Articolo metodologico

Protocollo standardizzato per la valutazione cardiometabolica precoce nella malattia steatosica del fegato associata a disfunzione metabolica

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DOI:

10.3791/70593

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29 settembre 2026

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1Clinical Research Department, Experimental Metabolism and Clinical Research Laboratory, 2Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), Laboratory of Biochemistry and Experimental Medicine, 3Cardiology Department, Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), 4Facultad de Enfermería y Nutrición, Universidad Autónoma de San Luis Potosí, 5Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada (CICATA), Instituto Politécnico Nacional (IPN)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro standardizzato per la valutazione precoce cardio-metabolica in adulti con steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD), integrando la valutazione dell'infiammazione legata all'alimentazione, biomarcatori biochimici, ecocardiografia e ultrasonografia carotidea, insieme a procedure standardizzate di acquisizione, controllo di qualità e validazione dei dati per migliorarne la riproducibilità.

Abstract

La malattia epatica steatotica associata alla disfunzione metabolica (MASLD) è associata a un'infiammazione cronica di basso grado e a un aumentato rischio di malattie cardiovascolari. L'identificazione precoce delle alterazioni cardiometaboliche subcliniche rimane una sfida, poiché sono limitati i protocolli standardizzati che integrano la valutazione dell'infiammazione indotta dalla dieta con immagini cardiovascolari oggettive. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro riproducibile per valutare l'associazione tra potenziale infiammatorio della dieta e alterazioni cardiometaboliche precoci in adulti con MASLD confermata. I partecipanti vengono arruolati secondo criteri di idoneità standardizzati e la steatosi epatica viene confermata mediante ecografia. L'assunzione alimentare viene valutata utilizzando un questionario validato sulla frequenza semiquantitativa degli alimenti (FFQ), a partire dal quale viene calcolato l'Indice Infiammatorio della Dieta (DII) mediante la metodologia originale derivata dalla letteratura scientifica. La valutazione cardiometabolica comprende misurazioni antropometriche, analisi biochimiche a digiuno, calcolo del rapporto tra trigliceridi e colesterolo delle lipoproteine ad alta densità (TG/HDL-C) e dell'Indice Aterogenico del Plasma (AIP), quantificazione mediante saggio immunoenzimatico (ELISA) di biomarcatori infiammatori, valutazione ecocardiografica transtoracica della funzione diastolica del ventricolo sinistro tramite il parametro E/e′ derivato dal Doppler tissutale e ecografia bilaterale delle carotidi per la misurazione dello spessore intima-media carotideo (CIMT). Procedure standardizzate di acquisizione, punti di controllo predeterminati per il controllo qualità e passaggi di validazione dei dati sono integrati per garantire coerenza metodologica e riproducibilità. I risultati rappresentativi mostrano i dati standardizzati generati dal protocollo, inclusa la classificazione del DII, i profili dei biomarcatori infiammatori, gli indici ecocardiografici e le misurazioni del CIMT, senza implicare associazioni biologiche confermate. Questo protocollo fornisce un quadro metodologico dettagliato e riproducibile per condurre studi clinici e traslazionali che indaghino la relazione tra carico infiammatorio derivante dall'alimentazione e alterazioni cardiometaboliche precoci in adulti con MASLD.

Introduzione

La malattia epatica grassa associata a disfunzione metabolica (MASLD) è la malattia epatica cronica più diffusa a livello mondiale, colpendo circa un terzo della popolazione adulta. Oltre al danno epatico progressivo, la MASLD è caratterizzata da infiammazione cronica di basso grado, resistenza all'insulina, disfunzione endoteliale e aterosclerosi accelerata1,2. Le malattie cardiovascolari rappresentano una delle principali cause di morbilità e mortalità tra le persone affette da MASLD, evidenziando la necessità di approcci affidabili per identificare precoci alterazioni cardiometaboliche prima dello sviluppo di una malattia cardiovascolare clinicamente evidente3,4. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un flusso di lavoro standardizzato e riproducibile per la valutazione integrata del carico infiammatorio legato all'alimentazione, dell'infiammazione sistemica e della disfunzione cardiovascolare subclinica precoce negli adulti con MASLD. Questo protocollo è destinato a studi clinici e traslazionali volti a indagare il rischio cardiometabolico precoce che precede la malattia cardiovascolare clinicamente significativa in questa popolazione.

Numerose evidenze indicano che l'alimentazione svolge un ruolo fondamentale nell'insorgenza e nella progressione della MASLD. Pattern dietetici caratterizzati da un elevato consumo di alimenti ultra-lavorati, grassi saturi, carboidrati raffinati e zuccheri aggiunti favoriscono lo stress ossidativo, la disfunzione endoteliale, l'attivazione immunitaria e l'infiammazione sistemica cronica5,6. Al contrario, pattern dietetici ricchi di fibre, polifenoli, acidi grassi omega-3 e micronutrienti antiossidanti attenuano le vie infiammatorie associate a disfunzioni metaboliche e malattie cardiovascolari6,7.

L'indice dietetico infiammatorio (DII) è stato sviluppato per stimare il potenziale infiammatorio dell'assunzione alimentare abituale, utilizzando un sistema di punteggio basato su dati letterari relativi agli effetti di 45 componenti della dieta sui biomarcatori infiammatori, tra cui la proteina C-reattiva (PCR), l'interleuchina (IL)-1β, l'IL-4, l'IL-6, l'IL-10 e il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α)8. Punteggi DII più elevati sono stati associati a un aumento dei mediatori infiammatori circolanti, resistenza all'insulina, sindrome metabolica, diabete mellito di tipo 2 e malattie cardiovascolari in diverse popolazioni9,10.

Sebbene il DII sia stato associato a esiti metabolici avversi, relativamente pochi studi hanno integrato la valutazione dell'infiammazione legata all'alimentazione con tecniche di imaging cardiovascolare oggettive per rilevare precoci alterazioni cardiovascolari in individui con MASLD4,11. Tra le prime manifestazioni di danno cardiometabolico vi sono la disfunzione diastolica subclinica del ventricolo sinistro, valutata tramite il rapporto E/e′ derivato dal Doppler tissutale, che riflette un aumento della pressione di riempimento del ventricolo sinistro e rappresenta una caratteristica precoce della cardiomiopatia diabetica e metabolica12,13, e lo spessore intima-media carotideo (CIMT), un marcatore surrogato validato di aterosclerosi subclinica che predice in modo indipendente futuri eventi cardiovascolari14,15.

Rispetto alla valutazione cardiometabolica convenzionale, che si basa principalmente su misurazioni antropometriche, test biochimici di routine e singoli fattori di rischio cardiovascolare, questo protocollo integra la valutazione dell'infiammazione indotta dalla dieta, il profilo dei biomarcatori infiammatori, la valutazione ecocardiografica della funzione diastolica e l'ecografia carotidea in un unico flusso di lavoro standardizzato. Questo approccio integrato consente la valutazione simultanea dell'esposizione dietetica, dell'infiammazione sistemica e del rimodellamento cardiovascolare subclinico mediante tecniche non invasive ampiamente disponibili nei contesti della ricerca clinica. Sebbene siano stati proposti approcci multimediali per migliorare la caratterizzazione della disfunzione cardiovascolare precoce nelle malattie metaboliche, protocolli standardizzati per la loro implementazione rimangono limitati.

Per integrare la valutazione convenzionale del profilo lipidico, questo protocollo include anche il rapporto tra trigliceridi e colesterolo delle lipoproteine ad alta densità (TG/HDL-C) e l'Indice Aterogenico del Plasma (AIP), calcolato come log (TG/HDL-C). L'AIP riflette l'equilibrio tra lipoproteine aterogeniche e anti-aterogeniche ed è emerso come marcatore surrogato delle particelle di lipoproteine a bassa densità (LDL) piccole e dense, della resistenza all'insulina, della disfunzione endoteliale e del rischio cardiovascolare residuo. Di conseguenza, l'AIP fornisce una valutazione più completa della dislipidemia aterogenica e ha dimostrato una buona capacità discriminatoria nell'identificare individui a rischio cardiovascolare aumentato, in particolare quelli con disturbi metabolici come la MASLD16,17.

Inoltre, questo protocollo include un pannello di biomarcatori infiammatori circolanti per caratterizzare ulteriormente i meccanismi biologici che collegano il potenziale infiammatorio della dieta al danno cardiometabolico nella MASLD. Questi biomarcatori sono stati selezionati perché svolgono ruoli centrali nel reclutamento dei leucociti, nell'attivazione dell'immunità innata, nella segnalazione pro- e anti-infiammatoria, nella disfunzione endoteliale e nella resistenza all'insulina. La valutazione simultanea di questi mediatori fornisce una caratterizzazione più completa dell'infiammazione sistemica rispetto alla sola PCR e approfondisce il meccanismo alla base della relazione tra carico infiammatorio derivato dalla dieta e danno cardiovascolare precoce nella MASLD1,18,19.

Pertanto, questo protocollo fornisce una metodologia standardizzata e riproducibile per valutare l'associazione tra potenziale infiammatorio della dieta e alterazioni cardiometaboliche precoci negli adulti con MASLD, integrando la valutazione dietetica, il profilo dei biomarcatori infiammatori, analisi biochimiche, ecocardiografia e ultrasonografia carotidea. Incorporando procedure standardizzate di misurazione e punti di controllo predefiniti per la qualità, questo flusso di lavoro è progettato per facilitare la riproducibilità tra diversi ricercatori e sedi di studio, sostenendo al contempo la ricerca clinica e traslazionale sul rischio cardiometabolico precoce nella MASLD.

Protocollo

Il protocollo dello studio è stato approvato dai comitati istituzionali per la ricerca e l'etica della ricerca del Centro Medico Nazionale "20 de Noviembre," Instituto de Seguridad y Servicios Sociales de los Trabajadores del Estado (ISSSTE), Città del Messico, Messico (ID approvazione: 04-118-2025). Eseguire tutte le procedure in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e con le normative nazionali applicabili che regolano la ricerca su partecipanti umani. Ottenere il consenso informato scritto da tutti i partecipanti prima dell'iscrizione. Proteggere la riservatezza dei partecipanti utilizzando identificatori codificati dello studio per tutti i dati clinici, di laboratorio, dietetici e di imaging.

1. Reclutamento dei partecipanti e valutazione dei criteri di idoneità

  1. Reclutare i partecipanti
    1. Reclutare adulti di età ≥18 anni con sospetta steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD) tra il 2025 e il 2026.
    2. Spiegare gli obiettivi dello studio, le procedure, i potenziali rischi e le misure di riservatezza prima dell'iscrizione.
    3. Acquisire il consenso informato scritto da ciascun partecipante prima di effettuare qualsiasi procedura dello studio.
  2. Confermare la MASLD
    1. Eseguire un'ecografia addominale utilizzando procedure istituzionali standardizzate.
    2. Confermare la steatosi epatica identificando un aumento dell'ecogenicità epatica rispetto alla corteccia renale insieme a un attenuazione acustica posteriore.
    3. Diagnosticare la MASLD confermando la steatosi epatica e la presenza di almeno un fattore di rischio cardiometabolico secondo i criteri consensuali attuali.
      NOTA: Eseguire tutti gli esami ecografici utilizzando lo stesso protocollo di acquisizione e, ogni volta che possibile, lo stesso radiologo esperto per ridurre al minimo la variabilità dipendente dall'operatore.
  3. Valutare l'idoneità
    1. Includere i partecipanti che soddisfano tutti i criteri di idoneità predeterminati e che hanno fornito il consenso informato scritto.
    2. Escludere i partecipanti con consumo significativo di alcol.
    3. Escludere i partecipanti con epatite virale (HBV o HCV), malattia epatica autoimmune, danno epatico indotto da farmaci, malattie epatiche ereditarie, gravidanza, neoplasia attiva, scompenso cardiaco decompensato o altre malattie epatiche croniche che potrebbero interferire con la valutazione cardiometabolica.
      NOTA: Proteggere la riservatezza dei partecipanti assegnando a ciascuno un identificatore codificato dello studio, rimuovendo nomi, numeri di cartelle cliniche e altri identificatori personali dai database di ricerca e archiviando le immagini ecocardiografiche e dell'ultrasuono carotideo in un database istituzionale sicuro.

2. Questionario sulla frequenza alimentare

  1. Selezionare lo strumento di valutazione della dieta
    1. Selezionare un questionario semiquantitativo sulla frequenza di assunzione di alimenti (FFQ) validato e appropriato per la popolazione in studio.
      NOTA: Utilizzare FFQ precedentemente validati rispetto a ripetuti diari alimentari o ricordi alimentari di 24 ore. In questo protocollo, è stato utilizzato il questionario FFQ semiquantitativo composto da 140 voci dell'ENSANUT per valutare l'assunzione abituale negli ultimi 7 giorni20,21.
  2. Preparare la valutazione della dieta
    1. Formare tutti gli intervistatori utilizzando istruzioni scritte standardizzate prima dell'arruolamento dei partecipanti.
    2. Standardizzare tra tutti gli intervistatori la somministrazione del questionario, la stima delle porzioni, l'interpretazione delle risposte e la registrazione dei dati.
  3. Somministrare il FFQ
    1. Somministrare il FFQ durante un'intervista faccia a faccia.
    2. Chiedere ai partecipanti di riportare l'assunzione abituale di alimenti e bevande durante il periodo di riferimento specificato dal FFQ.
    3. Includere gli alimenti consumati sia nei giorni feriali che nei fine settimana.
    4. Escludere i cambiamenti temporanei nell'alimentazione associati a malattie acute, ricoveri ospedalieri o interventi terapeutici a breve termine.
  4. Registrare l'assunzione alimentare
    1. Registrare il consumo di alimenti utilizzando le categorie di frequenza predefinite nel FFQ.
    2. Stimare le porzioni utilizzando utensili domestici standard, modelli alimentari, fotografie o guide di riferimento per le porzioni.
    3. Chiarire eventuali alimenti non familiari, porzioni o categorie di frequenza senza influenzare le risposte dei partecipanti.
      NOTA: Verificare la qualità dei dati rivedendo ogni FFQ completato immediatamente dopo l'intervista. Identificare risposte mancanti o incongruenze e risolvere le discrepanze direttamente con il partecipante prima di inserire i dati nel database dello studio.
  5. Calcolare l'assunzione alimentare giornaliera
    1. Convertire le frequenze di consumo riportate in assunzione media giornaliera (porzioni/giorno).
    2. Convertire le dimensioni delle porzioni in grammi o millilitri al giorno secondo le indicazioni del manuale del FFQ.
    3. Calcolare l'assunzione giornaliera di nutrienti utilizzando la banca dati sulla composizione degli alimenti appropriata e un software di analisi nutrizionale.
    4. Applicare la stessa procedura di calcolo dei nutrienti a tutti i partecipanti.
      PUNTO DI PAUSA: Archiviare in modo sicuro i FFQ completati dopo la verifica della qualità e procedere successivamente all'analisi dei nutrienti e al calcolo dell'Indice Dietetico Infiammatorio (DII).

3. Stima dell'indice infiammatorio della dieta

NOTA: L'Indice Dietetico Infiammatorio (DII) è un algoritmo basato sulla letteratura scientifica che stima il potenziale infiammatorio dell'assunzione alimentare abituale a partire da dati raccolti mediante uno strumento di valutazione dietetica validato8.

  1. Preparare i dati sull'assunzione alimentare
    1. Convertire tutte le risposte del questionario alimentare a frequenza (FFQ) in apporti giornalieri di nutrienti utilizzando un database standardizzato sulla composizione degli alimenti e un software di analisi nutrizionale.
    2. Applicare la stessa procedura di calcolo dei nutrienti a tutti i partecipanti.
  2. Selezionare i componenti dietetici
    1. Identificare i componenti dietetici disponibili per il calcolo dell'Indice Dietetico Infiammatorio (DII).
    2. Calcolare il DII utilizzando esclusivamente i componenti dietetici misurati in modo affidabile tramite il FFQ e il database sulla composizione degli alimenti selezionati.
    3. Applicare lo stesso insieme di componenti dietetici a tutti i partecipanti.
      NOTA: Non assegnare un valore pari a zero ai componenti dietetici non misurati.
  3. Calcolare i punteggi standardizzati
    1. Confrontare l'assunzione di ciascun componente dietetico con la corrispondente media globale di riferimento e deviazione standard descritta nella metodologia originale del DII8.
    2. Calcolare il punteggio standardizzato utilizzando la seguente equazione:
    3. Punteggio standardizzato = (Assunzione del partecipante − Media globale di riferimento) ÷ Deviazione standard globale di riferimento
  4. Calcolare i percentili centrati
    1. Convertire ciascun punteggio standardizzato in un percentile centrato secondo la metodologia originale del DII.
    2. Calcolare il percentile centrato utilizzando la seguente equazione:
    3. Percentile centrato = (Percentile × 2) − 1
  5. Calcolare i punteggi del DII per componente
    1. Moltiplicare il percentile centrato per il punteggio di effetto infiammatorio assegnato a ciascun componente dietetico nel database originale del DII8.
    2. Ripetere il calcolo per tutti i componenti dietetici disponibili.
    3. Punteggio del DII per componente = Percentile centrato × Punteggio di effetto infiammatorio
  6. Calcolare l'Indice Dietetico Infiammatorio complessivo
    1. Sommare i punteggi del DII per componente per ottenere il punteggio DII complessivo per ciascun partecipante.
    2. Interpretare i valori negativi come un profilo alimentare più anti-infiammatorio.
    3. Interpretare i valori positivi come un profilo alimentare più pro-infiammatorio.
  7. Classificare i partecipanti
    1. Ordinare i partecipanti in base ai loro punteggi DII.
    2. Suddividere i partecipanti in quartili in base alla distribuzione nella popolazione dello studio.
  8. Eseguire il controllo di qualità
    1. Utilizzare lo stesso FFQ, database sulla composizione degli alimenti, software di analisi nutrizionale e metodo di calcolo del DII per tutti i partecipanti.
    2. Verificare tutti i record dietetici per informazioni mancanti, apporti energetici implausibili ed errori di inserimento dati prima dell'analisi.
    3. Ricalcolare in modo indipendente il DII per un campione casuale di partecipanti per verificarne l'accuratezza.
    4. Documentare tutti i componenti dietetici inclusi nel calcolo del DII e riportare quelli non disponibili.

4. Valutazione della MASLD

  1. Confermare la steatosi epatica come indicato in 1.2.2.
    NOTA: Ogni volta che possibile, far eseguire tutti gli esami dallo stesso radiologo esperto utilizzando parametri di acquisizione identici per minimizzare la variabilità dipendente dall'operatore.
  2. Valutare il consumo di alcol
    1. Valutare il consumo di alcol mediante un'intervista clinica standardizzata.
    2. Escludere i partecipanti il cui consumo di alcol supera le soglie diagnostiche attuali per la MASLD.
  3. Escludere le cause secondarie di steatosi epatica
    1. Escludere i partecipanti con epatite virale cronica (HBV o HCV).
    2. Escludere i partecipanti con malattia epatica autoimmune, danno epatico indotto da farmaci, malattie epatiche ereditarie, gravidanza, neoplasia attiva o altri disturbi epatici cronici che potrebbero interferire con la valutazione cardiometabolica.
  4. Valutare i fattori di rischio cardiometabolico
    1. Valutare l'indice di massa corporea (BMI) e classificare sovrappeso o obesità come BMI ≥25 kg/m2.
    2. Valutare il diabete mellito di tipo 2 utilizzando una glicemia plasmatica a digiuno >125 mg/dL.
    3. Valutare la disregolazione metabolica confermando la presenza di almeno due dei seguenti criteri: circonferenza vita aumentata, pressione arteriosa ≥130/85 mmHg, trigliceridi ≥150 mg/dL, HDL-C <40 mg/dL negli uomini o <50 mg/dL nelle donne, glicemia plasmatica a digiuno 100–125 mg/dL o HbA1c 5.7%–6.4%, oppure marcatori elevati di resistenza all'insulina, come HOMA-IR.
  5. Diagnosticare la MASLD quando la steatosi epatica è confermata insieme ad almeno un fattore di rischio cardiometabolico secondo i criteri consensuali attuali.

5. Valutare il rischio cardiometabolico

  1. Ottenere misurazioni demografiche e antropometriche
    1. Registrare età, sesso, anamnesi medica, farmaci in uso e patologie cardiometaboliche diagnosticate del partecipante, inclusi diabete mellito di tipo 2 e ipertensione.
    2. Misurare l'altezza e il peso corporeo utilizzando apparecchiature tarate.
    3. Calcolare l'indice di massa corporea (BMI) dividendo il peso corporeo (kg) per il quadrato dell'altezza (m2).
    4. Misurare la circonferenza della vita a metà strada tra il margine inferiore dell'ultima costola e la cresta iliaca, utilizzando un nastro metrico non elastico.
  2. Determinare i marcatori biochimici del rischio cardiometabolico mediante metodi di laboratorio clinico automatizzati di routine.
    1. Prelievo di campioni di sangue a digiuno secondo le procedure di laboratorio istituzionali.
    2. Misurare i marcatori biochimici, inclusi colesterolo totale, HDL-C, LDL-C, trigliceridi, glucosio plasmatico a digiuno, HbA1c e insulina a digiuno, utilizzando test di laboratorio clinico automatizzati di routine.
      NOTA: I test automatizzati di laboratorio clinico determinano generalmente il colesterolo totale e i trigliceridi mediante saggi colorimetrici enzimatici; HDL-C e LDL-C mediante saggi colorimetrici enzimatici omogenei diretti; il glucosio plasmatico a digiuno mediante metodo esochinasi enzimatico; l'HbA1c mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC); e l'insulina a digiuno mediante saggio immunoenzimatico chemiluminescente.
    3. Calcolare il modello omeostatico per la valutazione della resistenza all'insulina (HOMA-IR).
    4. Calcolare il rapporto tra trigliceridi e colesterolo HDL (TG/HDL-C).
    5. Calcolare l'indice aterogenico del plasma (AIP) come:
      AIP = log (TG/HDL-C)
  3. Misurare i biomarcatori plasmatici dell'infiammazione
    NOTA: Manipolare i campioni biologici umani in conformità con le normative istituzionali sulla biosicurezza e le precauzioni standard. Indossare dispositivi di protezione individuale adeguati, utilizzare materiali sterili e tecniche asettiche, trasportare i campioni in contenitori sigillati e smaltire i rifiuti biologici secondo le normative istituzionali.
    1. Acquisire ed elaborare i campioni di sangue
      1. Prelievo di 15 mL di sangue venoso a digiuno dalla vena antecubitale utilizzando tecnica sterile e tubi appropriati contenenti anticoagulante.
      2. Invertire delicatamente i tubi da 8 a 10 volte. Centrifugare a 2.000 × g per 10 minuti a 4 °C.
      3. Trasferire il sopranatante plasmatico in un tubo sterile etichettato e suddividerlo in aliquote secondo necessità. Conservare le aliquote a −80 °C fino all'analisi.
    2. Eseguire il saggio ELISA
      1. Preparare standard e diluizioni dei campioni. Aggiungere 100 µL di standard, controlli e campioni plasmatici opportunamente diluiti in duplicato nei pozzetti rivestiti con anticorpo specifico.
      2. Incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente, con agitazione delicata. Aspirare il contenuto e lavare i pozzetti 3 volte con 300 µL di PBS contenente polisorbato 20 allo 0,05% (PBST), pH 7,2–7,4, rimuovendo il liquido residuo dopo l'ultimo lavaggio.
      3. Aggiungere 100 µL di anticorpo di rilevamento e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare la piastra, aggiungere 100 µL di streptavidina-HRP e incubare per 30–60 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il lavaggio.
      4. Aggiungere 100 µL di substrato TMB per lo sviluppo del colore. Incubare per 20–30 minuti a temperatura ambiente al buio. Aggiungere la soluzione di arresto.
      5. Misurare l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Calcolare le concentrazioni dell'analita a partire dalla curva standard.
      6. Analizzare ogni campione plasmatico in duplicato e calcolare il valore medio per l'analisi statistica.
      7. Includere standard di calibrazione e campioni di controllo qualità in ogni serie analitica.
      8. Verificare che le misurazioni duplicate soddisfino il criterio predeterminato del coefficiente di variazione. Ripetere le misurazioni se il criterio viene superato o se vengono rilevati errori tecnici.
      9. Registrare i risultati finali utilizzando identificatori codificati dei partecipanti. Mantenere l'anonimato dei campioni durante l'intera analisi di laboratorio.
  4. Valutare la funzione diastolica del ventricolo sinistro mediante ecocardiografia
    1. Preparare il partecipante e l'apparecchiatura
      1. Far riposare il partecipante in modo tranquillo per almeno 10 minuti prima dell'acquisizione delle immagini.
      2. Posizionare il partecipante in decubito laterale sinistro e applicare gli elettrodi ECG per la sincronizzazione con il ciclo cardiaco.
      3. Acquisire tutte le immagini durante una respirazione tranquilla, minimizzando i movimenti respiratori.
      4. Utilizzare un sistema ecografico ad alta risoluzione dotato di un trasduttore phased-array da 2–5 MHz, in grado di eseguire imaging Doppler a onda pulsata e Doppler tissutale.
      5. Mantenere, ogni volta che possibile, lo stesso apparecchio ecografico, le stesse impostazioni del trasduttore e gli stessi parametri di acquisizione per tutta la durata dello studio.
        NOTA: Eseguire tutti gli esami secondo le raccomandazioni attuali della American Society of Echocardiography e della European Association of Cardiovascular Imaging12,22.
    2. Acquisire immagini ecocardiografiche standard
      1. Acquisire le viste standard: asse lungo para-sternale, asse corto para-sternale, quattro camere apicale, due camere apicale e asse lungo apicale.
      2. Ottimizzare guadagno, profondità, larghezza del settore e frame rate prima dell'acquisizione Doppler.
    3. Misurare il flusso mitralico
      1. Posizionare il volume di campionamento del Doppler a onda pulsata tra le punte delle valvole mitrali nella vista a quattro camere apicale.
      2. Registrare le velocità del flusso trans-mitralico precoce (E) e tardivo (A).
      3. Acquisire almeno tre cicli cardiaci consecutivi per l'analisi.
    4. Eseguire l'imaging Doppler tissutale
      1. Attivare l'imaging Doppler tissutale a onda pulsata nella vista a quattro camere apicale.
      2. Posizionare il volume di campionamento in sequenza all'annulus mitralico settale e laterale.
      3. Mantenere il fascio ecografico il più parallelo possibile al movimento miocardico.
      4. Registrare tre cicli cardiaci consecutivi in ciascuna posizione annulare.
    5. Calcolare le velocità annulari
      1. Misurare le velocità e′ settali e laterali.
      2. Fare la media di tre cicli cardiaci per ciascuna posizione annulare.
      3. Calcolare la velocità media e′ annulare.
    6. Calcolare il rapporto E/e′
      1. Calcolare il rapporto medio E/e′ dividendo la velocità mitralica E per la velocità media e′ annulare.
      2. Segnalare separatamente i rapporti E/e′ settale e laterale quando disponibili.
        NOTA: Per il controllo di qualità, acquisire almeno tre cicli cardiaci consecutivi durante una respirazione stabile e fare la media di tre misurazioni indipendenti per ciascuna variabile ecocardiografica. Conservare tutte le immagini digitali per un'analisi off-line da parte di almeno due operatori addestrati, ciechi rispetto ai dati di laboratorio e dietetici, e valutare la riproducibilità tra operatori prima dell'analisi finale dei dati.
  5. Valutare l'aterogenesi subclinica misurando lo spessore intima-media carotideo
    1. Preparare il partecipante e l'apparecchiatura
      1. Eseguire l'ecografia carotidea utilizzando un sistema ecografico ad alta risoluzione dotato di un trasduttore vascolare lineare da 7–15 MHz.
      2. Far riposare il partecipante in posizione supina per almeno 10 minuti prima dell'acquisizione delle immagini.
      3. Posizionare il collo in leggera estensione e ruotare la testa di circa 30–45° rispetto al lato da esaminare.
      4. Evitare una rotazione eccessiva della testa per mantenere la geometria del vaso e ottimizzare la qualità dell'immagine.
      5. Utilizzare, ogni volta che possibile, lo stesso sistema ecografico, trasduttore, impostazioni di acquisizione e software di analisi per tutti i partecipanti.
    2. Eseguire l'ecografia carotidea
      1. Esaminare le arterie carotidi destra e sinistra separatamente.
      2. Individuare nell'immagine trasversale l'arteria carotide comune, il bulbo carotideo, l'arteria carotide interna e l'arteria carotide esterna.
      3. Ruotare il trasduttore per ottenere un'immagine longitudinale con chiari confini tra lume-intima e media-avventizia.
      4. Ottimizzare profondità dell'immagine, zona focale e guadagno complessivo prima di effettuare le misurazioni.
    3. Misurare lo spessore intima-media carotideo
      1. Definire lo CIMT come la distanza tra il margine anteriore dell'interfaccia lume-intima e il margine anteriore dell'interfaccia media-avventizia.
      2. Selezionare un segmento privo di placche della parete distale dell'arteria carotide comune, approssimativamente 10 mm prossimalmente al bulbo carotideo.
        NOTA: Non includere il bulbo carotideo o l'arteria carotide interna nella misurazione principale dello spessore intima-media carotideo, a meno che queste regioni non siano esiti predefiniti dello studio.
    4. Calcolare lo CIMT
      1. Eseguire almeno tre misurazioni per ciascuna arteria carotidea.
      2. Calcolare lo CIMT medio separatamente per le arterie carotidi destra e sinistra.
      3. Calcolare lo CIMT medio complessivo come media dei valori medi destro e sinistro.
      4. Registrare lo spessore intima-media massimo privo di placche per ciascun lato come variabile descrittiva secondaria.
    5. Interpretare lo CIMT
      1. Analizzare lo CIMT principalmente come variabile continua.
      2. Applicare un valore soglia predefinito dello CIMT specifico per lo studio (<0,7 mm o ≥0,7 mm) solo per analisi categoriali rappresentative, quando appropriato.
      3. Registrare la presenza di placche carotidee separatamente dalle misurazioni dello CIMT.
        NOTA: Utilizzare un valore soglia dello CIMT di ≥0,7 mm solo per analisi rappresentative; quando disponibili, utilizzare valori di riferimento specifici per età e sesso. Assicurare il controllo di qualità mediante ecografisti addestrati, immagini codificate e analisi indipendente cieca da parte di almeno due ricercatori. Valutare l'affidabilità intra- e inter-osservatore mediante coefficienti di correlazione intraclasse (ICCs) con intervalli di confidenza al 95% e ripetere le misurazioni quando le interfacce arteriose non sono adeguatamente visualizzate.

6. Analisi statistica

  1. Stimare la dimensione del campione
    1. Stimare la dimensione del campione necessaria in base all'obiettivo primario dello studio e all'entità dell'effetto atteso.
    2. Utilizzare un livello di significatività (α) di 0,05 e una potenza statistica di almeno l'80%.
  2. Valutare la distribuzione delle variabili continue utilizzando un test di normalità appropriato, come il test di Shapiro–Wilk.
  3. Selezionare i test statistici
    1. Analizzare le variabili continue con distribuzione normale utilizzando il test t di Student t-test.
    2. Analizzare le variabili continue non distribuite in modo normale utilizzando il test di Mann-Whitney U test.
    3. Confrontare più di due gruppi utilizzando l'analisi della varianza ad un fattore (ANOVA) o il test di Kruskal-Wallis, secondo opportunità.
    4. Analizzare le variabili categoriali utilizzando il test del chi-quadro o il test esatto di Fisher.
    5. Valutare le associazioni tra variabili distribuite normalmente utilizzando l'analisi della correlazione di Pearson.
    6. Valutare le associazioni tra variabili non normalmente distribuite utilizzando l'analisi della correlazione dei ranghi di Spearman23,24,25.
  4. Correggere per variabili di confondimento
    1. Eseguire analisi di regressione multivariata, quando appropriato, per valutare l'associazione indipendente tra l'Indice Dietetico Infiammatorio e gli esiti cardiometabolici.
    2. Aggiustare i modelli di regressione per variabili di confondimento clinicamente rilevanti, inclusi età, sesso, indice di massa corporea, circonferenza della vita, comorbilità, stato di fumatore, attività fisica e farmaci che potrebbero influenzare i biomarcatori infiammatori26.
  5. Considerare un bilaterale p valore <0,05 statisticamente significativo.
  6. Riportare le analisi statistiche
    1. Presentare le variabili continue come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile), secondo opportunità.
    2. Presentare le variabili categoriche come frequenze e percentuali.
    3. Riportare le stime dell'effetto insieme ai corrispondenti intervalli di confidenza al 95%, quando applicabile.

Risultati

Tutti i partecipanti avevano una MASLD confermata mediante ecografia epatica standardizzata. La popolazione dello studio era abbinata per età e sesso, e le comorbidità più prevalenti erano diabete mellito di tipo 2, ipertensione arteriosa sistemica e dislipidemia, come riassunto nella Tabella 1. I dati grezzi alla base delle analisi rappresentative sono forniti nel File Supplementare 1.

Come applicazione rappresentativa del protocollo, l'Indice Dietetico Infiammatorio (DII) è stato analizzato come indicatore del potenziale infiammatorio della dieta. Analisi esplorative hanno dimostrato una correlazione positiva moderata tra DII e rapporto E/e′ (ρ di Spearman = 0,50, p < 0,05), mentre nessuna correlazione significativa è stata osservata tra DII e CIMT (ρ di Spearman = 0,40, p = 0,81; Figura 1). Di conseguenza, la correlazione DII–CIMT deve essere interpretata come un risultato esplorativo non significativo.

Analisi biochimiche rappresentative hanno dimostrato che i partecipanti con MASLD presentavano concentrazioni plasmatiche più elevate di glucosio, HbA1c e trigliceridi, nonché un maggiore rischio cardiovascolare, come indicato dai rapporti trigliceridi-HDL colesterolo (TG/HDL-C) e dall'Indice Aterogenico del Plasma. L'aterosclerosi subclinica è stata ulteriormente valutata stratificando i partecipanti in base allo spessore intimale-mediale carotideo (CIMT). Analisi rappresentative hanno mostrato che un aumento del CIMT non era associato al peso corporeo, all'indice di massa corporea o alla circonferenza della vita, ma era associato alla presenza di MASLD (Tabella 2).

L'applicabilità del protocollo è ulteriormente illustrata dai criteri predefiniti di classificazione dei partecipanti. I partecipanti assegnati al quartile più alto dell'IDR (Q4) rappresentavano il sottogruppo con il maggiore carico infiammatorio derivante dall'alimentazione, mentre quelli assegnati a Q1 rappresentavano l'esposizione infiammatoria più bassa. Analogamente, i partecipanti con uno spessore intimale-mediale carotideo (CIMT) ≥0,7 mm sono stati classificati come affetti da aterosclerosi subclinica aumentata, mentre valori di E/e′ >14 indicavano una pressione di riempimento del ventricolo sinistro elevata e una disfunzione diastolica. Queste soglie predefinite forniscono un quadro standardizzato per l'interpretazione dei risultati dietetici, vascolari e cardiaci e facilitano confronti riproducibili del rischio cardiometabolico tra i diversi gruppi di partecipanti.

figure-results-1
Figura 1: Relazioni rappresentative tra l'Indice Dietetico Infiammatorio e le misurazioni precoci dei parametri cardiometabolici. (A) Correlazione tra l'Indice Dietetico Infiammatorio (DII) e il rapporto E/e′, un marcatore ecocardiografico della pressione di riempimento del ventricolo sinistro. (B) Correlazione tra DII e spessore intima-media carotideo (CIMT), analizzato come variabile continua. La soglia predeterminata di CIMT pari a 0,7 mm è stata utilizzata soltanto per analisi categoriali rappresentative e non deve essere interpretata come un valore soglia diagnostico universale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

senza MASLDcon MASLDvalore p
(n = 10)(n = 15)
Età (anni) 42 (37 – 48)41 (39 – 43)0.37
Sesso maschile n (%)4 (40,0)8 (53,3)0.4
Glucosio a digiuno (mg/dL)88 (83 – 94)105 (98 – 125)0.01
HbA1c5,9 (5,5 - 6,1)6,4 (6,0 – 7,2)0.02
TG (mg/dL)120 (74 – 147)219 (108 – 297)0.02
HDLc (mg/dL)41 (37 – 46)48 (30 – 57)0.43
Rapporto TG/HDL-C2,5 (1,8 – 4,9)5,1 (2,6 – 6,7)0.04
AIP0,32 (0,24 – 0,41)0,42 (0,35 – 0,62)0.04
CRP (mg/dL)0,8 (0,4 – 1,0)1,1 (0,2 – 1,3)0.23

Tabella 1: Caratteristiche demografiche, biochimiche e cardiometaboliche rappresentative in base allo stato di MASLD. Caratteristiche demografiche di base e parametri biochimici e cardiometabolici rappresentativi nei partecipanti senza MASLD e con MASLD. Le variabili continue sono riportate come mediana (intervallo interquartile), mentre le variabili categoriche sono riportate come n (%). I confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test t di Student ttest t o Mann-Whitney U test per le variabili continue e test esatto di Fisher per le variabili categoriali. Abbreviazioni: MASLD = malattia epatica steatotica associata a disfunzione metabolica; HbA1c = emoglobina glicata; TG = trigliceridi; HDL-C = colesterolo delle lipoproteine ad alta densità; AIP = indice aterogenico del plasma; CRP = proteina C reattiva

Prima fase dell'aterogenesiAterogenesi avanzataValore p
CIMT < 0.7 (n = 18)CIMT ≥ 0.7 (n = 7)
Peso (kg) 73.4 ± 18.070.0 ± 10.60.4
IMC (kg/m2) 30.0 ± 5.2429.0 ± 4.430.46
CC (cm)90.5 ± 7.596.5 ± 2.890.48
MASLD8 (44,4)7 (100)0,01

Tabella 2: Caratteristiche antropometriche rappresentative in base allo spessore intima-media carotideo. Caratteristiche antropometriche rappresentative e prevalenza della steatosi epatica di origine metabolica (MASLD) stratificate in base allo spessore intima-media carotideo (CIMT). I partecipanti sono stati classificati come affetti da aterosclerosi subclinica precoce (CIMT <0,7 mm) o aumentata aterosclerosi subclinica (CIMT ≥0,7 mm). Le variabili continue sono presentate come media ± deviazione standard, e le variabili categoriali sono presentate come n (%). I confronti tra gruppi sono stati effettuati utilizzando il test t di Student ttest di Mann-Whitney U test o test chi-quadrato, secondo opportunità. Abbreviazioni: BMI = indice di massa corporea; WC = circonferenza vita; CIMT = spessore intima-media carotideo.

File Supplementare 1: I dati grezzi utilizzati per le analisi descritte in questo studio. Cliccare qui per scaricare il file.

Discussione

I metodi descritti in questo documento forniscono un flusso di lavoro standardizzato per indagare se il carico cardiometabolico e aterogenico sia associato alla steatosi epatica associata a disfunzione metabolica (MASLD), sulla base dell'ipotesi che la disfunzione metabolica epatica contribuisca all'aterogenesi precoce27,28. Il flusso di lavoro proposto stabilisce procedure standardizzate per la selezione dei partecipanti, la valutazione della dieta, la quantificazione dei biomarcatori, l'imaging cardiovascolare, il controllo di qualità e la validazione dei dati, al fine di migliorare la coerenza e la riproducibilità metodologica. Ogni volta che possibile, tutte le misurazioni vengono effettuate utilizzando apparecchiature identiche, parametri standardizzati di acquisizione, personale addestrato, verifica duplicata e analisi delle immagini in cieco per ridurre al minimo la variabilità dipendente dall'operatore tra diversi ricercatori e istituzioni. La valutazione della dieta mediante un questionario strutturato sulla frequenza alimentare (FFQ) supportato da immagini rappresenta un componente fondamentale, poiché il calcolo dell'indice dietetico infiammatorio (DII) dipende dall'accuratezza dell'assunzione alimentare autodichiarata. L'uso di porzioni di riferimento standardizzate e di supporti visivi riduce il bias di memoria e migliora la comparabilità tra individui29,30. Analogamente, la stima dell'indice dietetico infiammatorio (DII) mediante il database di riferimento globale composto da 45 parametri dietetici consente una valutazione standardizzata del potenziale infiammatorio della dieta in diverse popolazioni8,9. Un'errata classificazione dell'assunzione alimentare in questa fase potrebbe attenuare le associazioni con gli esiti cardiometabolici. Inoltre, l'integrazione di marcatori biochimici, della valutazione ecocardiografica della funzione diastolica del ventricolo sinistro (E/e′) e dello spessore intimo-media carotideo (CIMT) fornisce una valutazione completa del rischio cardiometabolico precoce. L'aderenza rigorosa ai protocolli raccomandati dalle linee guida riduce al minimo la variabilità dipendente dall'operatore e garantisce misurazioni cardiovascolari affidabili e riproducibili12,15,22.

È importante sottolineare che l'IDI è concepito per caratterizzare la variabilità interindividuale del potenziale infiammatorio della dieta, piuttosto che per diagnosticare la MASLD o per prevedere in modo indipendente le malattie cardiometaboliche. Di conseguenza, non ci si aspetta che tutti gli individui con MASLD presentino punteggi IDI elevati, e un IDI alto non indica necessariamente anomalie cardiometaboliche avanzate. Al contrario, questo protocollo utilizza l'IDI come variabile di stratificazione per indagare se un aumento del carico infiammatorio derivante dalla dieta sia associato a progressivi cambiamenti cardiovascolari subclinici lungo lo spettro della MASLD. Per migliorare la fattibilità, il protocollo incorpora un QDF adattato alla popolazione, che ne facilita l'implementazione in contesti clinici. Sebbene strumenti dietetici completi catturino un intervallo più ampio di nutrienti, i QDF semplificati hanno dimostrato una validità accettabile nella stima dell'IDI e dei modelli infiammatori correlati alla dieta31.

Il protocollo incorpora anche procedure standardizzate di controllo della qualità per migliorare la riproducibilità durante le valutazioni di laboratorio e di imaging. La raccolta standardizzata del sangue, la tempestiva lavorazione dei campioni, le condizioni appropriate di conservazione, l'identificazione codificata dei campioni, le misurazioni di laboratorio duplicate e l'inclusione di campioni di controllo della qualità riducono la variabilità analitica. Analogamente, la posizione standardizzata del paziente, l'allineamento Doppler, i piani di acquisizione e la media di più cicli cardiaci riducono la variabilità nelle misurazioni ecocardiografiche, mentre la valutazione bilaterale dell'IMT carotideo mediante un segmento standardizzato della parete distale comune privo di placche e la revisione indipendente e in cieco delle immagini migliora la riproducibilità delle misurazioni vascolari. Questo flusso di lavoro è adattabile a diversi ambienti di ricerca, consentendo ai centri con infrastrutture di laboratorio limitate di implementare la valutazione dietetica, la valutazione antropometrica e la valutazione cardiovascolare basata sull'ultrasuono prima di integrare ulteriori biomarcatori molecolari o infiammatori, in base alle risorse disponibili e agli obiettivi dello studio.

Un'ulteriore forza di questo flusso di lavoro è la sua capacità di identificare partecipanti con fenotipi discordanti, come individui con un profilo alimentare fortemente pro-infiammatorio ma senza evidenza di anomalie cardiometaboliche o, al contrario, soggetti con valori relativamente bassi di DII nonostante un accertato danno cardiometabolico. Tali risultati possono fornire informazioni sulle complesse interazioni tra profili alimentari, sensibilità all'insulina, adiposità viscerale, attività fisica, fattori genetici ed epigenetici, terapia farmacologica, qualità del sonno e altri determinanti ambientali della salute cardiometabolica. Studi longitudinali che applichino questo protocollo standardizzato potrebbero chiarire ulteriormente la relazione tra il carico infiammatorio derivato dall'alimentazione e la progressione della malattia cardiometabolica nella MASLD.

Vanno considerati diversi limiti di questo protocollo. Il disegno trasversale esclude inferenze causali riguardo alla relazione tra potenziale infiammatorio della dieta e danno cardiometabolico. Inoltre, l'IDL riflette abitudini alimentari consolidate piuttosto che risposte infiammatorie acute, e la valutazione alimentare auto-riferita è soggetta a bias di richiamo32. L'uso della proteina C reattiva (PCR) come marcatore sistemico dell'infiammazione potrebbe sottostimare modifiche infiammatorie sottili rispetto a un profilo più ampio di citochine33. Analogamente, la riproducibilità dell'IMT dipende dal segmento arterioso valutato, dalla selezione della parete, dal timing rispetto al ciclo cardiaco e dal numero di misurazioni ottenute. Pertanto, è preferibile un'analisi continua dell'IMT e un'interpretazione basata su percentili specifici della popolazione, mentre la soglia di ≥0,7 mm utilizzata nei risultati rappresentativi dovrebbe essere considerata un cutoff analitico predeterminato specifico dello studio e non una soglia clinica universale. È importante sottolineare che questo protocollo è concepito come un flusso di lavoro per la valutazione precoce del rischio cardiometabolico, piuttosto che come un algoritmo diagnostico o prognostico. A differenza degli approcci convenzionali di screening cardiometabolico per pazienti con MASLD, che si basano principalmente su misurazioni antropometriche, valutazione della pressione arteriosa, stato glicemico, test biochimici epato-correlati e profilo lipidico per stimare il rischio cardiovascolare34,35, questo flusso di lavoro integra cinque domini complementari: (i) carico infiammatorio alimentare quantificato tramite l'IDL, (ii) profilo biochimico cardiometabolico, (iii) biomarcatori infiammatori circolanti, (iv) valutazione ecocardiografica della funzione diastolica del ventricolo sinistro mediante il rapporto E/e′, e (v) IMT come marcatore di aterosclerosi subclinica precoce. Nel complesso, queste valutazioni complementari forniscono un quadro standardizzato, non invasivo e riproducibile per identificare precoci alterazioni metaboliche e vascolari prima dello sviluppo di una malattia cardiovascolare clinicamente evidente, integrando piuttosto che sostituire lo screening cardiometabolico convenzionale1,3,12,15,34,35,36,37,38,39.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il supporto finanziario proveniente dal Programma Istituzionale E015.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit per saggio ELISA Abcamab65328Kit per saggi ELISA, colorimetrici, Abcam per piastre a 96 pozzetti
Lettore per micropiastre per assorbanza, SunriseTecan 30190079Modalità di rilevamento: Assorbanza; Intervallo di lunghezza d'onda: 340 nm - 750 nm; Lunghezze d'onda del filtro: 405 nm, 450 nm, 492 nm, 620 nm; Formato piastra: piastre a 96 pozzetti
SfigmomanometroHomecareANEROIDE 1000Bracciale in cotone al 100% autoregolante con gancio, cuffia indicatore per arteria adulta.
Ecografia per misurare lo spessore intimo-media carotideo (CIMT)Philips EPIQ7L12-3 Broadband Linear Array TransducerTransduttore lineare (Transduttore a matrice lineare a banda larga)

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