Articolo metodologico

Manipolazione fisica per generare embrioni mini di Xenopus

DOI:

10.3791/70602

⸱

10 aprile 2026

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descriviamo un metodo di costrizione fisica per produrre mini embrioni da embrioni a 1 cellula di Xenopus laevis .

Abstract

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Una caratteristica distintiva dell'embriogenesi precoce è la rapida e esponenziale diminuzione della dimensione delle singole cellule mentre il volume complessivo dell'embrione rimane costante. Il rapporto nucleocitoplasmatico (N:C) svolge un ruolo fondamentale nella regolazione delle attività cellulari e molecolari essenziali per l'embriogenesi precoce. La manipolazione fisica della dimensione dell'embrione, quindi, rappresenta un modo importante per indagare questi meccanismi di sviluppo. Le grandi dimensioni (~ 1,2 mm di diametro) e l'elevata plasticità dello sviluppo degli embrioni precoci di Xenopus laevis li rendono un modello ideale per la dissezione fisica e la manipolazione per esaminare i meccanismi regolatori dello sviluppo. Qui descriviamo un approccio per generare mini embrioni con volume citoplasmatico alterato e rapporto N:C costritori embrioni di Xenopus laevis a 1-cellula con nodi di capelli. È stato dimostrato che i mini embrioni risultanti avviano l'attivazione precoce del genoma zigotico (ZGA) indotta direttamente dalla riduzione della dimensione cellulare e dalla crescita del rapporto N:C. Questi mini embrioni, che possono essere generalizzati ad altri sistemi embrionali, forniscono quindi uno strumento unico e potente per analizzare i meccanismi mediati dalla dimensione dello sviluppo embrionale precoce.

Introduzione

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Una delle caratteristiche più evidenti dell'embriogenesi precoce è la riduzione esponenziale della dimensione delle singole cellule all'interno di un embrione che mantiene un volume costante. La rapida sintesi del DNA e la riduzione della dimensione cellulare portano a un aumento del rapporto nucleocitoplasmatico (rapporto N:C), che svolge un ruolo importante nella regolazione di diverse attività distintive della transizione mid-blastula (MBT) nei sistemi embrionali modello, tra cui la trascrizione genica zigotica, l'allungamento del ciclo cellulare e la motilitàcellulare 1,2,3,4 . Le manipolazioni del rapporto N:C modificando la ploidia del DNA supportano la sua importanza funzionale nella precoce embriogenesi in diversi sistemi modello 3,4,5,6.

La manipolazione fisica della dimensione dell'embrione rappresenta una tecnica importante per studiare i meccanismi regolatori nello sviluppo embrionaleprecoce 7. La rimozione citoplasmatica tramite aspirazione, che altera il rapporto N:C negli embrioni di topo precoci, induce una compattazioneprematura 8. Inoltre, la riduzione della dimensione dell'embrione di pesce zebra tramite il taglio ha rivelato un nuovo meccanismo basato su gradiente di scalaturadel somite 9. Inoltre, la riduzione del volume citoplasmatico negli embrioni di Xenopus ha rivelato una dinamica del ciclo cellulare dipendente dal rapportoN:C 10. È importante sottolineare che, generando mini embrioni di Xenopus attraverso la riduzione della dimensione cellulare e la marcatura dei trascricti nascenti con 5-etinil-uridina (5-EU) in singole cellule, abbiamo dimostrato che ridurre la dimensione cellulare induce l'attivazione zigotica del genoma (ZGA) in modo dipendentedalla dose 11. Questi risultati supportano il ruolo cruciale della dimensione cellulare nell'embriogenesi precoce.

Qui descriviamo una procedura dettagliata per generare mini embrioni di Xenopus laevis tramite manipolazione fisica usando nodi di capelli (Figura 1)10,11. Questo approccio si basa sull'uso fondamentale di Newport e Kirschner (1982) della costrizione a loop di capelli sugli embrioni precoci di Xenopus 1, fornendo un protocollo chiaro e affidabile per generare mini embrioni come strumenti sperimentali. Inoltre, questo metodo è applicabile ad altri sistemiembrionali 7, il che faciliterebbe la scoperta di nuovi meccanismi di embriogenesi precoce.

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Protocollo

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Il lavoro con gli animali descritto qui è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Sud.

1. Preparazione dei materiali

  1. Preparazione delle soluzioni
    1. Prepara 20× MMR mescolando 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 e 40 mMCaCl 2. Regola il pH a 7,8 con NaOH. Autoclave e conservazione a temperatura ambiente.
    2. Prepara una soluzione di mezzo a gradiente di densità al 3% (wt/vol) mescolando 1,5 g di mezzo a gradiente di densità in 50 mL di 0,5× MMR. Mescolare delicatamente con una barra magnetica di mescolare finché il polimero non si scioglie. Tieni a 4 °C fino all'uso.
    3. Prepara un gel di agarosio all'1% in una piastra di Petri da 60 mm mescolando 0,5 g di agarosio in 50 mL di 0,1× MMR. Riscalda con un forno a microonde per sciogliere l'agarosio, poi aggiungi 5 mL di agarosio per ricoprire il fondo di una piastra di Petri da 60 mm con uno strato sottile.
  2. Preparare nodi di capelli per costringere gli embrioni
    1. Prendi dei peli sottili e tagliali a pezzi di ~5 cm.
    2. Usa una pinzetta per inserire un'estremità del pelo in una punta P10 profonda circa ~1 cm.
    3. Metti la cera su un cucchiaio e scaldala per sciogliere la cera. Immergi rapidamente la punta P10 attaccata al pelo nella cera e lascia asciugare per 1 minuto. Assicurati che il pelo sia fissato all'estremità della punta P10.
    4. Usa una pinzetta per fare con cura un nodo sopra la testa dei capelli. Regola la dimensione dell'anello a ~1,5 mm. Ritaglia la sporgenza se necessario. Metti da parte il nodo per un uso futuro.
    5. Ripeti i passaggi sopra per fare più nodi di capelli secondo necessità.

2. Realizzare mini embrioni di Xenopus

  1. Per ottenere embrioni di Xenopus , si segue un protocollo standard per eseguire la fecondazione in vitro (IVF) (ad esempio, vedi Sive et al., 2007)12. L'embrione dovrebbe essere in 0,1× MMR, pronto all'uso.
  2. Per visualizzare la ZGA nelle singole cellule degli embrioni precoci e studiarne i meccanismi regolatori, microinietta gli embrioni dello stadio 1-cellulare con 5-etinil-uridina (5-EU) per marchettare metabolicamente i trascrivinascenti 11,13 prima di procedere con le seguenti procedure.
  3. Quando gli embrioni sono a ~1 ora dalla fecondazione (hpf), si utilizza una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire ~20 embrioni in una piastra di Petri da 60 mm (coperta con gel di agarosio all'1%) contenente ~15 mL di mezzo gradiente di densità al 3%/0,5× MMR.
  4. Usa una pinzetta in una mano per ruotare un embrione di circa ~45–60 gradi sotto uno stereomicroscopio per accedere al polo vegetale (l'emisfero pallido). Tieni l'embrione inclinato con la pinzetta e usa un ago da 30 G nell'altra mano per perforare con cura il palo vegetale. Rilascia un po' di citoplasma premendo delicatamente l'embrione.
  5. Copri con cura un nodo di capelli montato in una punta P10 su un embrione, così che il polo animale (l'emisfero scuro) sia all'interno del nodo di capelli. Regola la posizione del nodo in base alla dimensione desiderata dell'embrione miniatura.
  6. Tieni la pipetta P10 con una mano e usa una pinzetta nell'altra per tirare le due estremità sopra la mano del nodo in direzioni opposte. Il nodo di capelli si stringe attorno all'embrione, tra il polo animale (intatto) e il polo vegetale (con il citoplasma rilasciato). Taglia il nodo di capelli nel punto in cui si attacca alla punta P10.
  7. Ripeti i passaggi 2.4–2.6 sopra per ottenere la quantità desiderata di mini embrioni.
  8. Lascia che gli embrioni rimangano in un mezzo con gradiente di densità del 3%/MMR 0,5× per ~1–2 ore. Successivamente, rimuovere il mezzo con una pipetta P1000 senza disturbare gli embrioni e rifornire con 15 mL di MMR 0,1×.
  9. Lascia che gli embrioni si sviluppino nelle fasi desiderate, poi usa una pinzetta per rimuovere con cura i nodi dai mini embrioni.
  10. Raccogliere gli embrioni per l'analisi desiderata, ad esempio visualizzare la ZGA in singolecellule 11,13.

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Risultati

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Gli embrioni di Xenopus laevis allo stadio 1-cellulare erano costretti con i nodi di capelli come descritto sopra. Gli embrioni di controllo e mini embrioni allo ~Stadio 9 (8,5 hpf a 23 °C) sono stati fotografiati con uno stereomicroscopio. Come mostrato nella Figura 2, il volume di alcuni mini embrioni è ~1/3 di quello degli embrioni di controllo. Questo risultato suggerisce che gli embrioni di Xenopus iniziali possano essere manipolati pe...

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Discussione

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Qui descriviamo un metodo per generare mini-embrioni in Xenopus restringendo fisicamente embrioni in stadio 1 con nodi di capelli. Questo approccio fornisce prove dirette che la riduzione della dimensione cellulare induce la ZGA in un embrionemodello 11.

Diversi aspetti di questo protocollo sono fondamentali per generare con successo mini-embrioni. Per fare i nodi per capelli, è importante usare capelli sottili e resistenti, pr...

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Dichiarazioni

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L'autore dichiara di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il laboratorio Matthew Good dell'Università della Pennsylvania per la formazione fornita. Questo lavoro fu in parte sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago 30-GBD Medicina305128Per la perforazione degli embrioni
Piatte di Petri usa e getta da 60 mmVWR25384-092Per incubare embrioni
Stereomicroscopi zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Per visualizzare gli embrioni
AgaroseSigma-AldrichA-9414Per rivestire piastre di Petri
Pinza Dumont, Stile 5Scienze della microscopia elettronica72701-DPer modificare e mantenere embrioni
Ficoll 400Sigma-AldrichGE17-0300-10Per incubare embrioni
TipOne Punta per pipetta, 10 & micro; LUSA Scientific1111-3700Per montare i nodi per capelli
Blocco di cera, neroCarolina Biological Supply Co.974228Per montare i nodi per capelli

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  2. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  3. Kane, D. A., Kimmel, C. B. The zebrafish midblastula transition. Development. 119 (2), 447-456 (1993).
  4. Lu, X., Li, J. M., Elemento, O., Tavazoie, S., Wieschaus, E. F. Coupling of zygotic transcription to mitotic control at the Drosophila mid-blastula transition. Development. 136 (12), 2101-2110 (2009).
  5. Jevtic, P., Levy, D. L. Both nuclear size and DNA amount contribute to midblastula transition timing in Xenopus laevis. Sci Rep. 7 (1), 7908(2017).
  6. Edgar, B. A., Kiehle, C. P., Schubiger, G. Cell cycle control by the nucleo-cytoplasmic ratio in early Drosophila development. Cell. 44 (2), 365-372 (1986).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Lee, D. R., Lee, J. E., Yoon, H. S., Roh, S. I., Kim, M. K. Compaction in preimplantation mouse embryos is regulated by a cytoplasmic regulatory factor that alters between 1- and 2-cell stages in a concentration-dependent manner. J Exp Zool. 290 (1), 61-71 (2001).
  9. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145 (11), dev161257(2018).
  10. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  11. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  12. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, pdb prot4737(2007).
  13. Chen, H., Good, M. C. Imaging nascent transcription in wholemount vertebrate embryos to characterize zygotic genome activation. Methods Enzymol. 638, 139-165 (2020).
  14. Meaders, J. L., Burgess, D. R. Microtubule-based mechanisms of pronuclear positioning. Cells. 9 (2), 505(2020).

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Manipolazione delle dimensioni dell embrionerapporto nucleocitoplasmaticoembriogenesi precoceattivazione del genomacostrizione fisicavolume citoplasmaticofecondazione in vitrostereomicroscopiaregolazione della dimensione cellulare

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