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Articolo metodologico

Alternativa a basso costo per esaminare la preferenza sociale nel pesce zebra (Danio rerio) utilizzando il compito a 3 camere in acquario libero libero

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DOI:

10.3791/70610

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7 agosto 2026

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1Christopher Newport University, 2Virginia Governor's School for Science and Technology, 3Bay Path University

In questo articolo

Sommario

I compiti di preferenza sociale multi-camera sono stati adattati dai roditori al pesce zebra, facilitando lo studio del comportamento sociale negli organismi modello. Questo protocollo convalida un compito a basso costo a 3 camere in vasca aperta utilizzando webcam e software open source per misurare la preferenza sociale dei pesci zebra, rendendolo accessibile alla ricerca e all'insegnamento degli studenti universitari.

Abstract

Comprendere il comportamento sociale è un'attività fondamentale nella ricerca neurocomportamentale, spesso studiata utilizzando compiti di preferenza sociale. Questi compiti, originariamente sviluppati per roditori e successivamente adattati per il pesce zebra, sono ampiamente utilizzati per esaminare le dinamiche sociali e le risposte. Il compito di nuotare libera a 3 camere con serbatoio aperto (OTFST) consiste in una vasca centrale affiancata da due serbatoi di stimolo con una telecamera posizionata per registrare il comportamento del soggetto nella vasca centrale e polarizzare pellicola e retroilluminazione per migliorare la qualità e la validità del video. Questo protocollo utilizza una configurazione a basso costo con webcam USB e materiali facilmente reperibili. Utilizziamo DeepLabCut, uno strumento open-source di stima della posa senza marker che consente un tracciamento video accurato dei movimenti degli animali e fornisce dati di serie temporali posizionali da analizzare per varie metriche. Le sessioni pilota convalidano la capacità del sistema di catturare un comportamento di preferenza sociale robusto. Questo approccio economico offre una piattaforma accessibile e scalabile per laboratori che studiano l'interazione sociale nei pesci zebra, e la versatilità e relativa semplicità dell'OTFST a 3 camere lo rendono adatto per laboratori di insegnamento universitario e progetti di ricerca.

Introduzione

La preferenza sociale è la tendenza di un individuo a impegnarsi, cercare o evitare stimoli sociali ed è un aspetto fondamentale del comportamento sociale che svolge un ruolo fondamentale nell'instaurare legami e gerarchie all'interno di gruppi di animali, inclusigli esseri umani 1,2,3,4. Comprendere la preferenza sociale è essenziale per caratterizzare i meccanismi neurali e comportamentali che stanno alla base dell'interazione sociale. Ricerche precedenti indicano che i deficit nelle preferenze sociali possono essere associati a disturbi neuroevolutivie psichiatrici 5,6,7,8. I modelli animali possono fornire spunti sulla base biologica del comportamento sociale e aiutare nello sviluppo di strumenti traslazionali per diagnosticare e trattare le disabilità sociali. Questi modelli animali, che vanno dai roditori 9,10 alle specieacquatiche 11,12, forniscono quadri utili per la scoperta.

I roditori furono utilizzati per la prima volta per la ricerca comportamentale all'inizio del XIX secolo13, a causa delle loro somiglianze fisiologiche con gliesseri umani 14,15. Sebbene comportamenti come l'aggressività fossero stati inizialmente studiati, le misure sistematiche della preferenza sociale sono rimaste minime. I ricercatori colmarono questa lacuna sviluppando il compito di preferenza sociale a tre camere, introdotto da Nadler et al.16. L'apparato è composto da tre camere interconnesse. Tipicamente, una camera laterale contiene un nuovo conspecifico mentre l'altra camera rimane vuota. Il soggetto può esplorare liberamente tutte le camere, dove il tempo in ciascuna camera viene registrato e valutato come indicatore di preferenza. Questo apparato e procedura, insieme a diverse varianti, ha acquisito ampia popolarità e è stato utilizzato per studiare vari aspetti delle prestazionisociali 17,18,19 e dei deficit sociali in modelli di roditori per il disturbo dello spettro autistico 5,20,21. Tuttavia, gli studi con roditori sono più costosi e richiedono spazio considerevole. Per questo motivo, molti ricercatori si sono invece orientati verso l'uso di specie acquatiche per la ricerca neurocomportamentale.

Le specie acquatiche, in particolare il pesce zebra (Danio rerio), possiedono un elaborato repertorio comportamentale, che include complesse interazionisociali 22. Grazie alla loro utilità come modello di ricerca biomedica e all'importanza dell'interazione sociale nella loro ecologia comportamentale, i pesci zebra forniscono un quadro significativo per le risposte sociali che può essere utilizzato in confronto agli esseriumani 23. I pesci zebra sono diventati sempre più popolari per la ricerca nelle neuroscienze comportamentali, poiché sono economici da mantenere e richiedono uno spazio di detenzione relativamente piccolo, rendendo questa specie un modello pratico e conveniente per studi su larga scala sul comportamento sociale e sulla preferenza24. In alcuni studi, una configurazione adiacente di vasca è stata utilizzata per studiare le interazioni sociali nelle specieacquatiche 25,26; tuttavia, questa configurazione forniva un flusso di valutazione piuttosto limitato della preferenza sociale, poiché veniva presentato un solo stimolo. Questa limitazione è stata affrontata con l'adattamento del compito murino a tre camere per il pesce zebra nel2018-27. L'apparato modificato per il compito a 3 camere con serbatoio libero e nuoto libero (OTFST) consisteva in un singolo serbatoio di acrilammide diviso con barriere acrilamide fisse per fornire una zona di partenza neutra e due camere laterali, ciascuna camera laterale contenente un conspecifico familiare o nuovo. Per misurare la preferenza sociale, è stato registrato il tempo cumulativo trascorso vicino a ciascuna camera laterale, dimostrando che l'esposizione all'etanolo e il knockout al sam2 riducevano la preferenza per la novità nei pescizebra27. Mentre il test di interazione sociale a 3 camere del roditore consente interazioni multimodali complesse tra il soggetto e il/i conspecifico del test attraverso le modalità visiva, chimica, tattile e acustica, l'uso di camere separate per l'OTFST acquatico a 3 camere riduce l'interazione tra soggetto e animali stimolanti alla sola modalità visiva. Sebbene questa interazione monomodale possa avere una validità ecologica inferiore, offre un maggiore controllo sperimentale e aumenta la semplicità per i progetti condotti da ricercatori universitari. In letteratura, vari ricercatori hanno successivamente esplorato adattamenti dell'OTFST a 3 camere per indagare fattori genetici e ambientali che influenzano il comportamento sociale nei pesci zebra 28,29,30,31,32.

L'attuale adattamento dell'OTFST a 3 camere è progettato per servire come modello versatile e adatto agli studenti universitari. Il FishLab, un laboratorio completamente universitario, ha creato e utilizzato questa struttura e ne ha dimostrato l'efficacia come strumento ad alto rendimento per indagare la preferenza sociale nei pesci zebra. Gli studi che utilizzano questa configurazione hanno esplorato molteplici aspetti della preferenza sociale dei pesci zebra in risposta a manipolazioni di varie variabili indipendenti. Il primo studio ha dimostrato che il pesce zebra può rilevare stimoli sociali vivi rispetto a quellisimulati 33, mentre il secondo ha indagato la preferenza per i banchi consolidati rispetto ai banchi appenaformati 34. Lo studio più recente ha esaminato la capacità dei pesci zebra di distinguere tra banchi chimicamente allarmati e nonallarmati 35. Insieme, questi studi affrontano diversi aspetti del comportamento sociale, inclusi realismo, familiarità e rilevamento delle minacce, dimostrando al contempo le shancing preferenze e valutando le risposte al rischio di predazione. Tuttavia, l'installazione utilizzata per questi studi precedenti utilizzava telecamere IP digitali montate su impianti professionali, un sistema dedicato di rack acquatico e software proprietario sia per l'acquisizione che per l'analisi video, con un costo totale che poteva essere proibitivo per investigatori/istruttori con budget operativi ridotti. Con l'avvento del software open source e delle webcam USB di alta qualità, una versione a basso costo è ora fattibile per i ricercatori che desiderano utilizzare questa tecnica con i ricercatori universitari, con un prezzo totale (circa 2.000 dollari USA; escludendo il computer) sostanzialmente inferiore al costo del sistema costoso (circa 20.000 dollari USA, escluso il computer).

Il seguente protocollo delinea lo sviluppo e l'applicazione di una versione a basso costo dell'OTFST a 3 camere per il pesce zebra. La sua convenienza, semplicità e versatilità lo rendono uno strumento utile per piccoli laboratori o contesti educativi con finanziamenti limitati. Se combinata con abitazioni a basso costo, come acquari da 10 galloni comunemente disponibili, l'attuale allestimento costa significativamente meno da installare e mantenere. Inoltre, l'uso di software ad accesso aperto come open broadcasting system (OBS) per registrare sessioni sperimentali e varie applicazioni di tracking (ad esempio, DeepLabCut, SLEAP, ecc.) fornisce un framework accessibile e a basso costo per catturare video e generare dati di serie temporali delle interazioni sociali dei pesci zebra.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Christopher Newport University (Protocollo #2025-23).

1. Animali

  1. Ottenete adulti di pesci zebra selvatici a pinnacorta 23,36,37, anche se possono essere utilizzate altre ceppi. In alternativa, procurarsi embrioni e alleverli internamente.
  2. Ospita i pesci in vasche indipendenti da 10 galloni (38 L) con una densità di circa due pesci per gallone (3,8 L) d'acqua. Equipaggia i carri armati con biofiltri attivi, pietre d'aria e riscaldatori sommergibili. In alternativa, pesci domestici su un sistema di rack acquatico.
  3. Mantenere i parametri di qualità dell'acqua entro i seguenti intervalli: pH 7,0–8,0, conducibilità 400–700 μS, temperatura 25–27 °C, <40 ppm di nitrati, <0,2 ppm di nitriti e 0,01–0,1 ppm di ammoniaca.
  4. Tieni gli animali sotto un fotoperiodo scuro di 12 ore luce per 12 ore e nutri una volta al giorno con scaglie commerciali.
  5. Seleziona gli animali casualmente da queste vasche per l'assegnazione sperimentale.
  6. Al termine dell'esperimento, riutilizzare gli animali per altri scopi di ricerca o didattica, oppure soppressi per immersione in tricaina tamponata a 250-500 mg/mL per 30 minuti, seguita da un metodo fisico (ad esempio, decapitazione) per assicurare la morte. Utilizzare gli animali eutanasiati per successivi biosaggi e/o analisi neurochimiche.

2. Apparecchio e software per nuoto libero a 3 camere in serbatoio aperto

  1. Costruzione delle camere di prova
    1. Rimuovi con attenzione le rifiniture in plastica dal fondo di ogni acquario da 5,5 galloni. Usa uno strumento rotante con una rotella di taglio per tagliare la plastica agli angoli e facilitare la rimozione. Una volta che la cornice in plastica è stata tagliata, separare la plastica dall'adesivo in silicone con una semplice spatola.
    2. Per disinnescare la retroilluminazione, copri il retro di tutti e tre i serbatoi, l'estremità sinistra di un serbatoio e l'estremità destra dell'altro con il rivestimento bianco adesivo dello scaffale. Lascia le estremità scoperte sul serbatoio che sarà usato come camera centrale.
    3. Posizionare una linea orizzontale nera per indicare il livello di riempimento a 4,5 cm sotto il bordo superiore sulla parte anteriore di ogni camera con un marcatore smaltato o con nastro grafico nero.
    4. Taglia un foglio di filtro polarizzante per adattarlo al lato estremo scoperto di ogni vaso laterale. Orienta le lastre filtranti a 90° l'una dall'altra. Usa del nastro trasparente lungo tutti e quattro i bordi per evitare che l'acqua entri nello spazio tra il vetro dell'acquario e il materiale filtrante.
      NOTA: L'orientamento offset dei filtri polarizzanti impedirà agli animali stimolanti in una camera di stimolo laterale di vedere gli animali (o altri stimoli) nell'altra camera di stimolo laterale, pur permettendo loro di vedere il soggetto. Il soggetto nella vasca centrale può vedere gli stimoli visivi in entrambe le camere laterali.
    5. Costruisci la base in cloruro di polivinile (PVC) per allineare esattamente la posizione dei serbatoi sul banco di montaggio. Taglia il fondo della base da un foglio bianco di PVC spesso 1/4 di pollice (0,635 cm) di 21 cm x 122,5 cm e taglia le estremità da 1 x 2 pannello di rifinitura in PVC lungo 21 cm.
    6. Prova il fitting delle estremità della base con tutti e tre i serbatoi posizionati. Assicurarsi che i pannelli divisori (qui sotto) siano inseriti e rimossi facilmente i serbatoi laterali non siano stretti ai lati del serbatoio centrale. Una volta completato il test di montaggio, unire le estremità alla base in PVC con cemento in PVC.
    7. Per realizzare i coperchi trasparenti per ogni camera, tagliare il foglio di policarbonato in tre pezzi dimensionati secondo le dimensioni esterne del bordo superiore del serbatoio da 5,5 galloni (40 cm × 21 cm). Taglia un canale a rabbet (6 mm × 4 mm) intorno al bordo di ogni coperchio per garantire una posizione sicura del coperchio sopra la camera.
    8. Copri le camere con i coperchi ogni volta che ci sono animali tenuti all'interno. Posiziona un riscaldatore sommersibile e una pietra d'aria collegati a una pompa d'aria per acquario mentre gli animali sono tenuti nelle rispettive camere per garantire il controllo della temperatura e l'aerazione. Usa una valvola d'aria a tre vie per bilanciare il flusso d'aria tra tutte e tre le pietre d'aria.
    9. Realizzare semplici divisori opachi da posizionare tra la camera centrale e ciascuna camera laterale per controllare quando i soggetti di prova ricevono esposizione visiva a stimoli sociali, plastificando due fogli di cartoncino chiaro A4.
    10. Prepara i divisori per l'appendiccio e la rimozione remota facendo due fori da 85 mm e 125 mm lungo un bordo da 210 mm di ciascun foglio laminato.
    11. Taglia due lunghezze di spago ad alta resistenza da 75 cm e infila la spago attraverso ogni foro, legando insieme le estremità avanzate, collegando i due fogli in un giogo centrale.
    12. Taglia una lunghezza di spago di 6 m. Legare un'estremità dello spago da 6 m al giogo per creare una linea centrale legata, e infilare l'estremità libera dello spago attraverso una carrucola a occhio girevole.
    13. Montare la carrucola a occhio girevole sul soffitto sopra il serbatoio più centrale e assicurarsi che l'estremità dello spago sia appesa all'esterno dell'impianto sperimentale (Figura 1A).
  2. Costruzione dell'impianto di illuminazione
    1. Realizza un telaio con un foglio bianco di PVC spesso 1/4 di pollice (0,635 cm) per la luce del pannello. Taglia due estremità (10 cm × 31,5 cm) e una parte superiore e una inferiore (10 cm × 122 cm). Test per il montaggio dei pezzi del telaio in modo che il pannello si adatti all'interno della struttura. Una volta testato il fitting, unire i pezzi del telaio usando cemento in PVC.
    2. Fai aggiungere un cavo a 3 conduttori da un elettricista qualificato alla luce del quadro.
    3. Fai collegare il dimmer a scorrimento da un elettricista qualificato per controllare la presa di uscita nell'involucro impermeabile. Collega la luce del pannello a questa presa.
    4. Regola il dimmer a scorrimento per aumentare la luminosità della retroilluminazione a 350 lux. Riempi le camere d'acqua e sposta il dimmer scorrevole per regolare la luminosità frontale delle camere a 15 lux.
      NOTA: I ricercatori dovrebbero verificare l'illuminazione prima, durante e dopo uno studio per assicurarsi che le impostazioni di luminosità siano state mantenute.
  3. Costruzione della tenda e della cornice della telecamera
    1. Installa il banco di prova con la luce del pannello, il pannello base del serbatoio e le tre camere. Posiziona e regola verticalmente i due pali del telo in modo che si adattino perfettamente dal pavimento al soffitto, almeno 75 cm dalla parte anteriore dei serbatoi.
    2. Crea una tasca superiore per ogni tenda piegando un'estremità del lenzuolo per oltre 60 cm e cucendo un punto dritto a 6 cm dalla piega superiore per creare una tasca in cui il pezzo della cornice possa infilarsi.
    3. Misura le dimensioni delle sezioni di giunzione incrociata e stabilizzazione per il montaggio del telaio in base alla larghezza e profondità dell'area da utilizzare per l'allestimento.
      NOTA: Per l'attuale allestimento nel FishLab, i pali verticali del telo sono stati posizionati a 146,5 cm dalla parete posteriore nell'angolo del laboratorio. Il palo interno del telo è posizionato a 6,5 cm dalla parete laterale, mentre il palo esterno è posizionato a 142,5 cm dalla parete laterale.
    4. Tagliare tre sezioni di tubo metallico elettrico (EMT) di 143 cm da utilizzare come sezioni stabilizzanti per i lati del telaio. Passa una sezione attraverso la tasca superiore della tenda mobile e posizionati orizzontalmente a 190 cm dal pavimento.
    5. Fissa la sezione al palo esterno del telo con una morsetta a T su un'estremità e la presa personalizzata stampata in 3D all'altra. Fissa la presa stampata in 3D alla parete posteriore usando viti. Attacca le altre due sezioni al palo interno del telo.
    6. Fai passare la sezione superiore attraverso la tasca superiore di una delle tende fisse e posizionarla a 190 cm dal pavimento. Fissa al palo interno del telo con una morsetta a T a un'estremità e l'altra presa stampata in 3D all'altra estremità.
    7. Fissa la presa stampata in 3D alla parete laterale usando delle viti. Posizionare la sezione stabilizzante finale a 120 cm dal pavimento e fissarla in modo simile alle altre due sezioni stabilizzanti.
    8. Taglia un'altra sezione di condotto EMT di 127 cm da usare come sezione stabilizzante per la parte anteriore del telaio. Fai passare questa sezione attraverso la tasca superiore della seconda tenda fissa e montala a 193 cm sopra il pavimento fissando ciascuna estremità ai pali del telo usando una morsa a T a ciascuna estremità.
    9. Taglia il resto del condotto EMT a 145 cm da usare come barra di montaggio della telecamera. Posizionare questa sezione orizzontalmente a 88 cm dal pavimento per allineare le telecamere con il centro dei serbatoi. Inserisci un'estremità in una presa stampata in 3D, avvitata al muro, e usa le pinze trasversali stampate in 3D personalizzate per tenere la barra della telecamera saldamente contro i pali del telo (Figura 1B).
  4. Costruzione dell'impianto della telecamera
    1. Fissa un supporto della fotocamera sulla barra della fotocamera in modo che i centri orizzontali e verticali della fotocamera si allineino con i corrispondenti centri orizzontali e verticali della camera centrale.
      NOTA: Ulteriori telecamere possono essere montate davanti a ciascuna camera di fianco se i ricercatori desiderano ottenere video digitale delle risposte degli animali vivi utilizzati come stimoli visivi. La configurazione più semplice consiste nel posizionare una singola telecamera per catturare video della camera sperimentale centrale. Per stimoli sociali in tempo reale nelle camere di stimolo, i ricercatori potrebbero anche voler raccogliere video delle camere.
    2. Monta ogni fotocamera sul perno filettato di ogni supporto fotocamera. Regola ogni fotocamera in modo che l'immagine sia centrata sulla zona di osservazione della rispettiva camera.
    3. Fissa i cavi USB per ogni telecamera sulla barra della telecamera usando cinghie o fasce per evitare che i cavi pendano, che possono causare disallineamenti delle telecamere.
    4. Taglia una sezione di scaffale da rack metallico lunga 140 cm e fissala verticalmente all'esterno della parte anteriore della cornice per evitare che le fotocamere vengano allineate. Monta la "gabbia della telecamera" usando morsetti a T fissati ai pali del telo.
      NOTA: Una seconda gabbia per fotocamera può essere montata all'interno dell'inquadratura per evitare ulteriormente che le telecamere vengano allineate; Una piccola sezione di griglia metallica potrebbe dover essere rimossa se la parte frontale delle telecamere è "inchiusa" per evitare l'occlusione delle immagini del serbatoio.
  5. Carica e configurazione software di acquisizione - Open broadcaster studio (OBS)
    1. Scarica OBS e installalo su un computer locale con Windows. Avvia OBS Studio ed esegui l'Auto-Configuration Wizard per ottimizzare le impostazioni in base alle specifiche esigenze di registrazione, alle risorse hardware e alle condizioni di rete.
      NOTA: Questo strumento è disponibile sotto Strumenti > Assistente di Auto-Configurazione.
    2. Verifica le impostazioni di base prima di configurare la fotocamera. Imposta la risoluzione base (Canvas) per corrispondere alla risoluzione del display e imposta la risoluzione di uscita (scalata) alla risoluzione di registrazione (ad esempio, 720 pixel).
    3. Crea una scena cliccando con il tasto destro nella casella Scene (oppure usa la croce in basso). Assegna un nome alla scena. Usa la scena per definire la disposizione dello stream.
    4. Aggiungi una nuova sorgente cliccando con il tasto destro sulla casella Sorgenti (oppure usa il simbolo più in basso). Seleziona Dispositivo di cattura video per aggiungere una webcam. Assegna a ciascuna telecamera un nome distinto (ad esempio, "camera-left", "camera-center", "camera-right"). Ripeti questo processo per altre telecamere o sorgenti se necessario.
    5. Posiziona e ridimensiona le sorgenti nella finestra di anteprima. Assicurati che la telecamera sia visibile confermando che sia elencata sopra le altre fonti nella lista Fonti . Per centrare la visuale della telecamera sulla tela, seleziona la sorgente nella lista Sorgenti (apparirà una finestra di delimitazione rossa) e premi CTRL+D (Centra sullo schermo).
    6. Riempire l'intero schermo con una sorgente premendo CTRL+F (adattamento allo schermo) o CTRL+S (allungamento allo schermo), se desiderato. Ritaglia la sorgente tenendo premuto il tasto Alt mentre trascini la casella di delimitazione. Verifica il ritaglio controllando che i bordi diventino verdi.
    7. Regola le proprietà video come luminosità e contrasto cliccando doppiamente sulla fotocamera selezionata nella lista Sorgenti e selezionando Configura video. Modifica le impostazioni usando il menu proprietà .

3. Test comportamentali

  1. Acclimatazione
    1. Riempi tutte e 3 le camere con acqua proveniente dai serbatoi di alloggiamento. Posizionare barriere opache tra ciascuna camera e lasciarle in posizione per tutto il periodo di acclimatazione. Trasferire un soggetto nella camera sperimentale centrale e lasciarlo acclimatarsi per almeno 1 ora prima del test.
      NOTA: Il periodo di acclimatazione per i risultati rappresentativi è stato fissato a 3 ore. Il periodo di acclimatazione è necessario affinché gli animali si riprendano da qualsiasi stress momentaneo di trasferimento e si adattino all'ambiente della camera prima dei test comportamentali.
    2. All'inizio del periodo di acclimatazione, si posizionano gli stimoli sociali nelle camere di stimolo laterali. Centrare gli stimoli sociali artificiali nella camera degli stimoli sinistra e trasferire un piccolo banco di 4 pesci (2 maschi e 2 femmine di dimensioni, età e familiarità simili) nella camera degli stimoli destra.
      NOTA: Le posizioni degli stimoli sociali artificiali e degli stimoli sociali dal vivo erano fissate e non controbilanciate nel protocollo attuale, poiché studiprecedenti 33,34 non hanno rilevato alcun effetto della posizione dello stimolo utilizzando l'OTFST. Bilanciare in questo caso richiederebbe di raddoppiare inutilmente il numero di animali utilizzati per la ricerca, il che è contrario alle "3R" della ricerca sugli animali. Questo protocollo offre flessibilità nella natura degli stimoli da testare, ad esempio modelli statici, specie simpatriche o nuove, ecc.
    3. Durante l'acclimatamento, fornire a tutte le camere contenenti animali vivi un riscaldatore sommergibile (impostato a 26 °C), una pietra bolleggiante collegata alla pompa dell'aria dell'acquario e un coperchio per mantenere condizioni stabili di conservazione. Rimuovi i riscaldatori e i calcoli bubbler prima di iniziare una sessione sperimentale.
  2. Test sperimentali
    1. Verifica lo stato di attività degli stimoli sociali testati in ciascuna delle vasche di fiancheggiamento e del soggetto di prova nella vasca centrale. Usa la singola telecamera sul serbatoio centrale per registrare il video di ogni soggetto di prova.
      NOTA: I risultati rappresentativi di questo protocollo sono una replica di una singola condizione di Velkey et al.33 per testare la preferenza dei pesci zebra tra stimoli sociali a bassa fedeltà (modelli mobili) e ad alta fedeltà (live shoal).
    2. Apri OBS Studio per iniziare a registrare una sessione. Ridimensiona la visuale centrale della telecamera per riempire lo schermo cliccando e trascinando gli angoli del video. Seleziona Avvia registrazione sotto Controlli in basso a destra dello schermo.
    3. Immediatamente dopo l'inizio della registrazione, rimuovere le barriere opache tramite il sistema di corde a carrucola. Continuare a registrare per 10 minuti e permettere al soggetto di esporsi simultaneamente a entrambi gli stimoli sociali mentre si muove liberamente all'interno della camera sperimentale centrale.
    4. Termina la sessione selezionando Stop Recording sotto Controlli. Accedi alle sessioni registrate selezionando File nel menu in alto a sinistra e selezionando Mostra registrazioni dal menu a tendina.
      NOTA: I video risultanti forniscono dati non strutturati adatti a una varietà di analisi.
    5. Trasferire i pesci vivi nelle vasche di conservazione, rimuovere l'acqua da tutte e tre le camere, risciacquare accuratamente con acqua (evitando di far passare acqua tra i film polarizzati), spruzzare ogni camera con acido citrico al 5% per sanificare, lasciare asciugare le camere all'aria durante la notte e risciacquare all'inizio della giornata sperimentale successiva prima di riposarle sul banco di prova.

4. Ottenere dati strutturati per le analisi

  1. Seleziona un'applicazione software di analisi del movimento (ad esempio, DeepLabCut; vedi https://www.mackenziemathislab.org/deeplabcut). Installa DeepLabCut sul computer, seguendo la guida utente a https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/installation.html. Consulta le informazioni e la guida utente del software selezionato per ulteriori indicazioni se non utilizzi DeepLabCut.
  2. Carica quattro o cinque video in DeepLabCut per l'addestramento del modello ed estrai 20–30 fotogrammi per video. Definisci almeno tre punti di tracciamento principali (ad esempio, testa, tronco, coda) e addestra la rete a tracciare questi punti attraverso i telai.
    NOTA: Per maggiori informazioni, consultare la guida utente di DeepLabCut su https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/standardDeepLabCut_UserGuide.html. I risultati rappresentativi utilizzano 22 fotogrammi etichettati da cinque video con 3 punti di tracciamento.
  3. Usa una rete neurale basata su ResNet-101 per addestrare il modello. Determinare il numero di iterazioni necessarie per completare la formazione (si suggerisce tra 100.000 e 200.000). Determina un valore di soglia p tra 0,5 e 1.
    NOTA: Per i risultati rappresentativi, sono state utilizzate 150.000 iterazioni per addestrare il modello con un cutoff p di 0,7. Se la rete addestrata scende sotto il cutoff di 0,7 p, aumentare il contrasto video o modificare la convenzione di etichettatura risolverà questo problema.
  4. Distribuire il modello DeepLabCut completamente addestrato sui restanti video sperimentali. Estrai i dati posizionali per ogni studio. Segui la guida utente a https://deeplabcut.github.io/DeepLabCut/docs/beginner-guides/Training-Evaluation.html.
    NOTA: Per i risultati rappresentativi, abbiamo validato con 2 mescolamenti e determinato che l'errore di test era 2 pixel:train 4 pixel (con una dimensione immagine di 1600 x 820 pixel). La rete è stata poi utilizzata per analizzare i video sperimentali ottenuti dall'attuale configurazione sperimentale.
  5. Utilizza software di programmazione, come Python, per definire e analizzare il movimento attraverso le tre zone verticali dell'arena di uguale larghezza e quantificare le preferenze. Misura il tempo nella zona con almeno due punti del corpo all'interno della zona identificata per ridurre il rumore di tracciamento. Usa la formula: Tempo totale nella zona = (Totale fotogrammi nella zona)/(Totale dei fotogrammi).
  6. Se si desidera una misura di thigmotassi, quantificare le zone per tutta la lunghezza del corpo di un pesce zebra dalle pareti dell'acquario, il che fornirà una misura della tendenza passiva dei soggetti a rimanere vicino a un confine verticale. Questa misura è più adatta per serbatoi sperimentali relativamente più grandi.
  7. Usa lo stesso software di codifica per definire e misurare il tempo trascorso immobile (ad esempio, congelamento). Definire la soglia di movimento a 2–5 pixel per fotogramma con un conteggio minimo consecutivo di 15 fotogrammi.
    NOTA: Per i risultati rappresentativi, il congelamento è stato identificato con una soglia di 3 pixel per fotogramma per 15 fotogrammi.
  8. Compilare ed esportare misure per analisi statistiche e visualizzazioni.
    NOTA: Per l'analisi dei dati, si riferisca a https://github.com/farhanaugustine/DeepLabCut-Analysis-Jupyter-Scripts. Noi

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Risultati

Per convalidare i metodi a basso costo descritti sopra, una condizione degli esperimenti condotti in Velkey et AL.33 fu replicato utilizzando l'attuale configurazione a basso costo. I soggetti (N = 23, 11 maschi e 12 femmine) sono stati presentati gli stimoli sociali mobili artificiali mobili (bassa fedeltà) a sinistra e gli stimoli sociali live shoal (alta fedeltà) a destra (Figura 2); poiché studiprecedenti 33,34

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Discussione

L'attuale protocollo dimostra che l'attuale adattamento a basso costo dell'OTFST a 3 camere può essere utilizzato per caratterizzare in modo affidabile la preferenza sociale negli adulti zebra misurati dal tempo trascorso nella zona. Utilizzando materiali da costruzione economici, una webcam collegata a USB e applicazioni software open source per acquisizione e analisi, il sistema attuale ha replicato con successo la scoperta secondo cui i pesci zebra preferiscono un banco di conspecific...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non esserci conflitti di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Rommel Pagkalinawan, Robby Buck, Elizabeth Hiltz, Haley Dewitt, Maia Tankersley, Alexis Thai-Nguyen, Grady Fleming, Jacob Young e Jack Medlin del team TheFishLab della Christopher Newport University per i loro contributi all'allevamento animale e alla raccolta dati per l'esperimento di validazione. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Samantha Commons per il suo aiuto durante il suo Community Captains Summer Program 2025, inclusa la condotta dell'inventario di tutti i componenti dell'impianto ad alto costo esistente così come di quello a basso costo. Gli autori desiderano inoltre ringraziare l'Ufficio per la Ricerca e l'Attività Creativa Studentesca della Christopher Newport University per i finanziamenti forniti a K.K. nell'ambito del Programma Summer Scholars per studenti universitari. La Figura 2 è stata creata in BioRender da Kinslow, K. (2025). https://BioRender.com/wbf0wph.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10-Gallon AquariumAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100110010acquistato presso fornitore di animali locali (1 a 4)
12 Pezzi di fascette per tubi T da 1 polliceJoyHua Trade, CinaASIN #B0DF19DJF1acquistato da Amazon.com (1)
Scatola elettrica a 2 gangSigma Engineered Solutions, Raleigh, NC, USA# 14350acquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Condotto elettrico metallico (EMT) in argento-metallico da 3/4" - 10 piediWheatland Tube, Inc., Wheatland, PA, USA#0550110000acquistato presso negozio di ferramenta locale (3)
Cavo a 3 conduttoriUtilitech, Inc., Charlotte, NC, USAUT010710acquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Presa a 3 poliEaton, Inc., Beachwood, OH, USA#270W-SP-LWacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Valvola ad aria a 3 viePenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModello VN3acquistato presso fornitore di animali locali (1)
Cartone A4 (bianco), laminatovariavariaacquistato presso libreria del campus (2)
Bio-filtro attivo Penguin 100Spectrum Brands Pet, LLC, Blacksburg, VA, USA#PF00100Bacquistato presso fornitore di animali locali (1 a 4)
Pietre d'ariaPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModello AS6Qacquistato presso fornitore di animali locali (3)
Tubi d'aria per acquarioPenn-Plax, Inc. 35 Marcus Blvd. Hauppauge, NY, USAModello STD8acquistato presso fornitore di animali locali (1)
Fondi per lenzuola Twin in tessuto nero (167,6 cm X 243,8 cm)Royale Linens, Inc., Melville, NY, USA#00011342258875acquistato da Amazon.com (3)
Webcam Brio 4kLogitech International S.A., Losanna, Svizzera960-001419acquistato da Amazon.com (1 a 3)
Computer (sufficiente per eseguire Open Broadcaster Studio & 1-3 Webcam)Dell, Inc., Round Rock, TX, USAOptiPlex Micro 7010acquistato da dell.com (1)
Diodo emettitore di luce (LED) dimmerabile a pannello piattoLithonia Lighting-Acuity Brands, Inc. Conyers, GA, USACTCL-153P-WHacquistato da Amazon.com (1)
Polo di contenimento della polvere E-Z Up (confezione da 2)Trimaco, Inc., Cary, NC, USA# 00047034547330acquistato da Amazon.com (1)
Corda per fai-da-tevariaVariaacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Filtri polarizzanti lineariB&H Foto & Electronics, Inc., New York, NY USARosco #7300acquistato online (7)
Software Open BroadcasterOBS Projectv32.0.0scaricato da https://obsproject.com (1)
Foglio di policarbonato (spessore 0,38"/9,6mm)Spectraglass, ltd., Perth, ScoziaUPC # 608037376817acquistato da Amazon.com (1)
Cement per cloruro di polivinile (PVC), contenitore da 4 onceThe AZEK Co, Chicago, IL, USA#ARAD0004OZacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Acquario Rimless da 5,5 galloniAqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100541424acquistato presso fornitore di animali locali (3)
Film in plastica bianca autoadesivoCON-TACT Brand, La Miranda, CA, USA#16F-C9A952-06acquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Interruttore dimmer scorrevoleLutron, Inc., Cooperburg, PA, USA#LECL-150H-WHacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Poleggia piccolavariaVariaacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Riscaldatori subacquei da 50W (preimpostati a 26C)Aqueon, Inc. Franklin, WI, USA#100106251acquistato presso fornitore di animali locali (3 a 7)
Montaggio per fotocamera Super ClampJINSUI, CinaX0040GEYLRacquistato da Amazon.com (1 a 3)
Pompa d'aria per acquario Tetra Whisper 10Spectrum Pet, Home & Garden, Inc., Middleton, WI, USAUPC #046798778516acquistato presso fornitore di animali locali (1)
Contenitore elettrico resistente agli agenti atmosferici a 2 gangHubbell, Inc., Shelton, CT, USA#MM2420Cacquistato presso negozio di ferramenta locale (1)
Foglio di PVC bianco 1/4" x 24" 48"Royal Building Products, Bristol, TN, USA#3101acquistato presso negozio di ferramenta locale (2)
Pannello di rivestimento in PVC bianco, nominale 1 x 2 (0,75" x 1/5" x 96")Royal Building Products, Bristol, TN, USA#7832-8acquistato presso negozio di ferramenta locale (1)

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