Generazione di substrati extracellulari in poliacrilammide e silicone con rigidità definita per applicazioni in biologia cellulare

Summary

Sebbene la rigidità della matrice extracellulare (ECM) sia un regolatore chiave del comportamento cellulare, i meccanismi di rilevamento e trasduzione sottostanti restano poco chiari. Per affrontare questo problema, forniamo protocolli per creare substrati a base di poliacrilammide e silicone con rigidità regolabile, per approfondire la nostra comprensione della diafonia cellula-ECM.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) è un regolatore critico del comportamento cellulare, con la rigidità dell'ECM che funge da segnale meccanico chiave che governa la segnalazione cellulare, la morfologia e il destino. Tuttavia, l'indagine sperimentale sulle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità è spesso limitata dalla disponibilità di piattaforme di coltura riproducibili, economicamente convenienti e accessibili con proprietà meccaniche precisamente sintonizzabili. Questo protocollo descrive metodi a base di poliacrilammide (PA) e silicone per la fabbricazione di substrati ECM con rigidità sintonizzabile. Le procedure delineano la preparazione del substrato, la funzionalizzazione della superficie e la coniugazione delle proteine ECM per garantire un'adesione cellulare coerente in un intervallo di rigidità fisiologicamente rilevante. I substrati basati su PA sono compatibili con saghi biochimici a valle, inclusi l'estrazione di proteine e RNA, nonché l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione. I substrati a base di silicone sono ottimizzati per la microscopia a fluorescenza interna totale (TIRF), permettendo la visualizzazione delle interazioni cellula-ECM alla membrana basale. Inoltre, i substrati molli possono essere adattati per supportare colture sferoidi posizionate all'interno di un piano di imaging coerente, facilitando così l'acquisizione di immagini coerenti. Questi metodi forniscono piattaforme robuste, economiche e riproducibili per indagare sistematicamente come la rigidità dell'ECM regoli i processi cellulari, promuovendo una comprensione meccanicistica del crosstalk cellula-ECM sia in contesti fisiologici che patologici.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) è un impalcatura strutturale e biochimica fondamentale che definisce le proprietà meccaniche dei tessuti e ne sostiene le funzioni biologiche. Ad esempio, i tessuti elastici come polmoni e arterie sono arricchiti con ECM a base di collagene ed elastina che fornisce la resilienza meccanica necessaria per cicli ripetuti di allungamento-rinculo durante la respirazione. Al contrario, il sistema nervoso centrale contiene ECM ricca di glicosaminoglicani che crea un ambiente altamente approssimativo ottimizzato per la differenziazione neuronale e la^{segnalazione 1}. In diversi tessuti del corpo, la rigidità tissutale si estende su diversi ordini di grandezza, che vanno da centinaia di pascal nei tessuti molli come cervello e polmoni a livelli di rigidità di megapascal e gigapascal nei tendini e nelle ossa,^{rispettivamente 2,3}. Queste differenze meccaniche non sono solo strutturali, ma svolgono anche un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento^{cellulare 4,5}. Ad esempio, le cellule staminali mesenchimali subiscono una specificazione di linea dipendente dalla rigidità, adottando destini neuronali su substrati molli, fati miogenici su substrati intermedi e fati osteogeni su substrati^{rigidi 6}. Alterazioni patologiche nella rigidità della ECM possono anche guidare risposte cellulari aberranti e contribuire all'inizio e alla progressione della^{malattia 7,8,9}. Allo stesso modo, i cambiamenti nelle proprietà ECM intorno alle cellule modificano anche la funzione degli organi e vari comportamenti^{cellulari 10,11}. Nonostante l'importanza riconosciuta della ECM nella guida della segnalazione, della funzione degli organi e della patogenesi delle malattie, i meccanismi che le cellule percepiscono e trasducono i segnali ECM in segnali biochimici rimangono incompletamente compresi.

I progressi nella comprensione della diafonia cellula-ECM sono stati in parte ostacolati dalla limitata disponibilità di piattaforme sperimentali che offrono un controllo preciso sulle proprietà dell'ECM, pur rimanendo pienamente compatibili con i processi biochimici standard e i flussi di lavoro di imaging. Inoltre, studiare le interazioni cellula-ECM è spesso percepito come tecnicamente impegnativo, poiché richiede competenze interdisciplinari che spaziano dalla scienza dei materiali, biologia cellulare e bioingegneria. Questo metodo mira ad affrontare queste sfide fornendo protocolli passo dopo passo per generare substrati ECM a base di PA e silicone con proprietà meccaniche definite, che possono essere facilmente preparati nella maggior parte degli ambienti di laboratorio umido.

Gli idrogel PA con rigidità sintonizzabile sono fondamentali della meccanobiologia; tuttavia, la loro utilità è spesso ostacolata dall'elevato costo dei reagenti per la coniugazione ECM, dalla funzionalizzazione superficiale incoerente e dalla scarsa compatibilità con flussi di lavoro biochimici su larga scala. Inoltre, approcci pratici e standardizzati per il prelievo e l'imaging dei campioni su substrati di rigidità variabile non sono ben consolidati. Questi colli di bottiglia possono essere affrontati utilizzando la nostra piattaforma PA in gel descritta, caratterizzata da quattro innovazioni chiave: (i) sostanziale riduzione dei costi, (ii) chimica della funzionalizzazione riproducibile, (iii) produzione scalabile tramite hardware riutilizzabile e (iv) integrazione senza soluzione di continuità con molti saggi convenzionali di biologia cellulare e biochimica. Questo approccio utilizza diversi rapporti di acrilammide e bisacrilammide per generare idrogel con proprietà meccaniche distinte (Tabella 1). I gel PA sono inerti e non si conjugano direttamente con le proteine ECM. Pertanto, viene utilizzata una reazione di polimerizzazione a radicali liberi iniziata dai raggi UV per coniugare una sottile rete reticolata di tetraacrilato di di(trimetilolopropano), estere di acido acrilico N-idrossisuccinimide (NHS-acrilato) e bisacrilammide sulla superficie dei gel PA (Figura 1). Questa rete crea una superficie adesiva a doppia azione per le proteine ECM: il NHS-acrilato fornisce un ancoraggio covalente stabile per le proteine ECM, mentre il tetraacrilato facilita un'adsorbimento uniforme delle proteine^{ECM 12}. Inoltre, forniamo metodi che dimostrano come raccogliere proteine e acidi nucleici come l'RNA da questi substrati in modo compatibile con analisi di biologia cellulare a valle come il western blotting e la reazione a catena della polimerasi quantitativa trascrizione inversa (RT-qPCR). Inoltre, i substrati PA risultanti supportano anche la formazione degli sferoidi e la posizione degli sferoidi all'interno di un piano focale coerente, consentendo un'analisi sistematica dei comportamenti cellulari^{3D 13}.

Al contrario, le limitazioni ottiche degli idrogel PA ne limitano l'uso nelle modalità di imaging avanzate, in particolare nella microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (^{TIRF) 14}. Per affrontare questo vincolo, abbiamo sviluppato substrati ECM a base di silicone meccanicamente sintonizzabili, ottimizzati per l'imaging TIRF. Questi materiali mostrano un indice di rifrazione strettamente simile al vetro, mantenendo però una rigidità sintonizzabile su un'ampia gamma (Figura 2A). Un sottile strato di gel di silicone, con rapporti di parti variabili, viene rivestita su un vetro di copertura prima della coniugazione ECM (Figura 2B e Tabella 2). Tuttavia, l'idrofobia intrinseca e l'inercità chimica del silicone escludono la coniugazione diretta con ECM. Implementiamo quindi una strategia di modifica della superficie per consentire l'attacco covalente dei liganti ECM. Il trattamento con plasma con ossigeno introduce gruppi idrossile sulla superficie del silicone (Figura 2C). Successivamente, il (3-aminopropil)trietossisilano (APTES) converte questi gruppi idrossile in ammina reattiva. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimide cloridrato (EDC), un crosslinker carbodiimide a lunghezza zero, facilita quindi la formazione di legami amidici covalenti tra i gruppi amminici sulla superficie del gel e i gruppi carbossili sulle proteine ECM.

Collettivamente, queste piattaforme ECM forniscono sistemi economici, riproducibili e scalabili per sondare meccanismi di segnalazione dipendenti dalla rigidità dell'ECM. La loro flessibilità consente un'integrazione fluida con saghi biochimici, imaging ad alta risoluzione e flussi di lavoro ad alta produttività, permettendo di indagare come la rigidità dell'ECM influenzi il comportamento cellulare e favorisca la progressione della malattia.

Protocol

1. Generazione di idrogel ECM basati su PA

1. Funzionalizzazione delle superfici di vetro per l'adesione del gel PA
   NOTA: Eseguire tutti i passaggi a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Risciacqua accuratamente con acqua di alta qualità tra un passaggio e l'altro.
   1. Pulisci le superfici del vetro con candeggina al 10% per 3 ore in una piastra resistente ai prodotti chimici (ad esempio, polistirene). Usa un volume sufficiente per coprire completamente il vetro e assicurati che non ci siano bolle intrappolate o aree secche.
      ATTENZIONE: La candeggina è una sostanza chimica altamente corrosiva e reattiva. Segui le istruzioni di sicurezza del produttore.
   2. Incubare le coperture in acido cloridrico (HCl) 0,2 M per 16 ore con una delicata agitazione su uno shaker.
      ATTENZIONE: L'HCl è altamente corrosivo e può causare ustioni cutanee. Indossa DPI adeguati.
   3. Aggiungi 0,1 M di NaOH e incuba per 1 ora.
      ATTENZIONE: Le soluzioni di NaOH sono corrosive e possono causare ustioni cutanee. Indossa DPI adeguati.
   4. Incubare le coperte in APTES allo 0,5% in acqua di alta qualità per 30 minuti.
      ATTENZIONE: APTES è tossico. Lavora con APTES in una cappa con DPI appropriati.
   5. Sciacquare le coperte con un grande volume d'acqua per rimuovere eventuali residui di APTES.
      NOTA: Un lavaggio incompleto causerà una reazione tra APTES e glutaraldeide nella fase successiva e porterà a precipitati bianchi che comprometteranno l'attivazione della superficie del vetro.
   6. Incubare le coperture in glutaraldeide allo 0,5% in PBS per 1 ora.
      ATTENZIONE: Il glutaraldeide è tossico. Lavora con glutaraldeide in una cappa con DPI appropriati.
   7. Asciuga le coperture su materiali assorbenti (ad esempio, carta assorbente) durante tutta la notte. Conserva le coperture in un contenitore pulito e sigillato fino all'uso.
2. Preparazione della soluzione idrogel di PA e colata in gel
   NOTA: Le formulazioni necessarie per ottenere idrogel con il modulo elastico specificato sono fornite nella Tabella 1. I volumi di gel raccomandati e le dimensioni del vetro per diverse applicazioni sperimentali sono presentati nella Tabella 3.
   1. Mescolare i componenti idrogel di PA in un tubo microcentrifuga da 1,7 mL, escludendo il persolfato di ammonio (APS) e la tetrametiletilendiamina (TEMED).
      NOTA: Non preparare grandi volumi perché i gel a maggiore rigidità polimerizzano rapidamente e possono indurirsi prima del completamento della colata.
   2. Degassare la miscela gel PA, i tubi APS e TEMED in una camera a vuoto a 25 mmHg per 30 minuti.
   3. Prepara le coperture superiori idrofobe applicando un rivestimento idrofugo sulle coperture pulite usando un cotton fioc. Assicurati che le coperture siano prive di macchie per mantenere una polimerizzazione costante del gel.
   4. Aggiungi APS e TEMED alla soluzione degassata, poi pipetta delicatamente la miscela sulle coperture attive.
   5. Posiziona le coperture idrofobiche sopra la soluzione per creare uno strato uniforme di idrogel sottile. Lascia polimerizzare i gel per 35 minuti a temperatura ambiente. Assicurati che non si intrappolino bolle tra le coperture e che la soluzione non si riversi oltre i bordi.
      NOTA: Segui i volumi raccomandati per il getto in gel per garantire lo spessore corretto; gel eccessivamente sottili permettono alle cellule di percepire il vetro^{sottostante 15}. Prima di smontare il sandwich gel, controlla la miscela residua nel tubo della microcentrifuga per confermare la polimerizzazione.
   6. Immergi il sandwich con idrogel in PBS per separare gli strati. Assicurati che l'idrogel rimanga attaccato al copertino inferiore attivato, e il copertino superiore idrofobo si stacca facilmente.
3. Funzionalizzazione degli idrogel con liganti ECM
   NOTA: Tutti i passaggi di questa sezione devono essere eseguiti in condizioni sterili all'interno di un armadietto di biosicurezza.
   1. Sterilizza gli idrogel immergendoli nel 70% di etanolo, poi trasferili in plastica per coltura tissutale con PBS sterile.
      NOTA: Non lasciare gli idrogel nell'etanolo per un periodo prolungato, poiché ciò disidraterebbe i gel e comprometterà la coniugazione ECM.
   2. Prepara una soluzione di funzionalizzazione del mix master composta da acqua, etanolo, HEPES e bisacrilammide (Tabella 4).
      ATTENZIONE: La bisacrilammide è tossica all'inalazione o all'ingestione.
   3. Prepara soluzioni diluite di fotoiniziatore UV e tetraacrilato. Entrambi i reagenti sono sciolti nell'etanolo (Tabella 4).
      NOTA: Eseguire diluizioni seriali di tetraacrilato ogni volta, poiché quantità eccessive possono portare a una sovrapolimerizzazione e a depositi neri visibili sulla superficie (vedi Figura 3A).
   4. Pesa la quantità richiesta di acrilato NHS usando una bilancia analitica. Sospendere l'acrilato NHS in 50% etanolo/50% acqua immediatamente prima dell'uso.
      NOTA: Una quantità eccessiva di acrilato NHS causerà la formazione di depositi superficiali neri visibili e può portare a un rivestimento ECM irregolare (Figura 3B).
   5. Aggiungere soluzioni di fotoinitiatore UV, tetraacrilato e NHS-acrilato al mix master preparato nello Passo 1.3.2. Aspira il PBS e aggiungi il mix master ai gel, assicurandoti che siano completamente coperti.
   6. Espone gli idrogel (senza coperchi per piastre di coltura tissutale) alla luce UV per 400 secondi (sorgente UV con lunghezza d'onda inferiore a 365 nm).
      ATTENZIONE: Indossa una protezione oculare adeguata quando lavori con la luce UV.
   7. Rimuovi i gel e mettili sul ghiaccio. Aspirare la soluzione di funzionalizzazione, poi lavare i gel tre volte con HEPES sterile preraffreddato da 25 mM (pH 6,0), seguito da tre lavaggi con NaCl sterile preraffreddato allo 0,9%.
   8. Incubare gli idrogel con il ligando ECM preferito in un HEPES sterile preraffreddato di 100 mM (pH 8.0) con 100 mM di NaCl durante la notte a 4 °C su uno shaker orbitale.
      NOTA: La concentrazione di liganti ECM può essere selezionata a discrezione dell'utente; tuttavia, è fondamentale mantenere concentrazioni identiche di liganti su tutti i substrati di rigidità variabile all'interno dello stesso lotto.
   9. Aspirare con attenzione la soluzione del ligando ECM 16 ore dopo. Lava gli idrogel tre volte con PBS e aggiungi substrati base senza siero (o PBS) per mantenerli idratati. Incubare i gel durante la notte in un incubatore di colture tissutali per verificare la sterilità prima della semina cellulare.
      NOTA: Il substrato apparirà torbido dopo l'incubazione notturna a 37 °C nel substrato di coltura di base se è presente contaminazione.
   10. Usa subito i gel per la semina delle cellule o conservali a 4 °C nel substrato base per non più di 3 settimane.

2. Generazione di substrati ECM a base di silicone meccanicamente regolabili

1. Preparazione di coperture in vetro per rivestimento al gel di silicone
   1. Pulire i copriversi in vetro con 3 M NaOH per 20 minuti.
   2. Lava accuratamente con acqua di alta qualità cinque volte e aspira l'acqua alla fine. Lasciali asciugare all'aria e usa un getto d'aria di azoto per rimuovere eventuali gocce o detriti residui.
2. Preparazione del gel di silicone
   1. Pesare la componente A e la componente B dell'elastomero di silicone a due componenti secondo il rapporto di peso specificato nella Tabella 2, utilizzando una bilancia analitica. Usa una punta di pipetta tagliata per aspirare le soluzioni viscose.
   2. Mescola accuratamente il Componente A e il Componente B usando una punta di pipetta per garantire l'incorporazione completa.
   3. Degassare la miscela in una camera a vuoto a 25 mmHg per 10 minuti.
3. Colaggio del gel su voglietti di vetro
   1. Posiziona un copertino su un tappetino di gomma posizionato sul coater centrifugo, assicurandoti che sia ben centrato.
      NOTA: Il tappetino in gomma garantisce una corretta sigillatura sottovuoto. Senza una guarnizione adeguata, il sottoveste può essere spostato e rompersi. Un centraggio improprio può causare un rivestimento non uniforme.
   2. Attiva l'aspirapolvere per fissare il copricapo.
   3. Aggiungi 100 μL della miscela gel al centro della copertura. Spina a 500 giri/min per 10 secondi, seguito da 8.000 giri/min per 60 secondi.
   4. Cuocere il copertura rivestito a 80 °C per 2 ore. Lascialo raffreddare a temperatura ambiente.
      NOTA: Conserva a temperatura ambiente fino a un mese prima dell'uso.
4. Funzionalizzazione del gel di silicone con liganti ECM
   1. Esponi le coperture rivestite di silicone al plasma di ossigeno per 5 minuti a 11 W di potenza.
      NOTA: L'esposizione al plasma di ossigeno per un periodo più lungo o con una potenza superiore può causare crepe nei gel. La combinazione ottimale di potenza e tempo potrebbe essere necessaria a seconda dell'attrezzatura utilizzata.
   2. Prepara una soluzione di silanizzazione contenente 95% etanolo, 0,5% APTES e 4,5%_{dH 2O}.
      NOTA: Eseguire tutti i passaggi successivi in condizioni sterili all'interno di un armadietto di biosicurezza.
      ATTENZIONE: APTES è tossico. Lavora con APTES in una cappa con DPI appropriati.
   3. Incubare il coperto rivestito di gel con la soluzione di silanizzazione per 10 minuti.
   4. Lava accuratamente con PBS cinque volte.
   5. Preparare la soluzione ECM contenente 100 μg/mL EDC e la ECM scelta alla concentrazione desiderata in PBS.
      NOTA: L'EDC è instabile in soluzione e sensibile all'umidità. Preparatelo fresco prima dell'uso e conservalo ben chiuso in un luogo fresco e asciutto, protetto dall'umidità e dalla luce solare diretta.
      ATTENZIONE: L'EDC è dannoso se ingerito e tossico se inalato. Indossa DPI appropriati e lavora in una cappa a pompa.
   6. Incubare il coperto con la soluzione ECM per 1 ora a 37 °C o durante la notte a 4 °C.
   7. Lava il foglio con PBS cinque volte. Sciacquacqua con substrato base e aggiungi le cellule.
      NOTA: La densità cellulare ottimale dipende dalla linea cellulare specifica e dagli obiettivi sperimentali (ad esempio, subconfluente per morfologia o monostrato per l'adesione cellula-cellula). Ad esempio, una densità di 0,1 x 10⁶ cellule/cm² è comunemente usata per i fibroblasti per raggiungere una confluenza del 50% entro 48 ore.

3. Preparazione del substrato ECM per immunocolorazione e imaging

1. Immunocolorazione e imaging su substrati basati su PA
   NOTA: Gli idrogel PA da diciotto millimetri generalmente forniscono un'area sufficiente per l'analisi quantitativa. Per applicazioni di imaging, si fondono gli idrogel ed eseguite l'immunocolorazione in "camere arancioni" preparate da tubi da 15 mL. Riutilizzare le camere arancioni per più cicli di gettamento e tintura in gel, a condizione che mantenga l'integrità strutturale.
   1. Anelli perforatori in film policarbonato e film di gomma siliconica utilizzando perforatori di 18 mm di diametro esterno e 14 mm di foro interno per preparare distanziatori e guarnizioni.
   2. Taglia un'apertura al centro di un tappo di tubo centrifuga da 15 mL usando forbici per creare una camera per la fusione e la colorazione con gel.
   3. Ho visto il tubo della centrifuga al limite dei 14 mL. Taglia i bordi irregolari con un bisturi e lima il bordo del tappo per assicurarti che entri in una piastra standard a 12 pozzi.
   4. Assemblare il panino copertura idrogel (come descritto nella Sezione 1), posizionando l'anello distanziatore sulla copertura attivata.
   5. Smonta il panino una volta che i gel sono completamente polimerizzati.
   6. Sterilizza gli idrogel da 18 mm e trasferili su una piastra di coltura tissutale a 12 pozzi con PBS sterile.
   7. Eseguire la funzionalizzazione del ligando ECM come descritto nella sezione 1.
   8. Fissa le cellule dei semi e fissale con il 4% di formaldeide.
      NOTA: Evita i fissativi a base di alcol, poiché disidratano i gel e compromettono l'integrità strutturale.
      ATTENZIONE: Il formaldeide è tossico e deve sempre essere usato all'interno di una cappa di pompa.
   9. (Opzionale) Riassemblare i campioni sulla camera del tappo del tubo centrifuga. Usa una guarnizione in silicone per sigillare la camera.
      NOTA: Esegui un test di perdita con PBS per diverse ore prima di macchiare. Sebbene questo metodo possa sembrare più laborioso, favorisce una colorazione uniforme e riduce il consumo di anticorpi.
   10. Procedere con la colorazione immunofluorescenza secondo i protocolli preferiti dall'utente.
   11. Dopo la colorazione, conservare i campioni in PBS integrati con glicerolo al 50%. Visualizza i campioni il prima possibile.
       NOTA: Evita i mezzi di montaggio standard che si induriscano, poiché possono rompere gli idrogel col tempo e danneggiare i campioni. L'intensità della fluorescenza diminuisce nel tempo; Immagine entro 1 settimana per una qualità ottimale del segnale.
   12. Posiziona una piccola goccia di PBS (o mezzo di montaggio) sulla superficie del fondo di vetro di un piatto di coltura tissutale. Inverti con cura gli idrogel colorati sulla goccia in modo che le cellule siano rivolte verso il vetro di copertura e procedi con l'immagini.
2. Immunocolorazione e imaging su substrati ECM a base di silicone
   1. Fissare i campioni usando formaldeide al 4% e colorarli direttamente su una piastra con fondo di vetro seguendo un protocollo standard di immunofluorescenza. Evita i fissativi a base di alcol perché creperebbero i substrati dell'ECM.
   2. Campioni direttamente utilizzando un microscopio a fluorescenza tradizionale.

4. Raccolta di proteine e RNA da cellule placcate su substrati ECM

1. Utilizzando le pinze, rimuovi con cura i gel dalla vaschetta di coltura e immergili in PBS sterile per risciacquare via residui di substrato e siero.
   NOTA: Maneggiare delicatamente le coperture, poiché sono estremamente fragili e possono rompersi facilmente.
2. Tampona delicatamente il bordo dell'idrogel con salviette a basso contenuto per rimuovere l'eccesso di PBS.
3. Aggiungere un volume appropriato di buffer di estrazione RNA al coperchio di una ciotola di coltura tissutale.
   NOTA: I reagenti a base di fenolo-guanidina sono compatibili con l'estrazione di RNA da gel PA. I tamponi per la lisi proteica possono essere utilizzati in base ai requisiti sperimentali. Visualizza i campioni al microscopio dopo l'incubazione del tampone di lisi per garantire una completa interruzione cellulare.
4. Applica il coperto (lato gel verso il basso) sulla soluzione di lisi. Solleva e abbassa con attenzione l'idrogel più volte per garantire una lisi uniforme di tutte le cellule.
5. Raschia delicatamente la superficie del gel per rilasciare il lisato.
   NOTA: Non utilizzare raschietti a celle di plastica commerciali, poiché la plastica rigida potrebbe danneggiare gli idrogel molli e contaminare il lisato con pezzi di gel. La plastica morbida utilizzata per realizzare distanziatori (vedi Passaggio 3.1.1) è adatta a questo scopo e può essere riutilizzata per realizzare raschietti personalizzati.
6. Conservare l'RNA o i lisati proteici a -80 °C fino a ulteriori processi con metodi biochimici convenzionali o utilizzarli immediatamente.

5. Generazione della cultura sferoide a piano singolo

1. Preparare l'idrogel PA a 75 Pa su coperture da 18 mm e funzionalizzare la superficie con estratto di membrana basale (BME) o un altro ligando ECM appropriato per facilitare l'attacco cellulare.
2. Inserire le cellule di seme sugli idrogel o gel di silicone rivestiti in ECM alla densità desiderata.
3. Dopo 2 ore, rimuovere delicatamente le cellule non attaccate e aggiungere una sovrapposizione BME diluita in mezzo basale preraffreddato.
   NOTA: BME polimerizza mentre si riscalda. Punte per preraffreddare prima di pipettere. La percentuale di BME incorporata è determinata dall'integrità meccanica desiderata e dalla stabilità dell'impalcatura 3D risultante.
4. Incubare le colture a 37 °C in un incubatore di colture tissutali per 1,5 ore per consentire la polimerizzazione BME.
5. Aggiungi delicatamente il mezzo di coltura cellulare per coprire completamente i gel 3D.
6. Mantenere le colture in condizioni standard. Le cellule continueranno a crescere e a auto-assemblarsi in sferoidi 3D nel tempo fino a raggiungere il punto di riferimento sperimentale desiderato.

Results

La rigidità del gel PA generata utilizzando le formulazioni della Tabella 1 è stata testata sperimentalmente con un reometro. Sono stati selezionati gel con valori nominali di rigidità di 0,4 kPa, 6 kPa e 60 kPa, che coprono tre ordini di grandezza. I valori di rigidità misurati erano 363 ± 76 Pa per gel da 400 Pa, 6,41 ± 0,50 kPa per gel da 6 kPa e 36 ± 8 kPa per gel da 60 kPa (Figura 4A). Per valutare l'adesione uniforme dell'ECM ai gel PA, la fibronec...

Discussion

Il protocollo di fabbricazione ECM descritto fornisce un flusso di lavoro riproducibile, scalabile ed economico ed è facilmente implementabile nella maggior parte dei laboratori. Sebbene le ceramiche tradizionali in vetro e plastica siano comode e permettano una rapida raccolta dei dati, i substrati sintetici non riescono a replicare la rigidità tissutale fisiologicamente rilevante. Substrati alternativi meccanicamente regolabili come il polidimetilsilossano (PDMS) o il gelatina metacril...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethossisilane (APTES)	919-30-2	-	Thermo Fisher Scientific
Tubi per microcentrifuga da 1,7 mL	-	LMCT1.7B	FroggaBio
Piatti per coltura tissutale trattati, 12 pozzetti	-	83.3921	Sarstedt
Tubi per centrifuga da 15 mL (per camera arancione)	-	CLS430790	Corning
2-Idrossi-4′-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone (Irgacure)	106797-53-9	-	Thermo Fisher Scientific
Soluzione di bisacrilammide al 2%	110-26-9	-	Bio-Rad
3-(3-Dimetilaminopropil)-1-etilcarbodiimmide cloridrato (EDC)	25952-53-8	-	Chem Impex International
4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato	28718-90-3	-	Sigma
4′,6-Diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI)	-	D1306	Invitrogen
Soluzione di acrilammide al 40%	01/06/1979	-	Bio-Rad
Glutaraldeide al 50%	111-30-8	-	Thermo Fisher Scientific
Piatti per coltura tissutale trattati, 6 cm	-	83.3901	Sarstedt
Cellule A549	-	CCL-185	ATCC
Estere dell'acido acrilico con N-idrossisuccinimide	38862-24-7	-	Thermo Fisher Scientific
Anticorpo anti-coniglio Alexa Fluor 488	-	A11008	Invitrogen
Ester di NHS di Alexa Fluor 594 (tris(sale di trietilamminio))	-	A37572	Invitrogen
Persolfato di ammonio	7727-54-0	-	Bio-Rad
Film di policarbonato resistente agli impatti (0,005 pollici; distanziatore)	-	85585K72	McMaster-Carr
Gel di silicone CY 52-276, componenti A e B	2624028	-	Dow
Medium di Dulbecco modificato di Eagle (DMEM)	-	11995-065	Thermo Fisher Scientific
Etanolo anidro	64-17-5	-	Greenfield Canada
Fast SYBR Green Master Mix	-	4385612	Thermo Fisher Scientific
Siero fetale bovino	-	A52567-01	Thermo Fisher Scientific
Fibronectina	-	356008	Corning
Formaldeide (16%)	-	28908	Thermo Fisher Scientific
HEPES	7365-45-9	-	BioShop
Foglio di gomma siliconica ad alta temperatura (0,020 pollici; guarnizione)	-	86435K452	McMaster-Carr
Acido cloridrico	7647-01-0	-	BioShop
Set di punzonatrici per fori cavi grandi	-	66000	Mayhew Pro
Matrigel	-	356234	Corning
Flacone di vetro borosilicato per conservazione dei media, 250 mL	-	CLS1395250	Corning
Flacone di vetro borosilicato per conservazione dei media, 500 mL	-	CLS1395500	Corning
Piastra di reazione MicroAmp Fast Optical a 96 pozzetti	-	4346906	Thermo Fisher Scientific
Copriportaoggetti per vetrini di microscopio, diametro 18 mm	-	72222-01	Electron Microscopy Sciences
Copriportaoggetti per vetrini di microscopio, diametro 50 mm	-	1.84E+16	eBay
PBS (1x)	-	14190144	Thermo Fisher Scientific
PBS (10x)	-	70011044	Thermo Fisher Scientific
Phalloidina	17466-45-4	-	Biotium
Anticorpo anti-FAK (Tyr397) fosforilato	-	85567	Cell Signaling Technology
Anticorpo anti-MLC (Ser19) fosforilato	-	3671	Cell Signaling Technology
Pulitore al plasma	-	PDC-32G	Harrick Plasma
Primers per qPCR (diretto e inverso)	-	N/A	Integrated DNA Technologies
Kit di sintesi cDNA qScript	-	95047	QuantaBio
Rain-X	-	-	Rain-X
Tubi a vite, base conica, 15 mL	-	62.554.101	Sarstedt
Tubi a vite, base conica, 50 mL	-	62.547.205	Sarstedt
Pipetta serologica, 10 mL	-	170356N	Thermo Fisher Scientific
Pipetta serologica, 25 mL	-	170357N	Thermo Fisher Scientific
Pipetta serologica, 5 mL	-	170355N	Thermo Fisher Scientific
Pipetta serologica, 50 mL	-	170358N	Thermo Fisher Scientific
Idrossido di sodio	1310-73-2	-	BioShop
Colorante per gel proteico SYPRO Ruby	-	S12000	Invitrogen
TEMED	110-18-9	-	Bio-Rad
Reagente TRIzol	-	15596026	Thermo Fisher Scientific
Camera UV	-	165-5031	Bio-Rad