Articolo metodologico

Stabilizzazione di un protocollo standardizzato di manipolazione tramite pinching della colonna vertebrale per un modello di asma pediatrica nel ratto

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DOI:

10.3791/70623

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1 ottobre 2026

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1College of Acupuncture and Massage, Nanjing University of Chinese Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un protocollo standardizzato per la manipolazione mediante pizzicamento della colonna vertebrale (SP) in un modello di ratto giovane di asma. Questo protocollo ha attenuato l'infiammazione delle vie aeree, l'iperreattività e il rimodellamento in un modello di asma indotto da OVA. Lo studio potrebbe costituire la base per l'esplorazione dei meccanismi d'azione e la traduzione clinica.

Abstract

L'asma è la malattia infiammatoria cronica delle vie aeree più diffusa nei bambini ed è caratterizzata da infiammazione cronica delle vie aeree, iperreattività bronchiale (AHR) e rimodellamento delle vie aeree. Nella medicina tradizionale cinese (TCM), la manipolazione della colonna vertebrale (SP) è una tecnica di massaggio pediatrico ampiamente utilizzata per il trattamento dell'asma e di altre malattie infantili. Nonostante una storia di utilizzo clinico che supera i 1.000 anni, la SP rimane poco conosciuta al di fuori della Cina. Inoltre, i meccanismi alla base della SP non sono ancora stati sufficientemente chiariti. Questo articolo descrive un protocollo fattibile e standardizzato per la SP che riproduce le procedure essenziali impiegate nella pratica clinica. L'applicazione del protocollo ha migliorato l'infiammazione delle vie aeree, l'AHR e il rimodellamento delle vie aeree in un modello di ratto giovane con asma. Per migliorare la riproducibilità, sono stati standardizzati parametri procedurali chiave, tra cui la pressione esercitata con le dita, la frequenza della manipolazione, il numero di ripetizioni e la durata dell'intervento. Il protocollo standardizzato presentato in questo studio potrebbe costituire un riferimento per ulteriori ricerche sulla standardizzazione della SP e sui suoi meccanismi d'azione nell'asma pediatrico sperimentale.

Introduzione

L'asma pediatrico è caratterizzato da un'infiammazione cronica delle vie aeree, da iperreattività bronchiale (AHR) e da rimodellamento delle vie aeree1,2. Spesso ha inizio nella prima infanzia ed è la malattia cronica più comune tra i bambini in età scolare. I trattamenti convenzionali attualmente disponibili includono corticosteroidi inalatori, agonisti dei recettori β₂, antagonisti dei recettori dei leucotrieni e terapie biologiche3,4. Tuttavia, solo il 44,1% dei bambini e il 55,4% degli adolescenti con asma raggiunge un controllo adeguato della malattia a livello mondiale5. Inoltre, la somministrazione ripetuta di corticosteroidi sistemici o inalatori può contribuire a un ritardo della crescita nei bambini con asma mal controllato6.

Come terapia esterna tradizionale, il massaggio (noto anche come tuina in Cina) è economico, ben tollerato e generalmente considerato sicuro per i bambini. Il massaggio è stato utilizzato da tempo sia in Cina che nei paesi occidentali per la prevenzione e il trattamento dell'asma pediatrico7. Revisioni sistematiche e meta-analisi hanno riportato esiti favorevoli della terapia di massaggio nella gestione dell'asma pediatrico7,8. La manipolazione della pinzatura della colonna vertebrale (SP) è una tecnica classica e ampiamente praticata nel massaggio pediatrico tradizionale cinese. Secondo la teoria della medicina tradizionale cinese (TCM), la stimolazione del Vaso Governatore (GV) e dei meridiani della Vescica (BL) lungo la schiena modula la funzione degli organi Zang-Fu, mantenendo così l'omeostasi sistemica e prevenendo o trattando le malattie9,10,11. Studi precedenti hanno dimostrato che la SP non solo migliora i sintomi e i segni di atopia nei bambini, ma riduce anche l'infiammazione cronica delle vie aeree in un modello di ratto giovane con asma12,13,14. Oltre al suo utilizzo clinico, la SP è comunemente praticata come intervento sanitario a livello domestico11,15. Nonostante una storia clinica che si estende per oltre mille anni, la SP rimane relativamente sconosciuta al di fuori della Cina e i suoi meccanismi sottostanti non sono stati ampiamente studiati. Pertanto, modelli animali standardizzati sono essenziali per chiarire i meccanismi della SP e sostenere la sua più ampia valutazione scientifica e applicazione.

Diversi studi hanno stabilito protocolli standardizzati di massaggio per la ricerca animale. Uno studio precedente ha sviluppato un protocollo standardizzato di accarezzamento dorsale o addominale a una velocità di circa 20 cm/s e una pressione di 100 mm H₂O, in grado di inibire le risposte eccitatorie cardiovascolari16. Più di recente, è stato dimostrato che una stimolazione tattile ripetitiva unidirezionale lungo il meridiano GV, effettuata mediante un stimolatore meccanico, promuove il rimodellamento sinaptico nella corteccia prefrontale mediale di un modello murino adolescente di autismo. In tale protocollo, una pressione moderata di circa 30–50 g è stata applicata a una velocità di circa 15,3 cm/s, senza causare disagio o lesioni. La stimolazione è stata somministrata in modo unidirezionale, dalla regione caudale alla nuca (regione occipitale), due volte al giorno per 10 minuti nell'arco di 21 giorni17. Tuttavia, la manipolazione manuale differisce in modo fondamentale dalla stimolazione meccanica, e attualmente nessun dispositivo meccanico riesce a riprodurre i movimenti caratteristici della SP. Inoltre, sebbene diversi studi abbiano indagato i meccanismi della SP in modelli murini di asma e altre patologie pediatriche18, non è stato ancora stabilito un protocollo standardizzato che definisca la forza e la velocità di stimolazione necessarie per la SP negli studi sugli animali. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standardizzato di SP è essenziale per migliorare la riproducibilità e facilitare le indagini meccanicistiche.

L'asma allergico è il fenotipo più comune di asma pediatrico19. Di conseguenza, la sensibilizzazione e la sfida con ovoalbumina (OVA) sono i metodi più utilizzati per stabilire un modello sperimentale di asma pediatrico20. I ratti sono particolarmente adatti per studiare interventi basati sul massaggio poiché le loro dimensioni corporee maggiori facilitano la manipolazione manuale. Inoltre, i modelli ratini riproducono in modo affidabile le caratteristiche patologiche chiave dell'asma allergico, inclusa l'infiammazione polarizzata verso Th2, l'iperreattività bronchiale (AHR) e il rimodellamento delle vie aeree21.

Studi precedenti hanno dimostrato che la SP attenua l'infiammazione delle vie aeree in ratti giovani dopo sensibilizzazione e sfida con OVA11,14. Pertanto, lo scopo del presente studio è stato quello di stabilire un protocollo standardizzato di SP per un modello di ratto giovane di asma pediatrico, al fine di facilitare future indagini sui meccanismi alla base dell'effetto della SP. Questo protocollo standardizzato fornisce un quadro sperimentale riproducibile per studi meccanicistici e future ricerche traslazionali sulla SP in modelli animali di asma pediatrico.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Medicina Cinese di Nanchino (n. 202306A032). Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le Linee guida dei National Institutes of Health per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio e con le linee guida ARRIVE 2.0.

Sono stati utilizzati trenta ratti maschi Sprague-Dawley (SD) di 3 settimane di età, liberi da agenti patogeni specifici (SPF), del peso di 45–55 g. I ratti sono stati allevati (tre per gabbia) in un impianto a barriera SPF con un ciclo luce/buio di 12 ore, a 22 ± 2 °C e un'umidità relativa del 30%–40%, con libero accesso a cibo standard e acqua. Sulla base di studi precedenti che hanno utilizzato modelli di ratti giovani di asma11,14, la dimensione del campione è stata determinata per minimizzare l'uso di animali in conformità con il principio di riduzione delle 3R. Dopo un periodo di ambientamento di 7 giorni, è stato registrato il peso corporeo basale e a ciascun ratto è stato assegnato un numero di identificazione univoco. I ratti sono stati stratificati in base al peso corporeo basale e successivamente assegnati all'interno di ogni strato a uno dei cinque gruppi mediante una tabella di numeri casuali, con un rapporto di assegnazione di 1:1:1:1:1 (n = 6 per gruppo): controllo (CN), asma (AS), asma + SP (AS+SP), asma + metilprednisolone (AS+MP) e asma + SP + metilprednisolone (AS+SP+MP). La sequenza di randomizzazione e l'assegnazione ai gruppi sono state generate da un ricercatore che non ha partecipato alle successive interventi o valutazioni degli esiti.

I criteri di inclusione prevedevano ratti maschi SPF della linea Sprague-Dawley sani, di 3 settimane di età, con un peso corporeo compreso tra 45 e 55 g al basale, che mostrassero un pattern respiratorio normale e un'attività fisica regolare. I ratti sono stati esclusi se presentavano segni di malattia o una deviazione del peso corporeo di >20% rispetto alla media del gruppo durante l'acclimatazione, oppure se gli animali sono deceduti prima del completamento della fase di intervento. Durante tutta la procedura è stato indossato un idoneo equipaggiamento di protezione individuale, comprensivo di camice da laboratorio, mascherina monouso e guanti. Le carcasse animali e i tessuti sono stati collocati in sacchetti per rifiuti biologici a doppio strato e conservati a −20 °C prima dello smaltimento. La lettiera contaminata è stata smaltita come rifiuto solido biologico, e gli oggetti taglienti sono stati gettati in contenitori per materiale tagliente approvati, resistenti alla puntura. Per il prelievo terminale dei tessuti, è stato somministrato uretano al 20% (5 mL/kg, i.p.) e l’anestesia profonda è stata confermata dall’assenza del riflesso di ritrazione plantare e del riflesso corneale.

1. Creazione del modello di asma nel ratto giovane

NOTA: La seguente procedura è stata utilizzata per stabilire il modello di asma nel ratto giovane12.

  1. Preparare la sospensione di OVA/Al(OH)₃ immediatamente prima di ogni iniezione. Sciogliere 2 mg di OVA grado V direttamente in 1 mL di gel di Al(OH)₃ al 4% ed eseguire un vortex fino a ottenere una sospensione omogenea.
    NOTA: Assicurarsi che la sospensione sia omogenea prima dell'iniezione. In caso di precipitazione, eseguire brevemente un vortex per risospendere la miscela. Conservare la sospensione sul ghiaccio e utilizzarla entro 2 h dalla preparazione.
  2. Iniettare 1 mL della sospensione di OVA/Al(OH)₃ per via intraperitoneale nei giorni sperimentali 1, 8 e 15. Iniettare 1 mL di soluzione salina normale sterile (NaCl 0,9%) nei ratti del gruppo CN seguendo lo stesso schema.
  3. Sfidare i ratti con una soluzione di OVA al 2% (grado II) dal giorno sperimentale 21 al giorno 42 mediante un nebulizzatore ad ultrasuoni. Somministrare le ultime due sfide consecutive con OVA al 3% per indurre un peggioramento dopo la sensibilizzazione.
  4. Eseguire la nebulizzazione ogni due giorni per 30 minuti nell'arco di un periodo di 3 settimane. Posizionare ogni ratto singolarmente in una camera di esposizione sigillata collegata al nebulizzatore ad ultrasuoni (frequenza ultrasonica: 1,7 MHz ± 10%; velocità di nebulizzazione: ≥3 mL/min; diametro delle particelle: <5 µm).
    NOTA: Confermare l'avvenuta realizzazione del modello di asma osservando starnuti, movimenti oscillatori della testa durante la respirazione, respiro con la bocca aperta, contrazione dei muscoli addominali e sibili respiratori.

2. Funzionamento e applicazione del software del sistema Finger TPS

  1. Inserire il connettore del sensore verticalmente nell'interfaccia della scheda circuitale. Collegare la scheda al computer utilizzando un cavo USB-C di circa 40 cm di lunghezza per garantire una sufficiente flessibilità operativa.
  2. Disinfettare le mani e i protettori per le dita. Inserire il pollice e l'indice destro dell'operatore nei manicotti per le dita dotati di sensori. Posizionare i sensori flessibili al centro delle punte delle dita e assicurare un contatto stretto e senza pieghe con la pelle.
  3. Eseguire la calibrazione del sistema e il controllo qualità per la misurazione della forza
    1. Ispezionare i sensori e i cavi di collegamento prima di ogni sessione di addestramento dell'operatore e verificare che il dispositivo sia correttamente connesso.
    2. Selezionare “N” come unità di misura e impostare l'intervallo di misurazione da −3,5 a 32 N.
    3. Assicurarsi che nessuna forza esterna venga applicata ai sensori. Eseguire la funzione “Tara” per azzerare il sistema.
    4. Registrare la linea di base a vuoto per 30 s. Iniziare la misurazione della forza solo quando la variazione della linea di base rimane inferiore a 0,02 N.
    5. Ripetere la procedura di azzeramento ogni volta che viene modificata la posizione del sensore o la tensione del manicotto, oppure quando si osserva una deriva della linea di base.
    6. Utilizzare il sistema Finger TPS per monitorare la forza applicata durante l'addestramento dell'operatore. Mantenere una forza di 5 ± 0,6 N durante lo stroking dorsale e di 12 ± 2 N durante lo SP, mantenendo al contempo la velocità e la frequenza prescritte.
    7. Accettare la curva della forza solo quando la linea di base rimane stabile, non si verificano interruzioni o saturazioni del segnale e la forza applicata rimane entro i range obiettivo specificati.
  4. Eseguire lo stroking dorsale e lo SP monitorando la curva dinamica della forza. Regolare la tensione dei manicotti per le dita secondo necessità finché non si ottiene una curva di forza stabile.
  5. Praticare le manipolazioni monitorando la curva della forza in tempo reale. Mantenere una forza obiettivo di 5 ± 0,6 N e una velocità di circa 5 cm/s durante lo stroking dorsale, e una forza obiettivo di 12 ± 2 N con una frequenza di 6–8 ripetizioni/min durante lo SP. Considerare l'operatore competente solo dopo che cinque prove consecutive soddisfino i criteri relativi alla tecnica di manipolazione, alla forza delle dita e alla frequenza dello SP.
    NOTA: Considerare l'operatore qualificato solo dopo aver raggiunto in modo costante i parametri obiettivo di forza e movimento. Rimuovere i protettori per le dita prima di eseguire la procedura formale di SP per evitare stimolazioni tattili aggiuntive nei ratti. Tuttavia, nessuno dei test di riproducibilità tra operatori descritti in questo studio dovrebbe essere considerato nell'adozione di questo protocollo come riferimento per lo studio SP.

3. Procedura dettagliata della manipolazione mediante pinzatura della spina

  1. Tenere delicatamente il ratto in posizione prona su un palmo. Sostenere gli arti anteriori circondando delicatamente le ascelle con il pollice e l'indice, permettendo agli arti anteriori di pendere naturalmente. Assicurarsi che il ratto rimanga calmo con una respirazione regolare. Se si verificano vocalizzazioni, agitazione o defecazione, rilasciare il ratto e permettergli di ambientarsi per 2–3 minuti prima di riposizionarlo (Figura 1).
  2. Accarezzare due volte la schiena dalla regione delle spalle alla base della coda lungo il vaso governatore (GV) utilizzando l'indice, il medio e l'anulare della mano destra. Applicare una forza di circa 5 N per calmare il ratto prima della SP.
  3. Pizzicare la pelle alla radice della coda utilizzando il pollice destro posizionato posteriormente e l'indice e il medio posizionati anteriormente. Sollevare delicatamente la pelle, quindi ruotare e avanzare con le dita in direzione craniale lungo la colonna vertebrale verso Dazhui (GV14). Evitare di provocare segni evidenti di disagio. Mantenere una pressione delle dita di circa 12 N ed eseguire la manipolazione con una frequenza di 6–8 ripetizioni/min. Eseguire 15 ripetizioni dal giorno 1 al giorno 21 e 25 ripetizioni dal giorno 22 al giorno 44.
  4. Ripetere la procedura di accarezzamento della schiena descritta nel passaggio 3.2 per concludere la sessione di trattamento e calmare il ratto.
    NOTA: Secondo la teoria della medicina tradizionale cinese (MTC), la SP viene eseguita lungo la colonna vertebrale per stimolare i meridiani GV e Vescica (BL) (Figura 2). Il GV si estende lungo la linea mediana dorsale dalla radice della coda a Dazhui (GV14), mentre il meridiano BL si trova approssimativamente a 3–6 mm lateralmente rispetto alla linea mediana, a seconda delle dimensioni corporee22. Dazhui (GV14) si trova nel punto medio tra la settima vertebra cervicale e la prima vertebra toracica. Aumentare il numero di ripetizioni della SP con l'età per mimare il regime terapeutico clinico. Durante l'accarezzamento della schiena, assicurarsi che il ratto rimanga rilassato, respiri in modo tranquillo e non mostri comportamenti difensivi. Durante la SP, ci si aspetta un lieve arcuamento della schiena e un allargamento dei baffi, senza minzione o defecazione indotte da stress, agitazione violenta, vocalizzazioni o tentativi di fuga.

4. Protocolli di intervento

  1. Assegnare i ratti del gruppo CN a non ricevere alcun intervento specifico per la malattia. Manipolare i ratti delicatamente per la stessa durata del gruppo AS+SP, al fine di controllare gli effetti derivanti dalla manipolazione. Somministrare soluzione fisiologica intraperitoneale (1 mL/kg) secondo lo stesso schema utilizzato per le iniezioni di metilprednisolone.
  2. Sottoporre i ratti del gruppo AS a sensibilizzazione e sfida con OVA. Applicare le stesse procedure di manipolazione e di controllo con iniezione di soluzione fisiologica utilizzate per il gruppo CN.
  3. Sottoporre i ratti del gruppo AS+SP a sensibilizzazione e sfida con OVA. Applicare il protocollo SP una volta al giorno prima dell'induzione del modello.
  4. Sottoporre i ratti del gruppo AS+MP a sensibilizzazione e sfida con OVA. Somministrare metilprednisolone (10 mg/kg; 2 mg/mL preparato in soluzione fisiologica) mediante iniezione intraperitoneale 30 minuti prima di ogni sfida con OVA.
  5. Sottoporre i ratti del gruppo AS+SP+MP alle stesse procedure utilizzate per il gruppo AS+MP. Applicare il protocollo SP una volta al giorno prima dell'iniezione di metilprednisolone.
    NOTA: A eccezione dei gruppi AS+SP e AS+SP+MP, applicare le stesse procedure di manipolazione a tutti gli altri gruppi per controllare gli effetti non specifici legati alla manipolazione. Utilizzare siringhe sterili monouso per tutte le iniezioni e smaltire gli aghi in contenitori resistenti alle punture. Inserire l'ago per l'iniezione intraperitoneale lateralmente rispetto alla linea mediana addominale per ridurre al minimo il rischio di lesioni viscerali. Per controllare la stimolazione tattile nei gruppi non SP, accarezzare i ratti quattro volte durante lo stesso intervento effettuato nel gruppo SP ogni giorno. Utilizzare la stessa procedura di accarezzamento dorsale impiegata per i gruppi SP.

Risultati

Il peso corporeo è un indicatore importante della crescita nei ratti giovani. Non sono state osservate differenze significative nel peso corporeo tra i cinque gruppi prima del trattamento sperimentale. Dopo l'induzione del modello di asma, il gruppo AS ha mostrato un peso corporeo significativamente inferiore rispetto al gruppo CN (P = 0.000; Figura 3A). Rispetto al gruppo AS, il gruppo AS+SP ha mostrato un peso corporeo significativamente maggiore (P = 0.008; Figura 3A), mentre il gruppo AS+MP non ha mostrato alcuna differenza significativa (P = 0.975; Figura 3A). Analogamente, il gruppo AS+SP+MP non ha mostrato un aumento significativo del peso corporeo rispetto al gruppo AS (P = 0.925; Figura 3A). I risultati suggeriscono che la SP favorisce l'aumento di peso durante la modellizzazione dell'asma pediatrico e il trattamento con metilprednisolone (MP) nei ratti giovani.

Dopo la sfida con OVA, i ratti del gruppo CN non hanno mostrato segni di distress respiratorio, inclusi affanno, starnuti, movimenti oscillatori della testa, respiro con la bocca aperta, contrazione dei muscoli addominali o sibili. Al contrario, i ratti del gruppo AS hanno mostrato manifestazioni tipiche dell'asma pediatrico, come affanno, starnuti, movimenti oscillatori della testa e respiro con la bocca aperta. Questi segni clinici sono stati notevolmente attenuati dopo il trattamento con SP, MP o con la loro applicazione combinata.

Per valutare gli effetti antinfiammatori di SP in ratti giovani con asma sperimentale, i tessuti polmonari sono stati raccolti dopo anestesia profonda con uretano al 20% (5 mL/kg, i.p.) secondo procedure precedentemente descritte12. La colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e l'analisi dell'espressione genica di fattori pro-infiammatori sono stati eseguiti per valutare l'infiammazione cronica delle vie aeree, mentre la colorazione di Masson è stata utilizzata per valutare il rimodellamento delle vie aeree. L'iperreattività bronchiale (AHR) è stata valutata mediante plestimografia totale (WBP) misurando la pausa aumentata (Penh).

Dopo aver seguito le procedure di colorazione standard con ematossilina-eosina e Masson23, le sezioni polmonari sono state colorate con ematossilina ed eosina e valutate per l'infiammazione peribronchiolare utilizzando una scala modificata da 0 a 424. Il gruppo modello di asma ha mostrato punteggi di infiammazione significativamente più elevati rispetto al gruppo CN (P = 0,000). Rispetto al gruppo AS, i gruppi AS+SP, AS+MP e AS+SP+MP hanno mostrato tutti una riduzione significativa dei punteggi di infiammazione (P = 0,005, P = 0,006 e P = 0,000, rispettivamente), senza differenze significative tra i tre gruppi trattati (Figura 4A, Tabella 1).

Il rimodellamento delle vie aeree è stato valutato quantificando il deposito di collagene attorno ai bronchioli mediante colorazione di Masson. Il deposito di collagene è stato espresso come area positiva al collagene normalizzata al perimetro della membrana basale (µm2/µm). Il gruppo AS ha mostrato un deposito di collagene significativamente maggiore rispetto al gruppo CN (P = 0.000). Rispetto al gruppo CN, i gruppi AS+SP e AS+MP hanno mostrato un deposito di collagene moderatamente più elevato (P = 0.050 e P = 0.051, rispettivamente), ma significativamente inferiore rispetto al gruppo AS (P = 0.001 in entrambi i confronti). Il gruppo AS+SP+MP non ha mostrato differenze significative rispetto al gruppo CN (P = 0.105), ma ha evidenziato un deposito di collagene significativamente ridotto rispetto al gruppo AS (P = 0.001). Non sono state osservate differenze significative tra i tre gruppi di intervento (Figura 4B, Tabella 1).

Curve representative di forza ottenute utilizzando il sistema Finger TPS sono mostrate in Figura 5. Durante la formazione dell'operatore, la curva di forza registrata durante lo spostamento all'indietro è rimasta stabile a circa 5 N (Figura 5A), mentre la curva di forza registrata durante la SP ha mostrato picchi ripetuti di forza corrispondenti alla manipolazione di pizzicamento, con la forza applicata mantenuta all'interno dell'intervallo target predefinito (Figura 5B). Questi profili di forza dimostrano le caratteristiche di forza standardizzate utilizzate durante la formazione dell'operatore.

La cronologia complessiva dell'esperimento è riassunta nella Figura 6. Dopo il periodo di ambientamento di 7 giorni, è stata effettuata la sensibilizzazione con OVA secondo il programma specificato, seguita da sfide ripetute con OVA. La SP è stata somministrata ai gruppi AS+SP e AS+SP+MP durante il periodo di intervento stabilito, mentre la metilprednisolone è stata somministrata prima della sfida con OVA nei corrispondenti gruppi di trattamento. La valutazione mediante WBP e il prelievo dei tessuti sono stati eseguiti dopo l'ultima sfida (Figura 6).

La pletismografia corporea totale è ampiamente utilizzata per valutare il Penh in roditori coscienti e non vincolati, senza provocare lesioni o stress significativi25. Sebbene il Penh sia un indicatore indiretto influenzato dalla tempistica respiratoria e da fattori ambientali, la misurazione diretta della resistenza delle vie aeree richiede anestesia e tracheotomia, procedure che potrebbero alterare la fisiologia delle vie aeree26. Tuttavia, si è riportato che il Penh correla con misurazioni invasive della resistenza polmonare27. Ventiquattro ore dopo l'ultima sfida con OVA, i ratti sono stati posizionati in camere non vincolate ed esposti in sequenza a PBS aerosolizzato seguito da acetilcolina (Ach) alle concentrazioni di 3,125, 6,25, 12,5, 25 e 50 mg/mL. Ogni sfida con aerosol è durata 2 min e ha sido seguita da un periodo di registrazione di 5 min28. Il gruppo AS ha mostrato valori di Penh significativamente più elevati rispetto al gruppo CN, mentre il trattamento con SP, MP o la loro applicazione combinata ha ridotto in modo significativo i valori di Penh (P = 0,005; Figura 3B). Questo risultato ha indicato che SP migliora la funzione respiratoria nei ratti asmatici, un dato che necessita ancora di ulteriore validazione, in combinazione con misurazioni dirette della resistenza delle vie aeree (Raw).

L'interleuchina-4 (IL-4) inizia l'infiammazione eosinofila mediata da Th2, mentre il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) contribuisce all'iperreattività bronchiale (AHR) e al rimodellamento delle vie aeree, svolgendo insieme un ruolo centrale nella patogenesi dell'asma pediatrico29. Per valutare ulteriormente l'infiammazione delle vie aeree, i livelli di espressione di IL-4 e TNF-α nei tessuti polmonari sono stati quantificati mediante reazione a catena della polimerasi in tempo reale con trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR). Rispetto al gruppo CN, il gruppo AS ha mostrato un'espressione significativamente aumentata di IL-4 e TNF-α (P = 0,000 e P = 0,000, rispettivamente; Figura 3C,D). L'espressione di entrambe le citochine è risultata significativamente ridotta dopo il trattamento con SP o MP, e la combinazione di SP e MP ha prodotto la riduzione maggiore (P = 0,001 e P = 0,000, rispettivamente; Figura 3C,D).

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Figura 1: Procedura dettagliata della manipolazione di pizzicamento spinale (SP) nei ratti. (A) Tenere il ratto in posizione prona sul palmo dell'operatore. (B) Pizzicare la pelle alla base della coda. (C) Sollevare la pelle pizzicata. (D) Ruotare e avanzare con le dita in direzione craniale lungo la spina dorsale verso Dazhui (GV14). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Rappresentazione schematica del Vaso Governatore (GV), del meridiano della Vescica (BL) e del punto Dazhui (GV14) nei ratti. Il diagramma illustra la localizzazione anatomica del GV, del meridiano BL e del punto Dazhui (GV14), che costituiscono i siti bersaglio per la manipolazione mediante pizzicamento spinale. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3Effetti della manipolazione mediante compressione delle spine sulla massa corporea, sull'iperreattività delle vie aeree e sui fattori infiammatori polmonari in ratti giovani. (AConfronto del peso corporeo tra i gruppi sperimentali.BConfronto dei valori di pausa migliorata (Penh).CEspressione genica relativa dell'interleuchina-4 (IL-4) nel tessuto polmonare. (D) Espressione genica relativa del fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α) nel tessuto polmonare. I dati sono espressi come media ± SD. *P < 0,05 e **P < 0.01 rispetto al gruppo CN; #P < 0,05 e ##P < 0,01 rispetto al gruppo AS. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Modifiche istopatologiche rappresentative nel tessuto polmonare. (A) Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) che mostra infiammazione peribronchiolare. (B) Colorazione con tricromio di Masson che mostra deposito di collagene e rimodellamento delle vie aeree. Le immagini sono state acquisite con un ingrandimento di 200×. Le barre della scala corrispondono a 100 µm. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 5: Curve di forza rappresentative registrate durante la manipolazione di pinzamento della spina utilizzando il sistema Finger TPS. (A) Curva di forza registrata durante la manipolazione di retro-scansione. (B) Curva di forza registrata durante la manipolazione di pinzamento della spina (SP). Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Cronologia dell'esperimento. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

GruppoPunteggio di infiammazione in HEArea del collagene/Perimetro della membrana basale (μm²/μm)
CN1.10 ± 0.252.50 ± 0.43
AS2.32 ± 0.50**4.23 ± 0.53**
AS+SP1.66 ± 0.27##3.12 ± 0.56*##
AS+MP1.67 ± 0.31##3.12 ± 0.50*##
AS+SP+MP1.34 ± 0.27##3.01 ± 0.33##

Tabella 1: Punteggi di istopatologia polmonare. L'infiammazione peribronchiolare è stata valutata mediante colorazione con ematossilina-eosina, e il rimodellamento delle vie aeree è stato quantificato come area positiva al collagene normalizzata al perimetro della membrana basale (µm2/µm). I dati sono presentati come media ± SD (n = 5 per gruppo). *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo CN; #P < 0,05 e ##P < 0,01 rispetto al gruppo AS.

Discussione

La sensibilizzazione e la sfida con ovoalbumina (OVA) rappresentano uno dei modelli sperimentali più utilizzati per lo studio dell'asma pediatrico30,31. Lo studio attuale ha dimostrato che il protocollo standardizzato di manipolazione mediante pressione spinale (SP) attenua l'infiammazione cronica delle vie aeree, l'iperreattività bronchiale (AHR) e il rimodellamento delle vie aeree. Studi clinici precedenti hanno mostrato che il massaggio pediatrico tradizionale, inclusa la SP, migliora l'asma e altre malattie allergiche nei bambini11,13,32. Inoltre, studi su animali hanno dimostrato che la SP riduce l'infiammazione delle vie aeree nei modelli di ratto giovane con asma modulando la microbiota intestinale12,15. Il presente studio ha ulteriormente dimostrato che l'applicazione di un protocollo standardizzato di SP migliora l'infiammazione cronica delle vie aeree, l'AHR e il rimodellamento delle vie aeree in un modello di ratto giovane con asma. Inoltre, la SP potenzia gli effetti terapeutici del metilprednisolone (MP) riducendone gli effetti collaterali ritardanti la crescita.

La SP è praticata in Cina da oltre 1.000 anni e rimane una delle tecniche di massaggio pediatrico più ampiamente utilizzate per la prevenzione e il trattamento dell'asma e di altre malattie infantili12,15,33,34,35. Nonostante la lunga storia di applicazione clinica, la SP rimane relativamente poco conosciuta al di fuori della Cina. Secondo la teoria della medicina tradizionale cinese, i meridiani GV e BL si estendono lungo o adiacenti alla colonna vertebrale e comunicano con gli organi interni. Di conseguenza, si ritiene che la stimolazione dei meridiani GV e BL regoli la funzione viscerale, moduli l'attività immunitaria e potenzi la resistenza alle malattie. La SP consiste nel pizzicare, sollevare, torcere e avanzare lungo la pelle della colonna vertebrale, stimolando così sia il meridiano GV che quello BL. Questa manipolazione applica contemporaneamente forze di compressione e trazione sulla pelle e sulla fascia sottostante, producendo una stimolazione meccanica moderata. Nella pratica clinica, prima e dopo la SP viene regolarmente eseguita una manipolazione di scorrimento delicato sulla schiena, al fine di ridurre la stimolazione e migliorare il comfort del paziente. Lo scorrimento sulla schiena consiste in movimenti delicati discendenti lungo la schiena ed è ampiamente utilizzato nel massaggio pediatrico. Pertanto, sulla base dei principi di rilevanza clinica, fattibilità, semplicità e riproducibilità, il protocollo standardizzato include sia la SP che la manipolazione di scorrimento sulla schiena.

Studi precedenti hanno dimostrato che la SP riduce l'infiammazione sia nei polmoni che nell'ippocampo attraverso meccanismi immunomodulatori12,36. L'asma pediatrico è caratterizzato da un'infiammazione polarizzata verso la risposta Th2, strettamente associata a una disregolazione immunitaria37. Studi sperimentali precedenti hanno riportato che lo strofinamento manuale o con spazzola regola le risposte immunitarie nei topi quando viene eseguito a una pressione di 100–150 mmH₂O (7–11 mmHg) e a una velocità di circa 3 cm/s38. Inoltre, uno studio clinico ha riportato che lo strofinamento effettuato a una velocità di circa 1–10 cm/s viene percepito come più piacevole39. Sulla base di questi risultati, il protocollo standardizzato ha adottato una forza di strofinamento dorsale di 5 ± 0,6 N e una velocità di 5 cm/s per ottenere un effetto calmante adeguato. La pressione, la frequenza e il numero di ripetizioni della SP sono stati determinati sulla base di studi precedenti12,15 e di ricerche correlate di altri gruppi di ricerca40,41. Sebbene studi precedenti abbiano standardizzato o lo strofinamento manuale dorsale (20 cm/s; circa 100 mmH₂O) o la stimolazione meccanica del meridiano GV (30–50 g; circa 15,3 cm/s) per ottenere un'inibizione cardiovascolare o promuovere il rimodellamento sinaptico nei roditori, la SP manuale rappresenta un intervento biomeccanico distinto, che si basa sul feedback tattile e propriocettivo e quindi non può essere completamente replicato dai dispositivi meccanici esistenti. Questa differenza sottolinea l'importanza di protocolli standardizzati per l'operatore nella futura ricerca traslazionale sugli interventi tattili per l'asma allergico.

Numerosi studi pubblicati in cinese hanno dimostrato che la SP modula la funzione immunitaria e sopprime l'infiammazione42,43,44. Per quanto se ne sa attualmente, tuttavia, nessuno studio precedente al di fuori del gruppo di ricerca dell'autore ha standardizzato pressione e velocità della SP per indagare una malattia specifica in modelli animali di asma pediatrico. Studi precedenti hanno esaminato i meccanismi alla base della SP in modelli di ratti giovani con asma, inclusa la modulazione della microbiota intestinale, l'aumento della produzione di acidi grassi a catena corta, il miglioramento della funzione muscolare respiratoria (ad esempio, forza del diaframma) e l'attenuazione dell'infiammazione delle vie aeree e della disfunzione polmonare11. Il presente studio si è concentrato principalmente sull'istituire un protocollo standardizzato piuttosto che sull'elucidare in modo esaustivo i meccanismi d'azione sottostanti. È stato utilizzato un sistema di misurazione e registrazione della pressione tattile ad alta precisione per standardizzare la forza applicata sia durante il massaggio dorsale che durante la SP, mentre la velocità e la frequenza delle manipolazioni sono state standardizzate in base a studi precedenti. I ratti sono stati scelti perché le loro dimensioni corporee facilitano una manipolazione stabile e l'applicazione manuale della SP, avvicinandosi strettamente alla procedura clinica. Il massaggio dorsale è stato eseguito con le dita di una sola mano, come nella pratica clinica pediatrica. A causa delle dimensioni corporee più ridotte dei ratti, la SP è stata eseguita con tre dita di una mano anziché con entrambe, mantenendo comunque le caratteristiche biomeccaniche essenziali della tecnica clinica. Questa modifica riproduce in modo accurato la stimolazione dei meridiani GV e BL nel modello di ratto. Poiché i parametri di misurazione possono variare tra diversi sistemi di misurazione della pressione tattile, la standardizzazione della manipolazione manuale basata sulle risposte comportamentali dei ratti durante il massaggio dorsale e la SP potrebbe garantire una riproducibilità maggiore rispetto al solo affidamento a misurazioni di forza specifiche del dispositivo. Studi precedenti hanno inoltre dimostrato che il massaggio dorsale esercita effetti antidepressivi in giovani ratti con CUMS9, sebbene la SP abbia prodotto effetti terapeutici significativamente maggiori. Di conseguenza, gli effetti benefici osservati nel presente studio potrebbero riflettere in parte il contributo della manipolazione del massaggio dorsale oltre agli effetti principali della SP.

Vanno riconosciute diverse limitazioni. In primo luogo, la dimensione del campione era relativamente ridotta, il che potrebbe limitare la robustezza e la generalizzabilità dei risultati. In secondo luogo, lo studio attuale si è concentrato principalmente sull'istituzione e sulla validazione di un protocollo SP standardizzato; pertanto, ha esaminato solo un numero limitato di esiti meccanicistici, invece di delineare in modo esaustivo i meccanismi biologici sottostanti. Di conseguenza, non è stata effettuata la validazione meccanicistica — inclusi il conteggio delle cellule infiammatorie nel lavaggio broncoalveolare (BALF), i livelli di IgE specifica per OVA, il profilo delle citochine Th2 (ad esempio, IL-5, IL-13) e l'analisi delle vie di segnalazione intracellulari. Questo risultato ha indicato che la SP migliora la funzione respiratoria nei ratti asmatici, un dato che necessita ancora di ulteriore validazione, unitamente a misurazioni dirette della resistenza delle vie aeree (Raw). In terzo luogo, tutte le manipolazioni sono state eseguite da un singolo operatore addestrato, e la riproducibilità tra diversi operatori addestrati non è stata valutata. Infine, non è stato incluso un gruppo di intervento con soli movimenti di percussione dorsale, per distinguere gli effetti indipendenti della percussione dorsale da quelli della SP. Studi futuri dovrebbero prevedere campioni più ampi, valutare la riproducibilità tra operatori, includere gruppi di controllo aggiuntivi e approfondire i meccanismi molecolari alla base degli effetti terapeutici della SP.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nulla da divulgare. Durante il processo di preparazione del manoscritto, non sono stati utilizzati strumenti di intelligenza artificiale nella redazione del presente manoscritto. Gli autori si assumono la piena responsabilità della completezza e dell'accuratezza del manoscritto finale.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Natural Science Foundation of China (responsabile del progetto Xiong Ying, n. 81973970, presso l'Università di Medicina Cinese di Nanchino). Gli autori ringraziano l'Istituto di Pediatria, il Jiangsu Key Laboratory of Children's Health and Chinese Medicine e il Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research del Ministero dell'Istruzione per aver fornito strutture, strumenti e attrezzature.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
gel di Al(OH)3 al 4%Shanxi ZHHC Biomedical Technology Co., LTD, CinaBS010N/D
Ach (acetilcolina)Sigma, USAA2251N/D
Vetrini adesiviCitotest, Jiangsu, CinaREF.188105
P/N.80312-3161		N/D
Sacchetti per rifiuti biologici pericolosiNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.HJ421-2008N/D
Forno per tessuti biologiciKedee, Zhejiang, CinaKD-HIIN/D
Macchina per l'inclusione di tessuti biologiciKedee, Zhejiang, CinaKD-BMN/D
Macchina per l'espansione di tessuti biologiciKedee, Zhejiang, CinaKD-PIN/D
Buxco Research SystemsDSI Buxco, Wilmington, NC, USAPFTN/D
Mixer regolabile (MX-S)DLAB, Pechino, Cina8031102000N/D
Centrifuga per microtiterScilogex, USASCI-CF2800M E050S11B000798N/D
Posto di lavoro sterile Sanfa, Shanghai, CinaSF-CJ-1AN/D
Centrifuga convenzionaleDLAB, Pechino, CinaD100BE: 9031001011N/D
Guanti sterili monousoShanghai Kebang Medical Latex Equipment Co., Ltd.22010739https://www.sh-kebang.com/products_detail/6.html
Bilancia elettronicaJinghai, ShanghaiYP3001NN/D
Bilancia elettronicaJinghai,  Shanghai, CinaYP3001NN/D
Sistema Finger TPSPressure Profile System, Inc, USAVersione software applicabile: Chameleon 2018https://pressureprofile.com/body-pressure-mapping/finger-tps
 Microscopio ottico a fluorescenzaOlympus, Tokyo, GiapponeDP70N/D
Sterilizzatore a vapore ad alta pressioneTomy, GiapponeSX-500N/D
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàEppendorf5418RN/D
Kit per colorazione tricromatica di MassonSolarbio, Shanghai, CinaG1340N/D
Micropipette e punte sterilieppendorfJ48931Lhttps://www.eppendorf.com/hk-en/Products/Liquid-Handling/All-Pipettes-Dispensers-Automated-Liquid-Handlers/Eppendorf-Reference2-p-PF-222171
MicrotomiLeica, GermaniaRM2145N/D
MP (succinato sodico di metilprednisolone)Shyndec, Shanghai, CinaH20070007N/D
Spettrofotometro NanoDrop LiteThermo Fisher Scientific, USAnd-ndl-pr-2yrw-cccN/D
 Controllore di nebulizzazioneEmka, FranciaVENT4:14554N/D
Buste opache sigillateNanjing Kongdu printing Co., Ltd201701N/D
OVA (Grado II)Sigma, USAA5253N/D
OVA (Grado V)Sigma, USAA5503N/D
Kit PCRYeasen, Shanghai, Cina11201ES08N/D
Contenitore resistente alle punture per oggetti taglientiNanjing Xinyuan plastic Co., Ltd.KMT-15YN/D
Kit di trascrizione inversaBio.vazyme, Nanchino, CinaR323N/D
Centrifughe piccoleHettich, GermaniaMIKRO 220R D-78532N/D
Palline di cotone asciutte steriliZHENDE, Zhejiang, Cina202203121Bhttps://www.zhende.com/index.php?g=product&m=index&a=info&id=13
TrizolBio.vazyme, Nanchino, CinaR771N/D
Freezer per conservazione ultrafreddaThermo Fisher Scientific, USA950GP-ULTSN/D
Nebulizzatore ad ultrasuoniJiangsu Yuwell Medical Instruments Co., Ltd., Cina402AIN/D
Sistema PCR in tempo reale ViiATM7Life TechnologiesTM, Singapore278882021N/D
Pletismografo a corpo interoScrieq, Canada1185162,1184031,1185898FV-FXM1-01, cartuccia espiratoria FX1: FV-FXM1 ET, cartuccia inspiratoria FX1: FV-FXM1-IA

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