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Articolo metodologico

Visualizzazione dell'attivazione del genoma zigotico nelle singole cellule degli embrioni precoci

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DOI:

10.3791/70592

⸱

3 aprile 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

Descriviamo metodi per visualizzare la trascrizione nascente durante l'attivazione del genoma zigotico nelle singole cellule durante l'embriogenesi precoce.

Abstract

L'embriogenesi precoce richiede la transizione materna-zigotica (MZT) che rende necessaria l'attivazione del genoma zigotico (ZGA). Durante la ZGA, vengono trascritti centinaia o migliaia di geni, essenziali per vari processi nello sviluppo embrionale precoce, tra cui il mantenimento della sopravvivenza embrionale, la specifica del destino cellulare e la formazione dello strato germinale. Una delle principali sfide nello studio dello ZGA è stata visualizzare direttamente la ZGA nelle singole cellule degli embrioni precoci. Qui descriviamo un metodo per visualizzare direttamente la ZGA in singole cellule di embrioni precoci tramite la marcatura metabolica di trascritti nascenti usando 5-etinil uridina (5-EU), seguito dalla coniugazione degli ARN-UE nascenti con fluorofori tramite chimica del clic e dalla loro visualizzazione in embrioni a montaggio intero tramite microscopia confocale, utilizzando Xenopus laevis come modello. Questo metodo ci ha permesso di tracciare la ZGA a singola cellula negli embrioni a montaggio intero e di rivelare l'esordio eterogeneo della ZGA nello spazio e nel tempo durante l'embriogenesi precoce. Può essere utilizzato in altri sistemi embrionali o tessuti per studiare la trascrizione genica e la regolazione del genoma a livello di singola cellula.

Introduzione

Durante lo sviluppo iniziale, l'embrione subisce la transizione materna-zigotica (MZT) che gradualmente sposta il controllo dello sviluppo dai fattori materni a quelli dei geni zigotici. La MZT richiede l'attivazione del genoma zigotico inizialmente dormiente, un processo chiamato attivazione del genoma zigotico (ZGA); i geni espressi durante la ZGA sono necessari per la specificazione precoce del destino cellulare, la gastrulazione e la formazionedegli assi 1,2. È importante notare che la ZGA è conservata in tutti i metazoi e il tempismo della ZGA è strettamente controllato, anche se varia tra le specie 3,4. La disregolazione della ZGA può portare a gravi conseguenze, che vanno da difetti dello sviluppo alla morte embrionale, come un aborto spontaneo. Pertanto, studiare i meccanismi della ZGA non è solo importante per comprendere i fondamenti della regolazione genica, ma ha anche significative implicazioni cliniche.

Una sfida importante nello studio della ZGA è stata la visualizzazione diretta della ZGA su larga scala negli embrioni precoci e l'indagine dei suoi meccanismi a livello di singola cellula. Abbiamo superato questa sfida sviluppando un metodo che utilizza la marcatura metabolica dei trascritti nascenti durante la ZGA con 5-etinil uridina (5-EU), seguita dalla coniugazione degli EU-RNA nascenti con fluorofori tramite chimica del clic e visualizzazione in embrioni interi tramite microscopia confocale, utilizzando Xenopus laevis come modello. Il grande embrione di Xenopus (~1,2 mm di diametro) contiene un gradiente di dimensione cellulare, e la ZGA su larga scala si verifica intorno agli stadi medi della blastula (con esordio intorno allo stadio 7 e picco intorno allo stadio 9), rendendolo un modello ideale per studiare i modelli di ZGA5. Utilizzando la marcatura 5-EU negli embrioni primi di Xenopus siamo stati in grado di visualizzare e quantificare direttamente la ZGA su larga scala nelle singole cellule di embrioni interi precoci, il che ci ha portato a scoprire un nuovo schema spaziotemporale di ZGA regolato principalmente dalla dimensionecellulare 5,6.

Qui descriviamo i dettagli di questo approccio, adattato da lavori precedenti conottimizzazioni 5,7, tra cui la fissazione degli embrioni dopo la marcatura metabolica di trascritti nascenti con 5-EU, la coniugazione di EU-RNA nascenti con un fluoroforo tramite una reazionea clic 8, e l'immunocolorazione per marcatori subcellulari, seguita dalla liberazione degli embrioni per l'imaging confocale. Questo metodo può essere applicato ad altri sistemi embrionali, inclusi il pescezebra 9,10, oppure utilizzato nel sequenziamento per profilare il trascricromanascente 11, supportandone l'applicazione generale e ampia in vari tipi di campioni e analisi. Nel complesso, questo metodo rappresenta un nuovo e importante mezzo per studiare i meccanismi regolatori genomici nelle singole cellule.

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Protocollo

Il lavoro con gli animali descritto qui è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Sud.

1. Preparazione prima di iniziare il protocollo

NOTA: Prima di iniziare il protocollo, preparare le seguenti soluzioni utilizzando acqua priva di RNasi.

  1. Preparare 1× soluzione fisiologica Tris-buffered (TBS), pH 7,6: 50 mM Tris-HCl e 150 mM NaCl. Regola il pH a 7,6. Conserva a temperatura ambiente. Usa il buffer entro due mesi.
  2. Preparare 1× soluzione fisiologica Tris-Buffered con Tween 20 (TBST), pH 7,6: aggiungere Triton X-100 a una concentrazione finale dello 0,1% (vol/vol) a 1× cucchiare (pH 7,6) preparata con acqua priva di RNasi. Conserva a temperatura ambiente. Usa il buffer entro un mese.
  3. Preparare 4% di paraformaldeide (PFA)/1× MEM: miscelare 1 fiala (10 mL) di stock al 16% di PFA e 4 mL di 10× MEM (1000 mM 3- (N-morfolino)acido propanosulfonico [MOPS] pH 7,4, 20 mM EGTA e 10 mMMgSO 4). Aggiungi acqua senza RNasi a 40 mL. Aloquota e conserva a -20 °C. Usa la soluzione entro 6 mesi.
  4. Prepara il 70%, 50% e 25% di metanolo nello 0,5× SSC: mescola metanolo e SSC 0,5× rispettivamente 3:1, 1:1 e 1:3. Usa la soluzione entro sei mesi.
  5. Prepara la soluzione sbiancante: Mescola fino a raggiungere una concentrazione finale del 2% (vol/vol)H2O2, 5% (vol/vol) formamide e 0,5× SSC in acqua priva di RNasi. Prepara questa soluzione con una fresca prima dell'uso.
  6. Prepara la soluzione bloccante: Aggiungi una concentrazione finale di siero di capra al 10% (vol/vol) e 0,2% (peso/volume) BSA in 1× TBST. Conserva a -20 °C. Usa la soluzione entro 6 mesi.
  7. Prepara il reagente di eliminazione BABB: Mescola 1 parte di alcol benzilico (BA) e 2 parti di benzilbenzoato (BB). Conserva a temperatura ambiente. Usa la soluzione entro 6 mesi.

2. Fissazione degli embrioni microiniettati con 5-EU

  1. Per microiniettare 5-etinil-uridina (5-EU) in embrioni a 1-cellula, seguire le procedure descrittein precedenza 11. Lascia che gli embrioni si sviluppino fino agli stadi desiderati della ZGA, ad esempio lo stadio 9 quando la ZGA è attiva nella maggior parte delle cellule dell'embrione.
  2. Per fissare gli embrioni microiniettati con 5-EU, si aggiungono prima circa 1,8 mL di PFA/1× MEM al 4% in una fiala di vetro a scintillazione da 2 mL. Poi usa una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire ~20 embrioni nella fiala di vetro. Minimizza la quantità di mezzo di coltura aggiunta alla fiala di vetro.
  3. Riempi la fiala di vetro fino in cima con un ulteriore 4% di PFA/1× MEM. Chiudi la fiala con il tappo; Non dovrebbero rimanere bolle d'aria.
  4. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare l'embrione a bassa velocità (ad esempio, 10 giri al minuto) per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
  5. Usa una pipetta per rimuovere con cura il fissativo. Riempi la fiala di vetro con metanolo al 100%. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 5 minuti.
  6. Rimuovere con attenzione il metanolo e aggiungere nuovo metanolo. Ripeti la rotazione e la disidratazione almeno due volte in modo che gli embrioni siano completamente disidratati.
  7. Conservare gli embrioni nel metanolo a -20 °C.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Lascia che gli embrioni restino in metanolo per almeno 2 giorni prima di procedere con i seguenti passaggi. Gli embrioni possono essere utilizzati entro 2 mesi.

3. Coniugare RNA nascenti con un fluoroforo tramite reazione click

  1. Per reidratare gli embrioni, si rimuove prima il metanolo dalla fiala di vetro, poi si aggiungono 2 mL di metanolo al 75% in SSC 0,5× e si chiude la fiala con il tappo. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 5 minuti.
  2. Rimuovi il liquido nella fiala di vetro dopo la rotazione. Ripeti il passaggio sopra in modo sequenziale usando il 50% di metanolo nello 0,5× SSC, il 25% di metanolo nello 0,5× SSC e 0,5× SSC. Per reidratare completamente gli embrioni, ripeti il lavaggio finale con SSC 0,5× almeno due volte.
  3. Aggiungi 2 mL di soluzione sbiancante appena preparata (2%H2O2 e 5% formamide in 0,5× SSC) alla fiala di vetro. Metti la fiala di vetro su un pezzo di carta di alluminio, poi mettila sotto una luce LED a una distanza che non surriscalderà i campioni.
  4. Sbianca gli embrioni alla luce finché tutti i pigmenti diventano bianchi, cosa che di solito richiede 5–6 ore. Nota che, a causa della degradazione diH2O2 in O2, si genereranno piccole bolle d'aria che possono far galleggiare gli embrioni. Controlla periodicamente gli embrioni (ad esempio ogni 30 minuti) e ruota delicatamente la fiala di vetro per permettere agli embrioni di depositarsi nella soluzione sbiancante.
  5. Rimuovi con attenzione il buffer di sbiancante. Aggiungi 2 mL di SSC da 0,5× per risciacquare rapidamente gli embrioni. Ripeti ancora una volta il risciacquo veloce se necessario.
  6. Aggiungi 2 mL di 1× TBST nella fiala di vetro. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 1 ora. Rimuovi il liquido nella fiala di vetro dopo la rotazione.
  7. Ripeti il passaggio sopra almeno 5 volte. Si noti che un lavaggio accurato degli embrioni è fondamentale per i passaggi seguenti.
  8. Aggiungi 2 mL di 1× cucchiai nella fiala di vetro. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 5 minuti. Rimuovi il liquido nella fiala di vetro dopo la rotazione.
  9. Ripeti ancora una volta il passaggio sopra.
  10. Preparare la miscela per la reazione a clic in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL aggiungendo i seguenti reagenti per raggiungere concentrazioni finali di 100 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM di CuSO4, 25 μM tetrametilrodamina (TAMRA)-azide e 100 mM di acido ascorbico. Aggiungi l'acido ascorbico per ultimo alla reazione. Pipetta su e giù per mescolare bene.
  11. Aggiungi un mix di reazione di 200 μL agli embrioni nella fiala di vetro. Assicurarsi che il volume della miscela di reazione sia sufficiente a immergere tutti gli embrioni nella fiala. Incubare per 12 ore a temperatura ambiente al buio.
  12. Rimuovi con attenzione la miscela di reazione al clic. Si noti che si può osservare fluorescenza aspecifica sugli embrioni. Risciacquali rapidamente due volte con 1× TBST, poi lavarli con 1× TBST per almeno 5 volte, cambiando la soluzione ogni 1 ora come descritto sopra.
  13. Continua a lavare gli embrioni cambiando 1× TBST ogni 2 ore e lasciali tutta la notte a 4 °C su un rotatore. Smetti di lavare quando la fluorescenza non specifica è quasi evidente. Nota che, poiché i residui della reazione a click possono essere dannosi per l'immunocolorazione a valle, assicurati che gli embrioni siano accuratamente lavati per 1–2 giorni prima di passare ai passaggi successivi.

4. Immunocolorazione degli embrioni con marcatori subcellulari (opzionale)

  1. Per bloccare gli embrioni, rimuovere il TBST 1× dalla fiala di vetro nel passaggio finale di lavaggio sopra e aggiungere 200 μL della soluzione bloccante (10% siero di capra/0,2% BSA/1× TBST). Avvolgi la fiala di vetro con un pezzo di carta stagnola per proteggere gli embrioni dalla luce. Posiziona la fiala di vetro su un nutator e scuoti delicatamente gli embrioni per almeno 1 ora a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 °C).
  2. Diluire l'anticorpo primario (ad esempio, anticorpo anti-H3) a 1:1.000 in 200 μL di siero di capra al 10%/1× TBST. Aggiungi l'anticorpo diluito nella fiala di vetro e avvolgi la fiala con un pezzo di carta stagnola. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 °C su un nutator a bassa velocità.
  3. Rimuovi con attenzione l'anticorpo dalla fiala di vetro. Risciacqua rapidamente gli embrioni due volte aggiungendo 2 mL di 1× TBST nella fiala di vetro e rimuovendola.
  4. Aggiungi 2 mL di 1× TBST alla fiala di vetro, poi avvolgila con un pezzo di carta stagnola. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 1 ora. Rimuovi il liquido nella fiala di vetro dopo la rotazione.
  5. Ripeti il passaggio sopra almeno 5 volte.
  6. Diluire l'anticorpo secondario (ad esempio, anticorpo Alex Fluor 488 per coniglio) a 1:1.000 in 200 μL di siero di capra al 10%/1× TBST. Se è necessario la colorazione del DNA, diluire il colorante (ad esempio, TO-PRO-3) insieme all'anticorpo secondario.
  7. Aggiungi l'anticorpo diluito alla fiala di vetro e avvolgila con carta stagnola. Incubare gli embrioni durante la notte a 4 °C su un nutator a bassa velocità.
  8. Rimuovi con attenzione l'anticorpo dalla fiala di vetro. Risciacqua rapidamente gli embrioni due volte aggiungendo 2 mL di 1× TBST nella fiala di vetro e rimuovendola.
  9. Aggiungi 2 mL di 1× TBST alla fiala di vetro, poi avvolgila con un pezzo di carta stagnola. Posiziona la fiala di vetro su un rotatore e fai ruotare gli embrioni a bassa velocità per 1 ora.
  10. Ripeti il passaggio sopra almeno 5 volte.

5. Pulizia degli embrioni prima dell'imaging confocale

  1. Per disidratare gli embrioni, rimuovere con cura il tampone nella fiala di vetro dopo il lavaggio finale e aggiungere 2 mL di metanolo al 100%. Avvolgi la fiala di vetro in carta cartacea, mettila su un rotatore e lascia che gli embrioni ruotino a bassa velocità per 5 minuti. Rimuovi il liquido nella fiala di vetro dopo la rotazione.
  2. Ripeti il passaggio sopra almeno 5 volte.
  3. Per disidratare completamente gli embrioni, ripeti il passaggio sopra almeno 5 volte usando 2 mL di metanolo anidro al 100%.
  4. Rimuovi con attenzione quanta più metanolo possibile dalla fiala di vetro.
  5. Usa una pipetta di vetro per aggiungere lentamente 500 μL del reagente di pulizia BABB nella fiala di vetro. Gli embrioni galleggiano nel BABB e attendono 10 minuti finché tutti gli embrioni si stabilizzano sul fondo della fiala di vetro. Si noti che gli embrioni diventeranno quasi invisibili e rimuovere con cura il BABB senza danneggiare gli embrioni.
  6. Ripeti il passaggio sopra almeno altre 2 volte, o finché non si vedono più linee di schlieren. Per eliminare completamente gli embrioni, mantenerli in BABB per 1–2 giorni prima dell'imaging.
  7. Realizzare camere di imaging tagliando un piccolo quadrato (ad esempio, ~5 mm × 5 mm) dal nastro VHB con uno spessore di ~ 1,1-1,2 mm (simile alla dimensione dell'embrione) e una dimensione di ~10 mm × 10 mm, seguita dall'adesione su un vetro coperto da 24 mm × 40 mm.
  8. Trasferisci con cura gli embrioni sgomberati nella camera, poi coprili con un altro bicchiere di copertura. Gli embrioni saranno all'interno del sandwich di coverglass così da poter fotografare entrambi i lati.
  9. Eseguire l'imaging sotto un microscopio confocale.

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Risultati

Gli embrioni di Xenopus laevis allo stadio 1-cellulare sono stati microiniettati con 5-EU, mentre gli embrioni allo stadio 9 sono stati fissati quando la ZGA su larga scala si verificava in tutto l'embrione. Gli embrioni sono stati processati seguendo il protocollo descritto sopra. Gli RNA nascenti negli embrioni sono stati marcati con TAMRA-azide tramite reazione click, l'istona H3 è stata marcata utilizzando anticorpi anti-itopici H3, e il DNA è stato marcato con TO-PRO-3. Gli...

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Discussione

ZGA rappresenta una delle transizioni più critiche durante le prime fasi dello sviluppoembrionale 2,3. Qui abbiamo descritto procedure dettagliate per preparare campioni in modo da visualizzare direttamente lo ZGA in embrioni di Xenopus precoci a montaggio intero, inclusa la fissazione di embrioni microiniettati con 5-EU, la coniugazione di RNA nascenti con un fluoroforo tramite reazione a clic, l'immunocolorazione dei m...

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Dichiarazioni

L'autore dichiara di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

Ringraziamo il laboratorio di Matthew Good dell'Università della Pennsylvania per la formazione. Questo lavoro fu in parte sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16% Paraformaldeide (PFA)EMS15710-SPer realizzare la soluzione fissativa
20 e volte; SSCMediatechMT46-020-CMPer preparare la soluzione sbiancante
Miscelatore nutante 3DVWR76595-802Per embrioni in nutazione
Fiale a filettatura a vite da 9 mm (2 mL)VWR46610-722Per la lavorazione degli embrioni
Anticorpo anti-Histona H3Abcamab1791Per l'immunocolorazione
Acido ascorbicoSigma-AldrichA7506Per aver effettuato la reazione di clic
Alcol benzilicoSigma-Aldrich305197Per la liberazione degli embrioni
Benzoato di benzileACROS Organics105860010Per la liberazione degli embrioni
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA3059Per realizzare la soluzione di blocco
Tappi per fiale a filettatura a vite da 9 mm (2 mL)VWR46610-712Per la lavorazione degli embrioni
Vetro coperto (24 mm e volte 40 mm)VWR48393-060Per la realizzazione di camere di imaging
CuSO4Sigma-Aldrich61230Per aver effettuato la reazione di clic
Etilenebide (ossietilennitrilo)acido tetraacetico (EGTA)Thermo Fisher ScientificAC409915000Per realizzare la soluzione fissativa
Fiji ImageJNIHPer l'elaborazione dell'imaging
FormamideThermo Fisher ScientificAC181090010Per preparare la soluzione sbiancante
Pipete Pasteur di vetroVWR14673-010Per il trasferimento del BABB
Anticorpo secondario anti-coniglio Alex Fluor 488Thermo Fisher ScientificA27034Per l'immunocolorazione
Siero per capreAbcamab7481Per realizzare la soluzione di blocco
Perossido di idrogenoSigma-AldrichH1009Per preparare la soluzione sbiancante
Solfato di magnesio (MgSO4)Thermo Fisher ScientificM65-500Per realizzare la soluzione fissativa
MetanoloThermo Fisher ScientificA4524Per disidratare embrioni
Metanolo, anidroSigma-Aldrich322415Per disidratare embrioni
MOPSThermo Fisher ScientificAC172631000Per realizzare la soluzione fissativa
Miscelatore nutante multimodalitàVWR76595-812Per embrioni in nutazione
Pipetta di trasferimento in plasticaThermo Fisher Scientific13-711-9AMPer il trasferimento di embrioni
Lametta di rasoioThermo Fisher Scientific18-100-970Per tagliare nastri
Acqua priva di RNasiThermo Fisher ScientificBP561-1Per realizzare soluzioni Rnase libere di Rnase
Roto-Mini PLUS (rotatore)VWR470313-912Per rogere embrioni
Tetrametilrodamina (TAMRA)-azideAbcamab146486Per aver effettuato la reazione di clic
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605Per colorare il DNA
Triton X-100Sigma-Aldrich10789704001Per realizzare il tampone di lavaggio
Base Trizma (Base Tris)Sigma-AldrichT1503Per aver creato il tampone Tris
Nastri VHB 3M GPH-110GF (45 mil.)VWR76524-608Per la realizzazione di camere di imaging
Microscopio confocale Zeiss LSM 700ZeissPer l'imaging confocale

Riferimenti

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  2. Vastenhouw, N. L., Cao, W. X., Lipshitz, H. D. The maternal-to-zygotic transition revisited. Development. 146 (11), dev161471(2019).
  3. Jukam, D., Shariati, S. A. M., Skotheim, J. M. Zygotic genome activation in vertebrates. Dev Cell. 42 (4), 316-332 (2017).
  4. Palfy, M., Joseph, S. R., Vastenhouw, N. L. The timing of zygotic genome activation. Curr Opin Genet Dev. 43, 53-60 (2017).
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  12. Harland, R. M. In situ hybridization: An improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).

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