Method Article

Decodifica dell'Epitrastrastoma: Intuizioni in Silico sulla rete regolatoria m6A nel cancro al seno

DOI:

10.3791/70545

⸱

June 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, College of Science and General Studies, Alfaisal University, 2Department of Biological and Biomedical Sciences, Aga Khan University, 3College of Medicine, Alfaisal University, 4Affiliated Hospital of Hunan University, School of Biomedical Sciences, Hunan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo presenta un approccio per condurre analisi genetiche, molecolari e prognostiche in silico dei regolatori della modifica m6A integrando profili di mutazione, alterazioni del numero di copie, espressione genica ed esiti clinici utilizzando dataset pubblicamente disponibili dal Cancer Genome Atlas (TCGA), dal progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e dalle piattaforme microarray.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La N6-metiladenosina (m6A) è la modifica interna dell'RNA più abbondante nei tralciati eucariotici e svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo dell'RNA, nell'espressione genica e nell'omeostasi cellulare. La disregolazione dei regolatori m6A, inclusi "scrittori", "gomme" e "lettori", è stata sempre più implicata nella biologia del cancro; tuttavia, il loro ruolo globale nel cancro al seno resta da comprendere. L'obiettivo principale di questo articolo sui metodi è fornire ai principianti in bioinformatica un quadro passo dopo passo per utilizzare dataset oncologici pubblici al fine di effettuare analisi mutazionali, valutare alterazioni nell'espressione genica ed esaminarne le associazioni con la sopravvivenza del paziente. Come studio di caso, i regolatori m6A nel cancro al seno sono stati analizzati utilizzando dataset del Cancer Genome Atlas (TCGA), del progetto Genotype-Tissue Expression (GTEx) e di piattaforme microarray. I profili trascritomici sono stati analizzati sistematicamente per dimostrare i flussi di lavoro che valutano la rilevanza prognostica dei componenti regolatori m6A nel cancro al seno. Utilizzando questo quadro analitico, sono stati identificati distinti modelli di alterazioni genetiche ed espressione differenziale tra i principali regolatori m6A. Diversi regolatori, tra cui METTL14, CBLL1, YTHDC1, HNRNPC, HNRNPA2B1 e RBMX, sono stati associati a una migliore sopravvivenza dei pazienti, mentre YWHAG è stato associato a una scarsa sopravvivenza complessiva. Questo studio offre una panoramica completa della genomica dei sistemi sui geni regolatori m6A nel cancro al seno, dimostrando al contempo un flusso di lavoro pratico e riproducibile in bioinformatica basato sul web. Questi risultati avanzano nella comprensione della regolazione epitrastrastromica nel cancro al seno e offrono una base per lo sviluppo di nuove strategie diagnostiche e terapeutiche basate sull'm6A.

Introduction

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Le modifiche epitrascrivomiche rappresentano un importante strato di regolazione genica post-trascrizionale e contribuiscono a diversi processi cellulari e stati patologici. Tra oltre 170 modifiche di RNA identificate finora, la N6-metiladenosina (m6A) è la più diffusa e meglio caratterizzata negli mRNAeucariotici 1. Installato da complessi "scrittori" tra cui METTL3/METTL14, rimosso da "gomme" tra cui FTO e ALKBH5, e interpretato da proteine "lettore" tra cui membri delle famiglie YTH e IGF2BP, m6A orchestra lo splicing, la stabilità, il trasporto e la traduzione dell'RNA, influenzando così processi biologici chiave tra cui sviluppo, differenziazione e risposta allostress 2,3.

Sono state segnalate alterazioni nei componenti regolatori di m6A in un ampio spettro di neoplaze. In molti tumori, l'attività aberrante di m6A genera fenotipi maligni; ad esempio, l'espressione elevata di METTL3 favorisce l'inizio e la progressione del tumore alla prostata modulando la via del riccio e lametilazione 5,6 dell'RNA MYC. Inizialmente risultata implicata nell'esercitazione di effetti oncogenici nella leucemia mieloide acuta, la FTO ha dimostrato di guidare la progressione tumorale nei tumori epatici, polmoni ecolorettali 7,8,9,10. Tuttavia, sono stati identificati ruoli dipendenti dal contesto di FTO e ALKBH5 che illustrano la doppia natura della regolazione mediata da m6A, che può promuovere sia la segnalazione oncogenica che quella tumoralesoppressiva 11,12,13,14. I lettori di M6A, inclusi YTHDF1/2/3, ribonucleoproteine nucleari eterogenee (hnRNP) e proteine leganti mRNA simili a fattori di crescita insulino-2 (IGF2BP1-3), sono stati anch'essi associati allacarcinogenesi 15,16,17.

Nel cancro al seno, evidenze crescenti suggeriscono che i regolatori m6A sono frequentemente disregolati e potrebbero essere associati a sottotipi tumorali, caratteristiche immunitarie e esiticlinici 18,19. Numerosi studi meccanicistici posizionano METTL3 come un fattore pro-oncogenico frequentemente aumentato nel cancro al seno. L'installazione di m6A mediata da METTL3 può stabilizzare o migliorare la traduzione di trascritti che promuovono proliferazione, transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), metastasi echemioresistenza 20. È stato inoltre dimostrato che METTL3 promuove la progressione del tumore al seno attraverso il targeting diBcl-22. ALKBH5 è stato implicato nella regolazione dei programmi di stem oncologico tramite NANOG e altre molecole correlate alla stamina, ma il suo impatto può variare a seconda del contestotumorale 22.

Con l'aumento continuo degli ultimi anni di regolamentazione dell'm6A, è necessario un aggiornamento su come i nuovi regolatori identificati potrebbero essere disregolati nel cancro al seno. La Tabella 1 fornisce un elenco dei regolatori m6A che includono autori, lettori e cancellatori della modifica m6A. Inoltre, nuovi regolatori m6A, tra cui LRPPRC e YWHAG, sono stati identificati con implicazioni nella progressione delcancro 23,24,25. Pertanto, è stata condotta una caratterizzazione genetica e molecolare completa di tutti i regolatori m6A noti nel cancro al seno, utilizzando strumenti utilizzabili da ricercatori con limitata esperienza bioinformatica.

L'obiettivo di questo articolo sui Metodi è presentare un protocollo bioinformatico basato su piattaforme passo dopo passo per l'analisi dei regolatori m6A nel cancro al seno utilizzando risorse di genomica oncologica pubblicamente disponibili. Utilizzando dataset del Cancer Genome Atlas (TCGA) (www.cancer.gov/tcga), del progetto Genotype Tissue Expression (GTEx) 26 e di piattaforme analitiche web come cBioPortal e UCSC Xena, questo protocollo dimostra flussi di lavoro riproducibili per valutare profili mutazionali, alterazioni dell'espressione genica e associazione con la sopravvivenza del paziente. Questo approccio visualizzato e accessibile è pensato per facilitare l'adozione dell'analisi dei dati epitrastrastromici da parte di ricercatori alle prime armi nella bioinformatica oncologica.

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Protocol

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NOTA: L'elenco dei geni che codificano i regolatori di metilazione m6A, classificati come scrittori, lettori e gomma, è presentato nella Tabella 1. Tutti i geni elencati sono stati inclusi nelle analisi successive di mutazioni, modelli di espressione e sopravvivenza complessiva. Tutti i software e gli strumenti utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Identificazione di alterazioni genetiche nei regolatori m6A

  1. Accedi al cBioPortal per la genomica del cancro. Naviga al sito web del cBioportal (www.cbioportal.org)27,28. Dalla homepage, seleziona la scheda "Query" per iniziare una nuova analisi.
  2. Seleziona lo studio e la coorte sul cancro appropriati.
  3. Nella barra di ricerca "Seleziona studi per visualizzazione e analisi", digita "Carcinoma invasivo al seno" e seleziona "Carcinoma invasivo al seno (TCGA, Pan-Cancer Atlas)".
  4. In fondo, seleziona "Query by Gene".
    FONDAMENTALE: Assicurarsi che la coorte selezionata (996 campioni) includa sia dati di mutazione che di alterazione del numero di copia (CNA).
  5. Definisci la query genetica. Nella sezione "Inserisci i geni ", inserisci i simboli genici HUGO per l'elenco completo dei regolatori m6A sotto indagine.
    NOTA: I geni possono essere inseriti come una lista separata da spazi. Sotto "Seleziona profili genomici", assicurati che i seguenti due tipi di dati siano selezionati: Mutazioni e Alterazioni del numero di copia.
  6. Sotto "Seleziona Paziente/Set Casi", scegli il set di campioni predefinito che corrisponde alla coorte con tutti i casi profilato.
  7. Clicca sul pulsante blu "Invia query".
  8. Recuperare e interpretare i dati sulle alterazioni genetiche. Al momento dell'invio, il risultato verrà caricato nella scheda "riassunto". La visualizzazione centrale "OncoPrint" fornisce una panoramica immediata delle alterazioni genetiche tra tutti i geni interrogati nella coorte, che può essere scaricata.
  9. Accanto all'OncoPrint, trova il grafico "Cancer Type Summary". Questo fornisce una suddivisione quantitativa delle alterazioni tra i sottotipi di cancro al seno.
  10. Esegui un'analisi pan-tumorale. Torna alla homepage di cBioPortal e seleziona "TCGA PanCancer Atlas Studies" nella scheda "Query".
  11. Nella casella di input genico, inserisci la stessa lista di geni regolatori m6A.
  12. Clicca su "Invia Query" e nella pagina dei risultati, accedi alla scheda "Riepilogo Tipi di Cancro". Questo offre una visione pan-tumorale.

2. Analisi trascrivomica comparativa dei regolatori m6A utilizzando UCSC Xena.

  1. Accedi alla piattaforma UCSC Xena. Naviga sul sito web di Xena dell'UCSC (https://xena.ucsc.edu)29.
  2. Dalla homepage, clicca sul pulsante "Avvia Xena" per accedere al browser principale di analisi.
  3. Nel browser Xena, clicca su "DATA SETS".
  4. Tra i dataset, seleziona "TCGA TARGET GTEx". Questo contiene dati RNA-Seq processati uniformemente dai tessuti normali dei progetti TCGA e GTEx.
  5. Nella pagina successiva, clicca su "VISUALIZZE".
  6. Definisci la variabile fenotipo (gruppo campionario). Nella sezione "Seleziona la tua prima variabile", seleziona "Categoria principale" nel tipo di dato fenotipico.
  7. Clicca su "ALLA SECONDA VARIABILE". Poi, nel tipo di dato genomico, seleziona "Espressione genica" nel dataset. Aggiungi la lista dei geni nella casella "Aggiungi gene o posizione". Clicca su "Fatto".
  8. Visualizza i pattern di espressione con una heatmap.
  9. Per separare i campioni di seno (TCGA+GTEx) dal TCGA TARGET GTEx, digita "Breast" e usa l'opzione filtro per conservare i campioni.
  10. La mappa termica è ora visibile e può essere scaricata in PDF.
  11. Genera diagrammi a scatola comparativi per i singoli geni. Per quantificare e visualizzare le differenze di espressione per uno specifico gene, usa la funzione "Visualizza come grafico". Utilizzando questa opzione, i dati possono essere visualizzati come un box plot, un dot plot e un violin plot, confrontando la distribuzione delle espressioni tra i due gruppi campionari.
  12. Usa l'opzione "Download come PDF" per scaricare le classifiche.
  13. La significatività statistica (p-value) può essere ottenuta cliccando su "STATISTICS".

3. Valutazione del significato prognostico dei regolatori m6A utilizzando il plotter Kaplan-Meier.

  1. Accedi allo strumento Kaplan-Meier Plotter. Naviga sul sito web del Kaplan-Meier Plotter (https://kmplot.com/analysis)30.
  2. Dalla homepage, seleziona la scheda "cancro al seno" per avviare un'analisi specifica per i dataset sul cancro al seno.
  3. Configura la query genica per un singolo gene.
  4. Nella sezione di input principale, trova la casella "Simbolo gene".
  5. Inserisci il simbolo ufficiale del gene regolatore m6A da analizzare (ad esempio, METTL3).
    CRITICO: Direttamente sotto la casella di input genetico, localizza e attiva la casella di spunta "Only JetSet best probe set". Questo garantisce che la sonda microarray più affidabile e specifica venga automaticamente selezionata per il tuo gene, ottimizzando la qualità e la riproducibilità dei dati.
  6. Definisci i parametri di analisi della sopravvivenza. Nella sezione "Sopravvivenza", seleziona "Sopravvivenza complessiva (OS)" come endpoint principale per questa analisi. Lo strumento utilizzerà automaticamente i dati di 1880 pazienti con tumore al seno quando viene selezionata questa impostazione.
  7. Assicurati che l'opzione "Divide i pazienti per" sia impostata su "mediana". Questo stratificherà i pazienti in due gruppi uguali; alta e bassa espressione, basate sul valore mediano di espressione del gene interrogato su tutti i campioni.
  8. La "soglia di follow-up" può essere utilizzata per selezionare il periodo di follow-up. Per questo studio sono stati selezionati 180 mesi.
  9. Genera e interpreta il Plot di Kaplan-Meier.
  10. Clicca sul pulsante "Disegna la trama di Kaplan-Meier".
  11. Si caricherà una nuova finestra, mostrando la curva di sopravvivenza.
  12. Interpreta gli elementi chiave della trama; L'asse X indica il tempo in mesi, l'asse Y mostra la probabilità di sopravvivenza complessiva, le due linee colorate rappresentano le curve di sopravvivenza per i gruppi di pazienti ad alta espressione (rosso) e bassa espressione (nero). Viene mostrato il valore P di rango logaritmico, che indica la significanza statistica della differenza tra le due curve di sopravvivenza.

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Results

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Paesaggio mutazionale dei regolatori di metilazione m6a nel cancro al seno

In uno studio precedente sull'analisi genomica dei dataset TCGA, sono state segnalate mutazioni ricorrenti in diversi geni che codificano regolatori della metilazione del DNA31. Nel presente studio, cBioPortal è stato utilizzato per analizzare il dataset "Breast Invasive Carcinoma (TCGA, PanCancer Atlas)" al fine di esaminare i profili mutazionali dei geni che codificano gli auto...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'articolo di questo Metodo offre un flusso di lavoro completo, accessibile e integrato per la profilazione sistematica multi-omica e la traduzione clinica di qualsiasi firma genica nella ricerca sul cancro, dimostrata qui attraverso l'analisi dei regolatori di metilazione dell'RNA m6A nel cancro al seno. Combinando queste principali piattaforme pubbliche di bioinformatica, questo approccio consente ai ricercatori di progredire in modo efficiente dalla scoperta genomica a ipotesi clinica...

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Disclosures

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Alcune parti di questo manoscritto sono state riviste con l'aiuto di strumenti linguistici basati su IA per migliorare chiarezza e leggibilità. Tutti i contenuti sostanziali, interpretazioni, analisi e conclusioni sono di proprietà degli autori. Dichiariamo che non vi è conflitto di interessi.

Acknowledgements

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Una sovvenzione dell'Università Alfaisal (IRG 25450) a RM è stata fortunatamente riconosciuta.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
cBioPortalMemorial Sloan-Kettering Cancer Centerhttps://www.cbioportal.org
Genotype-Tissue Expression (GTEx)GTEx Consortiumhttps://gtexportal.org
Kaplan-Meier PlotterGyorffy lab/A5 Genetics Ltdhttps://kmplot.com
The Cancer Genome Atlas (TCGA)National Cancer Institute (NCI)https://www.cancer.gov/tcga
UCSC Xena BrowserUniversity of California Santa Cruzhttps://xenabrowser.net

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Tags

m6A ModificationEpitranscriptomic RegulationBreast CancerRNA Methylationm6A RegulatorsBioinformatics WorkflowGene Expression AnalysisCancer GenomicsPrognostic BiomarkersTCGA Datasets

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