, lettori e cancellatori della modifica m6A. Inoltre, nuovi regolatori m6A, tra cui LRPPRC e YWHAG, sono stati identificati con implicazioni nella progressione delcancro 23,24,25. Pertanto, è stata condotta una caratterizzazione genetica e molecolare completa di tutti i regolatori m6A noti nel cancro al seno, utilizzando strumenti utilizzabili da ricercatori con limitata esperienza bioinformatica.

L'obiettivo di questo articolo sui Metodi è presentare un protocollo bioinformatico basato su piattaforme passo dopo passo per l'analisi dei regolatori m6A nel cancro al seno utilizzando risorse di genomica oncologica pubblicamente disponibili. Utilizzando dataset del Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), del progetto Genotype Tissue Expression (GTEx) 26 e di piattaforme analitiche web come cBioPortal e UCSC Xena, questo protocollo dimostra flussi di lavoro riproducibili per valutare profili mutazionali, alterazioni dell'espressione genica e associazione con la sopravvivenza del paziente. Questo approccio visualizzato e accessibile è pensato per facilitare l'adozione dell'analisi dei dati epitrastrastromici da parte di ricercatori alle prime armi nella bioinformatica oncologica.

Protocol

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NOTA: L'elenco dei geni che codificano i regolatori di metilazione m6A, classificati come scrittori, lettori e gomma, è presentato nella Tabella 1. Tutti i geni elencati sono stati inclusi nelle analisi successive di mutazioni, modelli di espressione e sopravvivenza complessiva. Tutti i software e gli strumenti utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Identificazione di alterazioni genetiche nei regolatori m6A

  1. Accedi al cBioPortal per la genomica del cancro. Naviga al sito web del cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Dalla homepage, seleziona la scheda "Query" per iniziare una nuova analisi.
  2. Seleziona lo studio e la coorte sul cancro appropriati.
  3. Nella barra di ricerca "Seleziona studi per visualizzazione e analisi", digita "Carcinoma invasivo al seno" e seleziona "Carcinoma invasivo al seno (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. In fondo, seleziona "Query by Gene".
    FONDAMENTALE: Assicurarsi che la coorte selezionata (996 campioni) includa sia dati di mutazione che di alterazione del numero di copia (CNA).
  5. Definisci la query genetica. Nella sezione "Inserisci i geni ", inserisci i simboli genici HUGO per l'elenco completo dei regolatori m6A sotto indagine.
    NOTA: I geni possono essere inseriti come una lista separata da spazi. Sotto "Seleziona profili genomici", assicurati che i seguenti due tipi di dati siano selezionati: Mutazioni e Alterazioni del numero di copia.
  6. Sotto "Seleziona Paziente/Set Casi", scegli il set di campioni predefinito che corrisponde alla coorte con tutti i casi profilato.
  7. Clicca sul pulsante blu "Invia query".
  8. Recuperare e interpretare i dati sulle alterazioni genetiche. Al momento dell'invio, il risultato verrà caricato nella scheda "riassunto". La visualizzazione centrale "OncoPrint" fornisce una panoramica immediata delle alterazioni genetiche tra tutti i geni interrogati nella coorte, che può essere scaricata.
  9. Accanto all'OncoPrint, trova il grafico "Cancer Type Summary". Questo fornisce una suddivisione quantitativa delle alterazioni tra i sottotipi di cancro al seno.
  10. Esegui un'analisi pan-tumorale. Torna alla homepage di cBioPortal e seleziona "TCGA PanCancer Atlas Studies" nella scheda "Query".
  11. Nella casella di input genico, inserisci la stessa lista di geni regolatori m6A.
  12. Clicca su "Invia Query" e nella pagina dei risultati, accedi alla scheda "Riepilogo Tipi di Cancro". Questo offre una visione pan-tumorale.

2. Analisi trascrivomica comparativa dei regolatori m6A utilizzando UCSC Xena.

  1. Accedi alla piattaforma UCSC Xena. Naviga sul sito web di Xena dell'UCSC (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Dalla homepage, clicca sul pulsante "Avvia Xena" per accedere al browser principale di analisi.
  3. Nel browser Xena, clicca su "DATA SETS".
  4. Tra i dataset, seleziona "TCGA TARGET GTEx". Questo contiene dati RNA-Seq processati uniformemente dai tessuti normali dei progetti TCGA e GTEx.
  5. Nella pagina successiva, clicca su "VISUALIZZE".
  6. Definisci la variabile fenotipo (gruppo campionario). Nella sezione "Seleziona la tua prima variabile", seleziona "Categoria principale" nel tipo di dato fenotipico.
  7. Clicca su "ALLA SECONDA VARIABILE". Poi, nel tipo di dato genomico, seleziona "Espressione genica" nel dataset. Aggiungi la lista dei geni nella casella "Aggiungi gene o posizione". Clicca su "Fatto".
  8. Visualizza i pattern di espressione con una heatmap.
  9. Per separare i campioni di seno (TCGA+GTEx) dal TCGA TARGET GTEx, digita "Breast" e usa l'opzione filtro per conservare i campioni.
  10. La mappa termica è ora visibile e può essere scaricata in PDF.
  11. Genera diagrammi a scatola comparativi per i singoli geni. Per quantificare e visualizzare le differenze di espressione per uno specifico gene, usa la funzione "Visualizza come grafico". Utilizzando questa opzione, i dati possono essere visualizzati come un box plot, un dot plot e un violin plot, confrontando la distribuzione delle espressioni tra i due gruppi campionari.
  12. Usa l'opzione "Download come PDF" per scaricare le classifiche.
  13. La significatività statistica (p-value) può essere ottenuta cliccando su "STATISTICS".

3. Valutazione del significato prognostico dei regolatori m6A utilizzando il plotter Kaplan-Meier.

  1. Accedi allo strumento Kaplan-Meier Plotter. Naviga sul sito web del Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Dalla homepage, seleziona la scheda "cancro al seno" per avviare un'analisi specifica per i dataset sul cancro al seno.
  3. Configura la query genica per un singolo gene.
  4. Nella sezione di input principale, trova la casella "Simbolo gene".
  5. Inserisci il simbolo ufficiale del gene regolatore m6A da analizzare (ad esempio, METTL3).
    CRITICO: Direttamente sotto la casella di input genetico, localizza e attiva la casella di spunta "Only JetSet best probe set". Questo garantisce che la sonda microarray più affidabile e specifica venga automaticamente selezionata per il tuo gene, ottimizzando la qualità e la riproducibilità dei dati.
  6. Definisci i parametri di analisi della sopravvivenza. Nella sezione "Sopravvivenza", seleziona "Sopravvivenza complessiva (OS)" come endpoint principale per questa analisi. Lo strumento utilizzerà automaticamente i dati di 1880 pazienti con tumore al seno quando viene selezionata questa impostazione.
  7. Assicurati che l'opzione "Divide i pazienti per" sia impostata su "mediana". Questo stratificherà i pazienti in due gruppi uguali; alta e bassa espressione, basate sul valore mediano di espressione del gene interrogato su tutti i campioni.
  8. La "soglia di follow-up" può essere utilizzata per selezionare il periodo di follow-up. Per questo studio sono stati selezionati 180 mesi.
  9. Genera e interpreta il Plot di Kaplan-Meier.
  10. Clicca sul pulsante "Disegna la trama di Kaplan-Meier".
  11. Si caricherà una nuova finestra, mostrando la curva di sopravvivenza.
  12. Interpreta gli elementi chiave della trama; L'asse X indica il tempo in mesi, l'asse Y mostra la probabilità di sopravvivenza complessiva, le due linee colorate rappresentano le curve di sopravvivenza per i gruppi di pazienti ad alta espressione (rosso) e bassa espressione (nero). Viene mostrato il valore P di rango logaritmico, che indica la significanza statistica della differenza tra le due curve di sopravvivenza.

Results

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Paesaggio mutazionale dei regolatori di metilazione m6a nel cancro al seno

In uno studio precedente sull'analisi genomica dei dataset TCGA, sono state segnalate mutazioni ricorrenti in diversi geni che codificano regolatori della metilazione del DNA31. Nel presente studio, cBioPortal è stato utilizzato per analizzare il dataset "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" al fine di esaminare i profili mutazionali dei geni che codificano gli autori, i lettori e i cancellatori della metilazione dell'RNA m6A. Questa analisi ha rivelato diverse alterazioni genetiche tra le pazienti con cancro al seno, con frequenze di alterazione che variavano sostanzialmente tra i geni - dallo 0,4% in CNBP e RBM15B al 12% in VIRMA (Figura 1A). L'amplificazione genica rappresentava l'alterazione più comune, mentre eventi aggiuntivi includevano delezioni profonde, sostituzioni di basi e molteplici alterazioni concorrenti. In particolare, sono state rilevate alterazioni nei geni che regolano le funzioni correlate a m6A in 476 pazienti (48% della coorte) (Figura 1B), sottolineando l'importanza delle dinamiche di modifica di m6A nel cancro al seno. Sebbene la frequenza dei diversi tipi di alterazione variava, tali mutazioni sono state osservate in tutti i sottotipi molecolari del cancro al seno (Figura 1C). Per la validazione, PIK3CA, TP53, CDH1 e GATA3 sono stati inclusi come geni di riferimento di controllo (Figura 1A). È sorprendente che le modifiche al meccanismo regolatorio m6A non si sono limitate al cancro al seno. L'analisi di 10.967 campioni provenienti da 10.953 pazienti provenienti da 32 studi nel TCGA Pan-Cancer Atlas ha rivelato schemi mutazionali conservati in un'ampia gamma di tipi di tumore. È stato recentemente dimostrato che la via m6A è frequentemente alterata nel cancro alla prostata (PCa) e nel complesso esercita un ruolo pro-oncogenico32. Questi risultati indicano che le mutazioni che influenzano i geni che codificano gli autori, i lettori e i cancellatori della modifica dell'RNA m6A sono una caratteristica comune in più tumori (Figura 2).

Profili di espressione genica aberranti nel cancro al seno

Le evidenze emergenti evidenziano le interruzioni trasscrittomiche come fattori chiave della tumorigenesi, con un'espressione genica aberrante che offre potenziale come biomarcatori nel cancro al seno. Per indagare su questo, sono stati analizzati i livelli di trascritto dei geni che regolano la modifica m6A utilizzando dati del TCGA e del progetto Genotype Tissue Expression (GTEx) che rappresentano il tessuto mammario normale. Come illustrato nella Figura 3A, vari geni associati a m6A hanno mostrato una significativa disregolazione nei campioni di cancro al seno. Sia la regolazione al rialzo che quella alla bassa sono state osservate nei tessuti tumorali rispetto ai controlli normali. METTL3 e WTAP, entrambi componenti del complesso di scrittore, sono stati sottoregolati insieme ad altri geni, mentre diversi altri geni, tra cui VIRMA, YTHDF1 e YTHDF3, sono stati regolati al rialzo. La Figura 3B delinea ulteriormente i profili di espressione differenziale dei singoli geni tra le coorti TCGA e GTEx. Collettivamente, questi risultati indicano che i geni che codificano autori, lettori e gomme di metilazione m6A subiscono una deregolazione trascrizionale estesa nel cancro al seno, sottolineando la loro potenziale rilevanza nella progressione della malattia.

Geni della macchina m6A e il loro ruolo nella prognosi del paziente

A seguito dell'osservazione che alterazioni genetiche e cambiamenti nell'espressione genica sono altamente diffusi tra i pazienti oncologici, è stata indagata la rilevanza prognostica di questi cambiamenti di espressione nel cancro al seno. Utilizzando lo strumento plotter Kaplan-Meier (KM) 30, che integra dataset di microarray, la sopravvivenza complessiva (OS) è stata valutata in una coorte di 1880 pazienti con cancro al seno secondo l'espressione dei geni regolatori m6A. Questa analisi ha rivelato che l'elevata espressione di METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 e RBMX era significativamente associata a un miglioramento della sopravvivenza complessiva. Al contrario, la sovraespressione di YWHAG è correlata a scarsi esiti di sopravvivenza (Figura 4). Come controlli, sono stati inclusi CCND2 e TOP2A, noti indicatori di prognosi migliore e cattiva rispettivamente. Altri geni che codificano i regolatori m6A non hanno mostrato correlazioni statisticamente significative con la sopravvivenza del paziente (figura supplementare). Questi risultati evidenziano un sottoinsieme di geni regolatori della metilazione m6A con potenziale utilità nella prognosi del cancro al seno.

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Figura 1: Alterazioni genetiche negli autori, lettori e geni gommatori m6A nel cancro al seno. (A) Viene mostrata la distribuzione delle alterazioni tra 996 pazienti affette da cancro al seno, con ogni linea grigia che rappresenta un singolo caso. Le barre codificate a colori indicano diversi tipi di alterazione, inclusi mutazioni missens, delezioni profonde, amplificazioni, mutazioni nel fotogramma e mutazioni troncate. Geni ben caratterizzati, PIK3CA, TP53, CDH1 e GATA3, sono inclusi come controlli positivi grazie alle loro frequenze di mutazione già stabilite. (B) Frequenza complessiva di alterazione dei geni regolatori m6A all'interno della coorte di pazienti. (C) Modelli di alterazione genetica nei geni regolatori m6A da parte dei sottotipi di cancro al seno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 2: Frequenza delle alterazioni genetiche nei geni che codificano scrittori, lettori e gomme m6A tra diversi tipi di cancro. L'analisi si basa sui dati dell'atlante pan-tumorale TCGA, che comprende 10.967 campioni provenienti da 10.953 pazienti in 32 studi oncologici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

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Figura 3: Anomalie di espressione nei geni che codificano scrittori, lettori e gomme m6A. (A) La sovraespressione (barre rosse) e la sottoespressione (barre blu) di tutti i geni sono visualizzate. I dati di GTEx e TCGA sono stati utilizzati per confrontare campioni di cancro al seno normali e quelli del cancro al seno. (B) Questa figura presenta un confronto tra l'espressione genica individuale in pazienti normali e con cancro al seno. Xena utilizza il test t di Welch per determinare i valori p per ogni gene. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Profili espressivi di scrittori, lettori e gomme m6A e la loro associazione con la prognosi nel cancro al seno. Le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier rappresentano la sopravvivenza complessiva del paziente, con l'asse X che indica il tempo (mesi) e l'asse Y che mostra la probabilità complessiva di sopravvivenza. Le linee rosse rappresentano il gruppo ad alta espressione, mentre le linee nere rappresentano il gruppo a bassa espressione. I pazienti sono stati stratificati in base ai livelli mediani di espressione genica. i valori p venivano determinati utilizzando il test Log-Rank. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare: I membri dei regolatori m6A non mostrano una correlazione significativa con la sopravvivenza complessiva del paziente, come mostrato dalle curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier. Le linee rosse rappresentano il gruppo ad alta espressione, mentre le linee nere rappresentano il gruppo a bassa espressione. Clicca qui per scaricare questo file.

TipoSimbolo genetico
ScrittoriMETTL3
METTL14
ZC3H13
WTAP
RBM15
RBM15B
METTL16
CBLL1
KIAA1429/VIRMA
LettoriYTHDF1
YTHDF2
YTHDF3
YTHDC1
YTHDC2
HNRNPA2B1
HNRNPC
HNRNPG/RBMX
IGF2BP1
IGF2BP2
IGF2BP3
CNBP
ELAVL1
SND1
PRRC2A
PRRC2B
PRRC2C
EIF3A
FMR1
FXR1
FXR2
LRPPRC
MSI2
GommaALKBH5
FTO

Tabella 1: Geni che codificano autori, lettori e gomme di m6A. La Tabella 1 fornisce una panoramica delle principali famiglie geniche responsabili dell'installazione, del riconoscimento e della rimozione della modifica m6A nell'RNA eucariota.

Discussion

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L'articolo di questo Metodo offre un flusso di lavoro completo, accessibile e integrato per la profilazione sistematica multi-omica e la traduzione clinica di qualsiasi firma genica nella ricerca sul cancro, dimostrata qui attraverso l'analisi dei regolatori di metilazione dell'RNA m6A nel cancro al seno. Combinando queste principali piattaforme pubbliche di bioinformatica, questo approccio consente ai ricercatori di progredire in modo efficiente dalla scoperta genomica a ipotesi clinicamente rilevanti senza richiedere competenze computazionali avanzate.

Il punto di forza principale di questa metodologia è la sua pipeline modulare e generatrice di ipotesi. Il protocollo guida l'utente attraverso una sequenza logica; prima identificando quali geni sono geneticamente alterati (usando cBioPortal), poi valutando la disregolazione dell'espressione in un ambiente corretto da batch (usando UCSC Xena), e infine valutando l'impatto clinico di quella disregolazione sulla sopravvivenza del paziente (usando il plotter Kaplan-Meier). Questa analisi a passaggi, dal DNA all'RNA fino all'esito clinico, dà di fatto priorità ai geni candidati per ulteriori studi. Ad esempio, applicare questo flusso di lavoro ai regolatori m6A individuando efficacemente geni come YWHAG (alterazione frequente, prognosi di scarsa sopravvivenza) come obiettivi ad alta priorità per la validazione funzionale.

Il design del protocollo per l'analisi pan-tumorale ne aumenta ulteriormente l'utilità, permettendo ai ricercatori di determinare rapidamente se una firma molecolare è specifica di un solo cancro o una caratteristica condivisa della tumorigenesi, come osservato con le diffuse alterazioni nei meccanismi m6A in questo studio. L'analisi pan-tumorale ha rivelato che le mutazioni che colpivano scrittori, lettori e gomme di m6A non erano limitate al cancro al seno, ma erano condivise tra molteplici tumori maligni. Ciò si allinea con l'accumulo di evidenze che la regolazione aberrante del m6A è una caratteristica distintiva dell'oncogenesi in diversi tipi tumorali, poiché influenza molteplici caratteristiche del cancro e dei processi fisiologici, tra cui lo splicing dell'RNA, la stabilità, la traduzione e l'attività non codificantedell'RNA 33.

Questo approccio metodologico è altamente adattabile. Sebbene dimostrato con regolatori m6A, lo stesso flusso di lavoro può essere applicato immediatamente per caratterizzare geni di controllo immunitario, enzimi metabolici o nuove firme geniche provenienti da esperimenti RNA-seq in qualsiasi tipo di cancro presente in questi database. Questo formato passo dopo passo abbassa la barriera per gli scienziati di laboratorio umido di effettuare analisi in silico sofisticate, accelerando la transizione dai dati genomici alle intuizioni biologiche.

In conclusione, questo protocollo fornisce un quadro solido per la contestualizzazione dei geni correlati al cancro. Oltre a delineare il paesaggio mutazionale, i risultati hanno rivelato cambiamenti bidirezionali nell'espressione nei regolatori di m6A. Questo risultato sottolinea la complessità dell'epitrastrastoma e rafforza il paradigma consolidato della funzione dipendente dal contesto, come esemplificato dai doppi ruoli riportati per le proteine delle famiglie METTL3 e YTHDF in diversitumori 34,35. L'asse m6A ha inoltre dimostrato di svolgere un ruolo nella regolazione della proliferazione, della metastasi e dell'evasione immunitaria nel cancro al seno triplonegativo 36,37. Curiosamente, l'analisi di sopravvivenza ha identificato un sottoinsieme di regolatori m6A con rilevanza prognostica. L'espressione elevata di METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 e RBMX è stata associata a risultati favorevoli, mentre l'espressione di YWHAG è stata correlata a una scarsa sopravvivenza complessiva. Questi risultati supportano la potenziale utilità clinica dei regolatori m6A come biomarcatori prognostici. CBLL1 è stato anche identificato come uno dei fattori con una prognosi favorevole in uno studioprecedente 38. Tuttavia, l'analisi attuale che incorpora membri aggiornati dei regolatori m6A ha identificato membri aggiuntivi, come RBMX e YWHAG, rispettivamente con una sopravvivenza complessiva migliore e peggiore. L'osservazione che regolatori distinti possano prevedere una prognosi avversa o favorevole sottolinea le funzioni duali e specifiche per il contesto delle modifiche m6A nella biologia del cancro. Sebbene YTHDF1 e YTHDF3 siano significativamente aumentati nei tumori, la loro mancanza di correlazione con la sopravvivenza complessiva può riflettere ridondanza funzionale tra i lettori, ruoli dipendenti dal contesto tra i sottotipi di cancro o la necessità di considerare il loro rapporto o la rete regolatoria netta m6A piuttosto che i livelli di espressione individuali. Inoltre, sebbene VIRMA abbia mostrato la frequenza di alterazione più alta (12%, principalmente amplificazione), la sua espressione non è stata significativamente correlata con la sopravvivenza complessiva nel cancro al seno. Una possibile spiegazione è che l'espressione di hIgh VIRMA indichi solo un potenziale elevato per la deposizione di m6A, non se siano presenti i necessari lettori a valle o mRNA target per tradurre questo in un comportamento tumorale aggressivo. In particolare, mentre YTHDF1 e YTHDF3 erano sovraespressi nella coorte, YTHDC1 e YTHDC2 erano significativamente sottoregolati. Questo schema di espressione discorrispondente suggerisce che la combinazione funzionale di scrittori e lettori specifici necessaria per l'output oncogenico potrebbe non essere operativa nel cancro al seno. Pertanto, nonostante la sua elevata espressione, VIRMA potrebbe non essere un fattore dominante in questo contesto (figura supplementare).

Gli autori riconoscono una limitazione primaria di questa pipeline in silico . Le analisi sono intrinsecamente correlative; Identificano forti associazioni ma non stabiliscono una causalità meccanicistica. Tale causalità può essere stabilita tramite genomica funzionale o utilizzando inibitori a piccole molecole che prendono di mira componenti della viam6A 39. In particolare, il primo inibitore peptidico mirante a METTL3, RSM3, è stato recentemente sviluppato e ha dimostrato il potenziale antitumorale in modelli di cancro alla prostata in vivo40. Questo flusso di lavoro metodologico rappresenta quindi uno strumento prezioso per identificare i target candidati e stratificare le popolazioni di pazienti più probabili a beneficiare di questi interventi terapeutici.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alcune parti di questo manoscritto sono state riviste con l'aiuto di strumenti linguistici basati su IA per migliorare chiarezza e leggibilità. Tutti i contenuti sostanziali, interpretazioni, analisi e conclusioni sono di proprietà degli autori. Dichiariamo che non vi è conflitto di interessi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una sovvenzione dell'Università Alfaisal (IRG 25450) a RM è stata fortunatamente riconosciuta.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalCentro Oncologico Memorial Sloan-Ketteringhttps://www.cbioportal.org
Espressione Genotipo-Tessuto (GTEx)Consorzio GTExhttps://gtexportal.org
Tramatore Kaplan-MeierGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
L'Atlante del Genoma del Cancro (TCGA)Istituto Nazionale del Cancro (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversità della California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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