Articolo metodologico

Marcatura metabolica del trascricroma nascente in Xenopus Embriogenesi precoce

DOI:

10.3791/70591

⸱

27 marzo 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Forniamo metodi dettagliati per etichettare metabolicamente e purificare i trascriverti nascenti per l'analisi del trascrittoma negli embrioni precoci di Xenopus utilizzando la 5-etinil-uridina (5-EU).

Abstract

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L'embriogenesi precoce richiede la nuova trascrizione di geni zigotici dal genoma zigotico inizialmente dormiente dopo la fecondazione. Una sfida importante è stata rilevare con precisione i nuovi trascritti e determinarne il tempo di espressione durante l'attivazione del genoma zigotico (ZGA). Qui forniamo procedure dettagliate per la marcatura metabolica dei trascritti nascenti tramite 5-etinil-uridina (5-EU) negli embrioni precoci di Xenopus laevis . Dopo la fecondazione, il 5-EU viene microiniettato negli embrioni dello stadio 1-cellulare per marcare metabolicamente gli RNA appena trascritti durante lo ZGA. Gli EU-RNA nascenti vengono successivamente purificati dopo la biotinilazione tramite reazioni mediate dalla chimica del clic, e il trascrittoma nascente viene determinato tramite sequenziamento di nuova generazione. È importante sottolineare che questo metodo ha alta sensibilità e specificità che permettono la caratterizzazione di geni scarsamente attivati. Pertanto, questo approccio fornisce uno strumento potente per studiare la dinamica della trascrizione genica durante lo sviluppo precoce, e può essere generalizzato ad altri sistemi embrionali o tessuti.

Introduzione

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Dopo la fecondazione, l'embrione è sotto il controllo dei fattori materni depositati nell'ovo, mentre il genoma zigotico è trascrizionalmente silenzioso per un certo periodo; Viene attivato per trascrivere centinaia o migliaia di geni essenziali per lo sviluppo successivo, inclusa la specificazione del destino cellulare e la formazione dello stratogerminale 1,2,3,4,5,6. Questo fenomeno di attivazione del genoma zigotico (ZGA) durante la transizione materna-zigotica (MZT) è altamente conservato in tutte le specie di metazoi, anche se il momento della ZGA varia tra le specie 1,2,3,4,5,6. Comprendere come la ZGA viene regolata non è solo importante per la nostra comprensione dei principi fondamentali dello sviluppo precoce, ma offre anche il potenziale per sviluppare nuove strategie per diagnosticare e trattare i disturbi dello sviluppo e aumentare la salute riproduttiva.

Una delle principali sfide nello studio dello ZGA è stata rilevare con precisione nuovi trascrizioni e determinarne il momento di insorgenza durante l'attivazione del genoma zigotico (ZGA). A causa della predominanza dei trascrizioni materne nei primiembrioni 7, gli alti livelli di questi trascritti possono mascherare la rilevazione di nuovi trascritti durante la ZGA, in particolare per quei geni scarsamente attivati, utilizzando RNA-seq convenzionale di massa. Per superare questa sfida, abbiamo sviluppato un metodo per misurare il trascrinome nascente utilizzando la marcatura metabolica dei trascritti nascenti con 5-etinil-uridina (5-EU), seguita dalla biotinilazione degli EU-RNA nascenti tramite chimica del clic e la loro purificazione per il sequenziamento (EU-RNA-seq)8,9,10. Rispetto ad altri metodi di profilazione dei trascrizioni nascenti, come quelli che utilizzano la 4-tiouridina (4sU)11,12, la marcatura con 5-EU è altamente specifica tramite la chimica del click, può essere utilizzata sia per immagini che per sequenziamento e non richiede conversione chimica. Inoltre, il nascente EU-RNA-seq è altamente sensibile e rileva centinaia di geni, la cui attivazione non può essere rilevata dal convenzionale bulkRNA-seq 8. Questo approccio ci ha anche permesso di determinare con precisione l'insorgenza dell'attivazione genica zigotica individuale e di profilare i distinti pattern spaziotemporali della ZGA durante l'embriogenesiprecoce 8.

Qui descriviamo le procedure dettagliate per preparare i campioni per l'EU-RNA-seq al fine di profilare il trascrittoma nascente utilizzando embrioni precoci di Xenopus laevis come modello. Questo protocollo è adattato da un precedente metodo10,13 con ottimizzazioni minori nelle procedure, inclusa la microiniezione di 5-EU negli embrioni dello stadio 1-cellulare, la biotinilazione di EU-RNA nascenti tramite reazione a click e la loro purificazione per il sequenziamento (Figura 1). Per garantire la riproducibilità, a seconda delle fasi degli embrioni precoci con abbondanza variabile di trascritti nascenti, dovrebbero essere utilizzati 1–10 μg di RNA totale come input, anche se una quantità inferiore può comunque essere utilizzata. Questo protocollo può essere applicato in altri sistemi embrionali, come Drosophila 14 ezebrafish 15, e altri tessuti13. Questo metodo è uno strumento potente per la nostra comprensione della trascrizione genica e dei meccanismi regolatori in vari processi biologici, incluso il rivelare nuovi principi dell'embriogenesi precoce.

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Protocollo

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Il lavoro sugli animali descritto in questo studio è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Sud. La sicurezza in laboratorio e lo smaltimento dei rifiuti devono rispettare le normative istituzionali.

1. Preparazione di reagenti e tampone

  1. Soluzione 20x MMR (Marc's Modified Ringer): Mescola 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 e 40 mMCaCl 2. Regola il pH a 7,8 con NaOH. Autoclave e conservazione a temperatura ambiente.
  2. Ficoll 3% (w/v)/0,5x MMR: Aggiungi lentamente 1,5 g di Ficoll 400 in 50 mL di 0,5x MMR mescolando dolcemente con una barra magnetica finché il Ficoll non si dissolve completamente. Autoclave e mantenerlo a 4 °C fino all'uso.
  3. Soluzione stock di 5-etinil uridina (5-EU): Per ottenere la soluzione stock da 50 mM, aggiungere 372,8 μL di buffer (si noti che qualsiasi buffer compatibile con microiniezione può essere utilizzato, ad esempio 1x TBS, pH 7,6) nella fiala da 5 mg. Mescola bene e fai aliquote da 2 μL. Conserva a -80 °C.

2. Microiniezione di 5-EU in embrioni a 1-cellula

  1. Per ottenere embrioni di Xenopus , si seguono i protocolli standard per eseguire la fecondazione in vitro (IVF) (ad esempio, vedi Sive et al., 2007)16. L'embrione dovrebbe essere in MMR 0,1x, pronto all'uso.
  2. Aggiungi 1 mL di Ficoll al 3%/MMR 0,5x in una camera di microiniezione realizzata con una vetrata di vetro standard (25 mm x 75 mm). Usa una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire 20 (o più se necessario) embrioni al centro della camera di microiniezione.
  3. Usa una pinzetta fine per tagliare con cura l'estremità molto sottile della punta del ferro di vetro e infila l'ago in verticale (con la punta rivolta verso il basso) contro l'argilla da modellare sulla parete del banco di lavoro. Usa la pipetta P2 con la punta del microcaricatore per aggiungere 0,5 μL di 50 mM 5-EU dalla parte superiore dell'ago di vetro.
  4. Assembla l'ago su un micromanipolatore. Usa la pipetta P10 per aggiungere 10 μL di olio di alocarbonio su un micrometro da palco e mettilo sotto uno stereomicroscopio.
  5. Per calibrare il volume di iniezione, si usa prima il piede per premere il pad sul pavimento collegato al microiniettore e inietta una goccia nell'olio di alocarburi sul micrometro. A seconda della dimensione della goccia, si regola la pressione e il tempo di iniezione sul microiniettore per determinare il volume di iniezione a 10 nL, cioè 0,27 mm di diametro sul micrometro.
  6. Usa una pinzetta in una mano per aiutare a tenere l'embrione, usa l'altra mano per tenere il micromanipolatore e inietta 10 nL di 50 mM EU negli embrioni allo stadio 1-cellulare. La concentrazione finale di 5-EU nell'embrione è di ~0,5 mM.
  7. Dopo la microiniezione, si utilizza una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire gli embrioni dalla camera di iniezione a una nuova piastra di vetro contenente 3% di Ficoll/0,5x MMR. Tieni gli embrioni iniettati in Ficoll per ~1 ora.
  8. Rimuovi con attenzione la soluzione Ficoll e sostituisci il mezzo con 0,1x MMR. Tieni gli embrioni in 0,1x MMR fino a un ulteriore utilizzo. Monitorare costantemente lo sviluppo degli embrioni e rimuovere eventuali embrioni anomali se necessario.
  9. Quando gli embrioni raggiungono le fasi desiderate di sviluppo, si utilizza una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire 10 embrioni in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL. Usa una pipetta P200 per rimuovere con cura qualsiasi residuo di mezzo nel tubo e congela rapidamente gli embrioni in azoto liquido.
    Nota: Per garantire rigore e riproducibilità, raccogliere solo gli embrioni normali in base al loro aspetto rispetto al controllo del controllo. Rimuovere ed escludere eventuali embrioni anomali da ulteriori analisi. Se necessario, preleva anche lo stesso numero di embrioni senza microiniezione dei controlli negativi.
  10. Conservare gli embrioni in un congelatore a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.

3. Estrazione totale di RNA e misurazione della concentrazione

NOTA: Utilizzare un kit di estrazione di RNA totale a base di membrana silicea per isolare gli RNA totali degli embrioni precoci e un kit di quantificazione dell'RNA ad alta sensibilità basato sulla fluorescenza per determinare le concentrazioni di RNA. Segui le istruzioni fornite dal kit e i passaggi seguenti sono leggermente modificati rispetto al manuale. Tutte le soluzioni e i reagenti utilizzati nei passaggi seguenti devono essere privi di RNasi.

  1. Metti i campioni dal congelatore a -80 °C sul ghiaccio.
  2. Aggiungi 700 μL del Buffer RLT dal kit di estrazione RNA in ogni provetta. Usa una pipetta P1000 per pipettare su e giù almeno 15 volte o finché tutti gli embrioni non sono sciolti.
  3. Tieni i campioni in freddo per 20 minuti. Mescola delicatamente di nuovo pipettando su e giù per almeno 10 volte per omogeneizzare completamente gli embrioni.
  4. Aggiungere 700 μL di etanolo al 70% agli embrioni omogeneizzati. Pipetta su e giù per mescolare bene e trasferire i 700 μL della miscela in una colonna di rotazione.
  5. Centrifuga la colonna a 10.000 x g per 1 minuto. Scartare il flow-through. Ripeti la centrifuga finché il resto della miscela non è completo.
  6. Aggiungi 350 μL del tampone RW1 e centrifuga la colonna a 10.000 x g per 1 minuto. Scartare il flowthrough.
  7. Aggiungi con attenzione 80 μL di DNasi I al centro della membrana nella colonna. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  8. Aggiungi 350 μL di tampone RW1 e centrifuga la colonna a 10.000 x g per 1 minuto. Scartare il flowthrough.
  9. Aggiungi 500 μL di RPE tampone e centrifuga la colonna a 10.000 x g per 1 minuto. Scartare il flowthrough. Ripeti il lavaggio ancora una volta.
  10. Asciuga la colonna centrifugandola di nuovo a 10.000 x g per 2 minuti.
  11. Trasferisci la colonna in un nuovo tubo senza RNasi. Aggiungi con attenzione 35 μL di H2O senza RNasi al centro della membrana nella colonna.
  12. Centrifuga la colonna a 10.000 x g per 1 minuto. Raccogli l'RNA eluzionato e tieni sul ghiaccio.
  13. Per misurare la concentrazione di RNA, si prepara prima la soluzione operativa utilizzando il kit di quantificazione dell'RNA diluendo il reagente (colorante) a 1:200 nel buffer di RNA. Calcola il volume totale della soluzione di lavoro in base al numero totale di standard e prepara 200 μL per ogni standard o campione.
  14. Installa una striscia da 8 tubi da 0,2 mL. Per diluire ogni standard, aggiungere 10 μL a 190 μL della soluzione di lavoro. Per diluire ogni campione, si aggiunge 1 μL a 199 μL della soluzione di lavoro. Mescola bene.
  15. Metti la striscia a 8 tubi in un fluorometro. Seleziona il test di analisi a RNA, calibra con gli standard e leggi le concentrazioni dei campioni.

4. Biotinilazione e purificazione nascente dell'ARN-UE

NOTA: Un kit di cattura dell'RNA nascente basato sulla chimica del clic viene utilizzato per biotinilare e abbassare gli ARN EU nascenti. Segui le istruzioni fornite dal kit e i passaggi seguenti sono leggermente modificati. Gli RNA provenienti da embrioni non iniettati, così come gli EU-RNA senza biotinilazione, possono essere utilizzati come controlli di fondo per la specificità del pulldown.

  1. Biotinilazione e pulizia dell'RNA
    1. Per ogni campione, si mescolano i seguenti componenti in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per ottenere una reazione click da 50 μL: RNA totale (1–10 μg), 1x tamper EU, 2 mMCuSO 4, 0,25 mM biotina azide, 10 mM additivo 1 e 12 mM additivo 2.
    2. Incuba la miscela di reazione a temperatura ambiente per 30 minuti su un nutator.
    3. In ogni reazione sopra, si aggiungono 1 μL di glicogeno, 50 μL di acetato di ammonio da 7,5 M e 700 μL di etanolo raffreddato al 100%. Pipetta su e giù 5 volte per mescolarli bene.
    4. Metti il tubo in un congelatore a -80 °C e conservalo tutta la notte.
    5. Centrifuga il tubo a 13.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Rimuovi con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
    6. Aggiungi 700 μL di etanolo al 75% e mescola delicatamente per risospendere il pellet. Centrifuga il tubo a 13.000 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovi con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. Ripeti il lavaggio ancora una volta.
    7. Fai asciugare il pellet all'aria per 5–10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 10 μL di H2O senza RNasi.
  2. Purificazione dell'ARN-EUA
    1. Per rimuovere i nascenti EU-RNA, per ogni campione, si somministrano 5 μL di sfere magnetiche rivestite di streptavidina in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL.
    2. Aggiungi 9 μL di Wash Buffer 2. Mescola bene e posiziona il tubo su una griglia magnetica. Lascia riposare per 2 minuti. Rimuovi il soprannatante. Ripeti il lavaggio altre due volte. Sospezione delle sfere in 5 μL di Wash Buffer 2.
    3. Prepara il seguente master mix in un nuovo tubo microcentrifuga da 1,5 mL (15 μL per ogni campione): 12,5 μL di buffer di legame RNA (Componente G), 0,2 μL di RNasi OUT diluita 1:10 e 2,3 μL diRNasi H 2O. Aggiungi 15 μL della miscela a ciascun tubo contenente il campione di RNA.
    4. Incubare per 5 minuti su un blocco termico a 69 °C. Metti il tubo sul freddo.
    5. Aggiungere 5 μL delle sfere pre-lavate sopra a ciascun tubo contenente il campione di RNA. Incubare per 30 minuti su un nutator a temperatura ambiente.
    6. Aggiungi 50 μL di Wash Buffer 1. Mescola bene e posiziona il tubo su una griglia magnetica. Lascia riposare per 2 minuti. Rimuovi il soprannatante. Ripeti il lavaggio altre 4 volte.
      Nota: Il sovrantagente dopo il primo lavaggio, che presumibilmente contiene solo i trascrizioni materne, può essere raccolto per misurare il trascricroma materno.
    7. Aggiungi 50 μL di Wash Buffer 2. Mescola bene e posiziona il tubo su una griglia magnetica. Lascia riposare per 2 minuti. Rimuovi il soprannatante. Ripeti il lavaggio altre 4 volte.
    8. Sospezione delle sfere in 5 μL di Wash Buffer 2. Le sfere, che contengono i nascenti EU-RNA, sono pronte per la sintesi diretta del cDNA e la preparazione della libreria.
      Nota: Prima di procedere con la preparazione della libreria, l'arricchimento dei trascritti nascenti può essere valutato misurando l'espressione di geni individuali noti utilizzando la reazione a catena trascrizione-polimerasi inversa (RT-PCR).

5. Preparazione e sequenziamento della biblioteca di RNA

  1. Usa kit disponibili in commercio per preparare le librerie di cDNA e segui le istruzioni fornite dal kit. Usa il NEBNext Library Quant Kit per Illumina per quantificare le librerie e metterle in comune.
  2. Mettere insieme le librerie seguendo le istruzioni dei kit di sequenziamento di nuova generazione comunemente usati. Diluire le librerie a ~1,8 pM prima di caricarle nel sequencer da banco per ottenere una densità ottimale del cluster di ~200k/mm2 durante il sequenziamento. Sequenzia le librerie utilizzando il sequenziamento di nuova generazione comunemente usato. Ho usato sequenziamento a estremità accoppiata a 75 bp per ~20 milioni di letture per campione.
  3. Quantificare le letture trascrivomiche allineando le sequenze alla build genomica 9.2 di Xenopus laevis usando salmon17 ed eseguire un'analisi differenziale dell'espressione genica usando DESeq218. Per visualizzare i picchi nel browser genomico, mappa le sequenze al genoma usando STAR19 e visualizza nel Visualizzatore di Genomica Integrativa (IGV)19.

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Risultati

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Gli embrioni di Xenopus laevis (quattro repliche biologiche) nelle fasi da 5 a 9 ore dopo la fecondazione (hpf) a 22 °C, che copre le fasi dalla fase 5 (con poca ZGA su larga scala) alla fase 9 (con alto ZGA), sono stati processati seguendo il protocollo superiorea 8. Gli RNA totali, gli EU-RNA nascenti purificati e gli RNA a flusso sono stati utilizzati per preparare le librerie e sono stati sequenziati. Come mostrato nella Figura 2<...

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Discussione

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Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per la marcatura metabolica del trascrinome nascente nell'embriogenesi precoce, inclusa la microiniezione del 5-EU in embrioni a 1-cellula, l'estrazione totale degli RNA e la misurazione delle loro concentrazioni, nonché la biotinilazione e purificazione degli EU-RNA nascenti per la preparazione e il sequenziamento delle biblioteche (EU-RNA-Seq) (Figura 1). Grazie all'elevata sensibilità e specificità dell'approc...

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Dichiarazioni

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L'autore dichiara di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il laboratorio Matthew Good dell'Università della Pennsylvania per la formazione fornita. Questo lavoro fu in parte sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
& micro; Microiniettore PUPMStrumenti di Precisione MondialeUPUMPPer microiniezione (microiniezione a pressione)
5-etinyl uridinaThermo Fisher ScientificE10345Per microiniezione (marcatura di traqnscripts nascenti)
Stereomicroscopi zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Per microiniezione (visualizzazione degli embrioni)
Acetato di ammonioSigma-AldrichA2706Per la precipitazione dell'RNA
Acido ascorbicoSigma-AldrichA7506Per la reazione al click
Capillari in vetro borosilicatoStrumenti di Precisione MondialeTW100-4Per la microiniezione (produzione di aghi di vetro)
CentrifugaEppendorf5425RPer centrifuga
Kit di cattura dell'RNA nascente Click-iTThermo Fisher ScientificC10365Per la biotinilazione e purificazione dell'RNA nascente
CuSO4Sigma-Aldrich61230Per la reazione al click
DNasi IRoche Diagnostica4716728001Per l'estrazione dell'RNA
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Per microiniezioni (incubazione di embrioni)
Piastra di Petri in vetro (60 mm)VWR75845-542Per la fecondazione
GlicogenoThermo Fisher ScientificAM9510Per la precipitazione dell'RNA
Olio di alocarburo 27Sigma-AldrichH8773Per microiniezione (calibrazione del volume di iniezione)
L-cisteinaSigma-Aldrich168149Per embrioni in dejúlly
Punte per microcaricatorecalibre scientificEPE-5242956003Per la microiniezione (caricamento del 5-EU nell'ago di vetro)
NEBNext Library Quant Kit per IlluminaNEBE7630Per la quantificazione delle librerie
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (75 CYS)Illumina20024906Per il sequenziamento
Fluorometro Qubi FlexThermo Fisher ScientificD33327Per misurare la concentrazione di RNA
Kit di legame qubit RNA HSThermo Fisher ScientificQ32852Per misurare la concentrazione di RNA
RNeasy Mini KitQiagen74104Per l'estrazione dell'RNA
Micrometro a stadioLa scienza di Ward470175-914Per microiniezione (calibrazione del volume di iniezione)
RNA-seq universale con NuQuantNuGEN0364Per la preparazione della biblioteca

Riferimenti

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Embriogenesi di XenopusAttivazione del Genoma ZigoticoMarcatura con 5 EtiniluridinaTecnica di MicroiniezioneChimica ClickPurificazione dell RNASequenziamento di Nuova GenerazioneDinamiche dell Espressione Genica

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