Esplorare il meccanismo del granulo di Guben Pingchuan nel trattamento dell'asma bronchiale

Sommario

Questo protocollo indaga il meccanismo d'azione dei granuli di Guben Pingchuan nell'asma bronchiale utilizzando la farmacologia di rete, il docking molecolare e la validazione in vivo.

Abstract

Questo studio indaga il meccanismo d'azione dei granuli di Guben Pingchuan nel trattamento dell'asma bronchiale utilizzando la farmacologia di rete, il docking molecolare e la validazione sperimentale. Gli ingredienti attivi e i bersagli corrispondenti sono stati identificati utilizzando database TCMSP, HERB e SymMap. I bersagli correlati all'asma bronchiale sono stati raccolti da GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank e PharmGKB. Sono stati identificati bersagli sovrapposti e sono state costruite reti componente–bersaglio e interazione proteina–proteina (PPI). Sono state effettuate analisi di arricchimento della Gene Ontology (GO) e della Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) con correzione del tasso di false discovery (FDR). È stato condotto un docking molecolare per valutare l'affinità di legame, seguito dalla validazione in vivo . Sono stati identificati in totale 121 componenti attivi e 234 bersagli correlati ai farmaci, risultando 155 bersagli sovrapposti. I bersagli principali includevano TP53, AKT1, TNF e IL6. L'analisi KEGG ha dimostrato un arricchimento significativo della via di segnalazione PI3K–Akt, selezionata per la validazione sperimentale. L'aggancio molecolare ha rivelato una forte affinità di legame tra i componenti del nucleo e AKT1. Nei ratti asmatici indotti da ovalbumina, il granulo di Guben Pingchuan ha ridotto i livelli sierici di IL-4 e IL-10 , aumentato l'espressione di FoxP3 nel tessuto polmonare e aumentato i livelli di mRNA di PI3K e AKT . Questi risultati indicano che il granulo di Guben Pingchuan allevia l'asma bronchiale modulando la via di segnalazione PI3K–Akt ., regolando le citochine infiammatorie e migliorando la funzione regolatoria delle cellule T.

Introduzione

L'asma bronchiale è una malattia respiratoria cronica eterogenea caratterizzata da infiammazione delle vie aeree, iperreattività delle vie aeree, ipersecrezione di muco e rimodellamento delle vie^aeree. La sua patogenesi coinvolge complesse interazioni tra attivazione delle cellule immunitarie, mediatori infiammatori e molteplici vie di segnalazione. Clinicamente, l'asma si manifesta con respiri sibilanti ricorrenti, dispnea, oppressione al petto e tosse. L'infiammazione delle vie aeree è un meccanismo centrale alla base dell'insorgenza e della progressione della malattia, caratterizzata da un aumento della secrezione di citochine pro-infiammatorie come IL-6, IL-4, IL-17 e TNF-α., infiltrazione di cellule infiammatorie tra cui eosinofili e neutrofili, e cambiamenti strutturali come la proliferazione dei muscoli lisci delle vie aeree, l'ispessimento della membrana basale e l'iperplasia delle ghiandole^{mucose 2˒3}. Questi processi patologici portano infine a ostruzioni delle vie aeree e a un riducimento del flusso d'aria.

La fisiopatologia dell'asma è regolata da molteplici vie di segnalazione interagenti piuttosto che da un unico meccanismo. La via di segnalazione PI3K–Akt svolge un ruolo chiave nel modulare l'equilibrio immunitario, in particolare l'asse Treg/Th17, regolando l'espressione di FoxP3. Questa via interagisce anche con le vie di segnalazione IL-17 e TNF per amplificare le risposte infiammatorie e il rimodellamento delle vie aeree, contribuendo all'eterogeneità della malattia e alla resistenza al^{trattamento 3,4}. I dati epidemiologici indicano un continuo aumento globale della prevalenza dell'asma, con oltre 358 milioni di persone colpite in tutto il mondo e circa 45,7 milioni di pazienti adulti in^{Cina 5,6}. Le strategie di trattamento attuali si basano principalmente su agonisti β₂ inalati e glucocorticoidi; tuttavia, queste terapie mirano a meccanismi patologici limitati e possono portare a effetti avversi e resistenza ai glucocorticoidi in alcuni pazienti. La disregolazione di vie come PI3K–Akt. è stata associata a una ridotta reattività terapeutica, evidenziando la necessità di approcci terapeutici^{multi-bersaglio 7,4}.

La medicina tradizionale cinese (MTC) classifica l'asma come "Sindrome di Xiao", associata a carenze nelle funzioni polmonari, milza e renale, combinate con fattori patogeni esterni. Le formulazioni della MTC sono state ampiamente utilizzate nella gestione dell'asma grazie alle loro caratteristiche multi-componente e^{multi-bersaglio 8,9}. A differenza degli agenti farmacologici a bersaglio singolo, i composti della MTC esercitano effetti terapeutici coordinando la regolazione di molteplici vie biologiche, in linea con la complessa fisiopatologia^{dell'asma 10}. La farmacologia di rete fornisce un approccio a livello di sistema per analizzare le interazioni tra componenti dei farmaci, bersagli e vie malattiche, consentendo l'identificazione dei principali composti bioattivi e dei meccanismi^{molecolari 11}. L'aggancio molecolare completa ulteriormente questo approccio valutando l'affinità di legame tra piccole molecole e proteine bersaglio.

Il granulo di Guben Pingchuan è una formulazione medicinale tradizionale cinese composta da otto componenti erboristici, tra cui Ephedra sinica (erba di Ephedra), frutto di Psoralea corylifolia , seme di Prunus armeniaca (seme di albicocca), radice di Pseudostellaria heterophylla , frutto di Perilla frutescens , foglia di Eriobotrya japonica (foglia di nespo), bulbo di Lilium brownii ed Epimedium brevicornum. Questa formulazione viene tradizionalmente utilizzata per rafforzare l'energia vitale, eliminare il catarro e alleviare il respiro sibilante. Studi clinici precedenti hanno dimostrato la sua efficacia terapeutica nell'asma bronchiale, con tassi di risposta più elevati rispetto ai trattamenti^{convenzionali 12}.

Per chiarire il meccanismo d'azione sottostante, viene applicato un approccio integrato che combina farmacologia di rete, docking molecolare e validazione sperimentale in vivo . La farmacologia di rete viene utilizzata per identificare componenti attivi e potenziali bersagli associati all'asma bronchiale. L'aggancio molecolare viene impiegato per valutare le interazioni tra composti chiave e proteine bersaglio. Successivamente viene condotta una validazione sperimentale in un modello animale per valutare gli effetti regolatori sulle vie critiche di segnalazione, in particolare sulla via PI3K–Akt . Questo approccio mira a fornire approfondimenti meccanicistici sugli effetti terapeutici multi-bersaglio del granulo di Guben Pingchuan e a supportarne l'applicazione nel trattamento dell'asma bronchiale.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato di Etica Animale dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese del Liaoning (Approvazione n.: 21000042023058) e eseguite secondo le linee guida istituzionali. Gli strumenti di ricerca utilizzati in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Banche dati e software

1. Accedi ai seguenti database e software: TCMSP, HERB, SymMap, PubChem, STRING, GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank, PharmGKB, DAVID, UniProt e Cytoscape (versione 3.9.1).

2. Acquisizione di bersagli componenti

1. Recuperare costituenti chimici di erba efedrica, semi di albicocche, radice di Pseudostellaria, frutto di Perilla, foglia di nespola, specie di Lilium ed epimedium dal database^{TCMSP 13}. Recuperare composti di Psoralea dai database HERB e SymMap.
2. Selezionare i composti attivi utilizzando la biodisponibilità orale (OB ≥ 30%) e la somiglianza farmacologica (DL ≥ 0,18)^14,15.
3. Prevedere i geni bersaglio usando TCMSP. Standardizza tutti i bersagli utilizzando il database UniProt selezionando Homo sapiens. Rimuovere bersagli duplicati e non validi, inclusi voci non umane, proteine non annotate e identificatori obsoleti.

3. Acquisizione di bersagli per l'asma bronchiale

1. Cerca GeneCards, OMIM, TTD, DrugBank e PharmGKB usando la parola chiave "asma bronchiale". Imposta il punteggio di rilevanza GeneCard a >4. Unisci tutti i bersagli recuperati e rimuovi i duplicati.

4. Identificazione degli obiettivi di intersezione

1. Importa target di farmaci e di malattie in uno strumento online di analisi Venn. Identificare i bersagli sovrapposti e registrare il numero totale per analisi successive.

5. Costruzione della rete componente–bersaglio

1. Importa gli obiettivi di intersezione in Cytoscape 3.9.1. Costruire la rete componente–bersaglio. Regola la dimensione e il colore del nodo in base ai valori dei gradi.

6. Costruzione della rete di interazione proteina–proteina (PPI)

1. Carica i target di intersezione nel database STRING. Seleziona Homo sapiens e imposta il punteggio di fiducia a ≥0.900. Esporta la rete e importala in Cytoscape.
2. Calcola i parametri topologici (centralità di grado, centralità di intermedietà e centralità di vicinanza). Identificare i target core utilizzando soglie mediane e grado >20.

7. Analisi dell'arricchimento GO e KEGG

1. Carica obiettivi sovrapposti nel database DAVID o analizza usando il cluster Profiler del pacchetto R.
2. Eseguire analisi di arricchimento tramite Gene Ontology (GO) per processi biologici, componenti cellulari e categorie di funzione molecolare.
3. Eseguire l'analisi di arricchimento dei percorsi KEGG. Applicare la correzione del tasso di false discovery (FDR) e impostare la soglia di significatività a FDR < 0,05.
4. Visualizza i termini arricchiti in alto usando grafici a barre o a bolle.

8. Aggancio molecolare

1. Scarica le strutture 2D dei composti core da PubChem. Genera strutture 3D usando ChemOffice e salva come file mol2.
2. Scarica le strutture proteiche dal database RCSB PDB. Rimuovi molecole d'acqua e liganti usando PyMOL.
3. Esegui l'aggancio molecolare usando AutoDock Vina. Definisci i parametri della grid box ed esegui simulazioni di attracco.
4. Registra le energie di legame (kcal/mol) e i residui che interagiscono con le chiavi. Visualizza i risultati dell'attracco utilizzando piattaforme di modellazione molecolare, visualizzazione e simulazione.

9. Validazione sperimentale

1. Animali
   1. Ottenete 48 maschi di ratti Sprague–Dawley (9 settimane, 220–240 g). Animali domestici a 20–25 °C con umidità dal 55%–60% in condizioni standard.
2. Farmaci e reagenti
   1. Prepara granuli di Guben Pingchuan composti da erba efedra, Psoralea, semi di albicocca, radice di Pseudostellaria, frutto di Perilla, foglia di nespola, lilium ed epimedium.
   2. Prepara dexametasone, ovalbumina (OVA), idrossido di alluminio, kit ELISA, kit di estrazione RNA e anticorpi come elencato nella Tabella dei Materiali.
3. Strumenti
   1. Preparare apparecchiature standard di laboratorio, inclusi un lettore di microplacche, un sistema di elettroforesi, un microtomo di paraffina e un sistema di imaging.
4. Raggruppamento e trattamento degli animali
   1. Assegnare casualmente i ratti in sei gruppi (n = 8): gruppo di controllo vuoto, gruppo modello, gruppo dexametasone (0,3 mg/kg), gruppo di medicina cinese a basso dosaggio, gruppo di medicina cinese a dosaggio medio e gruppo di medicina cinese ad alta dose.
   2. Nei giorni 1, 7 e 14, somministrare 1 mL di iniezione intraperitoneale di OVA al 10% + 10% Al(OH)₃ ai ratti del gruppo modello, del gruppo medicina cinese a basso dosaggio, del gruppo medicina cinese a dosaggio medio, del gruppo medicina cinese ad alta dose e del gruppo desametasone per la sensibilizzazione.
   3. Somministrare 1 mL di iniezione intraperitoneale di soluzione fisiologica allo 0,9% ai ratti del gruppo di controllo a vuoto nei giorni 1, 7 e 14.
   4. Dal giorno 15 al 21, esegui una stimolazione inalata nebulizzata una volta al giorno per 20 minuti. Somministrare inalazione nebulizzata al 5% di OVA ai ratti del gruppo modello, del gruppo medicina cinese a bassa dose, del gruppo medicina cinese a dosaggio medio, del gruppo medicina cinese ad alta dose e del gruppo desametasone.
   5. Somministrare inalazione fisiologica nebulizzata con soluzione fisiologica allo 0,9% ai ratti del gruppo di controllo a vuoto dai giorni 15 al 21.
   6. Somministrare trattamenti con gavage orali una volta al giorno dal giorno 22 al 36 secondo il gruppo di trattamento assegnato.
   7. Monitora quotidianamente il peso corporeo e le condizioni generali durante l'esperimento. La timeline sperimentale è riassunta nella Tabella 1.
5. Istopatologia
   1. Raccogli tessuto polmonare. Corregge, incorpora e seziona campioni. Esegui la colorazione di ematossilina–eosina.
   2. Esegui la colorazione di Masson per valutare la deposizione di collagene.
6. Analisi RT-PCR
   1. Estrai l'RNA totale dal tessuto polmonare.
   2. Omogeneizzare il tessuto polmonare congelato in condizioni di temperatura ultra-bassa. Dopo aver pesato il campione, trasferiscilo rapidamente in un mortaio pre-raffreddato contenente azoto liquido e macinalo in polvere.
   3. Trasferire il campione in polvere in un tubo centrifuga. Aggiungi 1 mL di TransZol UP e 0,2 mL di reagente di estrazione di RNA ogni 50–100 mg di tessuto. Scuoti il tubo a temperatura ambiente per 5 minuti.
   4. Centrifugare il campione a 1000 × g e 2–8 °C per 15 minuti. Trasferire la fase acquosa incolore in un nuovo tubo centrifuga.
   5. Aggiungi 1 mL di TransZol fino a 0,5 mL di isopropanolo. Incuba la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti.
   6. Centrifuga il campione a 1000 × g per 10 minuti. Aggiungi 1 mL di etanolo al 75% e centrifuga di nuovo per 5 minuti.
   7. Scarta il sovrantante e asciuga all'aria il precipitato a temperatura ambiente per 5 minuti. Sciogliere il precipitato in 50–100 μL di soluzione di RNA, poi incubare per 10 minuti.
   8. Conservare il campione a −70 °C per una conservazione a lungo termine.
   9. Sintetizza cDNA ed esegui una PCR quantitativa per misurare l'espressione di PI3K e AKT.
7. ELISA
   1. Campioni di siero di scongelamento a 4 °C. Misurare i livelli di IL-4 e IL-10. utilizzando kit ELISA secondo le istruzioni del produttore.
8. Immunoistochimica
   1. Tessuto polmonare fisso con paraformaldeide al 4%, incorporato nella paraffina, affettato, decerato e idratato.
   2. Esegui il recupero degli antigeni, il blocco e l'incubazione degli anticorpi. La colorazione secondo il kit immunoistochimico FoxP3, la soluzione di colorazione DAB e l'espressione positiva appare come colorazione giallastra o marrone scuro.
   3. Osserva e fotografa al microscopio, e utilizza il software Image J per l'analisi statistica quantitativa dell'espressione di FoxP3.
9. Analisi statistica
   1. La normalità dei dati del test usando il test di Shapiro–Wilk e l'omogeneità della varianza tramite il test di Levene.
   2. Analizza i dati utilizzando test ANOVA unidirezionali o non parametrici, se appropriato. Esprimi i dati come media ± deviazione standard.
   3. Definisci p < 0,05 come statisticamente significativo. ★★p < 0,01 e ★p < 0,05 contro gruppo di controllo; ◆◆p < 0,01 e ◆p < 0,05 contro gruppo modello; ##p < 0,01 e #p < 0,05 contro gruppo dexametase.

Tabella 1: Tempistica sperimentale. Programma di sensibilizzazione, procedure di sfida e trattamento. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Risultati

Screening degli ingredienti attivi
Un totale di 121 componenti attivi sono stati identificati dal database TCMSP dopo il filtraggio per l'attività target. Questi includevano 23 componenti provenienti da erba Ephedra , 7 da Psoralea, 19 da semi di albicocca, 8 dalla radice di Pseudostellaria , 16 da frutto di Perilla, 18 da foglie di nespola, 7 da Lilium e 23 da Epimedium. (Tabella 2). Sono stati identificat...

Discussione

L'asma bronchiale è una malattia comune nel reparto^{respiratorio 16}. Si tratta di un disturbo ostruttivo delle vie aeree causato da allergeni e iperreattività delle vie^{aeree 17}. Ha un'alta incidenza clinica, è soggetta a recidiva ed è difficile da curare, influenzando significativamente la salute e la qualità della vita dei pazienti. La Global Initiative for Asthma (GINA) 2025 riporta che la terapia con glucocorticoidi inalati è efficace per...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
qPCR Kit	Novogene	NQ-001, 2×1mL	Rilevamento dell'espressione relativa dell'mRNA dei geni target
allumina idrato Al(OH)3	Shanghai Yubo Biotechnology Co., LTD	YB-AL001, 500g	Aggiuntivo immunologico per migliorare la risposta immunitaria all'antigene
Kit di test della concentrazione proteica BCA	Fode Biotechnology Co., LTD	FD2001, 100 pezzi per scatola	Quantificazione totale delle proteine per standardizzare il carico del campione
Sistema di imaging a chemiluminescenza	Tanon	5200Multi	Immagazzinamento delle bande WB, raccolta e analisi di immagini di gel e blot
Marcatore proteico pre-colorato	Biolaibo Technology Co., LTD	BL005, 10-180kDa, 500μL	Riferimento del peso molecolare delle proteine per esperimenti di elettroforesi
Kit di estrazione dell'RNA potenziato	Whole Golden Branch	ET111-01v2, 50 pezzi per scatola	Estrazione e purificazione di RNA totale da tessuti e cellule
Lettore per test immunoenzimatici	U.S. Biotek Company	Epoch/BioTek	Rilevamento quantitativo di citochine e contenuti proteici nei campioni
Anticorpo primario FOXP3	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	AG5002, 50ul/pezzo	Legazione mirata alla proteina FOXP3 per il saggio immunologico
Kit per preparazione rapida del gel	Shanghai Yamei	PG212, 30 set	Preparazione rapida del gel di separazione e del gel di stratificazione per l'elettroforesi
Kit di colorazione masson	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1340, 100 compresse	Colorazione specifica per le fibre di collagene tissutali e l'osservazione della fibrosi
OVA	Beijing Boaotoda Technology Co., LTD.	OVA-10g, ≥98%	Allergene classico per l'istituzione di modelli animali allergici
Soluzione per diluizione di anticorpi primari	Biyun Tian Biotechnology Co., LTD	P0256-100ml	Diluire l'anticorpo primario, mantenere l'attività e ridurre il legame non specifico
Kit ELISA per IL-10 di ratti	Andy Bio	E-30649, 96T	Rilevamento quantitativo del fattore antinfiammatorio IL-10 nei ratti
Kit ELISA per IL-4 di ratti	Andy Bio	E-30623, 96T	Rilevamento quantitativo del fattore infiammatorio IL-4 Th2 nei ratti
Kit di trascrizione inversa	Baori Medical Technology Co., LTD	E047-01A	Trascrizione inversa dell'RNA in cDNA per successiva analisi genica
Kit Oil Red O saturo	Solabao Biotechnology Co., LTD	G1261, 50mL×2 flacone	Colorazione e rilevamento specifici dei lipogranuli tissutali
Anticorpo secondario anti-coniglio Shangyang	Proteintech Biological Co., LTD	SA00001-2, 1mL	Lega l'anticorpo primario coniglio per la reazione a colorazione WB
Buffer TBST	Wuhan Sewell Biotechnology Co., LTD	G2150, 1L / flacone	Buffer per il lavaggio della membrana e la diluizione degli anticorpi in Western blot
Sistema di elettroforesi di trasferimento	Shanghai Jingcanshi Precision Machinery Co., Ltd.	PowerPac Basic	Utilizzato per l'elettroforesi delle proteine e il trasferimento della membrana del Western blot
Frigorifero per temperature ultra basse	Zhongke Meiling	MDF-382	Crioconservazione a basse temperature di reagenti, campioni di proteine e tessuti
Vaschetta per elettroforesi verticale	BIO-RAD	JY-ZY5	Separazione elettroforetica verticale di campioni di proteine e acidi nucleici