Articolo metodologico

Un protocollo standardizzato per l'indotta della senescenza prematura indotta dallo stress nei melanociti umani primari utilizzando idroperossido di tert-butil

DOI:

10.3791/70595

⸱

29 maggio 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Biomedical Aging Research, Universität Innsbruck, 2Center for Molecular Biosciences Innsbruck (CMBI), 3European Innovation Center, Proya Europe

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocollo standardizzato per indurre la senescenza prematura negli HNM utilizzando tBHP, protocolli standardizzati per l'analisi dei principali marcatori di senescenza, inclusi arresto della crescita, attività SA-β-galactosidasi e fattori SASP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli stress ambientali, tra cui radiazioni UV, inquinamento atmosferico o fumo di sigaretta, favoriscono l'invecchiamento estrinseco della pelle. L'esposizione a questi fattori di invecchiamento estrinseci favorisce l'accumulo di cellule senescenti, contribuendo alla formazione di rughe e disturbi della pigmentazione. I melanociti, che forniscono una protezione primaria contro i raggi UV, mostrano una riduzione dell'attività con l'età. I melanociti senescenti si accumulano nella pelle invecchiata e contribuiscono al suo aspetto invecchiato; Tuttavia, esistono pochi modelli per studiare la senescenza dei melanociti, e questo lavoro mira a sviluppare un modello riproducibile per ulteriori ricerche. In questo studio, presentiamo un modello di senescenza dei melanociti neonatali umani (HNM) utilizzando tert-butyl hydroperoxid (tBHP), un induttore di stress ossidativo ben caratterizzato. Il tBHP interrompe l'omeostasi redox esaurendo le difese antiossidanti cellulari e promuovendo la sovrapproduzione di radicali, causando danni al DNA e alle proteine. Caratterizziamo il fenotipo di senescenza dei melanociti trattati con tBHP attraverso l'analisi dei marcatori di senescenza consolidati, inclusi potenziale di crescita limitato, cambiamenti morfologici e attività SA-β-Galactosidasi. Questo modello fornisce uno strumento prezioso per indagare la senescenza prematura indotta dallo stress nei melanociti, offrendo una visione del loro ruolo nell'invecchiamento estrinseco della pelle e nei disturbi della pigmentazione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'invecchiamento cutaneo è composto da due fattori distinti: invecchiamento intrinseco ed invecchiamentoestrinseco 1,2. L'invecchiamento intrinseco è causato da processi cronologici naturali e fattori genetici, mentre l'invecchiamento estrinseco deriva dall'esposizione cumulativa a fattori di stress ambientali, principalmente radiazioni ultraviolette, ma anche inquinamento atmosferico, fumo di sigaretta e agenti chimici, che accelerano il processo di invecchiamento oltre i normali tassicronologici 3,4. Le esposizioni ambientali generano stress ossidativo che sovrasta le difese antiossidanti cellulari, causando danni al DNA, ossidazione delle proteine e perossidazione lipidica. Queste alterazioni molecolari scatenano risposte persistenti di danno al DNA e disfunzioni cellulari, favorendo infine una senescenzaprematura 5,6. Questa senescenza indotta dallo stress contribuisce alle caratteristiche cliniche della pelle invecchiata, tra cui rughe, pigmentazione irregolare, riduzione dell'elasticità e compromisso della funzionebarriera 7.

I melanociti risiedono all'interno dell'epidermide basale e rappresentano la principale difesa della pelle contro i danni indotti dai raggi UV, sintetizzando la melanina e trasferendola ai cheratinociti circostanti. Paradossalmente, questo ruolo protettivo li rende particolarmente vulnerabili allo stress ossidativo e alla senescenza prematura durante l'invecchiamentoestrinseco 8,9. Il processo di melanogenesi stesso genera notevoli specie reattive di ossigeno come sottoprodotti delle reazioni tirosinasi-catalizzate, creando un carico ossidativo intrinseco ulteriormente amplificato da esposizioni ambientali come radiazioni UV einquinamento 10,11. Di conseguenza, lo stress ambientale cronico può indurre danni ossidativi, disfunzione mitocondriale e, infine, senescenzacellulare 12. Nonostante la loro importanza, restano domande chiave sulle vie molecolari che governano la senescenza dei melanociti e su come lo stress ossidativo inizi questo processo. Inoltre, l'influenza dei melanociti senescenti sul microambiente cutaneo circostante come fattore di cambiamento cutaneo legati all'età, in particolare attraverso il rilascio di fattori SASP, rimane insufficientementecompresa 13,14.

Sebbene i melanociti siano particolarmente suscettibili alla senescenza indotta dallo stress ossidativo, i modelli sperimentali per studiare questo processo restanolimitati 15,16. La maggior parte delle ricerche sulla senescenza continua a basarsi su modelli di senescenza replicativa o indotta dallo stress nei fibroblasti, ma questi approcci non catturano la biologia distinta dei melanociti né il loro potenziale di influenzare l'invecchiamento cutaneo tramite intercomunicazioni con cellule vicine e il proprio profilo SASP17. Questa lacuna evidenzia la necessità di modelli di senescenza specifici per i melanociti che riflettano in modo più accurato le loro risposte fisiologiche agli stressambientali 18,19 e il loro contributo all'invecchiamento della pelle umana.

Nonostante la disponibilità di approcci di senescenza indotta dallo stress, la loro implementazione nei melanociti umani primari rimane tecnicamente difficile ed è spesso associata a una notevole variabilità. I melanociti sono particolarmente sensibili allo stress ossidativo, il che comporta una finestra sperimentale ristretta tra un'induzione efficace della senescenza e una citotossicità eccessiva. Inoltre, le differenze dipendenti dal donatore nelle preparazioni cellulari primarie contribuiscono ulteriormente a risultati incoerenti tra gli studi. Queste sfide sono spesso sottovalutate e i protocolli sono spesso insufficientemente standardizzati, limitando la riproducibilità. L'attuale protocollo colma questa lacuna fornendo un regime di trattamento ottimizzato e riproducibile, un programma di dosaggio definito e letture standardizzate per un'induzione e valutazione affidabili della senescenza nei melanociti umani primari.

Il tert-butil idroperossido (tBHP) è un induttore ben caratterizzato dello stress ossidativo che favorisce la senescenza generando specie reattive di ossigeno e impaurendo le difese antiossidanti cellulari. È stato ampiamente utilizzato per indurre la senescenza nei fibroblasti dermici, dove attiva marcatori di senescenza distintivi mantenendo la vitalitàcellulare 20,21. Poiché il tBHP produce uno stress ossidativo sostenuto attraverso vie biochimiche definite, offre un sistema riproducibile e accessibile per studiare la senescenza indotta dallo stress ossidativo e per indagare i meccanismi molecolari che collegano il danno ossidativo ai processi diinvecchiamento 22,23. A differenza dei modelli basati su UV, il tBHP è particolarmente vantaggioso quando è richiesta un'induzione controllata e riproducibile dello stress ossidativo, indipendente dai parametri di irradiazione e senza la necessità di apparecchiature specializzate.

HNM fornisce un modello rilevante per studiare i meccanismi di invecchiamentoestrinseci 24. Come cellule primarie derivate dal prepuzio, mantengono intatte vie di risposta allo stress ed evitano artefatti associati alla modifica genetica oall'immortalazione 25. I melanociti neonatali forniscono un modello sperimentale ottimale poiché presentano danni di base minimi, consentendo una valutazione chiara delle vie di senescenza indotte da stressambientale 26,27.

Questo studio impiega lo stress ossidativo indotto da tBHP nei melanociti neonatali umani primari, superando le limitazioni dei modelli cellulari non melanocitici e immortalizzati comunemente utilizzati nella ricerca sulla senescenza. Fornisce una piattaforma standardizzata per esaminare i meccanismi di senescenza specifici dei melanociti e per caratterizzare il fenotipo senescente con marcatori già consolidati. Nel complesso, questo protocollo fornisce un modello riproducibile e fisiologicamente rilevante per studiare la senescenza indotta dallo stress ossidativo nei melanociti.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo è stato ottimizzato per la ricerca sui melanociti neonatali umani primari (HNM) al fine di studiare i meccanismi della senescenza prematura indotta dallo stress indotta dal tBHP (Figura 1). I melanociti sono stati derivati dal prepuzio caucasico neonatale (fototipo a pigmentazione chiara) e ottenuti da una fonte commerciale. Secondo la documentazione del fornitore, i tessuti umani vengono raccolti da donatori pienamente informati e che hanno fornito il consenso, in conformità con i quadri etici e legali stabiliti, inclusa la Dichiarazione di Helsinki e le normative applicabili sulla protezione dei dati. Le celle sono state fornite in una forma de-identificata. Non è stata richiesta alcuna approvazione etica aggiuntiva per il loro utilizzo in questo studio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando la stessa linea di melanociti per garantire la coerenza. Si noti che quando si utilizzano linee cellulari primarie diverse, le condizioni della coltura, così come le concentrazioni e le procedure di manipolazione, potrebbero dover essere ulteriormente modificate.

1. Preparativi

NOTA: Per avviare il trattamento con tBHP, i melanociti devono essere scongelati almeno tre giorni prima per consentire un recupero e una confluenza sufficienti. La fase di trattamento dura 4 giorni, con il giorno di semina designato come Giorno 0. I dettagli di tutti i materiali utilizzati in questo studio sono forniti nella Tabella dei Materiali.

  1. Per preparare il mezzo di coltura, si combina il substrato basale dei melanociti con i relativi fattori di crescita. Fiamma il coperchio di ogni fiala prima di aggiungerne il contenuto al mezzo per minimizzare la contaminazione. Aggiungi 1% (v/v) di PenStrep al mezzo preparato e conservalo a 4 °C fino all'uso.
  2. Prima della semina, preparare la soluzione di inibitore della tripsina diluendo l'inibitore della tripsina di soia in DPBS. Filtrare la soluzione attraverso una membrana da 0,22 μm, aliquota, e conservare a −20 °C. Una volta scongelato, può essere usato fino a 10 giorni.

2. Scongelamento cellulare (Giorno -3)

ATTENZIONE: Tutti i materiali a contatto con cellule umane devono essere considerati contaminati biologicamente e smaltiti secondo le linee guida istituzionali di biosicurezza. Per valutare la senescenza, utilizziamo saghi complementari che analizzano l'arresto della crescita, l'attività del SA-β-gal e ulteriori marcatori molecolari. Qui presentiamo i protocolli per questi saghi e gli esiti attesi quando si lavora con questi indicatori di senescenza.

  1. Pipetta 20 mL di soluzione salina fosfatica (grado coltura cellulare) in un tubo conico da 50 mL a temperatura ambiente. Tieni la fiala contenente le cellule sul ghiaccio fino allo scongelamento.
  2. Accendi il coperchio prima di aprire la fiala contenente le cellule, svitala e fiamma di nuovo i lati per prevenire potenziali contaminazioni.
  3. Trasferire 500 μL di DPBS nella fiala contenente le celle. Scongelare delicatamente le cellule pipettando su e giù, poi trasferire tutto il contenuto nel tubo.
  4. Centrifuga a 100 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Il pellet risultante dovrebbe apparire dal beige al marrone (o più scuro, a seconda dell'etnia del donatore).
  5. Prepara una fiaschetta T75 con 14 mL di mezzo melanocitico.
  6. Fiammare una pipetta Pasteur in vetro (fiamma ogni volta durante la maneggiazione di melanociti), aspirare con cura il DPBS e risospendere il pellet in 1 mL di substrato.
  7. Trasferisci nella fiaschetta precedentemente preparata.
  8. Incubare a 37 °C, 5% di CO₂, e osservare quotidianamente al microscopio. Cambia media almeno ogni 48 ore.
    NOTA: Ogni fiala criopreservata contiene circa 1 × 106 melanociti umani primari. Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando celle al passaggio 9.

3. Semina delle celle (Giorno 0)

  1. Assicurati la confluenza dell'80–90% delle cellule nel giorno della semina.
  2. Aspira il mezzo dalla fiaschetta e lava due volte con DPBS.
  3. Distoglie le cellule aggiungendo 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubando per 5 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
  4. Tocca delicatamente la fiaschetta e osserva al microscopio per confermare il distacco completo delle cellule (incuba più a lungo se necessario).
  5. Ferma la reazione aggiungendo 1,5 volte il volume di inibitore della tripsina.
  6. Trasferire la sospensione della cella in un tubo conico da 15 mL e diluire con DPBS fino a un volume finale di 10 mL.
  7. Centrifuga la sospensione a celle a 100 × g per 5 minuti.
  8. Aspirare il sovrandante e risospendere al volume desiderato nel mezzo.
  9. Per le piastre trattate con tBHP, seminare 6 × 105 cellule per piatto da 10 cm. Per le piastre di controllo, semina 4 × 105 celle per piastra centrale.
    NOTA: Per le piastre trattate con tBHP, si semina una densità cellulare più elevata per garantire che siano disponibili cellule sufficienti per gli esperimenti, poiché il loro tasso di crescita diminuirà progressivamente durante il trattamento. Se si seminano cellule su coverslip per esperimenti microscopici, i coversheets devono essere rivestiti con 0,1 mg/mL di poli-D-lisina e completamente essiccati prima della semina cellulare.
  10. Incubare durante la notte a 37 °C con il 5% di CO₂. Cambia il mezzo ogni 48 ore per le piastre di controllo.

4. trattamento tBHP (Giorno 1–4)

  1. Prepara una soluzione lavorativa da 10 mM con materiale tBHP (diluito in DPBS o mezzo).
    NOTA: il tBHP è sensibile alla luce: copri il contenitore quando lavori con esso. La soluzione di lavoro può essere utilizzata fino a una settimana se conservata correttamente a 4 °C. Programma di trattamento: Il giorno 1 (il giorno dopo la semina) segna l'inizio dell'esposizione al tBHP. I melanociti vengono trattati due volte al giorno, con almeno un intervallo di 4 ore tra una applicazione e l'altra. Questo regime si ripete dal giorno 1 al giorno 4, per un totale di 4 giorni di trattamento. La concentrazione selezionata di tBHP e il programma di trattamento sono stati adattati da lavori precedenti sui fibroblasti dermici, dove concentrazioni più basse erano sufficienti a indurre la senescenza. Nei melanociti primari, tuttavia, erano necessarie concentrazioni più elevate per ottenere un'induzione di senescenza robusta, e 100 μM di tBHP è stato identificato come ottimale sulla base di esperimenti di titolazione che bilanciano induzione da senescenza e vitalità cellulare
  2. Aggiungere 100 μM di tBHP alle celle per 1 ora per trattamento (per iniziare, aggiungere il volume appropriato di soluzione di lavoro, assicurandosi di pipettare nel mezzo liquido).
  3. Muovi la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro per distribuire il tBHP in modo uniforme nel mezzo.
    NOTA: Evitare i movimenti circolari poiché potrebbero causare una distribuzione disomogenea del tBHP attraverso il mezzo.
  4. Incubare per esattamente 1 ora a 37 °C con il 5% di CO₂.
  5. Per interrompere il trattamento con tBHP, aspira il mezzo.
  6. Lava le piastre due volte con DPBS preriscaldato (37 °C).
  7. Aggiungi il volume appropriato di substrato fresco ai piatti.
  8. Lascia che le cellule si riprendano nell'incubatore per almeno 4 ore prima di iniziare il trattamento successivo.
  9. Ripeti questa procedura lo stesso giorno per il secondo trattamento e prosegui per i giorni rimanenti. Mantenere le cellule in coltura dopo la fine del trattamento fino al giorno 9 per valutare i marcatori di senescenza.
  10. Monitorare le piastre di controllo e il passaggio se confluente.

5. Analisi della curva di crescita

  1. Contare le cellule e i controlli trattati con tBHP seguendo il protocollo di seeding.
  2. Risemina la stessa densità iniziale o tutte le celle nel caso ne conti meno delle 6 × 10 celle5 per le piastre tBHP.
  3. Effettuare conteggi cellulari nei giorni 4, 9 e 15 di coltura.
  4. Calcola la curva di crescita usando la seguente formula:
    lg (conteggio) - log (seed) / 0,301 + cPDL
    Conteggio: numero di celle ottenute alla fine del passaggio.
    seme: numero di celle inizialmente placcate all'inizio del passaggio.
    cPDL: livello cumulativo di raddoppio della popolazione riportato dai passaggi precedenti.

6. Attività SA-β-galactosidasi

  1. Al nono giorno, lavare le cellule due volte in PBS prima di fissare con il 2% di formaldeide e lo 0,4% di glutaraldeide.
  2. Lava le cellule due volte con PBS.
  3. Incubare cellule fissate con soluzione di colorazione con pH di 6,0 (150 mM NaCl, 2 mM MgCl, 5 mM ferricianuro di potassio, 5 mM ferrocianuro di potassio, 40 mM di acido citrico, 12 mM fosfato di sodio e 1 mg/mL di 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattitide (X-gal).
  4. Dopo 18 ore di incubazione a 37 °C in assenza di CO₂, lavare due volte le cellule con PBS.
  5. Immagine usando la microscopia ottica.
  6. Quantificare il numero di cellule colorate di blu al microscopio contando il numero di cellule blu e dividendo per il numero totale di cellule in un campo. Esprimi i risultati come percentuale di cellule positive.

7. Colorazione da immunofluorescenza

ATTENZIONE: Formaldeide, glutaraldeide e rifiuti contenenti paraformaldeide devono essere gestiti come rifiuti chimici pericolosi e smaltiti in conformità con le normative istituzionali sulla sicurezza.

  1. Utilizzare cellule coltivate su coperture pre-rivestite con 0,1 mg/mL di poli-D-lisina.
  2. Al nono giorno, lava le cellule due volte, poi fissa con paraformaldeide al 4% per 15 minuti.
  3. Lava le cellule due volte con PBS.
  4. Permeabilizza usando 0,3% di Triton-X e 0,1% di citrato di sodio nel PBS.
  5. Blocca con 1% di BSA in PBS-T per 30 minuti a temperatura ambiente.
  6. Incubare cellule con anticorpi primari γH2AX per rilevare la risposta permanente al danno al DNA durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
  7. Il giorno seguente, lava due volte con PBS.
  8. Applica un anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente.
  9. Colora i nuclei con DAPI se lo desideri.
  10. Lavare due volte con PBS-T, seguite da due lavaggi con PBS e due volte con ddH2O.
  11. Monta le coperture e lasciale asciugare completamente prima dell'imagin.
  12. Analizza l'intensità media di fluorescenza e/o i focus γH2AX utilizzando il software ImageJ.

8. Isolamento dell'RNA e RT-qPCR

ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è altamente tossico e deve essere maneggiato in una cappa fumaria. I rifiuti contenenti β-mercaptoetanolo dovrebbero essere smaltiti come rifiuti chimici pericolosi.

  1. Al nono giorno, tripsinizzare le cellule usando 2 mL di tripsina-EDTA.
  2. Ferma la reazione applicando 1,5 volte la quantità di inibitore della tripsina.
  3. Trasferisci la sospensione della cella su un tubo conico da 15 mL e centrifuga a 100 x g per 5 minuti.
  4. Aspira con cura il soprandante.
  5. Pellet per cellule di lisi risospendendo in un tampone RLT da 350 μL contenente l'1% di β-mercaptoetanolo.
  6. Isolare l'RNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA a colonna.
  7. Determina la concentrazione di RNA usando uno spettrofotometro (260 nm).
  8. Per la sintesi del cDNA, si utilizza 1 μg di RNA per la trascrizione inversa in un volume totale di reazione di 10 μL utilizzando una miscela standard di trascrizione inversa (inclusi tampone RT, dNTP, primer casuali, trasscrittasi inversa e inibitore RNasi) seguita da condizioni di ciclo termico secondo le istruzioni del produttore.
  9. Eseguire RT-qPCR per fattori SASP
    NOTA: I fattori SASP selezionati (IL-8, IL-6 e MMP-1) rappresentano componenti ben consolidati del fenotipo secretorio associato alla senescenza e sono stati scelti in base alla loro rilevanza per la biologia della pelle, inclusi la segnalazione infiammatoria e il rimodellamento della matrice extracellulare
    IL-6 (Fwd: 5' AAGCCAGAGCTGTGTGCAGATGAGTA 3' Rev: 5' TGTCCTGCAGCCACTGGTTC 3')
    IL-8 (Fwd: 5' ACCGGAAGGAACCATCTCAC 3' Rev: 5' AAACTGCACCTTCACAGAG 3')
    MMP-1 (Fwd: 5' CATCGTGTTGCAGCTCATGA 3' Rev: 5' ATGGGCTGGACAGGATTTTG 3')
    GAPDH (Fwd: 5' GAGTCAACGGATTTGGTCGT 3' Rev: 5' GATCTCGCTCCTGGAAGATG 3')
  10. Analizzare l'espressione relativa dell'mRNA utilizzando il metodo ΔΔCt con normalizzazione al gene di mantenimento GAPDH.

9. Isolamento proteico e Western blot

  1. Al nono giorno, raccogli i lisati proteici.
  2. Aspira il mezzo e lava le piastre due volte usando DPBS freddo.
  3. Le cellule di lisi vengono effettuate meccanicamente utilizzando uno schiacciatore cellulare dopo aver aggiunto 150 μL di tampone RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% SDS e 2 mM EDTA) integrate con inibitori della proteasi e trasferite su un tubo da 1,5 mL.
  4. Esegui tre cicli di congelamento e scongelamento seguiti da un'incubazione di 30 minuti sul ghiaccio.
  5. Centrifuga a 9600 x g a 4 °C per 10 minuti.
  6. Determinare la concentrazione proteica del sovranante utilizzando il saggio BCA.
  7. Separare quantità uguali (20 μg) di proteina sui gel di poliacrilammide e trasferirsi alle membrane attive di PVDF.
  8. Bloccare membrane nel latte scremato al 5% in TBS-T.
  9. Incubare con anticorpi primari pRB e LaminB1 durante la notte a 4 °C.
  10. Il giorno dopo, lava le membrane 3 volte in TBS-T.
  11. Incubare in anticorpi secondari appropriati coniugati con HRP per 1 ora a temperatura ambiente.
  12. Rilevare le proteine tramite chemiluminescenza ed eseguire analisi densitometriche.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il trattamento con tBHP induce arresto della crescita nei melanociti neonatali umani.
Il trattamento con tBHP inibisce la proliferazione dei melanociti rispetto ai controlli non trattati (n = 3) (Figura 2A). Al nono giorno, le cellule trattate raggiungono solo 1,4 cPDL, mentre i controlli raggiungono 3,1 cPDL. Questa divergenza aumenta nel tempo, con i melanociti trattati che si avvicinano a un plateau di 1,9 cPDL al giorno 15, mentre i c...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo stabilisce un approccio standardizzato per indurre la senescenza prematura indotta dallo stress (SIPS) nei melanociti neonatali umani utilizzando tBHP, offrendo un modello robusto per studiare la senescenza specificamente in questo tipo cellulare. Cambiamenti costanti nella proliferazione, morfologia, attività SA-β-gal, marcatori di danno al DNA e componenti SASP supportano il fenotipo indotto. Concentrandosi sui melanociti, cellule che restano poco studiate nella ricer...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Lieve Declercq è affiliata a Proya Europe; tuttavia, l'azienda non ebbe alcuna influenza sulla progettazione dello studio, sulla raccolta dei dati, sull'analisi, sull'interpretazione o sulla decisione di pubblicare. Gli autori affermano inoltre che gli strumenti di intelligenza artificiale (IA) venivano utilizzati esclusivamente per assistere nell'editing del linguaggio e nel perfezionamento del testo. Tutti i contenuti scientifici, il disegno sperimentale e l'interpretazione dei dati sono stati sviluppati e validati dagli autori.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato dal Tiroler Wissenschaftsfonds (ZAP746010, F.33287/10-2021, F.50279/7-2024).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0.22 µm membrane filterMerck SLGVR33RS
1 M citric acid Merck K91567844prepare in aq. dest.
1 M MgCl2MerckA649033prepare in aq. dest.
1 M Na2HPO4MerckK56036736prepare in aq. dest.
10 M NaOHLab Honeywell30620prepare in aq. dest.
37% formaldehydeSigma252549
4% paraformaldehydeCarlRoth0335.3
5 M Sodium Chloride SigmaS3014prepare in aq. dest.
50% glutaraldehydeSigmaG6403
5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid (X-Gal)SigmaB9146
Alexa Fluor-conjugated secondary antibody 2 mg/mLInvitrogenA11008
BSA (bovine serum albumin)SigmaA7030
Chemiluminescent substrateSigmaWBKLS0500
Costar CellLifter Corning3008
Coverslips for cell culture/microscopyEprediaCB00200RA120MNZ0
DermaLife Basal MediumCellSystemsLM-0004
DermaLife M Melanocyte Kit CellSystemsLS-1041
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline SigmaD8537
Human neonatal melanocytesCellSystemsFC-0023
LaminB1 antibody (rabbit)AbcamAB16048Dilution 1:1000 in 5% BSA
Mounting medium containing DAPIAbcamAB104139
Penicillin-Streptomycin solution SigmaP4333
Polyacrylamide gradient gelsBio-Rad456-8095
Poly-D-Lysine, 0.1 mg/mL GibcoA38904-01
Potassium ferricyanideSigmaP8131
Potassium ferrocyanideSigmaP-9387
pRB antibody (rabbit)CellSignalling93085Dilution 1:1000 in 5% BSA
Protease inhibitor cocktailself preparedN/A500 mM NaF; 2 µg/ml Aprotinin; 1 mM PMSF; 1 mM activated Na-Orthovanadate
RIPA buffer self preparedN/Acontaining: 50 mM Tris-HCl; 1% NP-40; 0.5% Na-deoxycholate; 0.1% SDS; 150 mM NaCl; 2 mM EDTA
RLT bufferQiagen1015762Included in RNeasy Mini Kit 
RNeasy Mini KitQiagen74106
Skim milk powder (for 5% milk in TBS-T)Sigma70166
Sodium citrate (for 0.1% solution)SigmaS4641
Soybean trypsin inhibitor, 0.5 mg/mL Thermofisher17075-029
tert-Butyl hydroperoxide (tBHP)Sigma458139
Triton X-100 (for 0.3% solution)SigmaT9284
Trypsin-EDTA solutionSigmaT3924
β-mercaptoethanolCarlRoth4227.3
γH2AX antibody (rabbit)CellSignalling2577SDilution 1:200 

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hussein, R. S., Bin Dayel, S., Abahussein, O., et al. Influences on skin and intrinsic aging: biological, environmental, and therapeutic insight. J Cosmet Dermatol. 24, e16688 (2025).
  2. Dorf, N., Maciejczyk, M. Skin senescence-from basic research to clinical practice. Front Med (Lausanne). 11, 1484345 (2024).
  3. Grenier, A., Morissette, M. C., Rochette, P. J., et al. The combination of cigarette smoke and solar rays causes effects similar to skin aging in a bilayer skin model. Sci Rep. 13, 17969 (2023).
  4. Varani, J., Dame, M. K., Rittie, L., et al. Decreased collagen production in chronologically aged skin: roles of age-dependent alteration in fibroblast function and defective mechanical stimulation. Am J Pathol. 168, 1861-1868 (2006).
  5. Zhang, S., Duan, E. Fighting against skin aging: the way from bench to bedside. Cell Transplant. 27, 729-738 (2018).
  6. Hussen, N. H. a., Abdulla, S. K., Ali, N. M., et al. Role of antioxidants in skin aging and the molecular mechanism of ROS: a comprehensive review. Aspects Mol Med. 5, 100063 (2025).
  7. Addor, F. A. S. Beyond photoaging: additional factors involved in the process of skin aging. Clin Cosmet Investig Dermatol. 11, 437-443 (2018).
  8. Mucha, M., Skrzydlewska, E., Gęgotek, A. Natural protection against oxidative stress in human skin melanocytes. Commun Biol. 8, 1283 (2025).
  9. Hughes, B. K., Bishop, C. L. Current understanding of the role of senescent melanocytes in skin ageing. Biomedicines. 10, 3111 (2022).
  10. Kamiński, K., Kazimierczak, U., Kolenda, T. Oxidative stress in melanogenesis and melanoma development. Contemp Oncol (Pozn). 26, 1-7 (2022).
  11. Jiménez-Cervantes, C., Martínez-Esparza, M., Pérez, C., et al. Inhibition of melanogenesis in response to oxidative stress: transient downregulation of melanocyte differentiation markers and possible involvement of microphthalmia transcription factor. J Cell Sci. 114, 2335-2344 (2001).
  12. Dańczak-Pazdrowska, A., Gornowicz-Porowska, J., Polańska, A., et al. Cellular senescence in skin-related research: targeted signaling pathways and naturally occurring therapeutic agents. Aging Cell. 22, e13845 (2023).
  13. Green, K. J., Pokorny, J., Jarrell, B. Dangerous liaisons: loss of keratinocyte control over melanocytes in melanomagenesis. Bioessays. 46, e2400135 (2024).
  14. Ali, L., Al Niaimi, F. Pathogenesis of melasma explained. Int J Dermatol. 64, 1201-1212 (2025).
  15. Low, E., Alimohammadiha, G., Smith, L. A., et al. How good is the evidence that cellular senescence causes skin ageing. Ageing Res Rev. 71, 101456 (2021).
  16. Chin, T., Lee, X. E., Ng, P. Y., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
  17. Gerasymchuk, M., Robinson, G. I., Kovalchuk, O., et al. Modeling of the senescence-associated phenotype in human skin fibroblasts. Int J Mol Sci. 23, 7124 (2022).
  18. Zimmermann, T., Pommer, M., Kluge, V., et al. Detection of cellular senescence in human primary melanocytes and malignant melanoma cells in vitro. Cells. 11, 1489 (2022).
  19. Tang, J., Li, Q., Cheng, B., et al. Primary culture of human face skin melanocytes for the study of hyperpigmentation. Cytotechnology. 66, 891-898 (2014).
  20. Kučera, O., Endlicher, R., Roušar, T., et al. The effect of tert-butyl hydroperoxide-induced oxidative stress on lean and steatotic rat hepatocytes in vitro. Oxid Med Cell Longev. 2014, 752506 (2014).
  21. Wedel, S., Martic, I., Hrapovic, N., et al. tBHP treatment as a model for cellular senescence and pollution-induced skin aging. Mech Ageing Dev. 190, 111318 (2020).
  22. Rabin, D. M., Rabin, R. L., Blenkinsop, T. A., et al. Chronic oxidative stress upregulates drusen-related protein expression in adult human RPE stem cell-derived RPE cells: a novel culture model for dry AMD. Aging (Albany NY). 5, 51-66 (2013).
  23. Shakel, Z., Costa Lima, S. A., Reis, S. Strategies to make human skin models based on cellular senescence for ageing research. Ageing Res Rev. 100, 102430 (2024).
  24. Mort, R. L., Jackson, I. J., Patton, E. E. The melanocyte lineage in development and disease. Development. 142, 620-632 (2015).
  25. Goff, P. S., Castle, J. T., Kohli, J. S., et al. Isolation, culture, and transfection of melanocytes. Curr Protoc. 3, e774 (2023).
  26. Martic, I., Wedel, S., Jansen-Dürr, P., et al. A new model to investigate UVB-induced cellular senescence and pigmentation in melanocytes. Mech Ageing Dev. 190, 111322 (2020).
  27. Victorelli, S., Lagnado, A., Halim, J., et al. Senescent human melanocytes drive skin ageing via paracrine telomere dysfunction. EMBO J. 38, e101982 (2019).
  28. Zhang, H., Davies, K. J. A., Forman, H. J. Oxidative stress response and Nrf2 signaling in aging. Free Radic Biol Med. 88, 314-336 (2015).
  29. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34, 1565-1576 (2020).
  30. Kang, H. Y., Ortonne, J. P. What should be considered in treatment of melasma. Ann Dermatol. 22, 373-378 (2010).
  31. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., et al. ROS, cell senescence, and novel molecular mechanisms in aging and age-related diseases. Oxid Med Cell Longev. 2016, 3565127 (2016).
  32. Almeida, F. V., Douglass, S. M., Fane, M. E., et al. Bad company: microenvironmentally mediated resistance to targeted therapy in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 32, 237-247 (2019).
  33. Brenner, M., Hearing, V. J. The protective role of melanin against UV damage in human skin. Photochem Photobiol. 84, 539-549 (2008).
  34. López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153, 1194-1217 (2013).
  35. Videira, I. F., Moura, D. F., Magina, S. Mechanisms regulating melanogenesis. An Bras Dermatol. 88, 76-83 (2013).
  36. Ratz-Łyko, A., Arct, J. Resveratrol as an active ingredient for cosmetic and dermatological applications: a review. J Cosmet Laser Ther. 21, 84-90 (2019).
  37. Xu, M., Pirtskhalava, T., Farr, J. N., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24, 1246-1256 (2018).
  38. Ogrodnik, M., Evans, S. A., Fielder, E., et al. Whole-body senescent cell clearance alleviates age-related brain inflammation and cognitive impairment in mice. Aging Cell. 20, e13296 (2021).
  39. Hernandez-Segura, A., de Jong, T. V., Melov, S., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Curr Biol. 27, 2652-2660.e4 (2017).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Senescenza dei melanocitistress ossidativosenescenza indotta da stressmarcatori di senescenzainvecchiamento cutaneoSA beta galattosidasidisturbi della pigmentazioneomeostasi redox

Articoli correlati