Articolo metodologico

Un sistema in vitro per applicare la forza di trazione alle cellule staminali scheletriche utilizzando un sistema di tensione a stress cellulare ciclico

46 visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/70570

⸱

12 giugno 2026

 ,  ,  , 
1Key Laboratory of Emergency and Trauma of Ministry of Education, Hainan Academy of Medical Sciences, Hainan Medical University

In questo articolo

Sommario

Le cellule staminali scheletriche periosteali (SSC) del topo sono state isolate tramite FACS e coltivate in vitro. È stato stabilito un sistema sperimentale controllabile per applicare la stimolazione meccanica ciclica a trazione agli SSC, con conseguente diminuzione dell'espressione dei geni cellulari associati alla senescenza, in particolare p16 e p21.

Abstract

L'osso è un importante organo meccanosensibile che risponde continuamente ai segnali fisici nel corpo. Sebbene la stimolazione meccanica svolga ruoli importanti nello sviluppo scheletrico, nell'omeostasi e nella riparazione delle lesioni, le risposte specifiche delle cellule staminali scheletriche (SSC) allo stress meccanico rimangono incompletamente comprese. Per affrontare questa domanda, abbiamo stabilito un modello in vitro per isolare le SSC periosteali del topo e applicare la stimolazione meccanica. Le cellule periosteali del topo sono state ottenute per la prima volta tramite digestione enzimatica, e le SSC sono state successivamente isolate tramite modulo cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) basato su marcatori superficiali già stabiliti. Dopo l'adesione alla coltura, gli SSC venivano sottoposti a stimolazione meccanica in trazione utilizzando un sistema ciclo-tensione a cellula elettrica. Questo sistema consente l'applicazione riproducibile della forza di trazione alle celle coltivate e fornisce una piattaforma per l'analisi delle risposte degli SSC all'input meccanico. Utilizzando questo approccio, abbiamo riscontrato che l'espressione dei geni cellulari associati alla senescenza p16 e p21 era notevolmente ridotta negli SSC dopo stimolazione meccanica. Questi risultati suggeriscono che la stimolazione a trazione possa influenzare i cambiamenti legati alla senescenza negli SSC in condizioni in vitro . Nel complesso, questo protocollo fornisce una piattaforma utile e adatta per studiare il comportamento delle SSC sotto stimolazione meccanica e per indagare come i segnali meccanici influenzino la funzione delle SSC.

Introduzione

Essendo il più grande e importante organo di supporto del corpo umano, il sistema scheletrico non solo fornisce siti di attacco e protezione ad altri organi, ma funge anche da base per la funzione motoria. Pertanto, il sistema scheletrico è costantemente esposto a vari stimoli meccanici sia dall'ambiente interno che esterno. I segnali di stimolazione meccanica sono altrettanto cruciali per lo sviluppo osseo e la manutenzione funzionale. Già nel 1893 si propose che esistesse una certa correlazione positiva tra la densità ossea e la forza meccanica che le ossa sopportano, che è la leggedi Wolff 1. Negli ultimi anni, alcuni studi hanno dimostrato l'importanza del sistema scheletrico che sopporta forze meccaniche per lo sviluppo normale delle ossa 2,3,4,5. La risposta del sistema scheletrico alla forza meccanica dipende in parte dai componenti cellularidell'osso 6. Gli osteociti rappresentano dall'85% al 90% dei componenti cellulari del sistema scheletrico. Grazie alla loro ampia distribuzione e alla morfologia unica delle cellule dendritiche, gli osteociti sono attualmente il tipo di cellula scheletrica più studiato in termini di rispostameccanica 7,8. Oltre alla ampiamente riconosciuta capacità degli osteociti di rispondere alla forza meccanica, anche le cellule precursori scheletriche svolgono un ruolo indispensabile in essa. È stato riscontrato che la risposta delle cellule precursori periosteali ai segnali meccanici regolava la loro trasformazione del destino, influenzando così la riparazione del dannotissutale 9.

Le cellule staminali scheletriche (SSC) sono un tipo di cellule staminali specifiche per tessuto con capacità di auto-rinnovamento, che possono differenziarsi in tipi di cellule ossee mature necessarie per la crescita, il mantenimento e la riparazione ossea. Nel 2015, sono stati identificati10 geni marcatori di superficie per le SSC dei topini. Successivamente, numerosi studi hanno anche dimostrato che le SSC svolgono un ruolo molto importante in vari aspetti come lo sviluppo osseo, il mantenimento dell'omeostasi e la riparazione delle lesioniossee 11,12. A causa della caratteristica del sistema scheletrico che risponde alle forze meccaniche, possiamo considerare i segnali di forza meccanica come un fattore indispensabile nella regolazione della funzione delle cellule staminali scheletriche. Per studiare i cambiamenti comportamentali delle SSC sotto stimolazione meccanica, dobbiamo stabilire un sistema sperimentale adeguato per l'applicazione della forza meccanica in vitro.

I principali metodi di stimolazione meccanica in vitro per le cellule includono la tensione di taglio del fluido, la tensione compressiva, la forza di trazione, la pressione idrostatica, la rigidità della matrice e la topologia dellamatrice 6,13. Sulla base dei geni marcatori superficiali delle SSC del topo, abbiamo ottenuto SSC periostali del topo tramite ordinamento della citometria a flusso, poiché le SSC coinvolte nella riparazione delle fratture provengono principalmente dalperiosteo 14. Successivamente, una forza di trazione appropriata fu applicata agli SSC periostali tramite un sistema di tensione a celle cicliche e tensione. Dopo la stimolazione della forza di trazione, si possono ottenere campioni cellulari e si possono effettuare analisi multi-omiche, inclusi sequenziamento del trascrittoma, sequenziamento proteomico e ATAC-seq. Pertanto, l'istituzione di questo protocollo fornisce una solida base per studiare le risposte delle SSC alla stimolazione meccanica.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Gli esperimenti con topi in questo protocollo sono stati tutti approvati dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto di Biochimica e Biologia Cellulare di Shanghai, Accademia Cinese delle Scienze (SIBCB-S350-2312-41).

1. Isolamento delle cellule periosteali nei topi

  1. Metti topi da 4 a 6 settimane in una scatola di eutanasia CO₂ ed esponili continuamente alla CO₂ per 3 minuti finché la respirazione non si interrompe.
  2. Disinfettare la superficie del corpo dei topi con alcol al 75%. Usa forbici oftalmiche per separare gli arti posteriori. Successivamente, usare pinze appuntite e forbici oftalmiche per rimuovere i muscoli scheletrici dagli arti posteriori, assicurando che le regioni articolari del femore e della tibia rimangano intatte.
  3. Conservare le ossa isolate in PBS raffreddato, poi ricoprire entrambe le estremità delle ossa con agarosio a bassa fusione (5-10% in tampone TAE).
  4. Digerire femori e tibie in mezzo essenziale alfa (α-MEM) contenente 1 mg/mL di collagenasi, 2 mg/mL dispasi II e 0,1 mg/mL DNasi I a 37°C e 0,3 × g per 30 minuti due volte. Raccogliere le cellule digerite nel mezzo di coltura (α-MEM + 10% siero fetale bovino (FBS)).
  5. Filtrare la sospensione della cella attraverso un filtro a 40 μm e poi centrifugare a 500 × g per 5 minuti per rimuovere il soprantantante.
  6. Sospendere il precipitato cellulare con il tampone di lisi dei globuli rossi per 2 minuti e terminare la reazione con il tampone di citometria a flusso (PBS + 2% FBS).
  7. Centrifuga le celle a 500 × g per 5 minuti e scarta il soprandante. Risospendere le cellule con un buffer di citometria a flusso a 1 × 107 cellule/mL per la selezione cellulare.

2. Ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza

  1. Tingi la sospensione cellulare con i seguenti anticorpi come segue: Anti-topo coniugato PerCP/Cy5.5 CD45, Anti-topo coniugato PerCP/Cy5.5 CD31, Anti-topo coniugato PerCP/Cy5.5 Ter119, Anti-topo coniugato FITC 6C3/Ly-51, Anti-topo coniugato Violet brillante 605 CD90.2, Anti-topo coniugato PE/Cy7 CD105, Anti-topo coniugato APC CD200.
  2. Diluire gli anticorpi sopra elencati in un rapporto di 1:500 e incubarli sul ghiaccio per 30 minuti, protetti dalla luce.
  3. Lavare le cellule con un buffer di citometria a flusso ed eseguire la selezione cellulare con un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza per ottenere gli SSC CD45- CD31- Ter119- CD90.2- 6C3- CD105- CD200+ . Raccogli gli SSC ordinati con il mezzo di coltura. Analizza i dati acquisiti con il software FlowJo v10.8.1.
  4. Espandere gli SSC selezionati in piatti di coltura con mezzo di espansione in un incubatore di celluleCO2 al 5%. Un passaggio poteva essere eseguito prima della stimolazione meccanica.
    NOTA: Da ogni coppia di topi di 6 settimane si possono ottenere circa 1 × 105 SSC periosteali.

3. Stimolazione meccanica degli SSC

  1. Diluire il collagene tipo I della coda di ratto in acido acetico sterilizzato 0,02 M fino a una concentrazione finale di 0,15 mg/mL. Questa soluzione può essere riutilizzata 3 volte e deve essere mantenuta a 4 °C.
  2. Aggiungi 1,5 mL di collagene diluito di tipo I per coda di ratto in ogni pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzi con fondo flessibile. Dopo aver ricoperto le piastre per 1 ora a temperatura ambiente, aspirare l'eccesso di collagene e lavare le piastre una volta con PBS per un uso successivo.
  3. NOTA: Per un uso immediato, il piatto deve essere risciacquato con PBS per rimuovere qualsiasi residuo di acido. Prima di conservarlo a 4 °C, il piatto dovrebbe essere completamente asciugato con il coperchio rimosso.
  4. Digerire le SSC periosteali del topo colto, centrifugare a 500 × g per 5 minuti, risospendere il precipitato cellulare nel mezzo di coltura per raggiungere una densità cellulare di 1 × 105 cellule/mL, aggiungere 2 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzo della piastra di coltura a fondo flessibile a 6 pozzi e posizionarlo nell'incubatore cellulare.
  5. 24 ore dopo la semina delle cellule, si posiziona la piastra di coltura a fondo flessibile nella piastra di base allungata e si mantiene un'altra piastra di coltura a fondo flessibile come gruppo di controllo senza stimolazione della forza meccanica.
  6. Imposta i parametri nel software FX-6000 Versione 1.0 come segue: resistenza di stretching 8%, frequenza 0,1 Hz, forma d'onda come onda quadrata, duty cycle della forma d'onda 80% e durata di stretching per 12 ore.
    NOTA: Ci sono quattro posizioni sulla piastra di base allungata per posizionare una piastra di cultura a 6 pozzi con fondo flessibile. Se le cellule richieste per l'esperimento sono inferiori a 4, le posizioni vuote dovrebbero essere riempite con nuove piastre di coltura a fondo flessibile a 6 pozzi. Dopo aver applicato una stimolazione meccanica appropriata, gli SSC possono essere sottoposti a test funzionali, come la differenziazione o proliferazione cellulare, oppure possono essere estratti campioni per il sequenziamento multi-omic.

4. PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR)

  1. Dopo aver completato la stimolazione meccanica delle cellule, si elimina il mezzo di coltura, si lava le cellule una volta con PBS, si estrae l'RNA totale con il reagente TRIzol ed esegui la trascrizione inversa dell'RNA.
    NOTA: Dopo il completamento dell'estrazione dell'RNA, può essere conservato a -80 °C. Il cDNA ottenuto dalla trascrizione inversa può anche essere memorizzato a -20 °C per i test successivi.
  2. Esegui la RT-qPCR con un sistema PCR in tempo reale. I set di innesco utilizzati erano i seguenti:
    Hprt: avanti 5'-GTTAAGCAGTACAGCCCCAAA-3',
    Hprt: rovescio 5'-AGGGCATATCCAACAAAACTT-3',
    p16: avanti 5'-GGTCACACGACTGGGCGATT-3',
    p16: rovescio 5'-GCACCGTTAGTTGAGCAAGAG-3',
    p21: avanti 5'-GCCTGGTTCCTTGACTTCTT-3',
    p21: Retro 5'-ATTACGGTTGAGTCCTAACTGCCATC-3'.

5. Gli effetti del trattamento a breve termine dello stress meccanico

  1. Imposta i parametri nel software FX-6000 Versione 1.0 come segue: resistenza di stretching 8%, frequenza 0,1 Hz, forma d'onda come onda quadrata, ciclo di lavoro dell'onda 80%. Le cellule vengono lisate con il tampone di lisi RIPA I (con cocktail inibitore della fosfatasi e cocktail inibitore della proteasi) a 10 minuti e 60 minuti dopo la stimolazione meccanica a tensione.
  2. Esegui il Western blot con Erk e anticorpi p-Erk.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Dopo l'implementazione di questo protocollo, la forza di trazione è stata applicata con successo agli SSC periostali dei topi. Innanzitutto, gli SSC sono stati ottenuti dal periosto dei topi tramite citometria a flusso. I risultati della citometria a flusso hanno mostrato che la proporzione di SSC al periosto rappresentava quasi il 30% del Lin- (CD45-, CD31-, Ter119-) CD90,2- 6C3- (Figura 1), molto più alto di quell...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Negli ultimi anni, i geni marcatori delle cellule staminali scheletrici provenienti da diverse parti delle ossa sono stati scoperticontinuamente 11,12,17. Tuttavia, la ricerca sulla regolazione diretta della funzione degli SSC deve ancora essere approfondita, specialmente nell'aspetto della regolazione della stimolazione della forza meccanica. Finora, la ricerca sugli effetti regolatori meccanic...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Ringraziamo la struttura centrale per la citometria a flusso e la struttura centrale per animali dell'Istituto di Biochimica e Biologia Cellulare di Shanghai, Accademia Cinese delle Scienze. Il lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32471190, 82502903) e dal Programma Provinciale di Esperti Stranieri di Hainan (506068033010).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
α-MEMCorning10-022-CVIsolamento cellule periostali
APC anti-mouse CD200BioLegend123809Ordinamento SSC
BioFlex 6-Well Culture Plate FlexcellBF-3001AColtura cellulare
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD90.2BioLegend140317Ordinamento SSC
CollagenaseSigmaC0130Isolamento cellule periostali
Dispase IISigmaD4693Isolamento cellule periostali
DNase ISigmaDN25Isolamento cellule periostali
Fetal Bovine SerumGibcoA5356701Ordinamento SSC
FITC anti-mouse 6C3/Ly-51BioLegend108305Ordinamento SSC
 Flexcell Tension System FlexcellFlexercell FX-6000 Tensione cellulare
Flow Cytometry SorterBDBD FACSAria FusionOrdinamento SSC
MesenCult Expansion Kit (Mouse)Stem cell05513Coltura cellulare
PE/Cy7 anti-mouse CD105BioLegend120409Ordinamento SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD31BioLegend102522Ordinamento SSC
PerCP/Cy5.5 anti-CD45BioLegend103132Ordinamento SSC
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TER-119BioLegend116228Ordinamento SSC
 PrimeScript RT Reagent KitTaKaRaRR037ART-qPCR
Rat tail type I collagenCorning354236Coltura cellulare
real-time PCR systemThermo Fisher ScientificQuantStudio 1 PlusRT-qPCR
 red blood cell lysis buffer Beyotime C3702Isolamento cellule periostali
TRIzolSigmaT9424RT-qPCR
Phosphatase Inhibitor Cocktail IIMCEHY-K0022WesternBlot
 RIPA Lysis Buffer ISangon BiotechNO. C500005WesternBlot
Protease Inhibitor Cocktail MCEHY-K0010WesternBlot
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antibody Cell Signaling Technology9102WesternBlot
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology4370WesternBlot

Riferimenti

  1. Wolff, J. Das Gesetz der Transformation der Knochen. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 19, 1222-1224 (1893).
  2. Li, X., et al. Stimulation of Piezo1 by mechanical signals promotes bone anabolism. eLife. 8, 49631(2019).
  3. Sun, W., et al. The mechanosensitive Piezo1 channel is required for bone formation. eLife. 8, 47454(2019).
  4. Wang, L., et al. Mechanical sensing protein PIEZO1 regulates bone homeostasis via osteoblast-osteoclast crosstalk. Nat Commun. 11, 282(2020).
  5. Zhou, T., et al. Piezo1/2 mediate mechanotransduction essential for bone formation through concerted activation of NFAT-YAP1-ß-catenin. eLife. 9, 52779(2020).
  6. Wang, L., et al. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res. 10, 16(2022).
  7. Qin, L., Liu, W., Cao, H., Xiao, G. Molecular mechanosensors in osteocytes. Bone Res. 8, 23(2020).
  8. Uda, Y., et al. Osteocyte Mechanobiology. Curr Osteoporos Rep. 15, 318-325 (2017).
  9. Wang, L., et al. Piezo1 balances the osteogenic-tenogenic plasticity of periosteal progenitor cells through the YAP pathway. Cell Rep. 44, 115630(2025).
  10. Chan, C. K., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160, 285-298 (2015).
  11. Feng, H., et al. Skeletal stem cells: origins, definitions, and functions in bone development and disease. Life Med. 1, 276-293 (2022).
  12. Yuan, G., et al. Skeletal stem cells in bone development, homeostasis, and disease. Protein Cell. 15, 559-574 (2024).
  13. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. J Cell Mol Med. 17, 823-832 (2013).
  14. Jeffery, E. C., et al. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells make distinct contributions to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29, 1547-1561 (2022).
  15. Liu, Y. L., et al. Fibrous periosteum repairs bone fractures and maintains the healed bone throughout mouse adulthood. Dev Cell. 59, 1192-1209 (2024).
  16. Hu, H., et al. ZKSCAN3 counteracts cellular senescence by stabilizing heterochromatin. Nucleic Acids Res. 48, 6001-6018 (2020).
  17. Li, Q., Xu, R., Lei, K., Yuan, Q. Insights into skeletal stem cells. Bone Res. 10, 61(2022).
  18. Shen, B., et al. A mechanosensitive peri-arteriolar niche for osteogenesis and lymphopoiesis. Nature. 591, 438-444 (2021).
  19. Yu, H. S., et al. Impact of mechanical stretch on the cell behaviors of bone and surrounding tissues. J Tissue Eng. 7, 2041731415618342(2016).
  20. Chang, X., Xu, S., Zhang, H. Regulation of bone health through physical exercise: Mechanisms and types. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1029475(2022).
  21. Ma, Q., et al. Significance of mechanical loading in bone fracture healing, bone regeneration, and vascularization. J Tissue Eng. 14, 20417314231172573(2023).
  22. Sakurai, M., Ishitsuka, K., Becker, H. J., Yamazaki, S. Ex vivo expansion of human hematopoietic stem cells and clinical applications. Cancer Sci. 115, 698-705 (2024).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Stimolazione MeccanicaModello In VitroCellule PeriosteeSmistamento CellulareFluorescence Activated SortingSenescenza CellulareMarcatori di Superficie

Articoli correlati