Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile per integrare PIVKA-II, AFP e variabili cliniche di routine in un modello diagnostico basato sulla regressione logistica per il carcinoma epatocellulare, con validazione nei casi in stadio precoce e nei casi negativi per AFP.
Articolo di ricerca
Integrazione della protrombina anormale (PIVKA-II), dell'alfa-fetoproteina e di variabili cliniche di routine per la diagnosi precoce del carcinoma epatocellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il rilevamento precoce del carcinoma epatocellulare (HCC) rimane limitato dalla sensibilità incompleta dell'alfa-fetoproteina (AFP), specialmente nei tumori in stadio iniziale e nei casi negativi per AFP. Questo studio ha valutato se l'abnorme protrombina/proteina indotta dall'assenza di vitamina K-II (PIVKA-II), l'AFP e le variabili cliniche di routine potessero essere integrati in un modello diagnostico riproducibile per l'HCC. È stato utilizzato un coorte retrospettivo di addestramento composto da 205 partecipanti, inclusi 112 casi di HCC confermati mediante imaging e 93 controlli senza HCC, per lo sviluppo del modello. Un coorte indipendente e prospettico di validazione, composto da 184 partecipanti, inclusi 58 casi di HCC e 126 controlli senza HCC, è stato impiegato per testare il modello su campioni esterni, senza riadattamento del modello. Sono stati utilizzati campioni ematici prelevati prima dell'imaging per la misurazione di AFP e PIVKA-II, mentre le variabili cliniche sono state estratte dalla stessa finestra diagnostica. Il modello finale di regressione logistica multivariata ha combinato ln(AFP), ln(PIVKA-II), età, sesso, albumina, rapporto normalizzato internazionale e conta piastrinica. Il modello combinato ha raggiunto un AUC di 0,93 nella coorte di addestramento e di 0,89 nella coorte di validazione. Nella fase di validazione, la sensibilità è stata dell'84,5% e la specificità del 90,5%. La sensibilità è rimasta del 72,7% nei casi di HCC in stadio precoce e del 73,1% nei casi di HCC negativi per AFP, superando l'AFP da sola in entrambi i sottogruppi. La calibrazione e la validazione con metodo bootstrap hanno confermato una stabilità accettabile del modello. Questi risultati dimostrano come PIVKA-II, AFP e variabili cliniche comunemente disponibili possano essere combinati in uno strumento diagnostico pratico per il triage di popolazioni a rischio elevato di malattie epatiche.
Introduzione
Il carcinoma epatocellulare (HCC) è una delle principali cause di mortalità correlata al cancro e insorge solitamente in pazienti con malattia epatica cronica, inclusa l'infezione da virus dell'epatite B, l'infezione da virus dell'epatite C, la malattia epatica alcolica e la steatosi epatica associata a disfunzione metabolica1. La diagnosi precoce è clinicamente importante perché il trattamento curativo risulta più efficace quando i tumori vengono individuati prima dell'invasione vascolare, della diffusione extraepatica o di un marcato peggioramento della riserva epatica. Le attuali strategie di sorveglianza si basano generalmente sull'ecografia epatica, con o senza alfa-fetoproteina (AFP) sierica2. Nella pratica clinica, tuttavia, l'efficacia della sorveglianza è influenzata dalla dipendenza dall'operatore, dalle ridotte dimensioni dei tumori, dai noduli cirrotici eterogenei, dalle difficoltà di imaging correlate all'obesità e dai tumori che producono poca o nessuna AFP3,4.
L'AFP continua a essere ampiamente utilizzato perché è economico, accessibile e familiare ai clinici. Il suo valore diagnostico è limitato da una sensibilità incompleta e da una specificità imperfetta. Al valore soglia convenzionale di 20 ng/mL, l'AFP può non rilevare una percentuale significativa di carcinomi epatocellulari (HCC) in stadio precoce o negativi per l'AFP. Soglie più basse potrebbero migliorare la sensibilità, ma aumentano i risultati falsi positivi nei pazienti con epatite attiva, cirrosi o altre condizioni infiammatorie del fegato5,6. Queste limitazioni rendono l'interpretazione basata su un singolo marcatore insufficiente per il triage diagnostico nelle popolazioni a rischio elevato di malattie epatiche.
La protrombina anomala, nota anche come proteina indotta dall'assenza di vitamina K-II (PIVKA-II) o protrombina des-γ-carbossilata, viene rilasciata quando epatociti maligni producono protrombina incompletamente carbossilata. PIVKA-II riflette la biologia tumorale legata alla coagulazione piuttosto che la secrezione di AFP e può rimanere informativo anche quando i livelli di AFP sono bassi7. Studi precedenti e meta-analisi hanno dimostrato che PIVKA-II migliora il rilevamento del carcinoma epatocellulare (HCC), in particolare quando utilizzato in combinazione con AFP, e potrebbe aggiungere valore nei casi di malattia in stadio precoce o negativa per AFP8,9. Tuttavia, le strategie basate esclusivamente sui marcatori non tengono pienamente conto del contesto del paziente, della riserva epatica, del conteggio piastrinico, dello stato della coagulazione o della patologia epatica sottostante.
I modelli diagnostici compositi offrono un modo pratico per interpretare i risultati dei marcatori tumorali insieme al contesto clinico. GALAD, GAAD e modelli correlati hanno dimostrato che variabili demografiche e biomarcatori possono essere combinati per migliorare il rilevamento del carcinoma epatocellulare (HCC) in diverse eziologie e popolazioni10,11. Le loro prestazioni sostengono l'uso della stima del rischio multivariabile piuttosto che di soglie isolate per i biomarcatori. Allo stesso tempo, alcuni modelli includono saggi non disponibili in tutti i laboratori, e il comportamento delle soglie può variare tra regioni, profili eziologici, stadi della malattia e uso clinico previsto12. Un modello basato su biomarcatori ampiamente disponibili e variabili di laboratorio di routine potrebbe essere più facile da implementare nei normali flussi diagnostici. A differenza di modelli precedentemente pubblicati che potrebbero basarsi su biomarcatori specializzati o strategie di soglia specifiche per la popolazione, lo studio attuale ha valutato un modello diagnostico multivariabile basato su biomarcatori ampiamente disponibili e variabili cliniche di routine, validandone le prestazioni in una coorte prospettica indipendente.
PIVKA-II è adatto a questo contesto perché integra l'AFP ed è misurabile su piattaforme di immunodosaggio automatizzate già utilizzate nei laboratori clinici. Variabili di routine come età, sesso, albumina, bilirubina, conta piastrinica, rapporto normalizzato internazionale e anamnesi di malattia epatica sono disponibili durante lo stesso incontro clinico e possono fornire informazioni relative alla riserva epatica o alla coagulazione rilevanti per il rischio di carcinoma epatocellulare13. La combinazione di queste variabili con AFP e PIVKA-II potrebbe migliorare la capacità discriminante, evitando al contempo la dipendenza da un singolo valore soglia.
PIVKA-II, AFP e variabili cliniche di routine sono stati quindi valutati mediante un disegno diagnostico a doppia coorte. Un modello di regressione logistica multivariata è stato sviluppato in una coorte retrospettiva di addestramento e testato in una coorte indipendente di validazione prospettica, senza ulteriore aggiustamento. Le prestazioni diagnostiche sono state confrontate con quelle di AFP, PIVKA-II e variabili cliniche considerate singolarmente, prestando particolare attenzione predeterminata ai casi di carcinoma epatocellulare in stadio precoce, ai casi di carcinoma epatocellulare negativi per AFP, all'interpretazione delle soglie di cutoff, alla calibrazione e alla validazione interna con metodo bootstrap.
Protocollo
Lo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolare di Hangzhou affiliato alla Scuola di Medicina dell'Università Westlake. Il numero di approvazione era IIT-20230528-0108-01. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai partecipanti arruolati in modo prospettico prima del prelievo del sangue. Per le cartelle cliniche incluse in modo retrospettivo e i campioni residui archiviati raccolti durante le cure di routine, il consenso informato è stato esonerato dal comitato etico poiché sono stati utilizzati dati anonimizzati e non è stata effettuata alcuna ulteriore intervento.
Riproducibilità, controllo dei bias e integrità dei dati
I criteri di idoneità, i tempi di prelievo del sangue, le regole di valutazione dell'imaging, le definizioni dei sottogruppi, i predittori candidati, le definizioni delle soglie, le regole per i dati mancanti e le procedure di convalida sono stati specificati in anticipo prima dell'analisi statistica. I campioni di sangue sono stati raccolti prima della conferma tramite imaging con mezzo di contrasto e prima di qualsiasi trattamento antitumorale. I test di laboratorio hanno utilizzato identificatori dello studio anonimizzati e i campioni dei gruppi di addestramento e di convalida sono stati analizzati in ordine casuale. Il personale di laboratorio era all'oscuro della diagnosi finale, dell'assegnazione al gruppo, dello stadio secondo la classificazione del Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) e dello stato di negatività per AFP. La diagnosi e lo stadio radiologico sono stati determinati indipendentemente rispetto ai test di laboratorio. L'inserimento dei dati, la conversione delle unità, l'assegnazione ai gruppi, la codifica delle esclusioni, la codifica dei valori mancanti e i set di dati statistici sono stati verificati da due ricercatori prima dell'adattamento del modello. I gruppi di addestramento e di convalida sono stati mantenuti separati durante tutta la selezione delle variabili, l'adattamento del modello, la derivazione delle soglie e la convalida.
Popolazione oggetto dello studio e disegno dello studio
Questo studio diagnostico a doppia coorte ha sviluppato e convalidato un modello multivariabile per il rilevamento del carcinoma epatocellulare (HCC) utilizzando la protrombina anomala/proteina indotta da PIVKA-II, AFP e variabili cliniche di routine. La coorte di addestramento assemblata in modo retrospettivo includeva partecipanti valutati tra il 1° gennaio 2021 e il 31 dicembre 2023. Questa coorte è stata utilizzata per la selezione delle variabili, l'adattamento del modello, la derivazione delle soglie e la convalida interna tramite bootstrap. La coorte di convalida arruolata in modo prospettico includeva partecipanti valutati tra il 1° gennaio 2024 e il 31 dicembre 2025. Questa coorte è stata utilizzata esclusivamente per test su campioni esterni. Non è stata effettuata alcuna nuova selezione di variabili, riadattamento del modello, aggiornamento dei coefficienti, riottimizzazione delle soglie o ricalibrazione basata su sottogruppi nella coorte di convalida. Il flusso dei partecipanti, l'assegnazione alle coorti, il prelievo di sangue, l'elaborazione del plasma, i test sui biomarcatori, la valutazione delle immagini e il flusso di lavoro statistico sono mostrati in Figura 1.
I partecipanti sono stati reclutati da un percorso di sorveglianza o diagnostico per epatopatie ad alto rischio presso l'Ospedale Affiliato Hangzhou First People's Hospital, Scuola di Medicina, Westlake University. Lo stato di alto rischio è stato definito come infezione da epatite B cronica, infezione da epatite C cronica, cirrosi di qualsiasi eziologia o steatosi epatica con fibrosi documentata in base a valutazione clinica, referti di laboratorio o precedenti esami di imaging. I partecipanti idonei erano adulti di età ≥18 anni che avevano completato il prelievo ematico pre-imaging e una tomografia computerizzata (TC) multiphasica con mezzo di contrasto e/o una risonanza magnetica (RM) dinamica con mezzo di contrasto entro 14 giorni dal prelievo del sangue. I criteri di esclusione comprendevano trattamenti precedenti per carcinoma epatocellulare (HCC), inclusi resezione, ablazione, terapia transarteriosa o terapia sistemica; somministrazione di vitamina K nei 7 giorni precedenti il prelievo; terapia con antagonisti della vitamina K o altre terapie anticoagulanti che potessero influenzare l'interpretazione della coagulazione; colangite acuta o ostruzione biliare al momento del prelievo; gravidanza; dati mancanti relativi ad AFP, PIVKA-II o diagnosi finale tramite imaging; e qualità inaccettabile del campione senza un campione ripetuto valido.
La popolazione finale dello studio comprendeva 389 partecipanti. Il gruppo di addestramento includeva 205 partecipanti, di cui 112 casi di carcinoma epatocellulare confermati mediante imaging e 93 controlli senza carcinoma epatocellulare. Il gruppo di validazione includeva 184 partecipanti, di cui 58 casi di carcinoma epatocellulare confermati mediante imaging e 126 controlli senza carcinoma epatocellulare. Nel gruppo di addestramento, i 93 controlli senza carcinoma epatocellulare comprendevano 30 controlli sani e 63 controlli con malattia epatica cronica. Nel gruppo di validazione, i 126 controlli senza carcinoma epatocellulare comprendevano 0 controlli sani e 126 controlli con malattia epatica cronica.
Lo stato sintomatico non è stato assegnato sulla base della sola anamnesi di epatite o di cirrosi compensata. Un partecipante è stato classificato come sintomatico solo quando il referto precedente all'imaging ha documentato un dolore nuovo o peggiorato nel quadrante superiore destro, perdita di peso inspiegabile, distensione addominale, ittero, urine scure o una scompensazione clinicamente documentata non spiegata da un'altra causa confermata. I partecipanti senza questi reperti sono stati classificati come asintomatici o con lesioni rilevate durante il monitoraggio.
Adjudicazione diagnostica e stadiazione
Lo stato finale di carcinoma epatocellulare (HCC) è stato determinato mediante tomografia computerizzata multiphasica con mezzo di contrasto e/o risonanza magnetica dinamica con mezzo di contrasto eseguite nell'ambito delle cure abituali. L'imaging doveva includere almeno una fase arteriosa e una fase porto-venosa; i reperti della fase ritardata sono stati inclusi quando disponibili. Una lesione è stata classificata come HCC quando, in un fegato a rischio, l'imaging ha mostrato un'iper-rappresentazione in fase arteriosa con washout in fase porto-venosa e/o ritardata, con o senza capsula di enhancement. I partecipanti senza caratteristiche radiologiche compatibili con HCC e senza una diagnosi maligna alternativa sono stati classificati come non-HCC.
Le informazioni di imaging sono state estratte mediante un modulo predeterminato che registrava la modalità di imaging, le fasi ottenute, l'iper-rappresentazione in fase arteriosa, il washout, l'aspetto capsulare, il numero di lesioni, il diametro massimo delle lesioni, l'invasione macrovascolare e la diffusione extraepatica. Due lettori esperti hanno estratto in modo indipendente le caratteristiche di imaging dai referti radiologici finali. Le discrepanze sono state risolte mediante consenso, utilizzando gli stessi criteri predeterminati. Se erano disponibili sia TC che RM, è stata utilizzata la modalità con la caratterizzazione multiphasica più completa. Se entrambe le modalità erano complete, è stata utilizzata quella indicata come base per la decisione clinica finale.
Lo stadio BCLC è stato assegnato dopo che lo stato del carcinoma epatocellulare (HCC) era stato definitivamente stabilito. L'HCC in stadio precoce è stato definito come stadio BCLC 0–A. L'HCC negativo per AFP è stato definito come AFP <20 ng/mL al prelievo ematico effettuato prima dell'imaging. Queste etichette di sottogruppo sono state utilizzate per la valutazione delle prestazioni nei sottogruppi, non per l'addestramento del modello o per l'idoneità dei partecipanti.
Raccolta del campione e lavorazione del plasma
Il sangue venoso periferico è stato prelevato al mattino dopo un digiuno notturno di almeno 8 h, prima della conferma mediante TC/RMI con mezzo di contrasto e prima dell'inizio della terapia antitumorale. Sono stati raccolti complessivamente 10 mL di sangue venoso in provette per prelievo ematico con anticoagulante K2-EDTA. Le provette sono state capovolte 8–10 volte immediatamente dopo il prelievo e trasportate in laboratorio a 4 °C. L'intervallo tra il prelievo e la centrifugazione è stato mantenuto entro 2 h ed è stato registrato nel registro del campione.
Il plasma è stato separato mediante centrifugazione a 1.600 × g per 10 min a 4 °C utilizzando una centrifuga refrigerata. Il sopranatante plasmatico è stato trasferito in provette microcentrifuga da 1,5 mL prive di nucleasi e suddiviso in aliquote da 0,5–1,0 mL. Le aliquote sono state conservate a -80 °C fino al momento dell'analisi. Prima della misurazione dei biomarcatori, un'aliquote è stata scongelata una sola volta a temperatura ambiente, 20–25 °C, per 20–30 min, mescolata delicatamente per inversione ed analizzata entro 2 h dal completo scongelamento. I campioni con evidente coagulazione, emolisi da moderata a grave o marcata lipemia sono stati scartati in base ai criteri predeterminati di accettazione del laboratorio. Per il coorte di validazione prospettica, è stata effettuata una ripetuta raccolta del sangue prima della conferma mediante imaging, quando clinicamente fattibile.
Misurazione di AFP e PIVKA-II
AFP e PIVKA-II sono stati misurati mediante saggi immunoenzimatici a chemiluminescenza elettrochimica su un analizzatore immunoenzimatico automatizzato. L'AFP è stato registrato in ng/mL e il PIVKA-II in mAU/mL. I risultati sono stati esportati direttamente dal sistema informativo di laboratorio.
Ogni lotto analitico includeva calibratori specifici per il saggio e almeno due livelli interni di controllo qualità. L'accettazione del lotto richiedeva che tutti i risultati del controllo qualità rientrassero nell'intervallo di controllo di laboratorio predefinito. Gli obiettivi di precisione analitica erano un coefficiente di variazione all'interno della corsa ≤10% e un coefficiente di variazione tra le corse ≤15% sia per AFP che per PIVKA-II. Se il controllo qualità falliva o veniva rilevata una deriva del lotto, il lotto veniva respinto, l'analizzatore veniva ricalibrato e il lotto veniva ripetuto qualora rimanesse un volume sufficiente di campione. Per un risultato singolo implausibile o fuori intervallo, quando possibile venivano effettuate due misurazioni ripetute dallo stesso aliquota scongelato, e si utilizzava la media dei due valori ripetuti accettati. Se la ripetizione dei test falliva o il volume del campione era insufficiente, il risultato veniva contrassegnato come non valido e gestito secondo la regola prevista per i dati mancanti.
Estrazione di variabili cliniche di routine
Le variabili cliniche di routine sono state estratte dallo stesso incontro clinico del prelievo ematico pre-imaging per AFP/PIVKA-II. Le variabili considerate includevano età, sesso, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, albumina, bilirubina totale, rapporto internazionale normalizzato (INR), tempo di protrombina e conta piastrinica. Quando erano disponibili più valori all'interno della finestra pre-imaging, è stato selezionato il valore più vicino al momento del campionamento di AFP/PIVKA-II. Le unità sono state standardizzate prima dell'analisi. L'età è stata registrata in anni; il sesso è stato codificato come femmina = 0 e maschio = 1; la conta piastrinica è stata registrata come ×10⁹/L; l'albumina come g/L; la bilirubina totale come μmol/L; l'AFP come ng/mL; e il PIVKA-II come mAU/mL.
Dopo l'estrazione sono stati eseguiti controlli di intervallo, controlli dell'unità di misura e controlli sui valori implausibili. I valori segnalati sono stati verificati confrontandoli con i documenti originali. Un valore è stato escluso soltanto quando il documento originale confermava un problema di qualità del campione, un errore nella conversione dell'unità di misura o una deviazione nella procedura di elaborazione. I valori estremi verificati sono stati mantenuti. Il dizionario delle variabili ha definito la struttura del dataset, i nomi delle variabili, le unità di misura, le regole di codifica, le regole di trasformazione e i codici per i valori mancanti.
Definizione del predittore e selezione delle variabili
I predittori candidati sono stati definiti prima dello sviluppo del modello. I biomarcatori principali erano AFP e PIVKA-II. I candidati clinici di routine erano età, sesso, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, albumina, bilirubina totale, INR o tempo di protrombina e conta piastrinica. AFP e PIVKA-II sono stati trasformati mediante logaritmo naturale. I valori al di sotto del limite di segnalazione del saggio sono stati sostituiti con la metà del limite inferiore di segnalazione prima della trasformazione.
I confronti univariati tra partecipanti con HCC e senza HCC nella coorte di addestramento hanno utilizzato test t per campioni indipendenti per variabili approssimativamente distribuite in modo normale, test U di Mann-Whitney per variabili continue asimmetriche e test χ2 o test esatto di Fisher per variabili categoriali. Le variabili con P < 0,10 nella selezione univariata sono state prese in considerazione per la modellizzazione multivariabile. La multicollinearità è stata valutata mediante il fattore di inflazione della varianza (VIF), e un valore di VIF >5 è stato considerato indicativo di una collinearità preoccupante. Quando due variabili risultavano fortemente collineari, è stata mantenuta quella con un'interpretazione clinica più chiara e una migliore performance incrementale del modello.
Il modello finale di regressione logistica multivariabile è stato sviluppato soltanto nella coorte di addestramento. ln(AFP) e ln(PIVKA-II) sono stati inseriti obbligatoriamente nel modello. I predittori aggiuntivi sono stati selezionati mediante eliminazione all'indietro guidata dal criterio di informazione di Akaike. Dopo la selezione all'indietro, le variabili mantenute sono state ln(AFP), ln(PIVKA-II), età, sesso, albumina, INR e conta piastrinica.
Sviluppo del modello e calcolo del punteggio di rischio
Il modello diagnostico è stato costruito utilizzando una regressione logistica multivariata con lo stato di carcinoma epatocellulare (HCC) come risultato binario. La probabilità predetta di HCC è stata calcolata a partire dal predittore lineare η mediante la seguente equazione:
p(HCC)=1/[1+exp(-η)]
η = -4.862+0.247×ln(AFP)+0.712×ln(PIVKA-II)+0.018×età+0.331×sesso-0.062×albumina+0.554×INR-0.004×conteggio_piastrinico
L'AFP è stata misurata in ng/mL, la PIVKA-II in mAU/mL, l'età in anni, il sesso è stato codificato come femmina = 0 e maschio = 1, l'albumina è stata misurata in g/L, l'INR era senza unità di misura e il conteggio delle piastrine è stato misurato come ×109/L. Sono stati utilizzati logaritmi naturali per AFP e PIVKA-II. Un nomogramma è stato generato a partire dagli stessi coefficienti stimati. Per l'analisi della curva ROC (receiver operating characteristic), l'analisi di calibrazione, l'analisi della curva decisionale e la validazione, è stata utilizzata la probabilità predetta, e non la scala dei punti del nomogramma.
Definizioni di cutoff e gestione delle soglie
Le soglie di PIVKA-II sono state etichettate in base allo scopo analitico. Il cutoff clinico stabilito per PIVKA-II era di 40,0 mAU/mL. Il cutoff di Youden per il gruppo di addestramento per PIVKA-II era di 45,0 mAU/mL. Il cutoff a specificità fissa è stato determinato selezionando la soglia più vicina al 90% di specificità nel gruppo di addestramento; questo valore è risultato pari a 38,0 mAU/mL per PIVKA-II. Una soglia apparente utilizzata solo nella validazione di 37,5 mAU/mL è stata considerata esplorativa e non è stata utilizzata come cutoff primario per la validazione.
Per il modello combinato, la soglia binaria principale è stata ricavata dalla coorte di addestramento utilizzando l'indice di Youden ed è stata applicata invariata alla coorte di validazione. Per l'AFP è stata utilizzata la soglia clinica consolidata di 20,0 ng/mL per la definizione del sottogruppo negativo all'AFP e per il confronto con la pratica routinaria. Le soglie ottimizzate di AFP utilizzate nell'analisi ROC sono state etichettate separatamente rispetto alla soglia clinica. Le soglie sono state pertanto riportate in base allo scopo analitico e non considerate soglie intercambiabili.
Prestazioni, calibrazione e validazione del modello
La discriminazione è stata valutata mediante curve caratteristiche operative del ricevitore e area sotto la curva. Le AUC sono state riportate con intervalli di confidenza al 95%. Il confronto tra AUC ha utilizzato il test di DeLong. Le prestazioni della classificazione sono state riportate come sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo e accuratezza a cutoff predeterminati.
La calibrazione è stata valutata mediante intercetta di calibrazione, pendenza della calibrazione, punteggio di Brier e test di adattamento di Hosmer–Lemeshow. I grafici di calibrazione hanno confrontato le probabilità previste e osservate di HCC tra i diversi gruppi di rischio. La validazione interna ha utilizzato 1.000 ricampionamenti bootstrap nella coorte di addestramento per stimare l'AUC corretta per l'ottimismo e la pendenza della calibrazione corretta per l'ottimismo. La coorte di validazione è stata utilizzata esclusivamente per la valutazione delle prestazioni esterne. Nessun aggiornamento dei coefficienti, riparametrazione del modello, riottimizzazione delle soglie o ricalibrazione basata su sottogruppi è stato effettuato nella coorte di validazione.
L'utilità clinica è stata valutata mediante l'analisi della curva decisionale in un intervallo di probabilità soglia compreso tra 0,05 e 0,50. Il beneficio netto è stato confrontato per AFP singola, PIVKA-II singola, il modello basato sulle variabili cliniche e il modello combinato.
Gestione dei dati mancanti e analisi di sensibilità
L'analisi primaria ha utilizzato un modello basato sui casi completi per i partecipanti con tutte le variabili incluse nel modello finale. I valori mancanti sono stati riassunti per ciascun predittore candidato. Se la percentuale di dati mancanti superava il 5% per qualsiasi predittore incluso, è stata eseguita un'analisi di sensibilità mediante imputazione multipla tramite equazioni concatenate, utilizzando l'esito, tutti i predittori inclusi e l'indicatore della coorte nel modello di imputazione. Le variabili con una percentuale di dati mancanti superiore al 20% non sono state considerate idonee per la modellizzazione multivariata. I coefficienti del modello, l'AUC, la pendenza di calibrazione e le metriche di classificazione ottenute dall'analisi con dati imputati sono stati confrontati con i risultati ottenuti dai casi completi.
Software e reporting riproducibile
Tutte le analisi sono state eseguite utilizzando R versione 4.3.2 e RStudio versione 2023.12.1. La regressione logistica è stata effettuata utilizzando il pacchetto stats base. L'analisi ROC e i confronti secondo DeLong sono stati eseguiti utilizzando pROC versione 1.18.5. L'analisi di calibrazione è stata condotta utilizzando rms versione 6.7-1 e ResourceSelection versione 0.3-6. La validazione con bootstrap ha utilizzato 1.000 ricampionamenti con un seme casuale fisso pari a 70558. L'analisi della curva decisionale è stata eseguita utilizzando rmda versione 1.6. L'imputazione multipla, se necessaria, è stata effettuata utilizzando mice versione 3.16.0. Lo script di analisi ha riprodotto il flusso dei partecipanti, i coefficienti del modello, le curve ROC, le metriche di calibrazione, la validazione bootstrap, l'analisi della curva decisionale, le analisi basate su soglie e le tabelle statistiche.
Risultati
Caratteristiche alla baseline
L'analisi finale ha incluso 389 partecipanti. Il gruppo di addestramento comprendeva 205 partecipanti, di cui 112 casi di carcinoma epatocellulare (HCC) confermati mediante imaging e 93 controlli senza HCC. Il gruppo di validazione comprendeva 184 partecipanti, di cui 58 casi di HCC confermati mediante imaging e 126 controlli senza HCC. Le caratteristiche basali sono riassunte nella Tabella 1.
Nel gruppo di addestramento, i 93 controlli senza HCC includevano 30 controlli sani e 63 controlli con malattia epatica cronica. Nel gruppo di convalida, i 126 controlli senza HCC includevano 0 controlli sani e 126 controlli con malattia epatica cronica. L'infezione da virus dell'epatite B era la malattia epatica di base predominante. I casi di malattia BCLC 0–A rappresentavano 57 dei 112 casi di HCC nel gruppo di addestramento e 30 dei 58 casi di HCC nel gruppo di convalida. Età, sesso, anamnesi di malattia epatica, storia familiare di HCC, stato di cirrosi, classe Child-Pugh, alanina aminotransferasi, aspartato aminotransferasi, albumina, bilirubina totale, conta piastrinica, tempo di protrombina, rapporto normalizzato internazionale, diabete e ipertensione erano bilanciati tra le stratificazioni dei gruppi riportate nella Tabella 1.
L'AFP mediana era di 57,3 ng/mL nei casi di CHC del gruppo di addestramento e di 22,4 ng/mL nei controlli non CHC del gruppo di addestramento. La PIVKA-II mediana era rispettivamente di 197,6 mAU/mL e 86,3 mAU/mL. Nel gruppo di validazione, l'AFP mediana era di 60,2 ng/mL nei casi di CHC e di 21,5 ng/mL nei controlli non CHC. La PIVKA-II mediana era rispettivamente di 191,5 mAU/mL e 84,1 mAU/mL.
Prestazioni diagnostiche del gruppo di addestramento
La discriminazione nel gruppo di addestramento è mostrata nella Figura 2(A), e il corrispondente confronto tra sensibilità e specificità è mostrato nella Figura 2(B). Le caratteristiche operative sono riassunte nella Tabella 2. L'AFP presentava un AUC di 0,78, una sensibilità del 62,50% e un'accuratezza del 78,49% al cutoff clinico stabilito di 20,0 ng/mL. La PIVKA-II presentava un AUC di 0,85, una sensibilità del 78,57% e un'accuratezza dell'82,80% al cutoff di Youden determinato per il gruppo di addestramento di 45,0 mAU/mL. Il modello basato sulle variabili cliniche presentava un AUC di 0,81, una sensibilità del 69,64% e un'accuratezza dell'80,65% a una soglia di probabilità predetta di 0,40. Il modello combinato mostrava la discriminazione più elevata nel gruppo di addestramento, con un AUC di 0,93, una sensibilità dell'88,39% e un'accuratezza dell'89,25% a una soglia di probabilità predetta di 0,50.
Prestazioni stratificate per stadio
Le distribuzioni dei biomarcatori stratificati per stadio sono mostrate nella Figura 3(A), i tassi di rilevamento nella Figura 3(B) e le AUC specifiche per stadio nella Figura 3(C). AFP, PIVKA-II e il punteggio del modello combinato sono aumentati attraverso gli stadi di malattia BCLC 0–A, B e C. AFP ha mostrato un sovrapposizione tra il carcinoma epatocellulare in stadio precoce e i controlli non HCC. PIVKA-II ha mostrato una separazione più netta tra i diversi strati di stadio. Il modello combinato ha prodotto la discriminazione più elevata stratificata per stadio, inclusi i casi di HCC BCLC 0–A.
Complementarità tra AFP e PIVKA-II
Le correlazioni tra marcatori e punteggi sono mostrate in Figura 4(A)-(C)e la classificazione incrociata dei marcatori è mostrata in Figura 4(D)AFP e PIVKA-II hanno mostrato un parziale mancato sovrapporsi. Sono stati osservati sia casi di carcinoma epatocellulare AFP-positivo/PIVKA-II-negativo sia casi AFP-negativo/PIVKA-II-positivo. Il modello combinato ha classificato come ad alto rischio ulteriori casi di carcinoma epatocellulare negativi per un singolo marcatore, sostenendo l'uso del punteggio integrato piuttosto che di ciascun biomarcatore preso singolarmente.
Validazione esterna
Le curve ROC della coorte di validazione sono mostrate in Figura 5(A), la calibrazione è mostrata in Figura 5(B) e i modelli di sensibilità e specificità per sottogruppo sono mostrati in Figura 5(C). Le corrispondenti metriche di validazione sono riassunte in Tabella 3. In tutti i casi di HCC validati, l'AFP ha mostrato un AUC di 0,75, una sensibilità del 62,1% e una specificità dell'88,9% a 18,5 ng/mL. La PIVKA-II ha mostrato un AUC di 0,78, una sensibilità del 72,4% e una specificità del 91,3% a 38,0 mAU/mL. Il modello combinato ha mostrato un AUC di 0,89, una sensibilità dell'84,5%, una specificità del 90,5%, un valore predittivo positivo del 78,8% e un valore predittivo negativo del 94,1% a una soglia di probabilità predetta di 0,56.
Nel carcinoma epatocellulare in stadio precoce, l'AFP presentava una sensibilità del 45,5% e una specificità dell'88,9%, la PIVKA-II aveva una sensibilità del 59,1% e una specificità del 91,3%, mentre il modello combinato mostrava una sensibilità del 72,7% e una specificità del 90,5%. Nel carcinoma epatocellulare AFP-negativo, la sensibilità dell'AFP era del 23,1%, quella della PIVKA-II del 61,5% e quella del modello combinato del 73,1%. Nel carcinoma epatocellulare virale, il modello combinato presentava una sensibilità dell'85,3% e una specificità del 91,3%. Nel carcinoma epatocellulare non virale, il modello combinato aveva una sensibilità dell'83,3% e una specificità dell'89,7%. L'intercetta di calibrazione nel gruppo di validazione era -0,08, la pendenza della calibrazione era 0,91, il punteggio di Brier era 0,118 e il valore P di Hosmer–Lemeshow era 0,64.
Regressione multivariata e validazione interna
I risultati della regressione multivariata sono mostrati nella Tabella 4. Nel modello aggiustato, la PIVKA-II trasformata in logaritmo è rimasta il predittore indipendente più forte, con un'odds ratio aggiustata di 2,05, IC 95%: 1,48-2,89 e P < 0,001. Anche l'AFP trasformata in logaritmo era indipendentemente associata al carcinoma epatocellulare (HCC), con un'odds ratio aggiustata di 1,28, IC 95%: 1,05-1,62 e P = 0,021. Il rapporto normalizzato internazionale ha mantenuto un valore predittivo indipendente, con un'odds ratio aggiustata di 1,74, IC 95%: 1,12-2,78 e P = 0,015. Il modello finale ottenuto con selezione all'indietro ha mantenuto ln(AFP), ln(PIVKA-II), età, sesso, albumina, rapporto normalizzato internazionale e conta piastrinica.
Le metriche di validazione interna bootstrap sono riportate anche nella Tabella 4. L'AUC di addestramento apparente era 0,93, l'ottimismo medio era 0,018 e l'AUC corretto per l'ottimismo era 0,91. La pendenza di calibrazione apparente era 1,00, la pendenza di calibrazione corretta per l'ottimismo era 0,94, il punteggio Brier del cohort di addestramento era 0,104 e il valore P di Hosmer–Lemeshow era 0,72.
Verifica della soglia e prestazioni specifiche per soglia
Poiché le soglie della PIVKA-II variavano in base allo scopo analitico, i risultati basati sulle soglie sono stati riportati separatamente piuttosto che considerati intercambiabili. Le prestazioni della soglia ottimizzata post hoc tramite il metodo di Youden sono mostrate nella Tabella 5. L’AFP presentava una soglia ottimizzata con il metodo di Youden di 19,0 ng/mL, con una sensibilità del 67,9%, specificità dell’89,1%, valore predittivo positivo del 71,3%, valore predittivo negativo dell’87,3%, accuratezza dell’81,2% e AUC di 0,78. La PIVKA-II presentava una soglia ottimizzata con il metodo di Youden di 37,5 mAU/mL, con una sensibilità del 75,4%, specificità del 92,0%, valore predittivo positivo del 79,8%, valore predittivo negativo dell’89,7%, accuratezza dell’85,9% e AUC di 0,82. Il modello combinato presentava una soglia ottimizzata di probabilità predetta, calcolata con il metodo di Youden, di 0,57, con una sensibilità dell’86,2%, specificità del 90,6%, valore predittivo positivo dell’82,7%, valore predittivo negativo del 92,4%, accuratezza dell’89,8% e AUC di 0,90.
Le prestazioni ottenute utilizzando i cutoff clinici stabiliti sono riportate nella Tabella 6. Al valore cutoff stabilito per AFP di 20,0 ng/mL, l'AFP ha mostrato una sensibilità del 65,2%, una specificità dell'88,5%, un valore predittivo positivo del 70,1%, un valore predittivo negativo dell'86,0%, un'accuratezza dell'80,3% e un AUC di 0,77. Al valore cutoff stabilito per PIVKA-II di 40,0 mAU/mL, PIVKA-II ha presentato una sensibilità del 73,0%, una specificità del 93,1%, un valore predittivo positivo dell'81,8%, un valore predittivo negativo dell'89,0%, un'accuratezza dell'85,6% e un AUC di 0,82. A un valore soglia di probabilità predetta di 0,60, il modello combinato ha mostrato una sensibilità dell'83,5%, una specificità del 92,0%, un valore predittivo positivo dell'84,7%, un valore predittivo negativo del 91,2%, un'accuratezza dell'88,9% e un AUC di 0,89.
Le prestazioni al valore soglia più vicino al 90% di specificità sono mostrate nella Tabella 7. Per l'AFP è stato utilizzato un valore soglia di 19,0 ng/mL, con una sensibilità del 67,9% e un'accuratezza del 89,1%. Per il PIVKA-II è stato utilizzato un valore soglia di 37,5 mAU/mL, con una sensibilità del 75,4% e un'accuratezza del 92,0%. Il modello combinato ha utilizzato un valore soglia di probabilità predetta pari a 0,57, con una sensibilità dell'86,2% e un'accuratezza del 90,6%. Questi risultati dell'analisi dei valori soglia spiegano le differenze numeriche tra le soglie di PIVKA-II di 37,5, 38,0, 40,0 e 45,0 mAU/mL: 45,0 mAU/mL corrispondeva al valore soglia di Youden nel gruppo di addestramento, utilizzato per il confronto primario nell'addestramento; 38,0 mAU/mL è stato impiegato per la presentazione della specificità fissa nella fase di validazione; 40,0 mAU/mL era il valore soglia clinico stabilito; e 37,5 mAU/mL era il valore soglia di Youden ottimizzato a posteriori nella tabella di analisi dei valori soglia.
Distribuzioni per sottogruppo di malattia
Le distribuzioni per sottogruppo di malattia di AFP, PIVKA-II e del punteggio del modello combinato sono mostrate nella Figura 6(A)-(C). AFP, PIVKA-II e il punteggio del modello combinato erano più bassi nei controlli con malattia epatica cronica e più alti nei gruppi con HCC. AFP mostrava un'area di sovrapposizione tra i controlli con malattia epatica cronica e l'HCC in stadio precoce. PIVKA-II e il punteggio del modello combinato mostravano una separazione più netta tra controlli con malattia epatica cronica, HCC in stadio precoce e HCC in tutti gli stadi.
DISPONIBILITÀ DEI DATI:
Il set di dati a supporto dei risultati di questo studio è disponibile liberamente su Figshare all'indirizzo https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33048095.v1.
Figura 1: Flusso dei partecipanti, assegnazione dei gruppi, lavorazione dei campioni e valutazione diagnostica. Diagramma di flusso che illustra lo screening dei partecipanti, l'assegnazione ai gruppi, il prelievo di sangue prima dell'imaging, la lavorazione del plasma, la misurazione di AFP/PIVKA-II, la valutazione con TC/RMN con mezzo di contrasto e la valutazione finale dell'HCC basata sull'imaging nei gruppi di addestramento e di validazione. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Prestazioni diagnostiche nel gruppo di addestramento di AFP, PIVKA-II, del modello basato sulle variabili cliniche e del modello combinato. (A) Curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) che confrontano AFP, PIVKA-II, il modello basato sulle variabili cliniche e il modello multivariabile combinato nel gruppo di addestramento. (B) Sensibilità e specificità di ciascun metodo diagnostico alla soglia riportata per il gruppo di addestramento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le corrispondenti caratteristiche operative sono riassunte nella Tabella 2.
Figura 3: Prestazioni diagnostiche stratificate per stadio nei diversi stadi BCLC. (A) Distribuzioni di AFP, PIVKA-II e del punteggio del modello combinato nei controlli senza carcinoma epatocellulare e nei gruppi per stadio BCLC. (B) Tassi di rilevamento di AFP, PIVKA-II e del modello combinato nei diversi stadi BCLC. (C) AUC specifici per stadio per AFP, PIVKA-II e il modello combinato, inclusi i casi di carcinoma epatocellulare allo stadio BCLC 0–A. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Correlazione e complementarità tra AFP, PIVKA-II e il punteggio del modello combinato. (A) Correlazione tra AFP e il punteggio del modello combinato. (B) Correlazione tra PIVKA-II e il punteggio del modello combinato. (C) Correlazione tra AFP e PIVKA-II. (D) Classificazione incrociata dei casi di HCC in base allo stato di AFP, allo stato di PIVKA-II e alla classificazione del rischio secondo il modello combinato. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Validazione esterna delle prestazioni diagnostiche nella coorte di validazione indipendente. (A) Curve caratteristiche operative del ricevitore (ROC) della coorte di validazione per AFP, PIVKA-II e il modello combinato. (B) Grafico di calibrazione del modello combinato nella coorte di validazione. (C) Confronto tra sensibilità e specificità di AFP, PIVKA-II e del modello combinato in tutti i casi di HCC, negli stadi precoci di HCC e nei casi di HCC negativi per AFP. Le metriche di validazione corrispondenti sono riassunte nella Tabella 3. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Distribuzioni per sottogruppo di malattia di AFP, PIVKA-II e del punteggio del modello combinato. (A) Distribuzione dell'AFP nei controlli con malattia epatica cronica, nei pazienti con carcinoma epatocellulare allo stadio BCLC 0–A e in tutti gli stadi del carcinoma epatocellulare. (B) Distribuzione del PIVKA-II nei controlli con malattia epatica cronica, nei pazienti con carcinoma epatocellulare allo stadio BCLC 0–A e in tutti gli stadi del carcinoma epatocellulare. (C) Distribuzione del punteggio del modello combinato nei controlli con malattia epatica cronica, nei pazienti con carcinoma epatocellulare allo stadio BCLC 0–A e in tutti gli stadi del carcinoma epatocellulare. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Fattore | Categoria / Riassunto | Formazione sul carcinoma epatocellulare n = 112 | Addestramento dei controlli non HCC n = 93 | Convalida HCC n = 58 | Controllo di convalida non HCC n = 126 | P valore |
| Sesso, n (%) | Maschio | 76 (67.9%) | 59 (63.4%) | 39 (67.2%) | 76 (60.3%) | 0.374 |
| Femmina | 36 (32.1%) | 34 (36.6%) | 19 (32.8%) | 50 (39.7%) | — | |
| Età, anni | Media ± DS | 58.9 ± 9.3 | 58.1 ± 10.4 | 59.4 ± 8.8 | 57.6 ± 9.7 | 0.281 |
| Anamnesi di malattia epatica, n (%) | HBV | 84 (75.0%) | 64 (68.8%) | 42 (72.4%) | 83 (65.9%) | 0.332 |
| HCV | 6 (5.4%) | 5 (5.4%) | 3 (5.2%) | 7 (5.6%) | 0.914 | |
| Malattia epatica alcolica | 13 (11.6%) | 10 (10.8%) | 6 (10.3%) | 12 (9.5%) | 0.825 | |
| Anamnesi familiare di carcinoma epatocellulare, n (%) | Sì | 9 (8.0%) | 7 (7.5%) | 4 (6.9%) | 8 (6.3%) | 0.887 |
| Cirrosi epatica, n (%) | Sì | 80 (71.4%) | 61 (65.6%) | 42 (72.4%) | 88 (69.8%) | 0.468 |
| Stadio del carcinoma epatocellulare (BCLC), n (%) | 0–A | 57 (50.9%) | — | 30 (51.7%) | — | — |
| B | 33 (29.5%) | — | 17 (29.3%) | — | — | |
| C | 22 (19.6%) | — | 11 (19.0%) | — | — | |
| Classe di Child–Pugh, n (%) | A | 85 (75.9%) | 77 (82.8%) | 43 (74.1%) | 101 (80.2%) | 0.341 |
| B | 27 (24.1%) | 16 (17.2%) | 15 (25.9%) | 25 (19.8%) | — | |
| ALT, U/L | Media ± DS | 48.6 ± 22.1 | 47.1 ± 20.6 | 47.9 ± 22.4 | 45.2 ± 20.1 | 0.517 |
| AST, U/L | Media ± DS | 60.3 ± 28.5 | 58.0 ± 27.8 | 58.7 ± 29.4 | 56.2 ± 26.9 | 0.488 |
| Albumina, g/L | Media ± DS | 39.0 ± 4.7 | 39.5 ± 4.6 | 38.7 ± 5.1 | 39.6 ± 4.5 | 0.554 |
| bilirubina totale, μmol/L | Media ± DS | 20.1 ± 11.3 | 18.6 ± 10.8 | 20.4 ± 11.6 | 18.1 ± 10.9 | 0.321 |
| Numero di piastrine, ×10⁹/L | Media ± DS | 137 ± 61 | 146 ± 59 | 134 ± 60 | 149 ± 57 | 0.437 |
| Tempo di protrombina, s | Media ± DS | 13.7 ± 1.4 | 13.5 ± 1.3 | 13.8 ± 1.5 | 13.5 ± 1.2 | 0.411 |
| INR | Media ± DS | 1.18 ± 0.12 | 1.16 ± 0.11 | 1.19 ± 0.13 | 1.15 ± 0.10 | 0.334 |
| AFP, ng/mL | Mediana (IQR) | 57.3 (19.8–135.1) | 22.4 (10.4–46.0) | 60.2 (20.6–131.7) | 21.5 (9.8–48.1) | 0.071 |
| PIVKA-II, mAU/mL | Mediana (IQR) | 197.6 (83.1–438.2) | 86.3 (38.6–131.2) | 191.5 (81.4–422.5) | 84.1 (37.1–129.4) | 0.064 |
| PT prolungato, n (%) | Sì | 30 (26.8%) | 20 (21.5%) | 15 (25.9%) | 24 (19.0%) | 0.372 |
| Diabete, n (%) | Sì | 19 (17.0%) | 14 (15.1%) | 10 (17.2%) | 19 (15.1%) | 0.764 |
| Ipertensione, n (%) | Sì | 33 (29.5%) | 26 (28.0%) | 18 (31.0%) | 36 (28.6%) | 0.824 |
| Tipo di controllo tra i controlli non HCC, n (%) | Controlli sani | — | 30 (32.3%) | — | 0 (0.0%) | — |
| Controlli per malattia epatica cronica | — | 63 (67.7%) | — | 126 (100.0%) | — | |
| Nota: HCC, carcinoma epatocellulare; BCLC, Barcelona Clinic Liver Cancer; ALT, alanina aminotransferasi; AST, aspartato aminotransferasi; INR, rapporto normalizzato internazionale; AFP, alfa-fetoproteina; PIVKA-II, proteina indotta dall'assenza di vitamina K-II; PT, tempo di protrombina; IQR, intervallo interquartile. I valori P sono riportati per i confronti alla baseline tra le categorie della coorte o dello stato, ove applicabile. Lo stadio di HCC è stato riportato solo per i casi di HCC. Il tipo di controllo è stato riportato solo per i controlli senza HCC. | ||||||
Tabella 1: Caratteristiche di base delle coorti di addestramento e di validazione. Le caratteristiche demografiche, il contesto di malattia epatica, lo stadio del carcinoma epatocellulare (HCC), la classe Child-Pugh, gli indici di laboratorio di routine, l'AFP e la PIVKA-II sono riportati per coorte e per stato di HCC.
| Metodo | Sensibilità (IC 95%) | Specificità (IC 95%) | AUC (IC 95%) | Soglia |
| AFP | 62,50 (53,41–71,06) | 78,49 (69,07–86,04) | 0,78 (0,72–0,84) | 20,0 ng/mL |
| PIVKA-II | 78,57 (70,29–85,37) | 82,80 (73,95–89,61) | 0,85 (0,80–0,90) | 45,0 mAU/mL |
| Modello basato su variabili cliniche | 69,64 (60,28–77,87) | 80,65 (71,13–88,04) | 0,81 (0,75–0,87) | Probabilità predetta = 0,40 |
| Modello combinato | 88,39 (81,35–93,36) | 89,25 (81,26–94,65) | 0,93 (0,89–0,96) | Probabilità predetta = 0,50 |
| Nota: AFP è stato valutato al cutoff clinico stabilito di 20,0 ng/mL. La soglia di PIVKA-II di 45,0 mAU/mL corrisponde al cutoff di Youden ottenuto nel gruppo di addestramento, utilizzato per il confronto primario nell'addestramento. I modelli basati su variabili cliniche e quello combinato sono stati valutati utilizzando soglie di probabilità predetta derivate dal gruppo di addestramento. | ||||
Tabella 2: Prestazioni diagnostiche nel gruppo di addestramento. Sono riportati AUC, sensibilità, specificità e soglie indicate per AFP, PIVKA-II, il modello basato su variabili cliniche e il modello multivariabile combinato nel gruppo di addestramento.
| Sottogruppo | Voce | AFP | PIVKA-II | Modello Combinato |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | AUC | 0.75 | 0.78 | 0.89 |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | Soglia di validazione primaria | 18,5 ng/mL | 38,0 mAU/mL | Probabilità prevista = 0,56 |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | Sensibilità, % (IC 95%) | 62,1 (48,7–74,2) | 72,4 (59,1–83,5) | 84,5 (72,6–92,6) |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | Specificità, % (IC 95%) | 88,9 (82,0–93,4) | 91,3 (85,1–95,3) | 90,5 (84,2–94,8) |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | Valore predittivo positivo (PPV), % | 63,8 | 72,7 | 78,8 |
| Tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) | Valore predittivo negativo (NPV), % | 88,1 | 91 | 94,1 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) in fase precoce | Soglia esplorativa del sottogruppo | 15,2 ng/mL | 33,5 mAU/mL | Probabilità prevista = 0,51 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) in fase precoce | Sensibilità, % (IC 95%) | 45,5 (25,1–67,3) | 59,1 (38,5–77,7) | 72,7 (52,0–87,6) |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) in fase precoce | Specificità, % | 88,9 | 91,3 | 90,5 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) in fase precoce | Valore predittivo positivo (PPV), % | 40 | 54,5 | 66,7 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) in fase precoce | Valore predittivo negativo (NPV), % | 90,1 | 87,5 | 92,3 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP | Soglia esplorativa del sottogruppo | 7,5 ng/mL | 31,2 mAU/mL | Probabilità prevista = 0,48 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP | Sensibilità, % (IC 95%) | 23,1 (9,7–42,6) | 61,5 (40,6–79,8) | 73,1 (52,2–88,4) |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP | Specificità, % | 88,9 | 91,3 | 90,5 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP | Valore predittivo positivo (PPV), % | 22 | 52 | 64,5 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP | Valore predittivo negativo (NPV), % | 90,2 | 88,3 | 92,7 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) virale | Soglia esplorativa del sottogruppo | 19,3 ng/mL | 40,7 mAU/mL | Probabilità prevista = 0,59 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) virale | Sensibilità, % (IC 95%) | 64,7 (46,9–79,9) | 73,5 (56,4–86,4) | 85,3 (69,9–94,7) |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) virale | Specificità, % | 88,1 | 90,5 | 91,3 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) virale | Valore predittivo positivo (PPV), % | 67,3 | 73 | 81,3 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) virale | Valore predittivo negativo (NPV), % | 87,5 | 90,8 | 94,7 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) non virale | Soglia esplorativa del sottogruppo | 20,1 ng/mL | 34,5 mAU/mL | Probabilità prevista = 0,53 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) non virale | Sensibilità, % (IC 95%) | 58,3 (36,6–77,9) | 70,8 (48,9–87,4) | 83,3 (62,6–95,3) |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) non virale | Specificità, % | 89,2 | 92,1 | 89,7 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) non virale | Valore predittivo positivo (PPV), % | 59,2 | 69,7 | 75 |
| Caricinoma epatocellulare (HCC) non virale | Valore predittivo negativo (NPV), % | 89 | 92 | 93,8 |
| Calibrazione del modello combinato | Intercetta | — | — | −0,08 |
| Calibrazione del modello combinato | Pendenza | — | — | 0,91 |
| Calibrazione del modello combinato | Punteggio di Brier | — | — | 0,118 |
| Calibrazione del modello combinato | Valore P di Hosmer–Lemeshow | — | — | 0,64 |
| Nota: La riga relativa a tutto il carcinoma epatocellulare (HCC) riporta l'analisi primaria di validazione. Le righe relative ai sottogruppi in fase precoce, negativi per AFP, virali e non virali riportano le prestazioni esplorative. Le soglie dei sottogruppi sono state riportate per descrivere i punti operativi apparenti all'interno di ciascun sottogruppo e non sono state utilizzate per il riadattamento o la ricalibrazione del modello. Il carcinoma epatocellulare (HCC) negativo per AFP è stato definito come AFP <20,0 ng/mL. PPV, valore predittivo positivo; NPV, valore predittivo negativo. | ||||
Tabella 3: Prestazioni diagnostiche nella coorte di validazione e analisi per sottogruppi. Sono riportati AUC, soglie, sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e valore predittivo negativo per AFP, PIVKA-II e il modello combinato in tutti i casi di HCC, HCC in stadio precoce, HCC negativo per AFP, HCC virale e HCC non virale. Sono inclusi anche i parametri di calibrazione per il modello combinato.
| Fattore / metrica | Valore P univariato | Coefficiente β | OR aggiustata / metrica di validazione | IC 95% | Valore P |
| Intercetta | — | −4.862 | — | — | — |
| Età | 0,112 | 0,018 | 1,02 | 0,99–1,05 | 0,186 |
| Sesso, maschio | 0,087 | 0,331 | 1,41 | 0,83–2,37 | 0,204 |
| AFP, trasformata in logaritmo naturale | 0,004 | 0,247 | 1,28 | 1,05–1,62 | 0,021 |
| PIVKA-II, trasformata in logaritmo naturale | <0,001 | 0,712 | 2,05 | 1,48–2,89 | <0,001 |
| Albumina, g/L | 0,008 | −0,062 | 0,94 | 0,89–0,99 | 0,032 |
| INR | 0,012 | 0,554 | 1,74 | 1,12–2,78 | 0,015 |
| Conteggio piastrinico, ×109/L | 0,052 | −0,004 | 0,99 | 0,98–1,00 | 0,044 |
| AUC di addestramento apparente | — | — | 0,93 | 0,89–0,96 | — |
| Media dell'ottimismo | — | — | 0,018 | — | — |
| AUC corretta per l'ottimismo | — | — | 0,91 | 0,87–0,95 | — |
| Pendenza di calibrazione apparente | — | — | 1 | — | — |
| Pendenza di calibrazione corretta per l'ottimismo | — | — | 0,94 | — | — |
| Punteggio di Brier nell'insieme di addestramento | — | — | 0,104 | — | — |
| Valore P di Hosmer–Lemeshow | — | — | 0,72 | — | — |
| Nota: Il predittore lineare finale era η = −4,862 + 0,247 × ln(AFP) + 0,712 × ln(PIVKA-II) + 0,018 × età + 0,331 × sesso − 0,062 × albumina + 0,554 × INR − 0,004 × conteggio piastrinico. La probabilità predetta è stata calcolata come p(HCC) = 1 / [1 + exp(−η)]. L'AFP è stata misurata in ng/mL; la PIVKA-II in mAU/mL; l'età in anni; il sesso è stato codificato come femmina = 0 e maschio = 1; l'albumina in g/L; l'INR come valore senza unità; e il conteggio piastrinico come ×10⁹/L. | |||||
Tabella 4: Regressione logistica multivariata e validazione interna con bootstrap. Vengono mostrati i valori P univariati, i coefficienti del modello aggiustati, le odds ratio aggiustate, gli intervalli di confidenza al 95%, e i valori P multivariati per le variabili valutate nel modello del gruppo di addestramento. Sono riportati l'ottimismo del bootstrap, l'AUC corretta per l'ottimismo, la pendenza di calibrazione corretta per l'ottimismo, il punteggio di Brier e i risultati del test di Hosmer–Lemeshow.
Tabella 5: Prestazioni diagnostiche utilizzando cutoff ottimizzati con l'indice di Youden. Sono riportati sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo, accuratezza e AUC per AFP, PIVKA-II e il modello combinato, utilizzando cutoff basati sull'indice di Youden.
| Metodo | Valore soglia stabilito | Sensibilità, % (IC 95%) | Specificità, % (IC 95%) | Valore predittivo positivo, % (IC 95%) | Valore predittivo negativo, % (IC 95%) | Precisione, % (IC 95%) | AUC (IC 95%) |
| AFP | 20,0 ng/mL | 65,2 (57,0–72,7) | 88,5 (83,4–92,3) | 70,1 (61,8–77,4) | 86,0 (80,7–90,3) | 80,3 (75,0–84,8) | 0,77 (0,72–0,82) |
| PIVKA-II | 40,0 mAU/mL | 73,0 (65,2–79,8) | 93,1 (88,8–96,0) | 81,8 (74,2–87,7) | 89,0 (83,9–92,8) | 85,6 (80,9–89,5) | 0,82 (0,78–0,86) |
| Modello combinato | Probabilità predetta = 0,60 | 83,5 (76,6–89,0) | 92,0 (87,4–95,3) | 84,7 (77,9–90,0) | 91,2 (86,3–94,6) | 88,9 (84,6–92,2) | 0,89 (0,86–0,93) |
| Nota: I valori soglia clinici stabiliti erano AFP 20,0 ng/mL e PIVKA-II 40,0 mAU/mL. Il modello combinato è stato riportato al corrispondente valore soglia di probabilità predeterminato utilizzato per questo confronto con i valori soglia clinici. | |||||||
Tabella 6: Prestazioni diagnostiche utilizzando cutoff clinici stabiliti. Sono mostrati sensibilità, specificità, valore predittivo positivo, valore predittivo negativo, accuratezza e AUC utilizzando il cutoff stabilito per AFP di 20,0 ng/mL e il cutoff stabilito per PIVKA-II di 40,0 mAU/mL. Il modello combinato è riportato al corrispondente valore soglia di probabilità utilizzato per questo confronto tra cutoff.
| Metodo | Valore soglia più vicino al 90% di specificità | Sensibilità, % (IC 95%) | Specificità, % (IC 95%) | Valore predittivo positivo, % (IC 95%) | Valore predittivo negativo, % (IC 95%) |
| AFP | 19.0 ng/mL | 67.9 (59.1–75.7) | 89.1 (84.2–92.8) | 71.3 (62.4–79.0) | 87.3 (82.1–91.2) |
| PIVKA-II | 37.5 mAU/mL | 75.4 (67.3–82.2) | 92.0 (87.7–95.1) | 79.8 (71.6–86.3) | 89.7 (84.7–93.3) |
| Modello combinato | Probabilità predetta = 0.57 | 86.2 (79.3–91.3) | 90.6 (85.8–94.0) | 82.7 (74.8–88.7) | 92.4 (87.9–95.4) |
| Nota: Questi valori soglia sono stati scelti per ottenere una specificità il più vicina possibile al 90% nell'analisi di verifica della soglia. Per il PIVKA-II, 37.5 mAU/mL è il valore soglia di Youden e prossimo alla specificità del 90% in questa verifica; 38.0 mAU/mL è la soglia primaria di validazione riportata nella Tabella 3; 40.0 mAU/mL è il valore soglia clinico consolidato; e 45.0 mAU/mL è il valore soglia di Youden del cohort di addestramento utilizzato nella Tabella 2. | |||||
Tabella 7: Prestazioni diagnostiche al valore soglia più vicino al 90% di specificità. Sono riportate sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e valore predittivo negativo per AFP, PIVKA-II e per il modello combinato, a soglie selezionate per ottenere un'accuratezza specifica più vicina al 90%.
Discussione
Questo studio ha valutato una strategia diagnostica integrata per il carcinoma epatocellulare (HCC) basata su PIVKA-II, AFP e variabili cliniche di routine, con particolare attenzione alle forme in stadio precoce e ai casi negativi per AFP14. Nei gruppi di addestramento e di validazione, il modello combinato ha superato il test con singolo marcatore. Nel gruppo di addestramento, il modello combinato ha raggiunto un AUC di 0,93, rispetto a 0,78 per AFP e 0,85 per PIVKA-II. Nel gruppo di validazione indipendente, il modello ha mantenuto un'elevata capacità discriminatoria, con un AUC di 0,89, una sensibilità dell'84,5% e una specificità del 90,5%. Questi risultati sostengono un approccio basato su modelli in cui segnali clinici e biomarcatori complementari vengono interpretati congiuntamente, piuttosto che basare le decisioni diagnostiche su una singola soglia sierica.
I risultati della validazione chiariscono il valore aggiunto di PIVKA-II, specialmente nei casi in cui AFP ha una bassa affidabilità. La sensibilità di AFP è stata del 62,1% in tutti i casi di carcinoma epatocellulare (HCC) della coorte di validazione ed è scesa al 23,1% nei casi di HCC AFP-negativo. PIVKA-II ha mostrato una sensibilità complessiva più elevata, mantenendo una sensibilità del 61,5% nei casi di malattia AFP-negativa. Il modello combinato ha ulteriormente migliorato la sensibilità, portandola al 73,1% nei casi di HCC AFP-negativo e al 72,7% nei casi di HCC in stadio precoce, mantenendo al contempo un’elevata specificità. Questo andamento è coerente con le evidenze precedenti che indicano come PIVKA-II fornisca informazioni diagnostiche in parte distinte rispetto ad AFP, in particolare nei tumori con bassi livelli di AFP e nei tumori allo stadio iniziale15,16,17. Anche le analisi di correlazione e di classificazione incrociata supportano questa interpretazione, dimostrando che AFP e PIVKA-II non sono marcatori intercambiabili e che il punteggio integrato permette di identificare ulteriori casi non rilevati dalla classificazione basata su un singolo marcatore.
I risultati multivariabili indicano che il miglioramento ottenuto dal modello combinato non è stato determinato soltanto dall'aggiunta congiunta di AFP e PIVKA-II. Le variabili cliniche hanno fornito ulteriore contesto relativo all'età, al sesso, alla riserva epatica, allo stato di coagulazione e al conteggio piastrinico. Questo approccio è coerente con modelli multivariabili consolidati per il rischio di carcinoma epatocellulare (HCC), come GALAD, GAAD e altri punteggi basati su biomarcatori, che combinano variabili demografiche e di laboratorio per migliorare le prestazioni diagnostiche in popolazioni eterogenee con malattia epatica18,19,20. Nel modello aggiustato, il valore di PIVKA-II sottoposto a trasformazione logaritmica è rimasto il predittore indipendente più forte, l'AFP trasformata in scala logaritmica ha mantenuto un'associazione indipendente, e l'INR ha contribuito un segnale diagnostico aggiuntivo. Le aminotransferasi si sono rivelate meno informative dopo l'aggiustamento, suggerendo che l'infiammazione epatica aspecifica non è stata il principale fattore discriminante una volta considerati i marcatori associati al tumore e quelli legati alla coagulazione.
Le analisi dei valori soglia affrontano un punto importante sollevato durante la revisione. Le diverse soglie di PIVKA-II non devono essere interpretate come valori soglia primari contrastanti. Il valore di 45,0 mAU/mL è stato utilizzato per il confronto ROC nel gruppo di addestramento, 40,0 mAU/mL rappresentava la soglia clinica stabilita, e l'intervallo 37,5–38,0 mAU/mL rifletteva strategie alternative di soglia basate sull'ottimizzazione di Youden o su analisi a specificità fissa. Queste soglie rispondono a domande cliniche diverse: una soglia orientata alla sensibilità può essere utile per il monitoraggio in soggetti ad alto rischio, mentre una soglia orientata alla specificità può essere preferita quando la priorità è ridurre i falsi positivi. In tutte queste strategie, il modello combinato si è rivelato più stabile rispetto ad AFP o PIVKA-II presi singolarmente, sostenendone l'utilizzo come strumento di stratificazione del rischio piuttosto che come sostituto della diagnosi basata su imaging21.
Permangono diversi limiti. Il gruppo di addestramento era monocentrico e il gruppo di validazione prospettica aveva una dimensione moderata. È ancora necessaria una validazione multicentrica, specialmente in popolazioni con diverse basi eziologiche, inclusi HCC correlati a NAFLD, all'abuso di alcol e all'HCV. Lo stato di HCC è stato determinato mediante TC contrastografica e/o risonanza magnetica, un approccio che rispecchia la pratica diagnostica abituale ma potrebbe sottostimare lesioni estremamente precoci o atipiche. Alcune analisi per sottogruppi, in particolare quelle relative a HCC in stadio precoce e negativi per AFP, includevano un numero inferiore di casi rispetto all'intero gruppo. Le analisi di calibrazione e di bootstrap hanno contribuito a valutare la stabilità del modello, ma non possono sostituire studi di implementazione prospettici che verifichino se la sorveglianza guidata dal modello migliori l'efficienza dei riferimenti, il rendimento nella diagnosi precoce e gli esiti clinici successivi22.
In conclusione, l'integrazione di PIVKA-II, AFP e variabili cliniche di routine ha migliorato il rilevamento del carcinoma epatocellulare rispetto alle strategie basate su un singolo biomarcatore, con prestazioni costanti sia nel gruppo di addestramento che in quello di validazione indipendente. Il modello ha mantenuto una sensibilità clinicamente utile nei casi di carcinoma epatocellulare in stadio precoce e nei casi negativi per AFP, preservando al contempo un'elevata specificità, affrontando così due limiti comuni del monitoraggio basato sull'AFP. Poiché gli input sono comunemente disponibili, questo approccio risulta pratico per ulteriori test in popolazioni a rischio elevato di malattie epatiche. Studi futuri multicentrici dovrebbero confrontare direttamente il modello con l'ecografia abbinata all'AFP, valutare soglie operative predefinite e verificare se l'integrazione con biomarcatori emergenti o caratteristiche derivate dall'imaging possa ulteriormente migliorare il rilevamento precoce del carcinoma epatocellulare23,24.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari o non finanziari in conflitto. Nessun finanziatore commerciale, produttore di reagenti, fornitore di software o azienda di piattaforme diagnostiche ha avuto un ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi statistica, nell'interpretazione dei risultati, nella preparazione del manoscritto o nella decisione di sottoporre il lavoro per la pubblicazione.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i partecipanti allo studio e il personale clinico che ha supportato il prelievo del sangue, la coordinazione clinica, la revisione delle immagini e la verifica dei dati per questo studio.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta microcentrifuga priva di nucleasi da 1,5 mL | Eppendorf | 30123328 | Aliquotatura e conservazione del plasma |
| Calibratore AFP | Roche Diagnostics | AFP CalSet II, 09227261190 | Calibrazione AFP |
| Materiale di controllo qualità per AFP | Roche Diagnostics | PreciControl Tumor Marker, 11776452160 | Controllo qualità AFP |
| Materiale di controllo qualità per AFP | Roche Diagnostics | PreciControl Universal, 11731416160 | Controllo qualità AFP |
| Kit reagente per AFP | Roche Diagnostics | Elecsys AFP, 09015124190 | Misurazione AFP |
| Analizzatore automatizzato per immunodosaggio con elettrochemiluminescenza | Roche Diagnostics | cobas e 801 | Misurazione AFP e PIVKA-II |
| Pacchetto di calibrazione | Pacchetto R | rms 6.7–1 | Analisi di calibrazione |
| Pacchetto per l'analisi della curva decisionale | Pacchetto R | rmda 1.6 | Analisi della curva decisionale |
| Pacchetto del test di Hosmer–Lemeshow | Pacchetto R | ResourceSelection 0.3–6 | Test di Hosmer–Lemeshow |
| Provetta per prelievo del sangue con K2-EDTA, 10 mL | BD | 367525 | Prelievo di sangue venoso periferico |
| Pacchetto per l'imputazione multipla | Pacchetto R | mice 3.16.0 | Imputazione multipla |
| Kit reagente per PIVKA-II | Roche Diagnostics | Elecsys PIVKA-II, 08333629190/08333629500 | Misurazione PIVKA-II |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | Centrifuge 5425 R | Separazione del plasma |
| Pacchetto per l'analisi ROC | Pacchetto R | pROC 1.18.5 | Analisi ROC e test di DeLong |
| Software statistico | R Foundation | R 4.3.2 | Analisi statistica |
| Interfaccia software statistico | Posit Software | RStudio 2023.12.1 | Analisi statistica |
Riferimenti
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