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Dichiarazione etica
Tutte le procedure sugli animali sono state esaminate e approvate dal Comitato Etico Animale del Laboratorio Biotecnologico di Fujian Ambry, numero di approvazione: IACUC FJABR2024031202). Eseguire tutti gli esperimenti con animali in conformità con il protocollo istituzionale approvato per la cura e l'uso degli animali.
SDD e preparazione dell'ibuprofene
La SDD è composta da Shixiao San (9 g), Xiangfu (9 g), Moyao (6 g), Guizhi (9 g), Weilingxian (12 g), Shijianchuan (20 g), Yanhusuo (12 g), Danggui (9 g), Liujinu (15 g) e Xiaohuixiang (5 g). Shixiao San è composto da Puhuang (4,5 g) e Wulingzhi (4,5 g). Tutti i componenti erboristici venivano utilizzati come granuli concentrati e sono elencati nella Tabella dei Materiali. Preparare la SDD dissolvendo 106 g di granuli concentrati in 200 mL di acqua bollente per ottenere una concentrazione finale di 0,53 g/mL equivalente di farmaco greggio. Mescola accuratamente finché i granuli non sono completamente sciolti, lascia raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e somministra tramite gavage intragastrico a 2,5 mL/kg per somministrazione. Preparare la sospensione dell'ibuprofene in base alla concentrazione richiesta per la gavage intragastrica. Somministrare ibuprofene a 0,02 g/kg come trattamento di controllo positivo.
Animali e raggruppamento
Utilizzare 36 ratti Sprague-Dawley adulti sani di grado specifico privo di patogeni, di età 2–3 mesi e con un peso di 200 ± 20 g, senza precedenti di gravidanza o accoppiamento. Mantieni i ratti in un ciclo chiaro/scuro di 12 ore per 12 ore a 22 ± 2 °C e umidità relativa dal 50%-70%, con libero accesso al cibo standard e all'acqua potabile. Dopo 1 settimana di acclimatazione, assegnare casualmente i ratti in sei gruppi (n = 6 per gruppo): blank, modello, SDD, TEAP, SDD + TEAP e gruppi ibuprofene.
Preparazione e amministrazione del modello QSBSPD
In questo esperimento è stato utilizzato il modello ampiamente accettato di dismenorrea indotta da OT. In breve, i cicli estroli dei ratti sono stati valutati tramite test vaginali. I ratti sono stati considerati idonei all'inclusione nello studio se la durata del ciclo estrole è stata determinata in 4–5 giorni.
Ad eccezione del gruppo blank, ai ratti dei gruppi sperimentali è stata somministrata un'iniezione sottocutanea quotidiana di estradiolo benzoato ed epinefrina cloridrato per 10 giorni. Dopo l'iniezione di epinefrina cloridridata a un dosaggio di 0,9 mg/kg al giorno, i ratti sono stati esposti a varie stimolazioni combinate (A: Stimolazione acustica: i ratti sono stati esposti a stimoli acustici (90 dB, 1 kHz) per 5 minuti/volta, 3–4 volte al giorno, con un intervallo di 2 ore tra ogni volta. B: Stimolazione luminosa: i ratti sono stati esposti a stimoli luminosi lampeggianti per 5 minuti/volta, 3–4 volte al giorno, con un intervallo di 2 ore tra ogni volta. C: Stimolazione elettrica: i ratti sono stati sottoposti a stimolazione elettrica (impulsi a onde quadrate bifasiche) a 30–35 V, con corrente alternata applicata per 0,3 secondi ogni 2 secondi. Questa stimolazione è stata somministrata per 5 minuti ogni 2 ore, 2–4 volte al giorno. D: Contenzione: i ratti venivano posti in una gabbia di contenzione costruita con filo spinato, di circa 25 cm di lunghezza e 5 cm di diametro. Una volta dentro la gabbia, le estremità venivano strette per immobilizzare i ratti e limitarne il movimento per 2 ore, una volta al giorno). Inoltre, nei giorni 1 e 10, ai ratti sono stati iniettati sottocutaneamente 5,0 mg/kg/giorno di estradiolo benzoato, e nei giorni 2–9 hanno ricevuto 2,5 mg/kg/giorno.
A partire dal quinto giorno di iniezione di estradiolo benzoato, i ratti ricevettero la somministrazione intragastrica di diversi farmaci per 7 giorni, due volte al giorno alle 10:00 e alle 16:00, tranne il gruppo ibuprofene, che riceveva una volta al giorno alle 10:00. Nei gruppi blank, modello e TEAP, ai ratti sono stati somministrati 2,5 mL/kg di soluzione salina normale. Nei gruppi SDD e TEAP+SDD, i ratti hanno ricevuto 2,5 mL/kg di SDD (preparati come 106 g di farmaco grezzo disciolti in 200 mL d'acqua, 0,53 g/mL); Questa dose è stata convertita dalla dose clinica giornaliera adulta di 106 g in base all'equivalenza della superficie corporea, ottenendo una dose equivalente a quella del ratto. Nel gruppo ibuprofene, i ratti ricevettero 0,02 g/kg di sospensione di ibuprofene. Nei gruppi TEAP e TEAP+SDD, i ratti hanno ricevuto stimolazione TEAP a partire dal quinto giorno dopo l'iniezione di estradiolo benzoato. Fissare gli elettrodi ai punti auricolari bilaterali Jiaogan, Shenmen, Neishengzhiji e Neifenmi, come definito secondo uno standard precedentemente riportato per la localizzazione dei punti di agopuntunei ratti 12. Questi punti si trovano nella cavità conchal bilaterale dell'orecchio, innervati dal nervo vago. Gli elettrodi erano collegati a uno strumento elettronico di terapia con aghi, che emetteva un'onda continua per 20 minuti (frequenza: 20 Hz; intensità: 1 mA), una volta al giorno. I ratti del gruppo TEAP+SDD hanno subito TEAP dopo il primo gorgone SDD ogni giorno. La stimolazione finale del TEAP è stata condotta prima dell'iniezione intraperitoneale di OT.
A 24 ore dall'ultima iniezione di benzoato di estradiolo, cioè all'undicesimo giorno, 1 ora dopo l'ultima somministrazione intragastrica, ad eccezione dei gruppi a non rimasto e TEAP, i ratti degli altri gruppi ricevevano 2 U di OT per ratto con iniezione intraperitoneale. I ratti del gruppo TEAP hanno subito iniezioni intraperitoneali di OT a una dose di 2 U per ratto dopo la stimolazione finale TEAP. I ratti del gruppo a non vuoto non hanno ricevuto iniezione OT. Questo protocollo ha stabilito con successo un modello rat di QSBSPD. La selezione complessiva degli animali, la preparazione del modello, il calendario della somministrazione dei farmaci, i parametri di stimolazione TEAP e la posizione dei punti auricolari sono riassunti nella Figura 1.
Colorazione Wright-Giemsa
Il ciclo estrole è stato determinato dalla colorazione Wright-Giemsa delle macchie vaginali. Un cotton fioc sterile è stato umido con soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e inserito delicatamente 0,5–1,0 cm nel canale vaginale. Il tampone è stato ruotato 1–2 volte per raccogliere cellule esfoliate vaginali e il campione è stato spalmato uniformemente su un vetrino pulito in una direzione. La macchia veniva essiccata all'aria a temperatura ambiente. È stata aggiunta la soluzione di colorazione Wright-Giemsa per coprire la macchia e incubata per 5 minuti. Un volume uguale di soluzione salina tamponata con fosfato è stato poi aggiunto alla soluzione di colorazione, e la colorazione è stata proseguita per altri 5 minuti. Il vetrino è stato risciacquato delicatamente tre volte con acqua ultrapura, asciugato all'aria ed esaminato al microscopio ottico. Lo stadio del ciclo estrole è stato identificato in base ai tipi cellulari dominanti, inclusi cellule epiteliali nucleate, cellule epiteliali cornificate e leucociti.
Raccolta di campioni
I ratti sono stati inseriti in una scatola di induzione anestesica con una concentrazione di isoflurano impostata tra il 3% e il 5%. Dopo che i ratti persero conoscenza, furono trasferiti al tavolo operatorio e tenuti sotto anestesia con una mascherina. La concentrazione è stata ridotta dall'1,5% al 2,5%. Il pelo addominale del ratto è stato tagliato con forbici e successivamente disinfettato con un'applicazione topica di alcol. È stata realizzata un'incisione di 2–3 cm lungo la linea mediana dell'addome. Un lato dell'utero, insieme ai suoi legamenti, fu esterilizzato e il tessuto adiposo aderente alla superficie uterina fu espulso. Il tessuto uterino veniva quindi accuratamente isolato. Se il ratto è ancora vivo dopo il campionamento, si sopporta l'eutanasia con asfissia da CO₂.
Colorazione di ematossilina ed eosina (HE)
I tessuti uterini erano fissati, incorporati nella paraffina e sezionati con uno spessore di 5 μm. Le sezioni sono state decerate con xilene due volte per 10 minuti ciascuna. Le sezioni sono state poi reidratate sequencialmente in etanolo assoluto due volte per 5 minuti ciascuna, seguite da etanolo 95%, 90%, 80% e 70% per 5 minuti ciascuna. Le sezioni sono state risciacquate in acqua ultrapura. La colorazione con ematossilina è stata eseguita per 5 minuti e le sezioni sono state risciacquate con acqua finché non è rimasto alcun colorante in eccesso. Le sezioni sono state immerse in soluzione salina tamponata con fosfato per 5 minuti per l'incantura. Le sezioni sono state poi colorate con eosina per 1 minuto e risciacquate con acqua. Successivamente, le sezioni sono state disidratate in etanolo al 95% per 10 minuti e etanolo assoluto per 10 minuti, eliminate nello xilene per 10 minuti e montate con resina neutra. Le immagini rappresentative venivano acquisite utilizzando un microscopio lucinico o uno scanner digitale per vetrine.
Saggio immunoenzimatico legato (ELISA)
I tessuti uterini freschi venivano risciacquati con soluzione salina pre-raffreddata e tamponata con fosfato per rimuovere il sangue residuo. Ogni campione di tessuto è stato pesato, tagliato in piccoli pezzi e omogeneizzato in soluzione salina pre-raffreddata con fosfato tamponato, con un rapporto tessuto-tampone di 1:9. L'omogeneato è stato centrifugato a 5000 × g per 5–10 minuti a 4 °C, e il soprantantante è stato raccolto per un'analisi successiva. I livelli di IL-1β, IL-6, TNF-α, PGF2α e PGE2 sono stati misurati utilizzando kit ELISA per ratti secondo le istruzioni del produttore. Tutti i reagenti e le strisce a micropiastre venivano bilanciati a temperatura ambiente prima dell'uso. Ai pozzi designati venivano aggiunti standard o campioni (50 μL). Un anticorpo di rilevamento coniugato con perossidasi di rafano (100 μL) è stato aggiunto a ogni pozzo tranne che a quelli vuoti, e la piastra è stata sigillata e incubata a 37 °C per 60 minuti. Il liquido veniva scartato e ogni pozzo veniva lavato cinque volte con un tampone di lavaggio diluito. Successivamente, sono stati aggiunti 50 μL di substrato A e 50 μL di substrato B a ciascun pozzo, seguiti da incubazione a 37 °C al buio per 15 minuti. Successivamente è stata aggiunta una soluzione di stop (50 μL) a ciascun pozzo e la densità ottica è stata misurata a 450 nm entro 15 minuti. Le concentrazioni campionarie sono state calcolate a partire dalle curve standard.
PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)
L'RNA totale è stato estratto dai tessuti uterini utilizzando un reagente per l'estrazione totale di RNA secondo le istruzioni del produttore. Per un breve periodo, il tessuto è stato macinato in azoto liquido e è stato aggiunto 1 mL di reagente di estrazione di RNA. Il lisato è stato incubato a temperatura ambiente per 5 minuti. Successivamente veniva aggiunto cloroformio (200 μL), la miscela veniva agitata vigorosamente per 15 secondi, incubata a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugata a 12.000 × g per 12 minuti a 4 °C. La fase acquosa è stata trasferita in un nuovo tubo, miscelata delicatamente con un volume uguale di isopropanolo e incubata a −20 °C per 15 minuti. I campioni sono stati centrifugati a 12.000 × g per 10 minuti a 4 °C, il soprannatante è stato scartato e il pellet di RNA è stato lavato con etanolo al 75%. Il pellet è stato essiccato all'aria e sciolto in acqua priva di RNasi. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state determinate utilizzando uno spettrofotometro a microvolume. Il DNA genomico è stato rimosso e il cDNA è stato sintetizzato secondo le istruzioni del reagente di trascrizione inversa. Per la rimozione genomica del DNA, l'RNA totale è stato incubato con il reagente di rimozione del DNA genomico a 42 °C per 5 minuti e poi posto sul ghiaccio. La trascrizione inversa è stata eseguita a 50 °C per 15 minuti, seguita da 75 °C per 5 minuti per terminare la reazione.
La PCR in tempo reale veniva eseguita utilizzando un mix qPCR basato su SYBR Green. Ogni reazione da 20 μL conteneva 2 μL di cDNA, 0,4 μL di primer diretto, 0,4 μL di primer inverso, 10 μL di 2× miscela SYBR qPCR e 7,2 μL di acqua priva di nucleasi. La qPCR è stata eseguita con il seguente programma di ciclismo: 95 °C per 1 minuto; 40 cicli a 95 °C per 20 secondi, 56 °C per 20 secondi e 72 °C a 38 secondi; seguita dall'analisi della curva di fusione. Il GAPDH veniva utilizzato come controllo interno, e l'espressione relativa dell'mRNA veniva calcolata con il metodo 2−ΔΔCt . Ogni campione biologico è stato misurato in triplicata tecnica. Il valore medio di Ct dei triplicati tecnici è stato utilizzato per calcolare l'espressione di ΔCt e dell'mRNA relativa per ciascun replicato biologico. Le sequenze di primer sono le seguenti: PPAR-γ2, avanti 5′-CGGAAGCCCTTTGTGACTT-3′ e 5′ inverso -CTCGATGGGCTTCACGTTCA-3′; COX-2, avanti 5′-AACCAGGTGAACTTCGTCTATTAG-3′ e indietro 5′-GGTCGTTTGATGTGTCACTGTA-3′; GAPDH, avanti 5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′ e indietro 5′-GGTGGTCCAGGGTCTCTTACTC-3′.
Analisi statistica
I dati sono stati analizzati utilizzando software statistico. Tutti i dati quantitativi sono stati presentati come la deviazione media ± standard. Per l'analisi qRT-PCR, sono stati prima mediati i triplicati tecnici per ogni replica biologica e l'analisi statistica è stata effettuata utilizzando i valori della replica biologica. I confronti tra più gruppi sono stati effettuati utilizzando un'analisi unidirezionale della varianza seguita da test post hoc di Bonferroni quando i dati soddisfavano le assunzioni di normalità e omogeneità della varianza. La significatività statistica è stata definita come P < 0,05.