Un sistema di controselezione basato su tossine per la delezione genica senza marcatori e la mutagenesi del trasposone Tn5 ad alta densità in Pectobacterium brasiliense

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per generare delezioni geniche non marcate e costruire librerie mutanti per inserimento Tn5 a livello genomico in Pectobacterium brasiliense, un fitopatogeno responsabile della patata nera e del marciume molle. Questo approccio consente un'analisi genetica inversa efficiente e facilita la caratterizzazione funzionale dei geni associati alla virulenza in questo organismo.

Abstract

Pectobacterium brasiliense è un batterio altamente patogeno responsabile del marciume molle del tubero di patata, delle gambe nere e del marciume aereo del fusto. L'elucidazione dei suoi meccanismi patogeni è essenziale per il controllo delle malattie; tuttavia, gli strumenti genetici per questo organismo rimangono limitati. È stato sviluppato un sistema di controselezione basato su tossine per consentire la delezione genica senza marcatori e la mutagenesi del trasposone Tn5 ad alta densità. La tossina vmi480 derivata dal plasmide pLP12 è stata utilizzata come marcatore di controselezione per costruire il vettore suicidio pKV2. Utilizzando questo sistema, il gene recA nel ceppo SM di P. brasiliense è stato eliminato con successo. Il mutante recA risultante servì come ceppo parentale per la costruzione di una libreria di inserimento Tn5 composta da oltre 12.000 mutanti tramite coniugazione con il ceppo aiutante RHO3 portatore di pKV2-LLtnp. In questo plasmide derivato, la tossina vmi480 è stata sostituita con una trasposasi Tn5 iperattiva sotto il controllo di un promotore di lac rivolto verso l'esterno per ridurre gli effetti polari. Saggi di inoculazione tubericola ad alta produttività hanno permesso l'identificazione di mutanti carenti di patogenicità, inclusi inserti nel sistema di secrezione di tipo II, un determinante chiave della virulenza che media la secrezione degli enzimi degradanti della parete cellulare vegetale. Questa piattaforma supporta la genomica funzionale e facilita l'indagine dei meccanismi di virulenza in questo patogeno di importanza economica.

Introduzione

P. brasiliense è una delle specie più aggressive all'interno del genere Pectobacterium ed è l'agente causale del marciume molle della patata, del marciume nero e del marciume^{aereo del fusto.} Queste malattie portano a una perdita stimata del 30% di resa nella patata, una coltura classificata come la terza fonte alimentare più importante al mondo e un componente chiave del sistema di produzione agricola^{cinese 2}. Nonostante il suo impatto economico, i meccanismi molecolari che governano la patogenicità di P. brasiliense rimangono insufficientemente compresi, principalmente a causa della mancanza di strumenti di manipolazione genetica efficienti e riproducibili per questa specie ^3,4,5.

Gli studi genomici funzionali in molti batteri fitopatogeni si basano su sistemi robusti di scambio allelico e mutagenesi di trasposoni; tuttavia, strumenti genetici comparabili per P. brasiliense rimangono limitati o inefficienti. In particolare, i marcatori efficaci di controselezione compatibili con questa specie sono rari. Sebbene il gene sacB sia ampiamente utilizzato come marcatore di controselezione per la delezione genica in vari batteri, P. brasiliense potrebbe mostrare un'alta tolleranza fino al 50% di saccarosio durante il processo^{di selezione 5}. Questa tolleranza probabilmente riflette una mancanza di sensibilità alle tossine, forse dovuta alla conversione enzimatica dello saccarosio in polimeri zuccheri. Inoltre, concentrazioni elevate di saccarosio possono indurre shock osmotico^{deleterio 6}. Inoltre, metodi efficienti di mutagenesi su larga scala, come la costruzione di librerie di inserimento del trasposone Tn5, non sono ancora stati ben consolidati per questo organismo.

Per affrontare queste limitazioni tecniche, è stato sviluppato un sistema di controselezione basato sulle tossine e è stato stabilito un robusto flusso di lavoro di screening per la mutagenesi Tn5 per P. brasiliense. Rispetto ai metodi tradizionali a base di saccarosio, questo approccio basato sulle tossine offre vantaggi distinti, tra cui una maggiore stringenza della selezione, una maggiore specificità nell'identificazione degli eventi di doppio crossover e l'eliminazione dello stress osmotico confondente. Sistemi simili basati su tossina e antitossina vmi480 sono stati implementati con successo per superare le barriere di selezione nella specie 7 di Vibrio. La metodologia consolidata è altamente applicabile alla caratterizzazione funzionale ad alto rendimento di geni sconosciuti e fornisce una piattaforma versatile che può essere adattata ad altre Pectobacteriaceae affini con marciume molle.

Protocollo

1. Generazione di un mutante di delezione recA senza marcatori in P. brasiliense

1. Estrarre DNA genomico dal plasmide SM e pKV2 di P. brasiliense (pLP12 derivato con modifica del marcatore di selezione antibiotico e del sito di clonaggio multiplo) dal ceppo donatore di E. coli utilizzando procedure standard di preparazione del DNA.
2. Verifica la qualità e la concentrazione del DNA genomico estratto e del DNA plasmidico tramite elettroforesi su gel di agarosio e spettrofotometria NanoDrop.
3. Linearizzare il plasmide pKV2 tramite doppia digestione con EcoRI e NheI a 37 °C per 5 ore. Verifica la digestione completa tramite elettroforesi su gel di agarosio e purifica il plasmide linearizzato.
4. Identificare circa 800 bp regioni a monte e a valle del gene recA utilizzando software di analisi genomica e progettare le corrispondenti coppie di primer LBF/LBR e RBF/RBR (vedi la Tabella dei materiali per tutti i primer utilizzati in questo studio).
5. Amplificare entrambi i bracci omologhi in condizioni standard di ciclo PCR e purificare i prodotti PCR. Una PCR da 50 μL produce tipicamente 2,5 μg di prodotto.
   NOTA: I valori di Tm e il contenuto di GC dei primer possono essere regolati modificando i confini delle regioni omologhe.
6. Assemblare il plasmide suicida ricombinante pKV2-recA utilizzando un kit di assemblaggio del DNA legando i bracci omologhi purificati con la spina dorsale del plasmide linearizzato.
7. Trasformare la miscela di assemblaggio in celle λpir chimicamente competenti di E. coli S17-1 tramite shock termico, recuperare le celle nel mezzo LB e placcare su agar LB contenente kanamicina (LB + kan).
   NOTA: Le concentrazioni finali utilizzate sono 50 mg/mL di kanamicina, 0,2% (p/v) di glucosio, 0,3% (p/v) arabinosio e 0,3 mM di acido 2,6-diaminopimelico (DAP).
8. Validare i cloni positivi tramite digestione restritiva o PCR a colonie. (Vedi la tabella dei materiali per tutte le ricette con mezzi utilizzati in questo studio).
9. Estrarre il plasmide pKV2-recA confermato e trasformarlo in E. coli WM3064 usando la trasformazione da shock termico (tasso di trasformazione atteso > 10⁶ cfu/μg).
10. Seleziona i trasformanti su agar LB contenente kanamicina e acido diaminopimelico (DAP).
11. Eseguire la coniugazione biparentale mescolando colture notturne del ceppo donatore (WM3064 pKV2-recA) e del ricevente P. brasiliense SM in un rapporto 1:1 (v/v), ottenendo tipicamente 10^4-10 6 transconiuganti per millilitro di cellule donatrici e riceventi.
12. Lavare la coltura mista una volta con acqua sterile, posizionare la miscela su agar LB integrato con kanamicina e DAP, e incubare a 28 °C per 48–72 ore.
    NOTA: Se non si osservano transconiuganti, il rapporto donatore-ricevente può essere aumentato a 2:1 (v/v) per migliorare l'efficienza della coniugazione. Se si osserva un'elevata crescita di fondo, il DAP residuo può essere rimosso lavando la coltura mista due volte con acqua sterile.
13. Recuperare la miscela di coniugazione e imporre su agar LB contenente kanamicina e glucosio (senza DAP) per la contro-selezione.
14. Scegli 6–8 colonie e replicale su LB + kan e LB + kan + arabinose.
15. Seleziona colonie che crescono su LB + kan ma non crescono su LB + kan + arabinosi; Questi sono candidati per la prima volta che si incrociano.
16. Inoculare i ceppi di primo incrocio nel mezzo LB e incubare durante la notte. Placca le colture su agar LB contenente L-arabinosio per indurre la seconda ricombinazione omologa.
17. Scegli diverse colonie e replicale su LB + arabinoso e LB + kan. Seleziona le colonie che crescono su LB + arabinosio ma non su LB + kan; questi sono mutanti di delezione recA presunti.
    NOTA: Se non vengono osservate colonie dopo il secondo evento di incrocio, dovrebbe essere valutata l'essenzialità potenziale del gene bersaglio per la crescita batterica. In alternativa, le regioni omologhe a monte e a valle possono essere estese a 1.200 bp per aumentare l'efficienza della ricombinazione omologa.
18. Confermare i mutanti recA tramite PCR in colonie utilizzando coppie di primer checkF/checkR progettate per amplificare le regioni del promotore recA e del terminator per verificare la delezione in-frame del gene bersaglio. Sequenziare il prodotto PCR per confermare la cancellazione precisa nel fotogramma di recA.
19. La delezione riuscita è indicata da una riduzione della dimensione del prodotto PCR, che dovrebbe corrispondere alla lunghezza del frammento di tipo selvatico meno la lunghezza specifica del segmento genico eliminato.

2. Costruzione di pKV2-LLtnp per la mutagenesi di Tn5 in P. brasiliense

1. Amplifica la cassetta trasposasi Tnp da pMCS2-LLtnp⁸ usando la coppia di primer Tnp-F/Tnp-R, e amplifica la spina dorsale oriγR6K Tn5 da pKV2 usando la coppia di primer ori-F/ori-R. Purifica tutti i prodotti PCR utilizzando un kit di purificazione del DNA.
2. Assemblare la cassetta Tnp purificata e la dorsale oriγR6K Tn5 usando un kit di assemblaggio del DNA. Trasformare la miscela di assemblaggio in celle λpir S17-1 di E. coli chimicamente competenti tramite shock termico, recuperare in mezzo LB e impagare su agar LB integrato con kanamicina (LB + kan).
3. Validare i cloni positivi tramite PCR a colonie usando coppie di primer ori-F/ori-R e Tnp-F/Tnp-R.
4. Preparare cellule competenti per E. coli RHO3 inoculando una singola colonia in un mezzo LB e incubandola durante la notte. Diluire la coltura 1:100 in mezzo fresco LB e far crescere fino a un OD₆₀₀ di 0,6.
5. Raffreddare la coltura sul ghiaccio e lavare le celle tre volte con 0,1 M CaCl₂ pre-raffreddato. Risospendere l'ultimo pellet in 500 μL di glicerolo pre-raffreddato al 20% e conservarlo a −80 °C.
6. Trasformare 10 μL del plasmide ricombinante validato (pKV2-LLtnp) in 100 μL di celle competenti in RHO3 tramite shock termico (tasso di trasformazione atteso > 10⁶ cfu/μg). Incubare sul ghiaccio per 30 minuti, fare shock termico a 42 °C per 45 secondi, poi raffreddare sul ghiaccio per 2 minuti.
7. Aggiungere 500 μL di mezzo e incubare a 37 °C per 1 ora con agitazione. Implaccare su agar LB contenente kanamicina e DAP (LB + kan + DAP) e incubare a 37 °C durante la notte.
8. Validare i trasformanti RHO3 positivi tramite PCR a colonie utilizzando Tnp-F/Tnp-R.

3. Costruzione della biblioteca mutante trasposone Tn5 in P. brasiliense

1. Coltivare P. brasiliense ΔrecA in substrato LB a 28 °C e coltivare RHO3/pKV2-LLtnp in substrato LB integrato con kanamicina e DAP (LB + kan + DAP) a 37 °C. Permette a entrambe le ceppe di raggiungere un OD₆₀₀ di 1.
2. Mescolare 100 μL di P. brasiliense ΔrecA con 100 μL di RHO3/pKV2-LLtnp, centrifugare la miscela, scartare il surnante e risospendere il pellet lavato in 10 μL di mezzo LB.
3. Posizionare la miscela sospesa su una piastra agar LB integrata con DAP e incubare a 28 °C per 8 ore per consentire la coniugazione.
4. Recuperare la miscela di coniugazione risciacquando la superficie della lastra con 1 mL di medium sterile LB. Centrifuga brevemente, elimina il surnatant e lava il pellet due volte con LB medium per rimuovere il DAP.
5. Risospendere la pellet lavata in un mezzo LB da 300 μL e impagare 10 diluizioni seriali su agar LB integrato con kanamicina e glucosio (LB + kan + glucosio; senza DAP) per selezionare i transconiuganti.
6. Incubare le placche a 28 °C per 48 ore. Scegli cinque colonie e valida ciascuna tramite PCR di colonie usando coppie di primer ori-F/ori-R e Tnp-F/Tnp-R per confermare l'introduzione riuscita del trasposone Tn5. Sequenziare tutte e cinque le colonie per verificare l'inserimento di Tn5 nel genoma.
   NOTA: Prima della costruzione formale della biblioteca mutante, sei colonie singole venivano selezionate casualmente dalla targa di coniugazione. Sono stati eseguiti saggi di salvataggio plasmidico per determinare i siti di inserimento, utilizzando due diversi enzimi di restrizione separatamente come due gruppi di controllo paralleli. Sono state ottenute in totale 36 letture di sequenza. Un singolo evento di inserimento Tn5 veniva convalidato solo quando i sei siti di inserimento per ogni singola colonia erano identici.
7. Stima la capacità della libreria mutante ripetendo il passaggio di coniugazione e contando i numeri delle colonie. Assicurarsi che la dimensione totale della biblioteca superi le 12.000 colonie per ottenere una copertura genomica sufficiente per lo screening a valle.
   NOTA: Se si osserva una bassa frequenza di mutagenesi, si dovrebbe considerare l'uso di una variante iperattiva della trasposasi Tn5, come il mutante E54K/M56A/L372P, per aumentare l'efficienza della trasposizione.
8. Trasferire le singole colonie mutanti ottenute al passo 6 in piastre da 96 pozzi contenenti 200 μL LB + kan per pozzo. Incubare le piastre durante la notte a 28 °C con agitazione a 200 giri/min.
9. Aggiungi 133 μL di glicerolo sterile al 50% in ciascun pozzo per ottenere una concentrazione finale di circa il 20%. Sigillare e conservare le piastre da 96 pozzi a −80 °C per una conservazione a lungo termine.

4. Saghi di patogenicità ad alta produttività tramite inoculazione con tuberi di patata e vaso

1. Prepara i tuberi di patata (cv. Favorita) risciacquandoli con acqua sterile, immergendoli brevemente nel 75% di etanolo e asciugandoli all'aria su un banco pulito. Taglia i tuberi in sezioni spesse ~8 mm e posiziona le fette in piastre di Petri sterili da 90 mm. Prepara almeno tre fette per repliche biologiche.
2. Inoculare 1 μL di ogni ceppo mutante sulle fette di patata usando una pipetta multicanale, seguendo la disposizione delle piastre della libreria mutante a 96 pozzi. Includere P. brasiliense ΔrecA come controllo positivo e LB + kan come controllo negativo.
3. Incubare le fette di patata inoculate a 28 °C per 7–8 ore. Sono stati registrati mutanti che mostrano una macerazione visibilmente ridotta o aree di lesione più piccole rispetto al controllo ΔrecA . Quantifica l'area della lesione misurandone lunghezza e larghezza. Designa questi come candidati principali per lo screening.
   NOTA: Assicurarsi che i valori OD₆₀₀ delle colture e dei controlli mutanti siano normalizzati a 0,8 prima dell'inoculazione.
4. Per lo screening secondario, inoculare 5 μL di ciascun ceppo candidato su fette di patata fresca (6 ceppi per fetta, a pari spaziamento). Prepara tre repliche biologiche per ogni ceppo. Incubare a 28 °C per 7–8 ore e registrare le dimensioni delle lesioni per confermare l'attenuazione.
5. Isola ceppi che mostrano una riduzione costante della virulenza striandoli su piastre LB + Kan. Incubare le placche a 28 °C durante la notte e conservare i mutanti a virulenza ridotta validati a 4 °C per analisi successive.
6. Per la validazione intera della pianta, inoculare i gambi della patata con 150 μL di sospensioni batteriche normalizzate a 1 x 10⁸ CFU/mL. Iniettare le sospensioni nella regione del fusto basale usando una siringa sterile. Osserva lo sviluppo della malattia dopo 48 ore. Esegui repliche biologiche su tre singole piante.
7. Valuta la gravità della malattia utilizzando la scala di valutazione della malattia blackleg ("una scala ordinale a 6 punti: 0, 1, 3, 5, 7, 9") e calcola l'Indice della Malattia come:
   1. Grado 0: Nessun sintomo di malattia sull'intera pianta.
   2. Grado 1: Le lesioni del fusto coprono non più di un terzo della circonferenza dello stelo e/o le singole foglie sono appassite.
   3. Grado 3: Le lesioni del fusto coprono non più di metà della circonferenza dello stelo e/o meno della metà delle foglie mostra un leggero appassimento, e/o alcune foglie inferiori presentano lesioni.
   4. Grado 5: Le lesioni del fusto coprono più di metà della circonferenza dello stelo e/o più della metà delle foglie mostrano un leggero appassimento.
   5. Grado 7: Le lesioni del fusto circondano l'intera circonferenza dello stelo e/o più di due terzi delle foglie sono appassite.
   6. Classe 9: Tutte le foglie della pianta sono appassite o morte.
      
8. Preparare scorte di stoccaggio a lungo termine di mutanti attenuati confermati, mescolando colture con un volume uguale di glicerolo sterile al 50% fino a una concentrazione finale del 25%, e conservare a -80 °C.

5. Identificazione dei siti di inserimento di Tn5 tramite soccorso plasmidico

1. Coltiva il mutante Tn5 di interesse ed estrai il DNA genomico usando un kit di estrazione del DNA genomico batterico. Quantificare la concentrazione di DNA per garantire un input sufficiente per la digestione a valle.
2. Digerire 1–2 μg di DNA genomico con EcoRI in una reazione da 100 μL contenente 10× tampone di reazione e 5 μL di enzima, e incubare la miscela a 37 °C per un minimo di 3 ore. Verifica il completamento della digestione usando un gel di agarosio.
3. Precipitare il DNA digerito aggiungendo 1/10 di volume di 3 M acetato di sodio e 3 volumi di etanolo assoluto. Mescola bene e incuba a -20 °C per 1 ora.
4. Centrifuga a 13.500 x g per 5 minuti e lava il pellet in sequenza con etanolo al 75% ed etanolo assoluto. Asciugare il pellet all'aria e risospendere in 17 μL di acqua sterile.
5. Auto-liga i frammenti di DNA digeriti aggiungendo 2 μL di 10× tampone di ligasi di DNA T4 e 1 μL di ligasi di DNA T4. Includere un controllo negativo (senza ligasi) per controllare la trasformazione del background. Incubare la reazione di ligatura a 4 °C durante la notte per favorire la circolarizzazione dei frammenti di restrizione.
6. Trasformare 10 μL della miscela di ligatura in E. coli S17-1 λpir chimicamente competente utilizzando la trasformazione da shock termico come descritto in precedenza. Recuperare cellule in LB per 1 ora e placcare su agar LB contenente kanamicina (LB + kan) per selezionare plasmidi che trasportano la cassetta Tn5.
7. Scegli cinque colonie resistenti alla kanamicina a caso ed estrai il DNA plasmidico usando un kit standard di minipreparazione per plasmidi. Validare la struttura del plasmide digerendo 500 ng di ciascun plasmide con HindIII e incubando a 37 °C per 5 ore. Analizzare i modelli digertivi tramite elettroforesi in gel di agarosio.
8. Se le dimensioni delle bande plasmidiche corrispondono ai pattern di frammenti attesi, esegui il sequenziamento Sanger usando il primer ME da 5' situato all'interno delle estremità Tn5.
9. Identificare il sito di inserimento preciso del Tn5 allineando la sequenza di fiancheggiamento a 50-100 bp a valle della regione 5'-ME del Tn5 contro il genoma SM di P. brasiliense utilizzando software BLAST o di analisi genomica.
10. Confermare che tutte e cinque le reazioni di sequenziamento indipendenti per ciascun mutante corrispondano alla stessa coordinata genomica (> 98% di identità di sequenza).
11. Se una delle cinque reazioni di sequenziamento corrisponde a una coordinata genomica diversa, ciò indica la presenza di più siti di inserimento Tn5 in quel mutante. In tali casi, si analizzano ulteriori colonie per determinare tutte le posizioni di inserimento. In alternativa, eseguire il Southern blot o il sequenziamento dell'intero genoma per ottenere una mappatura più definitiva del sito di inserimento.
12. Designare i mutanti con un unico e coerente sito di inserzione in tutte le reazioni di sequenziamento come mutanti Tn5 a singolo inserimento veri e propri, adatti per analisi fenotipiche o genetiche a valle.

Risultati

Per superare l'instabilità causata dalla mutazione sucB in P. brasiliense, la tossina vmi480 dal plasmide pLP12 è stata impiegata come marcatore di controselezione, e il vettore suicida modificato pKV2 (Figura 1A) è stato costruito sostituendo la cassetta di resistenza agli antibiotici e regolando la configurazione del sito di clonazione. Per generare un mutante di delezione recA senza marker, sono stati clonati bracci omologhi sinistro e destro del gene r...

Discussione

La strategia di manipolazione genetica sviluppata in questo studio offre un'opzione per la genomica funzionale in P. brasiliense, un patogeno principale della marciume morbida della^{patata 9,10}. Integrando un sistema di controselezione basato su tossine in una spina dorsale plasmide suicida, si generava un mutante ΔrecA senza marcatori. Questo approccio offre vantaggi significativi rispetto ai sistemi tradizional...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di estrazione del DNA genomico batterico	Estrarre il DNA genomico batterico	Tiangen	DP302-02
Acido diaminopimelico	0,3 mM in 1 L di mezzo	Macklin	D836611-5g
Kit di assemblaggio del DNA	Assemblaggio del DNA	Vazyme	C116-02
Kit di purificazione del DNA	Purificazione del DNA	Tiangen	DP214-02
Kanamicina	50 mg/mL	Aladdin	K103025-25g
Glucosio	0,2% (p/v)	Aladdin	G116305-250mg
Tryptone	10% in 1 L di mezzo	OXOID	LP0042B
Estratto di lievito	5% in 1 L di mezzo	OXOID	LP0021B
NaCl	10% in 1 L di mezzo	Biofroxx	1249KG001
Agar	15% in 1 L di mezzo	Biofroxx	8211GR500
L-arabinosio	0,3% (p/v)	Aladdin	A106196-25g
Kit Miniprep plasmidi	Estrarre plasmidi	Tiangen	DP103-02
EcoRI	Endonucleasi di restrizione	Yugong Biotech	EG15536
NheI	Endonucleasi di restrizione	Yugong Biotech	EG15552
HindIII	Endonucleasi di restrizione	Yugong Biotech	EG15539
T4 DNA ligasi	Autocircolarizzazione del DNA lineare	Yugong Biotech	EG15205
Centrifugatrice	RWD	M1324R
Ciclotermico PCR	BIO-GENER	GET3XG
Fotocamera digitale	SONY	ILCE-7M4
Sistema di elettroforesi	LY	DYY-6C
Bagnomaria	JOANLAB	WB100-1F
Sistema di documentazione gel	Thermo Fisher Scientific	iBright CL750
Autoclave	Yamato	SQ510C
Incubatrice con agitazione	ZHICHU	ZQZY-AR8
Incubatore a temperatura costante	ZQ	DHP-9272
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	Lite Plus
Spettrofotometro UV-Vis	HITACHI	U-3900
Elettroporatore	BIO-RAD	MicroPulser
Ceppi e plasmidi
P. brasiliense SM	Batteri patogeni delle patate	Collezione di ceppi di laboratorio
E. coli S17-1 λpir	Cellule competenti di E. coli	WEIDI	DL2010S
E. coli WM3064	Cellule competenti di E. coli	BIO SCI BIO	C1039
E. coli RHO3	Cellule competenti di E. coli	Collezione di ceppi di laboratorio
pKV2	Il plasmide suicida modificato	Costruiti in questo studio
pLP12	plasmide suicida	Collezione di ceppi di laboratorio
pMCS2-LLtnp	Fornisce il frammento che trasporta Tn5	Collezione di ceppi di laboratorio
pKV2-LLtnp	Il plasmide modificato che trasporta il frammento Tn5.	Costruiti in questo studio
Pimers
LBF (ctgaaagcttctgcaggagctcgctgacccaacaatccttgattaagatgaggc)		Personalizzato
LBR (gttcagccaccattctgctcctgtcatgcggcgt)		Personalizzato
RBF (caggagcagaatggtggctgaacgggttgtgac)		Personalizzato
RBR (gatcctgcagcggagcggccgcgcagatcgcgggcaaggttagtc)		Personalizzato
checkF (ctatgcgcttcgcataccgtgc)		Personalizzato
checkR (gctcttgctcataattgtcctgg)		Personalizzato
TnpF (ggaatctagaccttgagtcgatatcactctcgtttaatgctg)		Personalizzato
TnpR (acaaacaaaaccaaattctgtacggcgaag)		Personalizzato
ori-F (taatcgccttgcagcacatc)		Personalizzato
ori-R (ggtatgagtcagcaacacct)		Personalizzato
5’ME (attcattaatgcagctggcacg)		Personalizzato