Articolo metodologico

Fabbricazione e applicazione chirurgica di idrogel arricchiti foto-reticolati gelatina–riboflavina per la riparazione delle ferite corneali nei conigli

DOI:

10.3791/70579

⸱

24 aprile 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, School of Medicine and Nursing, University of the Basque Country UPV/EHU, 2BEGIKER Ophthalmology Research Group, IIS Biobizkaia, 3Department of Ophthalmology, University Hospital of Cruces

In questo articolo

Sommario

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Viene presentato un protocollo riproducibile per la preparazione, l'arricchimento e l'applicazione di un idrogel in situ con luce blu e reticolabile gelatina–riboflavina per la riparazione della ferita stromale corneale nei conigli, inclusi i passaggi procedurali per la gestione chirurgica, la tarsorrafia parziale e le cure post-operatorie.

Abstract

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Questo articolo presenta un protocollo passo dopo passo per fabbricare, integrare e applicare chirurgicamente un idrogel gelatinoso reticolabile in situ con luce blu e reticolabile per la riparazione della ferita stromale corneale nei conigli. Il precursore dell'idrogel comprende gelatina al 5% (p/v) e fosfato di riboflavina allo 0,01% (p/v), preparata in condizioni sterili e protette dalla luce, filtrata sterile e riscaldata prima dell'uso per ottenere viscosità iniettabile. È dettagliata l'incorporazione opzionale di estratto di membrana amniotica umana o siero autologo del coniglio. La gelificazione on-demand viene attivata sulla superficie oculare tramite luce blu a λ = 420–480 nm per un totale di 2 minuti. Il metodo in vivo include una cheratectomia stromale anteriore riproducibile (diametro trefina 6,5 mm; profondità circa 187 μm), seguita da riempimento con idrogel, attivazione leggera e una tarsorrafia laterale parziale per stabilizzare il trattamento, favorire la guarigione della ferita e standardizzare l'assistenza post-operatoria. Gli esiti rappresentativi in vitro evidenziano un comportamento viscoelastico simile a un gel con assottigliamento da taglio e rapido recupero, e alta trasmittenza ottica (> 90%) oltre i 500 nm, indicando l'idoneità all'uso corneale. In vivo, i trattamenti a base di idrogel supportano una chiusura epiteliale progressiva, una buona tolleranza oculare (bassi punteggi di Draize a 3 e 7 giorni) e una perdita temporanea di idrogel visibile, compatibile con biodegradazione e sostituzione tissutale. Vengono evidenziati passaggi critici e punti di pausa per garantire la riproducibilità, incluso il controllo della temperatura durante la dissoluzione e la filtrazione, la protezione dalla luce e il posizionamento della lampada durante il crosslinking. Il protocollo consente stabilizzazione con idrogel attivata dalla luce senza suture e posizionata con precisione, compatibile con l'aggiunta di molteplici integratori bioattivi. Fornisce una piattaforma pratica per la valutazione preclinica di biomateriali oftalmici di nuova generazione e facilita la traduzione di terapie idrogel fotoreticolabili per la riparazione della ferita corneale.

Introduzione

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La cornea è una struttura trasparente e avascolare che rappresenta circa due terzi della potenza di rifrazione dell'occhio, rendendo la sua integrità strutturale e funzionale essenziale perla visione 1. A causa della sua esposizione diretta all'ambiente esterno, la cornea è altamente suscettibile a traumi, infezioni, lesioni chimiche e complicazioni post-operatorie 2,3. Il mancato ripristino rapido ed efficace dell'integrità epiteliale può portare a difetti epiteliali persistenti (PED) e ulcere corneali croniche, causando infine scioglimento stromale, perforazione, cicatrici e perdita visiva irreversibile 4,5. Le terapie convenzionali—inclusi lubrificanti, profilassi antibiotica e colliri sierosi autologhi—spesso offrono solo un beneficio parziale e non favoriscono adeguatamente la riparazione stromica in difetti da moderati a gravi 6,7,8.

Per affrontare queste limitazioni, le terapie basate su biomateriali si sono emerse come alternative promettenti grazie alla loro capacità di proteggere la ferita, supportare la riparazione epiteliale e ripristinare il tessuto stromale 9,10,11,12,13,14. Gli idrogel sono particolarmente attraenti per la loro biocompatibilità, trasparenza ottica, comportamento meccanico regolabile e capacità di incorporare agenti terapeutici. Sia idrogel naturali che sintetici, tra cuigelatina 15,16,17, collagene 18,19, chitosano20,21, polietilenglicole (PEG)22,23 e acido ialuronico18,24, hanno dimostrato potenziale nel favorire la guarigione delle ferite corneali. Tra questi, gli idrogel a base di gelatina sono particolarmente preziosi per la loro composizione derivata dal collagene e i motivi di adesione cellulare intrinseca.

Gli idrogel foto-reticolabili offrono un vantaggio aggiuntivo consentendo la solidificazione su richiesta direttamente sulla superficie oculare, consentendo una posizione precisa e una maggiore stabilità meccanica senza suture. Il reticolamento mediato dalla riboflavina, originariamente sviluppato per il trattamento del cheratocono, è stato recentemente adattato per la fotopolimerizzazione con idrogel grazie alla sua eccellente biocompatibilità, sicurezza oftalmica e capacità di generare specie reattive di ossigeno che inducono il crosslinking sotto luce visibile o UV25,26. La luce blu (≈445 nm) è particolarmente vantaggiosa per applicazioni corneali, consentendo un crosslinking efficiente evitando rischi associati airaggi UV 27,28,29.

Questo articolo presenta la fabbricazione, l'arricchimento e l'applicazione chirurgica di un idrogel fotoreticolabile composto dal 5% (p/v) di gelatina e 0,01% (p/v) di riboflavina fosfato (RFP). È previsto un protocollo dettagliato per la preparazione in vitro di idrogel, inclusa l'incorporazione opzionale di estratto di membrana amniotica umana (HAMe) o siero autologo (AS), nonché applicazione in vivo in un modello di cheratectomia stromale di coniglio. È noto che HAMe esercita effetti antinfiammatori, antifibrotici e pro-rigeneratori sulla superficieoculare 30,31,32,33,34,35, mentre il siero autologo fornisce concentrazioni lacrimose di vitamina A, EGF, fibronectina e altri fattori di crescita essenziali per la rigenerazione epiteliale 36,37,38. Insieme, questi elementi supportano la ri-epitelializzazione, riducono l'infiammazione e potenzialmente prevengono la degradazione stromica39,40.

Sebbene l'approccio descritto offra fotopolimerizzazione controllata e bioattività personalizzabile, la sua applicabilità è attualmente limitata a difetti superficiali e mid-stromali e richiede un'esposizione in linea di vista alla luce blu, che può limitare l'uso in tessuti opachi o profondamente infiltrati. Integrando la preparazione e l'arricchimento dell'idrogel, la gestione oftalmica e la cura postoperatoria, inclusa la tarsorrafia laterale parziale, questo articolo offre un approccio riproducibile che supporta la riparazione corneale, facilita la traduzione delle tecnologie idrogel attivate dalla luce nella pratica clinica e contribuisce allo sviluppo di piattaforme standardizzate per la ricerca rigenerativa corneale.

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Protocollo

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Le placente umane sono state prelevate da donatori con consenso informato, in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e con l'approvazione del Comitato Etico dell'Ospedale Universitario di Cruces (numero di approvazione CEIC E15/03). Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico della Ricerca Animale dell'Università dei Paesi Baschi (UPV/EHU) (numero di approvazione CEEA M20/2023/038) e sono stati conformi alla Dichiarazione ARVO per l'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva. Tutte le procedure sono state condotte presso la struttura veterinaria UPV/EHU (SGIker), mantenendo una tecnica sterile per tutta la durata (armadio di biosicurezza Classe II durante la gestione di biologici).

1. Sintesi idrogel

  1. Soluzioni precursori di gelatina–riboflavina (5% e 10% w/v)
    NOTA: Lavorare in condizioni di luce fioca o utilizzare bottiglie ambrate o bottiglie avvolte in carta stagnola di alluminio per proteggere la soluzione dall'esposizione alla luce. Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare quando l'idrogel è destinato a uso biologico.
    1. Pesare le quantità richieste di gelatina e riboflavina fosfato (RFP): per 10 mL di precursore RFP al 5% (a/v) + 0,01% (a/v) di RFP, pesare 500 mg di gelatina e 1 mg di RFP. Per 30 mL di stocco RFP al 10% (a/v) + 0,02% (a/v) di RFP, pesare 3 g di gelatina e 6 mg di RFP.
    2. Aggiungi la gelatina e la RFP al volume corrispondente di acqua deionizzata (≈90% del volume finale). Mescola delicatamente finché la polvere non è completamente dispersa.
    3. Regolare il pH a 7,0 usando 1 M di NaOH, aggiungendo la base a goccia mentre monitora il pH. Annota il volume di NaOH usato e il volume finale regolato. Dopo la regolazione del pH, porta le soluzioni al volume finale con acqua deionizzata.
    4. Sciogliere e omogeneizzare la soluzione a 80 °C sotto mescolamento magnetico a 200 giri/min per 30 minuti.
      NOTA: Maneggiare le soluzioni calde (>70–80 °C) usando guanti resistenti al calore.
    5. Lascia raffreddare le soluzioni a 30–40 °C e filtrale attraverso filtri a membrana idrofila di polieterosolfone (PES) da 0,22 μm in bottiglie ambrate sterili.
      NOTA: Riscaldare delicatamente le soluzioni viscose (≈ 40–50 °C) prima della filtrazione se necessario; evitare il surriscaldamento.
    6. Etichetta le bottiglie con la composizione, la data e le iniziali dell'operatore. Conserva le soluzioni di idrogel filtrate a 4 °C fino all'uso, assicurandoti che il periodo di conservazione non superi le 2 settimane dal momento della preparazione.
  2. Idrogel gelatinosi integrati (volume finale: 10 mL)
    1. Prepara siero autologo (AS) o estratto di membrana amniotica umana (HAMe) seguendo le procedure descritte nelle sezioni 4 e 5. Conserva gli estratti sterili e raffreddati fino all'utilizzo.
    2. Per ogni 10 mL di idrogel arricchito, si mescolano 5 mL della stocca RFP al 10% (p/v) + 0,02% (p/v) e 5 mL dell'estratto biologico corrispondente (AS o HAMe).
      NOTA: Riscaldare delicatamente le soluzioni viscose (≈ 40–50 °C) prima della filtrazione se necessario; evitare il surriscaldamento.
    3. Filtrare la soluzione calda attraverso un filtro a membrana idrofila PES da 0,22 μm in bottiglie ambrate sterili.
    4. Etichetta e conserva gli idrogel a 4 °C fino all'uso. Assicurati che il periodo di conservazione non superi le 2 settimane dal momento della preparazione.
      NOTA: Smaltire tutti i rifiuti secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza.

2. Applicazione in vitro di idrogel

  1. Preparare le formulazioni di idrogel come descritto nella Sezione 1 e mantenerle a 32 °C prima dell'applicazione per mantenere una viscosità adeguata.
  2. Utilizzando la tecnica sterile, pipettare il volume richiesto di idrogel nel pozzo bersaglio, nello stampo, nel piatto o nel substrato (Figura 1A).
  3. Posizionare la lampada di polimerizzazione Led-C 2 cm sopra la superficie dell'idrogel. Avviare il reticolamento in situ esponendo l'idrogel alla luce blu (λ = 420–480 nm) e a una potenza luminosa di 850-1000 mW/cm2 per una durata totale di 2 minuti. Fornire l'illuminazione come sei impulsi di 20 secondi, inserendo pause di 5–10 secondi tra un impulso e l'altro per prevenire il riscaldamento locale (Figura 1B).
  4. Confermare la gelificazione completa visivamente e toccando delicatamente la superficie con uno strumento sterile per garantire la formazione di un idrogel solido e manipolabile (Figura 1C,D).
  5. Utilizzare immediatamente l'idrogel reticolato o conservarlo a 4 °C in condizioni sterili adatte all'applicazione a valle.
    NOTA: Mantieni la tecnica asettica durante tutta la procedura. Evita l'esposizione diretta di pelle o occhi all'irradiazione da luce blu.

3. Procuramento della membrana amniotica umana (HAM)

NOTA: Utilizzare solo placente di donatori sieronegativi che hanno fornito un consenso informato e soddisfano i requisiti istituzionali ed etici.

  1. Idoneità e consenso del donatore
    1. Confermare che ogni donatore sia stato selezionato e sia risultato negativo per HIV di tipo 1 e 2, epatite B e C e sifilide.
    2. Ottieni il consenso scritto informato di ciascun donatore prima dell'intervento.
    3. Ottenere placente umane immediatamente dopo i parto cesarei elettivi di donatori sani.
  2. Raccolta e trattamento iniziale
    1. Raccogli ogni placenta in un contenitore sterile in acciaio inox immediatamente dopo il parto.
    2. In sala operatoria, risciacquare la placenta in modo approfondito con soluzione salina sterile per rimuovere i coaguli di sangue. Identificare l'amnion—la membrana trasparente più interna che riveste la cavità amniotica—e separarla con cura dal corione sbucandola dolcemente verso il bordo placentare con pinze sterili.
      NOTA: Maneggiare le membrane con attenzione per evitare strappi.
    3. Dopo la completa separazione, fissare pezzi sterili del filtro di nitrocellulosa alla superficie stromale del HAM per facilitarne la manipolazione e standardizzarne la divisione. Dividere il HAM in tre regioni definite (Figura 2A,B): amnnio distale: sezione larga 10 cm, amnnio mediale: sezione larga 10 cm, amnnio prossimale: sezione che si estende fino al bordo placentare.
  3. Trasporti
    1. Inserire ogni frammento di HAM in una bottiglia sterile, immergendolo nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con 1,25 μg/mL di anfotericina B, 50 μg/mL di penicillina-streptomicina e 50 μg/mL di neomicina.
    2. Etichetta chiaramente ogni bottiglia con il codice donatore, la data e la regione di origine (distal, mediale o prossimale).
    3. Trasportare immediatamente i campioni in laboratorio in condizioni di refrigerazione pulite e asettiche (4 °C).
      NOTA: Trasportare le membrane in confezioni triple sigillate conforme alla norma ONU 3373 (Sostanza Biologica, Categoria B), in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza che regolano i tessuti umani.
  4. Lavorazione in laboratorio
    NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in un armadietto di sicurezza biologica di Classe II in condizioni sterili.
    1. Taglia ogni frammento distal, mediale e prossimale di HAM in quadrati di 4,0–4,5 × 4,0–4,5 cm usando forbici sterili.
    2. Immergi i frammenti in DMEM già integrato con antibiotici e spazzola delicatamente con pinze sterili per rimuovere residui di sangue. Lava in DMEM contenente 50 μg/mL di penicillina-streptomicina per 2 x 5 minuti.
    3. Lava in DMEM senza antibiotici per 2 x 5 minuti.
    4. Lavare questi frammenti selezionati in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
    5. Trasferire ogni frammento in un tubo sterile da 5 mL senza alcun mezzo di coltura. Congelare i campioni direttamente a –80 °C fino a un ulteriore utilizzo.

4. Preparazione dell'estratto di membrana amniotica umana (HAMe)

NOTA: Eseguire tutti i passaggi in condizioni asettiche e fredde per minimizzare la degradazione e la contaminazione delle proteine.

  1. Recuperare i tubi contenenti frammenti di membrana amniotica umana (HAM) conservati a −80 °C. Immergere i tubi nell'azoto liquido per 5 minuti per indurire il tessuto.
  2. Trasferire ogni frammento congelato in una malta pre-raffreddata (−80 °C) e schiacciarlo accuratamente con un pestello finché non si ottiene una polvere morbida e omogenea.
  3. Pesa immediatamente il campione in polvere su una piastra di bilanciamento per minimizzare lo scongelamento. Trasferisci la polvere pesata in un tubo da 5 mL e risospendila in 3 mL di PBS integrato con un cocktail inibitore della proteasi da 5 μL/mg.
    NOTA: Tieni tutti i tubi sul ghiaccio durante la lavorazione per preservare l'integrità proteica.
  4. Sonica ogni campione per 20 minuti all'ampiezza del 90% usando il sonicatore e la sonda di 1,5 mm di diametro, applicando cicli di 15 s acceso / 15 secondi spento per evitare il surriscaldamento.
  5. Centrifugare i lisati a 3.000 × g per 10 minuti a 4 °C. Raccogliere con cura il soprannatante senza disturbare il pellet.
  6. Filtrare il sovrandanante attraverso un filtro a membrana idrofila PES da 0,22 μm utilizzando condizioni sterili. Aliquota l'HAMe filtrato in microtubi da 0,2 mL. Conservare le aliquote a −80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
    NOTA: Assicurarsi che il periodo di conservazione non superi i 6 mesi dal momento della preparazione.

5. Estrazione di siero autologo derivato dal sangue dai conigli

NOTA: Eseguire tutte le procedure per i sami in vivo nei conigli bianchi neozelandesi (≈2 kg) con l'approvazione del Comitato Etico della Ricerca Animale dell'istituzione corrispondente e in conformità con le linee guida istituzionali.

  1. Anestetizzare localmente il coniglio con lidocaina (topica o sottocutanea) nel sito della venipuntura.
  2. Raccogliere sangue dall'arteria centrale dell'orecchio in tubi di raccolta da 4,5 mL contenenti un separatore di gel polimerico (Figura 3A,B). Lasciare che il sangue coaguli per 2 ore a RT senza agitazione (Figura 3C).
  3. Centrifugare i campioni a 1.000 × g per 15 minuti a RT. Raccogliere il soprantantante (siero), che costituisce il siero autologo del coniglio (AS) (Figura 3D).
  4. Filtrare il siero attraverso un filtro a membrana idrofila PES da 0,22 μm. Mettere in tubi sterili da 0,2 mL e conservare a −80 °C fino all'uso.
    NOTA: Assicurarsi che il periodo di conservazione non superi i 6 mesi dal momento della preparazione.

6. Intervento chirurgico in vivo

NOTA: Eseguire tutte le procedure sperimentali in conformità con il Comitato Etico della Ricerca sugli Animali dell'istituzione corrispondente e rispettare i Principi della Dichiarazione di Helsinki e la Dichiarazione ARVO sull'Uso degli Animali nella Ricerca Oftalmica e Visiva.

  1. Preparazione preoperatoria
    NOTA: Utilizzare conigli bianchi neozelandesi (≈2 kg) come modello animale.
    1. Prima dell'intervento, somministrare anestesia generale tramite iniezione intramuscolare nella coscia degli animali utilizzando: ketamina a 1 mL/kg (50 mg/mL) e xilazina a 0,3 mL/kg (20 mg/mL). Confermare l'assenza del riflesso corneale e del piede prima di procedere.
    2. Posizionare l'animale in una posizione di decubito laterale su una piattaforma chirurgica sterile e disinfettare la regione perioculare con soluzione di povidone-iodio. Posizionare uno speculum palpebrale sull'occhio operatorio per mantenere un'esposizione continua della superficie oculare durante la procedura.
  2. Ceratectomia stromaica anteriore
    1. Centrare una trefina a vuoto di 6,5 mm di diametro sulla cornea del coniglio (Figura 4A). Applicare aspirazione per stabilizzare il dispositivo e ruotare la trefina di tre quarti di giro, raggiungendo una profondità stromale approssimativa di 187 μm.
    2. Eseguire una cheratectomia stromaica anteriore all'interno dell'area trefineta utilizzando una lama a mezzaluna, rimuovendo gli strati epiteliali e stromali anteriori fino a ottenere un letto liscio della ferita (Figura 4B).
  3. Applicazione in vivo dell'idrogel
    1. Riempire il difetto corneale con 50 μL della corrispondente formulazione idrogel, preriscaldata a 32 °C per garantire una viscosità ottimale (Figura 4C).
    2. Avviare il crosslinking in situ illuminando la superficie corneale con luce blu (λ= 420–480 nm) per 2 minuti. Fornire sei impulsi da 20 s con pause di 5–10 s tra un impulso e l'altro per limitare il riscaldamento locale (Figura 4D).
  4. Tarsorrafia laterale parziale
    1. Identificare il terzo nasale dei margini superiore e inferiore delle palpebre per consentire l'esposizione mediale per l'osservazione e il trattamento.
    2. Posizionare la prima sutura (utilizzare 1–2 suture a seconda della lunghezza e stabilità della palpebra necessaria) (Figura 4E).
      1. Afferra il margine laterale superiore della palpebra con la pinza. Fai passare l'ago attraverso la linea grigia/margine della palpebra dal lato cutaneo al lato congiuntivale, facendo un morso a piena spessore ma evitando se possibile penetrazioni profonde nella placca tarsale.
      2. Far passare l'ago attraverso il punto corrispondente del margine inferiore della palpebra dal lato congiuntivale al lato cutaneo per creare l'apposizione dei margini della palpebra.
      3. Legare il punto con un nodo chirurgo sicuro e due nodi quadrati, lasciando il nodo sulla superficie cutanea posizionato leggermente sul lato esterno del margine della palpebra piuttosto che direttamente sopra di esso.
      4. Posizionare una seconda sutura circa 3–4 mm medialmente rispetto alla prima se è necessaria maggiore stabilità, utilizzando la stessa sutura a forma di U a spessore completo o una semplice cucitura interrotta.
      5. Taglia le code dei punti a 3–4 mm per ridurre l'irritazione, lasciando abbastanza lunghezza per la rimozione successiva.
      6. Confermare che la posizione della palpebra protegga la cornea trattata, consentendo al contempo la congiuntiva/cornea mediale e temporale per l'ispezione e il trattamento con gocce. Assicurarsi che la tarsorrafia non sia troppo stretta e che le palpebre dell'animale non siano ischemiche (Figura 4F).
  5. Monitoraggio e cura postoperatoria
    1. Somministrare buprenorfina a 0,05 mg/kg tramite iniezione sottocutanea prima della cheratectomia e ogni 12 ore per 72 ore per fornire analgesia.
    2. Inietta 3 mg/mL di colliri oculari di Tobramicina due volte al giorno fino alla chiusura completa della ferita per prevenire infezioni.
    3. Applica una goccia di lacrime artificiali al 0,2% di acido ialuronico (HA) su tutti gli occhi, compresi i controlli, quattro volte al giorno per mantenere l'idratazione corneale.
    4. Ispezionare la tarsorrafia almeno due volte al giorno per eventuali segni di allentamento dei punti di sutura, infezione, necrosi locale dei tessuti o tensioni eccessive. Tenere l'animale sotto osservazione per comportamenti normali, alimentazione e segni di fastidio oculare.
    5. A 72 ore dopo la procedura, taglia il nodo di sutura e ritira delicatamente ogni punto con la pinza, facendo attenzione a non trascinare contaminanti sulla superficie congiuntivale.
    6. Ispezionare i margini delle palpebre per la corretta guarigione e la superficie corneale per verificare l'integrità epiteliale. Continuare il trattamento oculare secondo necessità fino a quando non si osserva la completa chiusura epiteliale.
    7. Monitorare e registrare la guarigione oculare e i segni clinici dal giorno 3 al 7, valutando la chiusura epiteliale, l'opacità e la neovascolarizzazione tramite microscopia a lampa a fessura e colorazione con fluoresceina.
      NOTA: Se dovesse manifestarsi qualsiasi segno di ischemia, deiscenza della ferita o grave irritazione, rimuovere immediatamente la sutura o le suture e gestirle di conseguenza.
  6. Valutazione dell'irritazione oculare acuta
    1. Immobilizza delicatamente il coniglio con un avvolgimento per asciugamano o coperta. Esamina prima l'iride e la congiuntiva sotto luce bianca.
    2. Punteggiare rossore congiuntivale, chemiosi (edema) e secrezione secondo la scala di Draize (vedi Tabella 1 e Tabella 2).
    3. Annota tutti e sei i parametri di Draize nella scheda tecnica. Calcola l'indice di irritazione oculare (OII) come somma dei punteggi dei componenti; OII varia da 0 a 110, dove valori più alti indicano un'irritazione più forte.
    4. Classificare ogni occhio secondo le categorie Kay–Calandra basate sull'OII; registrare la categoria nel dataset.
  7. Documentazione fotografica della guarigione delle ferite
    1. Inietta soluzione di fluoresceina (5 μL) nel sacco congiuntivale inferiore.
    2. Illuminare l'occhio con luce blu e valutare l'opacità corneale (densità e area) e l'entità della colorazione con fluoresceina.
    3. Impostare la fotocamera con bilanciamento del bianco regolato manualmente, zoom ottico disabilitato e posizionare circa 3 cm dall'occhio per catturare tutte le immagini utilizzando parametri identici durante le sessioni. Acquisire immagini dopo l'instillazione con fluoresceina con e senza illuminazione alla luce blu per delineare i difetti epiteliali. Acquisire immagini al giorno 0 (pre-tarsorrafia) e quotidianamente dal giorno 3 (dopo la rimozione della tarsorrafia) fino alla chiusura epiteliale completa.
    4. Analizza le immagini con il software ImageJ e quantifica l'area delle regioni colorate dalla fluoresceina.
      NOTA: La documentazione fotografica dei giorni 1 e 2 di solito non è fattibile a causa della tarsorrafia parziale. Indicare che le immagini dei giorni 1 e 2 sono mancanti dal dataset e segnalare eventuali eventi avversi (ad esempio, abrasione corneale incidentale).
  8. Eutanasia e raccolta dei tessuti
    1. Al giorno 21 (dopo il periodo di valutazione di entrambi gli occhi), gli animali sono anestesiati in profondità utilizzando ketamina (2 mL/kg) e xilazina (0,6 mL/kg) somministrate intramuscolarmente.
    2. Eutanasia tramite iniezione endovenosa di 10 mL di cloruro di potassio saturo (KCl) nella vena marginale dell'orecchio.
    3. Confermare la morte per insorgenza di rigor mortis e assenza di riflessi vitali prima di procedere al prelievo del tessuto.

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Risultati

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Sintesi e caratterizzazione dell'idrogel
L'idrogel è stato sintetizzato e valutato in vitro per determinarne le proprietà reologiche e ottiche prima e dopo il foto-crossing. La reologia di taglio è stata utilizzata per caratterizzare viscoelasticità, elasticità e comportamento del flusso. Le scansioni di frequenza hanno mostrato che G′ rimaneva superiore a G" su tutte le frequenze testate, indicando un comportamento simile a un solido (Fi...

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Discussione

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L'attuale protocollo fornisce un flusso di lavoro riproducibile per la preparazione, il carico e l'applicazione di un idrogel gelatina–riboflavina fotoreticolabile per la guarigione delle ferite corneali. Diversi passaggi in vitro sono fondamentali per ottenere una qualità del gel costante e meritano enfasi perché sono le fonti di variabilità più frequenti. Innanzitutto, mantenere la soluzione precursore a 80 °C durante la mescolare garantisce la completa dissoluzione di gelatin...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio di ricerca è stato finanziato da sovvenzioni del Dipartimento della Salute del Governo Basco (2023111027 e IT524-22). C.R.-V. è stato sostenuto da una borsa di studio dell'Università dei Paesi Baschi UPV/EHU. Il supporto tecnico nella cura degli animali e il Servizio di Microscopia Analitica e ad Alta Risoluzione forniti da SGIker (UPV/EHU) è gratamente riconosciuto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amphotericin BGibco (Thermo Fisher Scientific)15290018Concentrazione finale: 1,25 µg/mL
Siero autologo, coniglio (AS)Preparato in casa-Preparato dal sangue intero; filtrato attraverso 0,22 µm PES
Lampada di polimerizzazione LED bluWoodpecker Medical Instrument CoModello LED.CLunghezza d'onda: λ=420–480 nm; Distanza: 1–2 cm; Potenza luminosa: 850-1000 mW/cm2
Buprenorfina (Buprecare)Ecuphar578950Dose: 0,05 mg/kg, iniezione sottocutanea ogni 12 h per 72 h
FotocameraPanasonicLUMIX TZ35Fotocamera dotata di ottica Leica
Piastra di riscaldamento con agitazione digitale CimarecThermo Fisher ScientificSP131320-33220-240 V, Temperatura massima: 540 °C
Lama microchirurgica a mezzalunaBVI Medical373807-
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)Gibco (Thermo Fisher Scientific)11966025-
Eppendorf tube (0,2 mL)Merck KGaA30124707Mantenuti al freddo per la preparazione HAMe; aliquotazione
Eppendorf tube (5 mL)Merck KGaA30119606Mantenuti al freddo per la preparazione HAMe; aliquotazione
Soluzione di fluoresceina NovartisColorcusi FluotestSoluzione di Fluorescein 2%, 5 µl gocce per gli occhi
Gibco NeomicinaMerck KGaAN1142Concentrazione finale: 50 µg/mL
Polvere di gelatinaSigma AldrichG1890Sciolta a 80 °C; pH regolato a 7,0
Lacrime artificiali all'acido ialuronico (0,2%)Chem.-pharm. Fabrik GmbHHylo-Tear-
Software di elaborazione delle immagini ImageJNational Institute of Mental Health-Sviluppato da Wayne Rasband presso il Research Services Branch
Ketamine (Ketolar)Pfizer631028.1
LidocainaVet OneNDC 13985-222-04Iniezione topica o sottocutanea
Penicillina-StreptomicinaGibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Concentrazione finale: 50 µg/mL
Filtri per siringhe PES, 0,22 µm0,22µm (Millex)Merck KGaASLGP033RS-
Soluzione salina tamponata con fosfati (PBS)Sigma AldrichP4417-100TAB-
Cocktail di inibitori delle proteasiSigma AldrichP8340Aggiunto a 5 µL per mg di tessuto
Soluzione di iodio-povidoneMeda pharma7167204Disinfezione preoperatoria
Fosfato di riboflavina (RFP)Sigma AldrichR0630000Concentrazioni: 0,01% w/v (finale); 0,02% w/v (stock)
SonicatoreBandelein electronicSonoplus GM mini20-
Sonda per sonicatoreBandelein electronicMS 1.5Sonda di 1,5 mm di diametro, 63 mm di lunghezza.
Suture per tarsoraffia (non riassorbibili)Alcon 80653080011–2 suture secondo necessità
Soluzione oftalmica di tobramicina (3 mg/mL)NovartisTobrexDosaggio: due volte al giorno fino alla chiusura
Trephina Hessburg-Barron, diametro 6,5 mmJedmed21-8265-
Tubetti per prelievo di sangue Vacutainer con separatore in gel polimericoBD (Becton, Dickinson and Company)367704-
Soluzione di xilazinaLaboratorios Calier SAXylagesicDose: 5 mg/kg iniezione intramuscolare

Riferimenti

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