Modello di metastasi cerebrale per il cancro al seno intracranico per la caratterizzazione delle cellule immunitarie e stromali nelle meningi e nel bulbo olfattivo

Sommario

Il protocollo stabilisce le metastasi cerebrali per il tumore al seno tramite inoculazione intracranica e caratterizza tramite citometria di flusso sottoinsiemi chiave di cellule linfatiche e immunitarie che regolano l'immunità cerebrale. Queste analisi forniscono spunti sulle dinamiche immunitarie e stromali che modellano il microambiente cerebrale, informando lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (SNC) è circondato da interfacce immunitarie specializzate, tra cui le meningi e il bulbo olfattivo, che possono fungere sia da vie permissive per la colonizzazione metastatica sia da punti di ingresso per risposte immunitarie antitumorali. Comprendere come la dinamica delle cellule immunitarie evolva all'interno di queste strutture durante la progressione metastatica è essenziale per identificare i meccanismi che supportano o limitano la crescita tumorale nel cervello. Questo protocollo dettaglia l'istituzione di un modello topino per metastasi cerebrali per il cancro al seno (BCBM) tramite iniezione intracranica di cellule di cancro al seno E0771 nei topi C57BL/6. Dopo lo sviluppo del tumore, le meningi e il bulbo olfattivo vengono accuratamente dissezionati, digeriti enzimaticamente e processati in sospensioni monocellulari. Queste popolazioni vengono poi analizzate utilizzando citometria a flusso spettrale multiparametrico per caratterizzare in modo completo sottoinsiemi di cellule linfoide, mieloidi e stromali all'interno delle nicchie immunitarie associate al SNC. Questo flusso di lavoro consente analisi comparative tra controlli con e non tumori, identificando alterazioni all'interno delle interfacce immunitarie del sistema nervoso centrale che possono essere alla base dell'evasione immunitaria e rappresentare potenziali bersagli terapeutici. Nel complesso, il protocollo fornisce un approccio riproducibile per studiare la BCBM e interrogare la regolazione immunitaria alle interfacce CNS-sistema immunitario periferico. Può essere adattato per ulteriori linee cellulari tumorali, immunoterapie o modelli genetici murini per indagare i meccanismi di resistenza immunitaria e la risposta terapeutica all'interno del microambiente cerebrale.

Introduzione

Le metastasi cerebrali sono i tumori maligni più comuni che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC), verificandosi più frequentemente dei tumori cerebrali primari. Il cancro ai polmoni, il cancro al seno e il melanoma sono i tumori principali che più spesso metastatizzano al^{cervello 1}. Tra queste, le metastasi cerebrali per il cancro al seno (BCBM) rappresentano una sfida clinica importante, colpendo dal 10%–30% delle pazienti con malattia metastatica e mostrando un'incidenza crescente grazie al miglioramento delle terapie sistemiche e ai progressi nella^{neuroimaging 2}. La prognosi per i pazienti con BCBM rimane negativa, poiché i trattamenti disponibili – inclusi chirurgia, radioterapia e chemioterapia – sono in gran parte palliativi, e i sintomi neurologici incidono gravemente sulla qualità^{della vita 3}. Sebbene terapie mirate e immunoterapie siano esplorate come strategie complementari, il beneficio clinico dell'immunoterapia nelle metastasi cerebrali rimane^{limitato 4,5,6}.

Lavori recenti hanno affinato la nostra comprensione dell'immunità cerebrale e rinnovato l'interesse per le vie linfatiche funzionali associate al SNC, inclusi i vasi linfatici nelle^{meningi 7} e nella mucosa^{nasale 8}. Queste strutture formano una rete linfatica continua che circonda il cervello e si estende adiacente al bulbo olfattivo e alla lamina cribriforme, collegandosi infine ai linfonodi cervicali. Questo sistema svolge ruoli chiave nell'omeostasi dei fluidi, nella sorveglianza immunitaria e nel traffico cellulare immunitario tra il SNC e gli organi linfoidi^periferici. Con la crescita dell'interesse per approcci immunoterapeutici per tumori cerebrali e metastasi, queste interfacce linfatico-immunitarie stanno emergendo come vie promettenti, ma ancora poco studiate, attraverso cui l'immunità sistemica può comunicare con lesioni intracraniche. Inoltre, i meccanismi che regolano il reclutamento delle cellule immunitarie nel microambiente tumorale cerebrale e come queste cellule interagiscono in questo ambiente unico rimangono poco compresi. Insieme, queste lacune sottolineano la necessità di modelli e procedure precliniche che permettano un'analisi completa delle interazioni tumore-immunità e supportino lo sviluppo di strategie per migliorare l'immunità antitumorale contro le metastasi cerebrali.

Qui descriviamo un protocollo che combina la generazione di un modello topino BCBM riproducibile e immunocompetente tramite l'inoculazione intracranica stereotassica delle cellule E0771 con l'isolamento e la dissociazione delle meningi e del bulbo olfattivo per l'immunofenotipizzazione tramite citometria a flusso spettrale. Questo approccio consente la modellazione controllata del BCBM per valutare la sicurezza e l'efficacia degli interventi terapeutici e consente una caratterizzazione approfondita delle popolazioni immunitarie e stromali all'interfaccia cerebro-linfatica-immune, fornendo una comprensione dei fattori cellulari che plasmano il microambiente tumorale cerebrale e influenzano le risposte terapeutiche.

I modelli animali rimangono indispensabili per studiare le metastasi cerebrali, poiché molti aspetti critici della progressione metastatica non possono essere replicati in vitro. Sono stati sviluppati diversi modelli murini in vivo per generare metastasi cerebrali, ciascuno con vantaggi e limitazioni specifiche¹⁰. I modelli di metastasi spontanea, inclusi impianti ortotopici o modelli murini geneticamente modificati, imitano più da vicino la progressione clinica della malattia ma raramente generano lesioni intracraniche, richiedono lunghi tempi sperimentali e spesso producono un'elevata variabilità a causa di una diffusa malattia extracranica. Gli approcci sistemici, inclusi iniezioni intracardiache, intracarotide o nelle vene caudali, introducono cellule tumorali nella circolazione e mimetizzano meglio la diffusione ematogena, l'estravasazione della barriera emato-encefalica e la colonizzazione. Tuttavia, questi modelli non cogliono le fasi iniziali dell'invasione tumorale primaria e producono frequentemente metastasi extracraniche estese e variabili, in particolare nei polmoni. Tra i modelli sistemici, l'iniezione intracarotide presenta la minore variabilità, ma richiede competenze chirurgiche avanzate. In alternativa, l'iniezione intracranica offre diversi vantaggi, tra cui un controllo preciso della localizzazione del tumore, uno sviluppo tumorale rapido e riproducibile e una minore variabilità tra gli esperimenti. Questo approccio può anche essere integrato da un impianto tumorale primario ortotopico seguito da una resezione chirurgica per imitare più accuratamente il decorso metastatico. Sebbene l'iniezione intracranica non ricapitoli l'intera cascata metastatica e non sia adatta allo studio dell'invasione e della diffusione precoce, fornisce un modello robusto per valutare l'efficacia terapeutica contro lesioni consolidate e per indagare le interazioni all'interno del microambiente cerebrale. Una limitazione nota è che l'iniezione stessa può indurre neuroinfiammazione locale, influenzando potenzialmente le letture immunitarie, che possono essere valutate confrontando i profili immunitari nei topi iniettati e non iniettati.

La caratterizzazione immunitaria delle meningi e del bulbo olfattivo rimane un campo di ricerca relativamente nuovo e poco esplorato. La maggior parte degli studi si basa su campioni di linfonodi interi del cervello^{o cervicali 11}, che non riescono a catturare la composizione cellulare distinta e le funzioni immunitarie specializzate di questi tessuti associati ai linfatici. Il recupero di entrambe le strutture offre una visione più ampia e informativa dell'immunità cerebrale. Quando combinato con la citometria a flusso spettrale multiparametrico, questo flusso di lavoro supporta la profilazione ad alta capacità di popolazioni immunitarie abbondanti e rare coinvolte nella comunicazione immunitaria CNS-periferia. Ciò include la quantificazione dei marcatori di superficie e intracellulari per identificare sottoinsiemi cellulari, valutare gli stati di attivazione e valutare i cambiamenti indotti dal trattamento. Altre metodologie per l'analisi immunitaria del SNC non coperte da questo protocollo includono immunoistochimica (IHC) e immunofluorescenza (IF), che preservano la distribuzione spaziale delle cellule immunitarie ma sono limitate da multiplexazione a basso marcatore, quantificazione soggettiva e sotto-rappresentazione dei tipi cellulari^{rari 12}. Più recentemente, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha ampliato la capacità di profilare le popolazioni immunitarie del SNC permettendo la scoperta di stati cellulari e programmi di trascrizione ad alta risoluzione. Nonostante offra una potente intuizione trascrictomica, scRNA-seq è limitata da costi, artefatti di dissociazione, perdita del trascritto e perdita di risoluzione a livello^{proteico 13,14}. La citometria a flusso, pur priva di analisi spaziale ed è sensibile agli effetti legati alla dissociazione, offre una risoluzione fenotipica superiore grazie a un pannello multiparametrico avanzato e fornisce un robusto profiling immunitario quantitativo.

Insieme, le metodologie descritte qui forniscono una piattaforma flessibile e potente per modellare il BCBM e interrogare le dinamiche immunitarie alle interfacce linfatiche del SNC, supportando lo sviluppo preclinico di terapie che mirano sia al microambiente del tumore cerebrale sia alle relative vie di regolazione immunitaria.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state condotte secondo le linee guida della Facoltà di Farmacia dell'Università di Lisbona. I protocolli sono stati esaminati e approvati dall'autorità portoghese competente per la protezione animale, Direção-Geral de Alimentação e Veterinária (Riferimento 0421/000/000/2021).

1. Preparazione delle cellule E0771 per l'impianto in vivo

1. In un cappuccio sterile, si coltura cellule E0771 in una fiaschetta T75 utilizzando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con siero fetale bovino (FBS) al 10% (v/v) e al 1% (v/v) di penicillina e streptomycina (PEST).
   1. Assicurarsi che le cellule siano autenticate tramite profilazione STR al momento della ricezione dal fornitore e confermate che sono prive di micoplasma tramite test di routine. Coltivare cellule tumorali per almeno 2–8 passaggi dopo lo scongelamento prima dell'impianto cerebrale.
2. Il giorno dell'impianto, assicurati che le cellule siano sane e con un 80-90% di confluenza. Rimuovere il mezzo e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
3. Aggiungi la tripsina alla fiaschetta e incuba per 5 minuti a 37 °C. Poi, aggiungi tre volte il volume del mezzo integrato (DMEM con 10% v/v FBS e 1% v/v PEST) per neutralizzare la tripsina e dissocare le cellule.
4. Trasferire le celle in un tubo e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovi il soprandanante e risospendi il pellet nel PBS per il conteggio delle cellule.
5. Centrifugare di nuovo (300 x g per 5 minuti), scartare il soprantantante e risospendere le cellule in PBS a una concentrazione di 1 x 10⁵ celle di E0771 in 2 μL per animale. Tieni la sospensione cellulare sul ghiaccio fino all'inoculazione tumorale. Prepara la sospensione cellulare immediatamente prima dell'iniezione.

2. Inoculazione del tumore intracranico tramite apparecchio stereotassico

1. Procura le femmine di topi C57BL/6 (6-8 settimane) e acclimatale alla struttura per animali per almeno 7 giorni prima dell'intervento. Tieni i topi domestici in condizioni controllate con un ciclo di 12 ore luce/scure e fornisci cibo e acqua ad libitum.
   NOTA: Si raccomanda un minimo di cinque animali per gruppo sperimentale per garantire una potenza statistica sufficiente per una profilazione immunitaria comparativa significativa tra condizioni di tumore e condizioni di controllo.
2. Prepara il campo chirurgico e tutti i materiali necessari prima di iniziare la procedura:
   1. Strumenti chirurgici: bisturi, forbici, forci, pinze, portaaghi, filo per sutura.
   2. Attrezzature e altro: strumento stereotassico, siringa di vetro, trapano, rasoi, cotton fioc, borsa riscaldante.
   3. Anestesia: Preparare ketamina-xilazina (K-X) (rispettivamente 25 mg/mL e 2 mg/mL) in PBS in un tubo da 15 mL.
   4. Analgesia: Prepara buprenorfina a 15 μg/mL in PBS in un tubo da 15 mL.
   5. Altre soluzioni: povidone-iodio, perossido di idrogeno al 3% v/v (_{H 2O 2}), unguento oftalmico.
      ATTENZIONE:_L'H2O2 è dannoso se ingerito e può causare irritazione cutanea.
3. Anestetizzare il topo tramite iniezione intraperitoneale (i.p.) di K-X (100 μL per 10 g di peso corporeo). Confermare un'anestesia adeguata in assenza di risposta al pizzicamento del dito del piede.
4. Applica una pomata oftalmica su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione e posiziona il topo su una borsa riscaldante durante tutta la procedura.
5. Rasi il cuoio capelluto e disinfetta l'area chirurgica con povidone-iodio. Fai un'incisione longitudinale di 1 cm lungo la linea mediana per esporre il cranio.
6. Pulisci il cranio esposto con_H2O2 usando un cotton fibb in movimento circolare per visualizzare il bregma. Se si verifica un eccesso di schiuma, rimuovilo con un tampone a secco.
7. Posiziona il mouse nel frame stereotaxico. Impostare il bregma come punto di riferimento (0,0) e misurare 2,5 mm laterali e 0,5 mm anteriori al bregma. Segna il sito dell'iniezione.
8. Rimuovi il topo e fai un piccolo foro alle coordinate segnate. Evita di forare troppo in profondità per prevenire danni cerebrali.
9. Monta la siringa sull'iniettore. Sospendere le celle e caricare la siringa di vetro con un volume sufficiente per due iniezioni (4–5 μL). Non preparare più di due iniezioni alla volta per evitare il sedimento cellulare.
10. Riposiziona il topo nella stereotassia, allinea l'ago con il foro e abbassalo lentamente fino a una profondità di 3,0 mm nel parenchima cerebrale. Iniettare cellule (o PBS sterile per un controllo fittizio) a 1 μL/min.
11. Dopo l'iniezione, tieni l'ago in posizione per almeno 1 minuto, ritrai 1,5 mm, tieni per un altro minuto, poi ritira completamente. Questo minimizza il riflusso e garantisce una corretta deposizione cellulare.
12. Chiudi l'incisione con punti di sutura e applica povidone-iodio. Somministrare buprenorfina (100 μL) sottocutanea.
13. Tieni il mouse su una borsa termica fino al completo recupero dall'anestesia. Riporta il topo in una gabbia pulita e monitora quotidianamente se disturbi psicologici, segni neurologici o infezioni.

3. Perfusione intracardiaca del topo

1. Anestetizzare i topi tramite iniezione i.p. di K-X (100 μL per 10 g di peso corporeo). Confermare un'anestesia adeguata in assenza di risposta al pizzicamento del dito del piede.
2. Con le forbici, effettuare un'incisione di 5–6 cm attraverso la parete addominale e due incisioni attraverso la gabbia toracica fino alla clavicola. Fai attenzione a non tagliare vasi sanguigni importanti.
3. Con il cuore esposto, taglia l'atrio destro per permettere il flusso sanguigno. Iniettare PBS gelato nel ventricolo sinistro con una siringa da 20 mL dotata di un ago da 25G × 1 pollice.
4. Ferma la perfusione quando il liquido che esce è libero dal sangue. Per i topi adulti, servono circa 20 mL di PBS.

4. Isolamento delle meningi e del bulbo olfattivo del topo

1. Dopo la perfusione intracardiaca, decapitare il topo con forbici chirurgiche. Rimuovi completamente il cuoio capelluto per esporre il cranio.
2. Con forbici, taglia il cranio nel piano trasversale dalla regione posteriore verso gli occhi, facendo attenzione a non danneggiare il tessuto cerebrale sottostante. Estrarre delicatamente il cervello usando pinze fine, evitando il contatto o il raschiamento della superficie interna del cranio.
3. Dopo la rimozione cerebrale, le meningi durali rimangono attaccate alla superficie interna del cranio. Immergi il cranio in PBS gelato per almeno 5 minuti per facilitare la separazione intatta delle meningi.
4. Dissezionare il bulbo olfattivo dalla regione anteriore del cervello e trasferirlo in PBS gelato per una conservazione temporanea fino alla lavorazione.
5. Utilizzando pinze a punta fine, stacca delicatamente le meningi dalla superficie interna del cranio sollevando e pelando con cura lo strato tissutale sottile. Trasferire le meningi in PBS gelato fino a ulteriori lavorazioni. Evita di strappare il tessuto per garantire un recupero cellulare ottimale a valle.

5. Dissociazione dei tessuti in singole cellule

1. Meningi
   1. Trasferire le meningi in 3 mL RPMI 1640 contenenti 0,05% collagenasi II e DNasi I. Incubare per 20 minuti a 37 °C, agitando delicatamente ogni 10 minuti. La digestione eccessiva riduce la vitalità cellulare e dovrebbe essere evitata.
   2. Far passare il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare da 40 μm in un tubo da 50 mL. Dissocia meccanicamente il tessuto residuo premendo delicatamente uno sturalavandini a siringa contro il colino e lava con 5 mL di PBS.
   3. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet in 3 mL PBS.
   4. Ripeti centrifugazione. Scartare il sovrantantante, risospendere il pellet finale nel volume residuo e trasferire su una piastra U-bottom a 96 pozzi.
2. Bulbo olfattivo
   1. Rimuovere il PBS e dissociare meccanicamente il tessuto usando uno sturalavandini a siringa. Aggiungi una soluzione digertiva da 3 mL contenente lo 0,02% di collagenasi II nella soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS). Incubare per 20 minuti a 37 °C, agitando delicatamente ogni 10 minuti.
   2. Passa la sospensione della cella attraverso un filtro da 70 μm in un tubo da 50 mL e lava con PBS da 10 mL.
   3. Centrifuga a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il sovrantantante e risospendere il pellet finale nel volume residuo. Trasferisci su una piastra a 96 pozzi con fondo a U.
3. Conserva le piastre a 4 °C fino a quando non si tingono.
   NOTA: Eseguire la colorazione lo stesso giorno per garantire la vitalità ottimale delle cellule.

6. Colorazione cellulare e acquisizione della citometria a flusso

1. Progettazione del pannello
   1. Si veda la Tabella 1.
      NOTA: Il pannello in questo protocollo è stato progettato per un citometro a flusso spettrale equipaggiato con 4 laser (viola, blu, giallo-verde e rosso) e un totale di 51 rivelatori (48 canali di fluorescenza + 3 canali di scatter). Il pannello deve essere progettato in base alla configurazione del citometro di flusso e alle proteine/marcatori di interesse.
2. Colorazione cellulare
   1. Centrifugare le piastre a U a 96 pozzi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare con cura il soprannatante. Da questo passaggio in poi, proteggi le piastre dalla luce.
   2. Aggiungere un colorante di vitalità da 50 μL (FVD, diluizione 1:5000 in PBS) ai pozzi appropriati e incubare per 20 minuti a RT. Lavare con PBS da 150 μL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante. Aggiungi il colorante di vitalità solo ai controlli di vitalità e ai campioni.
   3. Bloccare i recettori Fc incubando le cellule con 30 μL di anticorpi anti-CD16/CD32 (0,01 μg/mL nel buffer FACS: PBS con 2 mM EDTA e 0,5% BSA) per 10 minuti sul ghiaccio. Lavare con un tampone FACS da 170 μL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
   4. Aggiungere una miscela di anticorpi da 30 μL o controlli monocolori (preparati secondo le diluizioni degli anticorpi elencate nella Tabella dei Materiali, nel tampone FACS) e incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Lavare con un tampone FACS da 170 μL, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
   5. Fissare le celle con 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 2% in PBS per 20 minuti a RT. Lavare con 100 μL di PBS, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e scartare il soprantantante.
      NOTA: Per i marcatori intracellulari, sostituisci questo passaggio con fissazione e permeabilizzazione utilizzando un set di tampone commerciale, poi esegui la colorazione intracellulare prima della risospensione finale.
   6. Sospensa i pellet finali delle celle in 200 μL di buffer FACS. Conservare i piatti a 4 °C fino all'acquisizione sul citometro di flusso.
3. Controlli a colorazione singola e Fluorescenza Meno Uno (FMO)
   1. Per l'ottimizzazione del dismix sono necessari campioni colorati a colori singoli. Le celle sono utilizzate per campioni colorati a colori singoli per i marcatori che mostrano picchi positivi e negativi. Altrimenti, l'uso di perle di compensazione è preferito e raccomandato per ottenere una dismixatura ottimale. Prepara le sfere di compensazione per gli anticorpi coniugati con fluorescente secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: Preparare i controlli FMO è un passaggio importante per ottenere un gating corretto, specialmente per i marcatori che non mostrano picchi positivi e negativi chiari. Prepara più campioni FMO per diversi fluorocromi secondo necessità.
   2. Preparare i campioni di FMO per gli antigeni della superficie cellulare seguendo i passaggi della Parte 6.2, ma escludere l'anticorpo di interesse dal mix di anticorpi al passaggio 6.2.4.
4. Acquisizione e analisi della citometria di flusso
   1. Accendi il citometro, avvia il software di acquisizione del citometro a flusso e prepara le sfere di controllo qualità (QC) (1 goccia in PBS da 300 μL) in un tubo campione da 12 x 75 mm mentre la macchina si riscalda (almeno 30 minuti).
   2. Pulisci lo strumento facendo: 3 min 10% candeggina v/v, 30 min_{H 2}O a portata alta. Riporta la portata a basso per i passaggi successivi.
   3. Seleziona la scheda QC, carica il tubo e fai girare le sfere premendo start. Una volta terminato il QC, compare un messaggio con scritto "Passato".
   4. Vai nella scheda acquisizione, seleziona o crea l'esperimento e avvia l'acquisizione facendo il gate delle celle per FSC e SSC. Acquisisci controlli senza colori e a colore singolo, esegui la wizard di unmixing e salva le impostazioni. Procedi a raccogliere campioni colorati.

Risultati

Dopo l'inoculazione intracranica delle cellule E0771, i topi hanno sviluppato una lesione localizzata del cancro al seno alle coordinate stereotassiche mirate. Le coordinate stereotassiche che mirano al parenchima striatale (2,5 mm laterale, 0,5 mm anteriore al bregma e 3,0 mm ventrali dal bregma) sono state selezionate sulla base degli atlanti cerebrali standard dei topi e sugli approcci di impianto intracranico descritti in^{precedenza 15,16}. Questa regione è amp...

Discussione

Combinando l'impianto del tumore intracranico con l'isolamento, la dissociazione e la caratterizzazione immunitaria delle meningi e del bulbo olfattivo, questo protocollo consente un'indagine dettagliata dell'interazione dinamica tra il microambiente del tumore cerebrale e le interfacce immunitarie associate al SNC. Il metodo fornisce formazione riproducibile di tumori intracranici, sospensioni cellulari di alta qualità e una robusta risoluzione dei sottogruppi immunitari. Tuttavia, l'im...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Alexa Fluor 594 anti-mouse CD45R/B220 antibody (clone RA3-6B2)	BioLegend	103254	used at 1:300 dilution
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD8 antibody (clone 53-6.7)	BioLegend	100730	used at 1:50 dilution
APC anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848006	used at 1:80 dilution
Betadine	Selleck Biotechnology GmbH	S4678-100mg	Povidone-iodine
Bovine Serum Albumin (BSA), lyophilized powder, ≥96% (agarose gel electrophoresis)	Sigma-Aldrich	A2153	To prepare FACS Buffer
Brilliant Violet 421 anti-mouse Podoplanin antibody (clone 8.1.1)	BioLegend	127423	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 510 anti-mouse CD11b antibody (clone M1/70)	BioLegend	101263	used at 1:30 dilution
Brilliant Violet 570 anti-mouse NK1.1 antibody (clone PK136)	BioLegend	108733	used at 1:40 dilution
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD19 antibody (clone 6D5)	BioLegend	115541	used at 1:50 dilution
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD44 antibody (clone IM7)	BioLegend	103057	used at 1:80 dilution
Brilliant Violet 785 anti-mouse F4/80 antibody (clone BM8)	BioLegend	123141	used at 1:40 dilution
Bupaq 3 mg/mL	Bio5	1002241	Buprenorphine
Cell strainer 40-µm	Avantor	732-2757
Cell strainer 70-µm	Avantor	732-2758
Centrifuge 5910 Ri	Eppendorf	5943000011
Collagenase type II	Worthington Biochemical Corporation	LS004176
Corning Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix	Corning	356231
Cytek Aurora Spectral Flow Cytometer	Cytek Biosciences
Dnase I	Worthington Biochemical Corporation	LS002006
Drill	Stoelting Europe	51630
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high-glucose, pyruvate	Gibco	41966029
E0771 cell line	ATCC	CRL-3436
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Merck	E4884	To prepare FACS Buffer
FCS Express Flow Cytometry Software	De Novo Software
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A5256801
FITC anti-mouse CD3 (clone 17A2)	BioLegend	100204	used at 1:50 dilution
Ghost Dye Red 780	Cytek Biosciences	13-0865-T500	Viability dye (used at 1:5000 dilution)
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Gibco	14025092
Heating Pad	MOBICLINIC
Hydrogen Peroxide 34.5 to 37% (H2O2)	ACROS	10002780
Ketamax 100 mg/mL	Bio3	1009495	Ketamine
Lubrithal Eye Gel	Bio4	1731329
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) 1M	Gibco	15630080
Paraformaldehyde (PFA) 16 %	Avantor	43368	To prepare Fixation Buffer
Pacific Blue anti-mouse Ly-6G antibody (clone 1A8)	BioLegend	127612	used at 1:50 dilution
PE anti-mouse Ly-6C antibody (clone HK1.4)	BioLegend	128008	used at 1:300 dilution
PE anti-mouse P2RY12 antibody (clone S16007D)	BioLegend	848004	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine5 anti-mouse CD11c antibody (clone N418)	BioLegend	117316	used at 1:80 dilution
PE/Cyanine7 anti-mouse CD80 antibody (clone 16-10A1)	BioLegend	104734	used at 1:100 dilution
PE-eFluor 610 anti-mouse CD31 antibody (clone 390)	eBioscience	61-0311-82	used at 1:160 dilution
PE/Fire 810 anti-mouse I-A/I-E (clone M5/114.15.2)	BioLegend	107667	used at 1:300 dilution
Penicillin-Streptomycin (PEST), 10 000 U/mL	Gibco	15140-122
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 antibody (clone 30-F11)	BioLegend	103132	used at 1:80 dilution
Phosphate-buffered saline (PBS) 10X, pH 7.4	Gibco	70011044
Prism (version 10)	GraphPad
RN Needle (27/51/3)S	Hamilton Company	7762-01
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870044
Scalpel Blades, carbon steel	B Braun	BB510
Sedaxylan 20 mg/mL	Bio2	1112384	Xylazine
Spark Blue 574 anti-mouse CD4 antibody (clone GK1.5)	BioLegend	100490	used at 1:50 dilution
Stereotaxic Instrument	Stoelting Europe	51730D
Suture wire Silkam black 5/0 10x45 cm	B Braun	C0266639	non-absorbable
Surgical Tool Kit (Scissors, Clam