Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Summary

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Abstract

I bilayer di interfaccia a gocce (DIB) offrono una piattaforma sintonizzabile per sondare le proprietà elettromeccaniche delle membrane lipidiche e lipidi-peptidiche sotto stimolazione elettrica controllata. I DIB consentono sia misurazioni di conduttanza ionica a canale singolo che a ensemble su aree a membrana ordini di grandezza maggiori rispetto a quelle accessibili con le tecniche tradizionali di patch clamp, consentendo così analisi a livello di membrana della deformazione elettromeccanica e della sua influenza sui peptidi conduttori di ioni. Regolando sistematicamente la struttura della membrana attraverso la fase oleosa idrocarburica in blocco (ad esempio, esadecano [C16] vs. dodecano/esadecano [C12/C16] [25%/75%, v/v]), questa piattaforma bottom-up consente una variazione sistematica della composizione della membrana e dell'ambiente oleoso, che influenzano la viscoelasticità e la riorganizzazione strutturale della membrana, e quindi la conduzione degli ioni peptidici. Sono fornite procedure dettagliate per l'assemblaggio di membrane DPhPC, dotate con gramicidina A-dopata 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina utilizzando diverse composizioni di olio idrocarburico e per l'applicazione di protocolli a impulsi di tensione che spingono le membrane in stati elettromeccanici metastabili. La conduzione ionica a membrana adattativa è caratterizzata, includendo risposte a breve termine simili alla plasticità (simili a STP) e a lungo termine simili a potenziazione e depressione (simili a LTP/simili a LTD) in un sistema a membrana modello. Più in generale, questo protocollo fornisce un approccio robusto e riproducibile per indagare sistematicamente i contributi elettromeccanici a livello di membrana dipendenti dalla composizione al comportamento conduttivo simile a sinattico e per comprendere come gli ambienti delle membrane lipidiche modulino la funzione dei canali ionici.

Introduction

Le membrane biologiche sono strutture supramolecolari critiche che possono regolare la conduzione ionica e consentire la comunicazione tra neuroni tramite sinapsi elettriche e ^chimiche 1,2,3,4.Questo tipo di comunicazione è ulteriormente controllato dalla plasticità sinaptica, dove i cambiamenti strutturali delle sinapsi ne modulano la forza e la persistenza su un intervallo di scale^{temporali 5,6}, comunemente descritte in termini di plasticità a breve termine (STP) e potenziazione o depressione a lungo termine (LTP o LTD). Questi fenomeni, che comportano cambiamenti dinamici nella conduttanza della membrana in risposta all'attività neurale, sono spesso accoppiati alla neuroplasticità⁷, che sta alla base dell'apprendimento e della^{memoria 8}. I modelli tradizionali di plasticità spesso enfatizzano la regolazione biochimica dei canali ionici tramite sintesi, traffico proteico o^{fosforilazione 9}. Tuttavia, il ruolo delle membrane plasmatiche neuronali nei modelli di plasticità è, per la maggior parte,^{trascurato 10,11}.

I metodi patch-clamp sono stati utilizzati da oltre mezzo secolo per studiare l'elettrofisiologia a canale ionico singolo. Tuttavia, possono esaminare solo aree di membrana molto più piccole rispetto alle sinapsi intatte o ai modelli sintetici su larga scala. Di conseguenza, rappresentano un limite tecnico per lo studio della riorganizzazione e della deformazione delle membrane mesoscale. La mesoscala è sempre più riconosciuta come una scala critica di lunghezza per comprendere molti aspetti della biofisica delle membrane^12,13.

Viene presentata una metodologia per l'uso di bilayer di interfaccia a gocce (DPhPC) 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DIBs⁾ dopati con l'ionofero monovalente peptidico cationico, gramicidina-A (gA), per modellare la conduzione ionica, non dissimile da quanto avviene in una sinapsi elettrica. Questo sistema offre diversi vantaggi chiave: (i) i DIB forniscono una piattaforma lipidica e oleosa sintonizzabile che consente una riorganizzazione sistematica della^{membrana 16}; (ii) I DIB permettono lo studio di eventi a canale singolo e ensemble su una gamma di scale di lunghezza ^17,18; e (iii) i DIB permettono l'interrogazione di patch di membrana di dimensione^{submillimetrica 2} che catturano la ristrutturazione collettiva della membrana indotta elettromeccanicamente, preservando la capacità di risolvere eventi di conduzione ionica a canale^{singolo 19,20}. Questo metodo è più adatto per studi che richiedono un'interrogazione simultanea elettrica e ottica dell'elettromeccanica delle membrane su aree di membrana più grandi rispetto a quelle accessibili con il patch clamp convenzionale, pur mantenendo la capacità di risolvere eventi di canale discreti. È particolarmente utile quando l'obiettivo sperimentale è esaminare come la composizione delle membrane, l'ambiente petrolifero e le forme d'onda di tensione imposte influenzino la ristrutturazione collettiva delle membrane e la conduzione peptidica. Il metodo è meno adatto per esperimenti che richiedono architettura cellulare nativa o letture molecolari dirette dei cambiamenti conformazionali proteici in membrane biologiche^intatte 19,20,21.

Applicando stimolazioni elettriche fisiologicamente rilevanti, i DIB vengono spinti in stati stazionari fuori equilibrio in cui la ristrutturazione elettromeccanica dinamica altera la conduzione dei canali ionici peptidici. Questi cambiamenti emergenti nella conduzione ionica sono descrittivamente analoghi ai fenomeni neurologici STP, LTP e LTD discussi in^neuroscienze 22,23,24. Nel presente studio, questi comportamenti sono interpretati principalmente come risposte fisiche a livello di membrana alla stimolazione elettrica associate a proprietà meccaniche intrinseche della membrana, come viscoelasticità e comprimibilità in un sistema modello^{di membrana 25}. In particolare, lo studio descritto qui si basa su prove precedenti che i bilayer lipidici possono mostrare memoria elettrica fondamentale attraverso persistenti spostamenti di conduttanza e accumulo di carica capacitiva dopo^stimolazioni 14,15,25,26,27,28,29,30,31,32,33^{, 34}, offrendo nuove intuizioni sui meccanismi attraverso cui i bilayer lipidici possono sostenere una funzionalità adattiva simile a quella sinaptica in assenza di meccanismi cellulari complessi. Infine, questa metodologia consente anche l'esame diretto delle relazioni struttura-funzione e di come il comportamento macroscalare emergente derivi da una semplice riorganizzazione^strutturale 21,25,27.

Protocol

Pulire accuratamente tutto il vetro e le attrezzature preparatorie con i detergenti da laboratorio appropriati e risciacquare con acqua distillata prima della preparazione del campione. Indossa sempre occhiali di sicurezza e guanti in nitrile o lattice per evitare contaminazioni. Smaltire tutti i rifiuti chimici secondo le linee guida di sicurezza istituzionali. Assicurarsi che i solventi volatili siano conservati correttamente in conformità con le linee guida di sicurezza istituzionali. Assicurarsi che lo spazio e l'hardware del laboratorio di sperimentazione (Figura 1A), il recipiente di sperimentazione (Figura 1B) e le connessioni elettriche e ottiche (Figura 1C) rimangano liberi e senza ostacoli.

1. Preparazione di una soluzione acquosa tampone

1. Pesare la quantità appropriata di acido propanesulfonico 3-(N-morfolino) (MOPS) e cloruro di potassio (KCl) per ottenere le concentrazioni finali desiderate (ad esempio, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl in 500 mL).
2. Aggiungere il MOPS e il KCl a ~450 mL di acqua distillata in una fiaschetta volumetrica da 500 mL o in un cilindro graduato e mescolare con una barra magnetica fino a disciolto.
3. Misura il pH con un misuratore calibrato. Regola il pH a 7,4 aggiungendo 1 M di idrossido di potassio (KOH) o acido cloridrico (HCl) in incrementi di 0,25 mL mentre si mescola continuamente.
4. Portate il volume totale a 500 mL con acqua distillata e mescolate accuratamente. Trasferisci il buffer su una bottiglia pulita e etichettata, sigilla e conserva a 4 °C.
   NOTA: Usa il buffer fino a ~2 mesi. Verifica e regola nuovamente il pH a 7,4 prima di ogni utilizzo.

2. Preparazione della soluzione di stock di gramicidina

1. In una cappa chimica, aggiungi 5 mg di gramicidina A (gA) a una fiala di vetro pulita da 20 mL. Aggiungi 10 mL di metanolo usando una siringa a tenuta di vetro o a tenuta di gas e vortice finché il peptide non si scioglie completamente. Etichetta la fiala come "gA stock" e conserva a -80 °C.
   NOTA: Gli esperimenti di ensemble utilizzano rapporti molari lipidi: peptidici di ~1:^10-4. Gli esperimenti a canale singolo utilizzano peptidi ~10–100 volte inferiori (1:^10-5–^10-6) per risolvere eventi individuali in tempi di registrazione brevi (<1 minuto). La preparazione di un calcio diluito migliora la precisione del pipetto a bassi rapporti molari (< ~ 1:^10-4).
2. Purificare due fiale di vetro pulite aggiuntive da 20 mL con gas argon per ~5 secondi ciascuna per rimuovere la polvere.
3. Utilizzando una siringa pulita e ermetica, eroga 9,9 mL di metanolo in ogni fiala purgata.
4. Pipetta 100 μL della soluzione di gA con una siringa sterile a tenuta di gas in una sola fiala per ottenere un volume totale di 10,0 mL. Etichetta questa fiala come "A". Concentrazione = 2,66 μM gA nel metanolo.
5. Pipettare 100 μL di soluzione "A" nella seconda fiala di vetro per ottenere un volume totale di 10,0 mL. Etichetta questa fiala come soluzione "B". Concentrazione = 26,6 nM gA nel metanolo.
6. Sigilla le fiale con tappi e avvolgi con parafilm.
7. Conserva tutte le soluzioni di gA a -80 °C fino all'uso.

3. Preparazione di vescicole lipidi-peptidiche

1. Purifica una fiala di vetro pulita da 20 mL con gas argon per ~5 secondi.
2. Aggiungere 4 mg di lipide 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) lipide al fialo.
3. In una cappa fumante, aggiungi 1 mL di metanolo usando una pipetta di vetro. Vortice o vortice delicato finché tutti i lipidi non si sciolgono.
4. Utilizzando una siringa ermetica ai gas da 500 μL, aggiungere 178 μL di soluzione "A" (per esperimenti STP a livello di ensemble; Rapporto molare DPhPC:gA = 1:^10-4) oppure 890 μL di soluzione "B" (per esperimenti a canale singolo; Rapporto molare DPhPC:gA = 1:5×^10-6) nella soluzione metanolica DPhPC. Vortice delicato per mescolare.
5. Sotto un delicato flusso di argon nella cappa fumaria, si fa evaporare il metanolo finché non si forma una sottile e uniforme pellicola lipidica sul fondo della fiala.
6. Posiziona la fiala aperta in un forno a vuoto a 40 °C e tira un aspirapolvere completo per 10–12 ore o per tutta la notte per rimuovere il solvente residuo.
7. Rimuovere la fiala dal forno a vuoto e aggiungere 2 mL del tampone KCl da 0,1 M preparato nella Sezione 1 per gli esperimenti STP, ottenendo una concentrazione finale di lipidi e gramicidina in sospensione rispettivamente di 2,36 mM e 236 nM. Per esperimenti a canale singolo, aggiungere 2 mL di un buffer KCl da 1 M come preparato nella Sezione 1. Vortice per reidratare il film lipidico e ottenere una sospensione lipidica di 2 mg/mL, risultando in una concentrazione finale di lipidi e gramicidina in sospensione rispettivamente di 2,36 mM e 11,8 nM.
8. Congela la fiala a -80 °C per almeno 6 minuti, poi scongelala su una piastra calda a 40 °C o a bagno d'acqua per 6 minuti. Vortice per un breve periodo di miscelazione. Ripeti questo ciclo di congelamento-disgelo sei volte per favorire la formazione di vescicole multilamellari.
9. Assemblare un estrusore a vescicole lipidiche con una membrana incisa a binari di 0,1 μm di diametro seguendo le istruzioni del produttore. Far passare 500 μL di buffer attraverso l'estrusore 3 volte per idratare la membrana, verificare che non ci siano perdite e scartare il buffer.
10. Carica 1 mL della sospensione lipidi-peptidica scongelata nell'estrusore ed esegui 31 passaggi attraverso la membrana da 0,1 μm per ottenere vescicole unilamelari di diametro ~100 nm e garantire l'omogeneità delle dimensioni.
11. Trasferire le vescicole estruse (Vescicole unilamelari grandi, LUV) in un tubo PCR da 1 mL, etichettare e conservare a 4 °C. Da usare entro 2 settimane dalla preparazione.
12. Sigillare eventuali sospensioni lipidi-proteiche residue non estruse nella fiala originale, avvolgere con parafilm e conservare a -80 °C per un uso successivo.
13. Se si utilizzano campioni già congelati e non estrusi, rifondi a 40 °C usando una piastra riscaldante oppure lascia che il campione si scaldi alla temperatura ambiente, poi estrusca il campione.

4. Preparazione del gel di agarosio

1. Metti un becher di vetro pulito da 50 mL su una piastra riscaldante. Aggiungi una compressa di agarosio a 50 mL dello stesso tampone usato per idratare la pellicola lipidica (ad esempio, 10 mM MOPS, 0,1 M KCl, pH 7,4) per formare una soluzione di gel di agarosio all'1%.
2. Aggiungi una barra di mescolare in Teflon pulita e mescola energicamente finché la compressa non si disperde.
3. Copri il becher con carta stagnola e fora un piccolo foro di ventilazione con una spatola metallica. Imposta la temperatura della piastra riscaldante a 220–230 °C. La soluzione diventerà trasparente e raggiungerà una bollizione rotolata, indicando la completa dissoluzione dell'agarosio.
4. Spegni il fuoco e rimuovi con attenzione la stagnola. Scorre qualsiasi pellicola superficiale con una spatola metallica pulita. Usa subito la soluzione di agarosio calda per il rivestimento degli elettrodi oppure lasciala raffreddare e solidificarsi nel vaso per un uso successivo.
5. Dopo il rivestimento dell'agarosio con elettrodo, coprire l'agarosio solidificato con un foglio, sigillare con parafilm, etichettare e conservare a 4 °C. Quando necessario, riscalda fino a ebollizione mescolando fino a quando non si rifonde completamente.

5. Preparazione degli elettrodi

1. Tagliare fili d'argento di 0,125 mm di diametro in lunghezze di ~70 mm per gli elettrodi di testa e lunghezze di ~130 mm per gli elettrodi di massa.
2. Utilizzando una fiamma aperta (ad esempio, accendino portatile o bruciatore Bunsen), tieni un'estremità di ciascun filo d'argento orizzontalmente nel cono centrale più caldo della fiamma finché la punta non si scioglie e forma una sfera sferica di diametro ~0,2 mm (Figura 2A).
3. Posiziona i fili su una superficie pulita e verifica al microscopio che le palline siano sferiche e di dimensioni simili. Se una palla è oblunga o irregolare, taglia la punta e ripeti la fusione (Passo 5.2).
4. Metti le estremità di entrambi i fili d'argento in un contenitore di vetro con candeggina fresca per la casa (ipoclorito di sodio, NaClO). Assicurati che le palline siano completamente sommerse e incubino per almeno 1 ora per clorare la superficie e formare Ag/AgCl. Un aspetto marrone-grigio opaco conferma una clorazione riuscita (Figura 2B).
5. Rimuovi i fili dalla candeggina una volta che le estremità della palla sono di colore grigio opaco, risciacqua accuratamente con acqua distillata e adagia su una superficie pulita e priva di lanuggini per asciugarli.
6. Procurarsi un portapipete a testa e un portaelettrodo a terra. Taglia a metà un capillare di vetro borosilicato da 100 mm (1,0 mm di diametro diametrale, 0,58 mm diametro diametrale) utilizzando un tagliavetro.
7. Inserisci un semicapillare nel portapipete di headstage e stringi il porta-pipette per fissarlo. Monta un capillare completo da 100 mm sul portaelettrodo a terra e fissalo.
8. Inserire l'estremità non sferica del filo d'argento da 130 mm nel capillare dell'elettrodo di massa finché non sporgono ~20 mm dell'estremità a sfera. Attacca l'estremità opposta del filo al supporto, lasciando ~5 mm esposto per la connessione a terra.
9. Ripeti il passo successivo con un filo da 70 mm per l'elettrodo headstage, assicurando un contatto saldo tra il filo e il connettore headstage (pezzo dorato). Taglia eventuali fili in eccesso dall'estremità del connettore headstage.
10. Immergi ogni sfera d'argento clorata nell'agarosio, appena sopra la giunzione sfera-fusto, per formare un rivestimento sottile e uniforme. Entra e esce almeno 10 volte.
11. Ritira l'elettrodo e lascia che l'agarosio gelifici a temperatura ambiente. Ripeti l'immersione se necessario per ottenere un guscio liscio e uniforme di agarosio, spesso decine di micrometri. Evita di applicare un rivestimento troppo alto o troppo basso sul filo (Figura 2C).
12. Monta gli elettrodi di testa e terra su micromanipolatori. Collega il filo di massa esposto (~5 mm) alla massa dell'amplificatore usando una clip a alligatore.
13. Con una pinzetta, piega delicatamente ogni elettrodo a metà strada tra l'estremità a sfera e il capillare, in modo che l'estremità a sfera sia perpendicolare allo stadio del microscopio. Evitare curve superiori a 90° per minimizzare la distorsione ottica nelle visuali e video del microscopio.
14. Regolare l'orientamento degli elettrodi nei loro supporti in modo che le estremità a sfera rivestite di agarosio siano perpendicolari al piano di imaging del microscopio (Figura 3A).

6. Formazione di bilayer di interfaccia a gocce (DIB)

1. Posiziona una piastra di Petri pulita e trasparente sul palco di un microscopio rovesciato. Riempi la ciotola con olio di alcano (ad esempio, 100% esadecano, o 25%/75% v/v dodecano/esadecano) fino a una profondità di ~ 5 mm (Figura 1B).
2. Utilizzando i controlli del micromanipolatore, abbassare entrambe le estremità della sfera rivestite di agarosio nell'olio fino a una profondità di ~2,5 mm sotto la superficie dell'olio. Evitare movimenti rapidi con il micromanipolatore per evitare collisioni tra la testa sferica e l'elettrodo con la piastra di Petri.
3. Regola la messa a fuoco del microscopio finché entrambe le estremità della sfera e i loro rivestimenti in agarosio sono nitidamente a fuoco. Posiziona gli elettrodi vicino al bordo del campo visivo in modo che entrambi possano essere osservati simultaneamente.
4. Utilizzando una pipetta calibrata da 2 μL, aspirare la sospensione estrusa della vescicola lipidica peptidica. Distribuire lentamente 250 nL della sospensione direttamente su ciascuna estremità sferica rivestita di agarosio usando una punta separata per ciascuna, senza toccare il guscio dell'agarosio con la punta della pipetta.
   NOTA: Per minimizzare le vibrazioni delle mani e aumentare la stabilità, ancorare entrambi i gomiti al bordo antivibrazioni. Stabilizzare il polso pipettatore con la mano non pipetta, immergere lentamente la pipetta nell'olio e avvicinarsi gradualmente all'elettrodo. Una breve trattenuta del respiro durante il carico delle gocce può ridurre ulteriormente i movimenti indesiderati.
5. Lascia che le goccioline si diffondano e ricoprano il guscio di agarosio, poi si allontanino dall'elettrodo sotto la gravità. Osservare l'abbassamento laterale attraverso la parete della piastra di Petri se libero (Figura 3B).
   NOTA: Il tempo necessario per l'abbassamento delle gocce dipende dalla distribuzione delle dimensioni della vescicola, dalla temperatura e dalla topografia dell'agarosio. Per i DIB DPhPC, attendi almeno 5 minuti dopo la deposizione di^{gocce 15}.
6. Spingi delicatamente il tavolo antivibrazione per valutare la prontezza delle gocce. Confermare che le gocce che si abbassano si muovono con un leggero ritardo rispetto al movimento dell'elettrodo, indicando la formazione di gocce monostrato lipidici completamente rivestite.
   NOTA: Il moto ritardato avviene perché la formazione di uno strato monolipidico attorno alla goccia acquosa riduce significativamente la tensione superficiale, ritardando così la risposta fisica durante lo spostamento dell'elettrodo nell'olio.
7. Se questo comportamento non viene osservato, attendi altri 2–3 minuti e ripeti il processo.

7. Installazione elettrica e monitoraggio bistrato (visivo ed elettrico)

1. Assicurarsi che il microscopio, il tavolo antivibrazioni, la gabbia di Faraday e tutti i componenti elettrici, inclusi amplificatore, digitalizzatore, generatore di funzioni e computer, siano collegati a una messa a terra comune (Figura 1).
2. Organizza le connessioni degli strumenti secondo la guida di configurazione del produttore. Usa la Figura 1C come riferimento schematico per la configurazione elettrica e ottica essenziale. Consulta le istruzioni dettagliate sul messa a terra³⁵, la configurazione hardware/software e la regolazione dello offset della pipetta per gli esperimenti DIB.
   NOTA: Segui le istruzioni specifiche per l'attrezzatura di configurazione per tutto il software e l'hardware elencati nella Tabella dei Materiali.
3. Collega gli elettrodi headstage e di massa all'amplificatore patch-clamp.
4. Configura un generatore di funzioni esterno (o il canale di uscita del software di acquisizione) per generare una forma d'onda di tensione triangolare da 10 Hz e 10 mV. Conferma ampiezza e frequenza su un oscilloscopio collegato e all'interno del software di acquisizione.
5. Dopo che le gocce si sono affloscate per ~ 10 minuti, usa i micromanipolatori per portare le due gocce a un contatto delicato. Regolare le posizioni degli elettrodi in modo che l'area di contatto delle gocce non superi inizialmente ~ 1/^{4 del loro} diametro.
6. Attiva la forma d'onda triangolare a 10 Hz, 10 mV e monitora la risposta della corrente capacitiva con l'amplificatore e il software di acquisizione.
7. Aspettare la formazione spontanea di due strati, indicata elettricamente da una risposta di corrente capacitiva picco a picco in espansione e otticamente da una crescente riflessione interna (aspetto ovale) dal contatto con due strati (Figura 4). Confermare che i bilayer lipidici puri mostrano plateau di corrente rettangolare rispetto allo stimolo di tensione triangolare, mentre i bilayer dopati con gA a ~1:^10-4 lipidi: i peptidi mostrano altipiani inclinati che riflettono la conduzione ionica in ensemble.
8. Regolare l'area di contatto delle gocce spostando leggermente gli elettrodi finché la risposta della corrente capacitiva picco a picco alla forma d'onda triangolare da 10 Hz, 10 mV è compresa tra ~100–200 pA per i DIB di ~250 nL negli oli C16 o C12/C16, corrispondenti a un intervallo di capacità di ~250–500 pF³³.
   NOTA: Impulsi ad alta frequenza o tensioni di mantenimento DC diverse da zero possono indurre elettrobagnazione e un'espansione eccessiva dei due strati, portando alla coalescenza delle goccioline e alla rottura dei due strati. L'intervallo 100–200 pA fornisce un equilibrio tra stabilità a due strati e rapporto segnale-rumore, permettendo un'espansione sufficiente dell'area durante la stimolazione.
9. Se il DIB si coagula, solleva gli elettrodi dall'olio. Risciacquare accuratamente le teste degli elettrodi con lo stesso tampone acquoso usato per i campioni lipidici e l'agarosio.
10. Rimuovere eventuali gocce acquose dalla piastra di Petri con una siringa sterile. Riempi con olio fresco se necessario, immergi nuovamente gli elettrodi. Ricarica la soluzione LUV sugli elettrodi come descritto nella Sezione 6 e ripeti il processo.
11. Una volta confermate risposte capacitive o conduttive stabili, disattivare la forma d'onda triangolare e lasciare che il DIB si equilibri per almeno 15 minuti prima di applicare i protocolli di stimolazione.

8. Protocolli di stimolazione elettrica

1. Esperimenti con impulsi (risposte insieme, simili a STP e LTP/LTD)
   1. Configurare il generatore di funzioni o il software di acquisizione per fornire impulsi di tensione dell'ampiezza, durata e intervallo inter-impulsi desiderati (ad esempio, schemi PPF [facilitazione a impulsi accoppiati] e PPD [depressione a impulsi abbinati]).
   2. Apri il software di cattura video. Seleziona le impostazioni appropriate della fotocamera e dell'obiettivo obiettivo. Imposta il frame rate ad almeno 20 frame/s e conferma che rimanga stabile durante la registrazione.
   3. Nel software di acquisizione dati, imposta la frequenza di campionamento ad almeno 5 kHz per il segnale attuale.
   4. Clicca su Acquisisci > Nuovo Protocollo per creare un nuovo protocollo, oppure Acquisisci > Modifica Protocollo per modificare uno esistente. Nella scheda Modalità Acquisizione , seleziona Stimolazione Episodica. Imposta Runs/Trial a 1 e Sweeps/Run a 1.
   5. Imposta la durata dello sweep a 4 s in più rispetto alla durata sperimentale totale. Per un protocollo STP da 120 s (60 s PPF + 60 s PPD), imposta la durata dello sweep a 124 s per consentire 2 s di basi pre- e post-stimolo.
   6. Nella scheda Input, assegna il canale di registrazione all'ingresso corrente. Nella scheda Outputs, assegna il canale di stimolazione all'uscita di tensione che controlla gli elettrodi.
   7. Apri la scheda Forma d'Onda . Nella Colonna A, imposta Tipo a Passo, Primo Livello a 0 mV e Prima Durata a 2000 ms per definire una linea di base pre-stimolazione.
   8. Nella Colonna B (PPF), impostare Tipo a Passo. Specificare l'ampiezza di tensione desiderata (ad esempio, +100 mV), la durata dell'impulso (ad esempio, 100 ms) e la Velocità di Treno per impostare l'intervallo inter-impulsi corrispondente al ciclo di lavoro target (ad esempio, 90,9%).
   9. Nella Colonna C (PPD), si imposta in modo simile Tipo a Passo con la stessa ampiezza e durata dell'impulso, ma aumentando la Velocità di Treno o l'intervallo interimpulsi per ottenere il ciclo di lavoro desiderato più basso (ad esempio, 28,6%).
   10. Nella Colonna D, configurare una base post-stimolazione identica alla Colonna A (0 mV, 2000 ms).
       NOTA: Se la durata totale di tutte le epoche nella scheda Forma d'Onda supera la durata dello sweep nella scheda Modalità/Velocità , aumenta leggermente la durata dello sweep finché l'errore non si risolve.
   11. Salva il protocollo con un nome descrittivo (ad esempio, "STP_120s").
   12. Avvia la registrazione video, poi avvia immediatamente l'acquisizione/stimolazione elettrica cliccando sul pulsante cerchio rosso "Registra" per registrare i dati. In alternativa, configura un trigger digitale in modo che l'inizio della stimolazione innescassi contemporaneamente la registrazione video e l'acquisizione elettrica.
   13. Per i primi 60 secondi di stimolazione (PPF), la risposta alla corrente misurata generalmente aumenta dal primo impulso e può raggiungere un plateau visibile di t = 60 s, mentre negli ultimi 60 secondi di stimolazione (PPD), la risposta alla corrente misurata generalmente diminuisce (Figura 5). Alla fine del protocollo, interrompere contemporaneamente l'acquisizione elettrica e la registrazione video.
2. Esperimenti a canale singolo
   1. Sul pannello frontale dell'amplificatore patch clamp, imposta l'interruttore External Command Input su OFF. Imposta la tensione di mantenimento a +200 mV. Imposta il filtro passa-basso integrato dell'amplificatore a 1 kHz. Nel software di acquisizione, imposta la frequenza di campionamento su 10–50 kHz e seleziona una modalità di registrazione continua "senza interruzioni".
      NOTA: Alti tassi di campionamento possono ridurre il rapporto segnale-rumore dei dati acquisiti. È importante utilizzare tassi di campionamento più elevati nella risoluzione di transizioni di gating rapide o stati di sfarfallio di breve durata. Le durate medie aperte della gramicidina A sono tipicamente nell'intervallo da 0,1 s a 10 s, mentre gli stati di sfarfallio possono verificarsi su scale temporali sub-ms e μs; pertanto, possono essere necessarie frequenze di campionamento di ~50 kHz per catturare tali^{eventi 36}. L'analisi successiva di idealizzazione a canale singolo con JSMURF consente un rilevamento robusto degli eventi su registrazioni con rapporti segnale-rumore^{variabili 37}.
   2. Senza alcun comando esterno applicato, iniziare a registrare il segnale di corrente di base. Sull'amplificatore, commuta il comando Tension da OFF a "+" per applicare una tensione DC di +200 mV sul DIB.
   3. Record di ~15 secondi per catturare eventi a canale singolo limitando la deriva di base. Alla concentrazione molare lipid:gA di 1:5×^10-6_, la corrente registrata appare a gradini a causa della formazione e eliminazione degli eventi di gating della conduttanza del canale.
   4. Prima di fermare la registrazione, riporta il comando Tension da "+" a OFF. Interrompi l'acquisizione dei dati e salva la registrazione con un nome file descrittivo (ad esempio, "DIB_C16_postPPF_200mV.abf").
      NOTA: Le registrazioni a canale singolo di durata definita possono essere eseguite anche tramite una Stimolazione Episodica programmata, con ampiezza e durate fisse come descritto nella Sezione 8 per PPF/PPD. Per gli esperimenti "post-PPF" a canale singolo, la stimolazione episodica con una tensione DC di +200 mV viene aggiunta subito dopo i 60 secondi di PPF.

9. Estrapolazione dell'area della membrana e del flusso

1. Alla fine di ogni esperimento di ensemble (STP, LTP/LTD), muovi lentamente un elettrodo lateralmente con i micromanipolatori per staccare il DIB.
2. Allenta il supporto elettrodo del micromanipolatore e ruota l'elettrodo nel suo supporto di ~45° in modo che il filo d'argento da 125 μm si trovi nel piano di immagigine.
3. Regola l'altezza dell'elettrodo finché il filo non è a fuoco nitido al microscopio. Scatta un'immagine fissa o uno screenshot del filo argenteo messo a fuoco usando il software della fotocamera. Salva l'immagine in scala per una successiva calibrazione della dimensione del pixel in millimetri.
4. Elaborare le tracce di corrente registrate secondo le procedure descritte nella rif. 28 per ottenere dati continui e privi di artefatti sulla corrente vs tempo (Figura 6A).
5. Determina la mappatura frame-time dividendo gli indici dei frame per la frequenza di frame misurata e abbinandola ai timestamp di acquisizione.
6. Importare l'immagine di calibrazione della scala e i fotogrammi dell'esperimento nel software di analisi delle immagini.
7. Utilizzare il diametro del filo noto (125 μm) dall'immagine di calibrazione della scala per impostare la scala spaziale usando la funzione di calibrazione software (Analizza > imposta la scala).
8. Per i calcoli di flusso per ogni esperimento, si sceglie N punti temporali che coprono il periodo totale di stimolazione (ad esempio, 30 punti temporali nell'esperimento di 120 s). Assicurati che il primo punto corrisponda al primo impulso di stimolo.
9. In ogni punto temporale, misurare il diametro del DIB tracciando una linea attraverso l'intersezione del bordo a due strati e registrandone la lunghezza in unità calibrate.
10. Converti ogni diametro misurato in area di membrana (A), assumendo geometria circolare o utilizzando il fattore di scala geometrica dell'ellisse appropriato per la specifica configurazione lipido-olio. Utilizzare le aree risultanti per valutare l'evoluzione dell'area della membrana nel tempo per diverse condizioni sperimentali (Figura 6B).
11. Per ogni punto temporale, dividere il corrispondente valore di corrente per l'area per ottenere il flusso (I/A). Dividere tutti i N punti dati di flusso per il primo valore di flusso per ottenere il flusso normalizzato al primo impulso, (I/A) / (I₀/A₀), quando si desidera un'analisi del flusso normalizzata (Figura 6C).
12. Traccia il flusso o flusso normalizzato contro il tempo o il numero di impulsi contro il tempo. Analisi di flusso ripetuta per tutti gli esperimenti di ensemble (STP, LTP/LTD) (figura 6D).
13. Interpretare le elevazioni persistenti di flusso o il flusso normalizzato rispetto al primo impulso durante la PPD o oltre i 2 minuti come conduzione potenziata, mentre i ritorni alla linea di base o le diminuzioni sotto il valore del primo impulso indicano una conduzione depressa. Usa le scale temporali risultanti per classificare le risposte come comportamenti a breve termine simili alla plasticità (<2 min) o comportamenti a lungo termine simili a potenziamento / depressione (> ~5 min).

10. Analisi a canale singolo

1. Importare registrazioni grezze a canale singolo in un ambiente di analisi preferito o nell'interfaccia clampSeg e consultare³⁷ per descrizioni complete e spiegazioni delle funzioni software.
2. Applicare un filtro passa-basso digitale che corrisponde al filtro di acquisizione sperimentale (ad esempio, Bessel a 1 kHz).
3. Configurazione dei parametri.
   1. Imposta alfa (α) = 0,05, definendo il livello di confidenza statistica tale che ogni passo rilevato abbia <5% di probabilità di essere una fluttuazione casuale del rumore.
   2. Specificare 5.000-10.000 iterazioni di Monte Carlo per segmento di 1 s per stimare la distribuzione del rumore e migliorare la robustezza statistica del rilevamento degli eventi.
      NOTA: Utilizzare l'elaborazione computazionale parallela di 1 s "chunk" se disponibili per ridurre il tempo di analisi.
   3. Esegui l'algoritmo JSMURF sulla traccia di corrente filtrata.
4. Validazione del modello.
   1. Sovrapponi la traccia idealizzata di conduttanza (a onda quadrata) sulla traccia di corrente filtrata e confermi visivamente che le transizioni a gradini coincidono con cambiamenti improvvisi nel segnale sperimentale.
   2. Utilizzare le caratteristiche note del filtro passa-basso per generare una ricostruzione convoluta della traccia idealizzata e sovrapporla alla traccia^{grezze 37}. Confermare che il segnale ricostruito corrisponda fedelmente al tempo e all'inviluppo di ampiezza della corrente registrata.
5. Quantificazione della conduttanza e delle durate di vita.
   1. Definire il piatto stabile più basso nella traccia idealizzata come lo stato di base chiuso. Identificare l'ampiezza del primo plateau non nullo come la conduttanza primaria a stato aperto (livello a canale singolo).
   2. Classificare i multipli interi più alti di questa ampiezza come stati aperti multicanale (2+, 3+, ecc.). Identificare gli altipiani intermedi stabili ma inferiori ai livelli completamente aperti come stati di subconduttanza.
   3. Estrai l'ampiezza e la durata di ogni evento dalla traccia idealizzata e li inserisci in bining per generare istogrammi di ampiezza di conduttanza e istogrammi a durata di vita.
6. Istogrammi di ampiezza e distribuzioni della durata della vita
   1. Confrontare gli istogrammi idealizzati di conduttanza-ampiezza con gli istogrammi di ampiezza generati direttamente dai dati filtrati. Confermare che gli istogrammi idealizzati mostrino picchi più nititi e meglio separati corrispondenti a stati di conduttanza^{discreta 37}.
   2. Per ogni condizione sperimentale, si calcola la funzione di sopravvivenza N(t)/N(0), dove N(0) è il numero totale di eventi aperti (pieni e subconduttanza) e N(t) è il numero di eventi con durate superiori a t. Escludere gli intervalli di stato chiuso da questa analisi.
   3. Traccia N(t)/N(0) rispetto al tempo e adatta le funzioni di decadimento esponenziale usando una routine di minimi quadrati non lineari in un software preferito.
   4. Interpretare gli spostamenti a destra nei picchi di distribuzione della conduttanza negli istogrammi di ampiezza come aumento della conduttanza, costanti di decadimento più lunghe in N(t)/N(0) rispetto ai grafici temporali come maggiore stabilità allo stato aperto, e distribuzioni spostate a sinistra come durate di vita dei canali più brevi.
      NOTA: Minimizzare i disturbi ambientali come correnti d'aria, vibrazioni e oggetti in movimento nelle vicinanze. Evita di appoggiarti al tavolo ottico e tieni le conversazioni lontane dall'allestimento sperimentale. Tieni telefoni cellulari, tablet, laptop e altri dispositivi elettronici personali ad almeno 1,5 m di distanza dalla gabbia di Faraday per ridurre le interferenze elettromagnetiche. Utilizza un serbatoio d'olio otticamente trasparente e ottimizza l'illuminazione e il contrasto del microscopio per rendere più niti i bordi di gocce e bistrati. Acquisire e/o esportare video in scala di grigi se questo migliora il contrasto dei contorni e semplifica le misurazioni manuali del diametro DIB. Per esperimenti che non indagano gli effetti della temperatura, assicurarsi che l'ambiente di laboratorio, il supporto del microscopio e l'olio siano mantenuti a 21–22 °C.

Results

Configurazione sperimentale DIB
Il sistema di registrazione è alloggiato all'interno di una gabbia di Faraday su un tavolo antivibrazione, con dati elettrici e video acquisiti da due computer separati (Figura 1A), anche se può essere utilizzato un singolo computer con capacità di split-screen. L'ambiente del campione DIB è costituito da due elettrodi rivestiti di agarosio sommersi in un volume definito di olio di alcano (Figura 1B). Figura 1C mostra uno schema delle connessioni elettriche e ottiche essenziali per l'allestimento sperimentale descritto in questo manoscritto.

Figura 1: Configurazione sperimentale. (A) Tavolo antivibrazione e involucro a gabbia di Faraday con componenti principali indicati, inclusi amplificatore, digitalizzatore, filtro rumore, generatori di funzioni e interfaccia dual-computer per l'acquisizione elettrica e video. (B) Vista dall'alto frontale dell'ambiente del campione DIB e degli elettrodi. (C) Schema delle connessioni elettriche e ottiche associate all'allestimento sperimentale descritto in questo manoscritto. Tutti i singoli componenti condividono un terreno comune nell'edificio del laboratorio. Tutti gli esperimenti sono stati condotti a temperatura ambiente (21–22 °C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Preparazione e controllo qualità degli elettrodi Ag/AgCl
Fondendo la punta del filo d'argento si forma una sfera sferica (Figura 2A); i fusi di scarsa qualità appaiono allungati o irregolari. La clorazione nella candeggina produce una superficie opaca di Ag/AgCl marrone-grigio (Figura 2B). Un rivestimento sottile e uniforme di agarosio, dell'ordine di decine di micrometri sulla palla, è essenziale per un supporto stabile delle gocce e un accoppiamento elettrochimico a bassa impedenza, mentre un rivestimento irregolare porta a un attacco scarso delle gocce (Figura 2C).

Figura 2: Preparazione degli elettrodi. (A) Immagini al microscopio di fusi elettrodi di buona e scarsa qualità. (B) Confronto tra teste di elettrodi non clorate e clorurate. (C) Esempi di rivestimenti in agarosio di buona e scarsa qualità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Configurazione degli elettrodi. (A) Vista dall'alto dell'allineamento dell'angolo degli elettrodi montato. (B) Vista laterale del confronto delle gocce non cadenti immediatamente dopo il carico LUV con le gocce che cadono dopo la formazione del monostrato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Posizionamento degli elettrodi e comportamento di abbassamento delle gocce
Le viste dall'alto mostrano una corretta posizione angolare degli elettrodi per minimizzare la distorsione ottica (Figura 3A). Le viste laterali confrontano gocce non abbassate (immediatamente dopo il carico della soluzione LUV) e gocce rivestite di lipidi che cadono (dopo 5 minuti) (Figura 3B). Le gocce che cadono utilizzate per formare un DIB mostrano una risposta fisica ritardata al movimento dovuta a una significativa diminuzione della tensione superficiale dovuta ai monostrati lipidici, confermando visivamente la formazione di una goccia acquosa sospesa completamente rivestita da un monostrato lipidico. Dopo aver stabilito il slack, si utilizza la stimolazione a onda triangolare per fornire conferma elettrica della formazione e stabilità a due strati³⁵.

Figura 4: Formazione di bilayer di interfaccia gocce. (A) Sequenza time-lapse che mostra la formazione e l'espansione del bistrato dopo il contatto con gocciole. (B) Riflessione interna della membrana utilizzata per la stima del diametro e dell'area a due strati. L'imaging DIB viene eseguito da sotto l'impianto tramite un microscopio invertito. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Formazione DIB e misurazione dell'area
Le immagini sequenziali catturano uno scambio spontaneo di "zip" a due strati e l'espansione dell'area quando due gocce che si afflosciano vengono portate in contatto (Figura 4A). Le riflessioni ovali interne luminose al contatto delle gocce vengono utilizzate per stimare il diametro dei due strati e, per estensione, l'area della membrana nel tempo (Figura 4B).

Figura 5: Protocollo STP—stimolazione e risposta. Le risposte rappresentative della corrente durante la facilitazione a impulsi accoppiati (PPF, 0–60 s, rosso) e la depressione a impulsi accoppiati (PPD, 60–120 s, blu) sono mostrate (in alto), insieme al corrispondente protocollo di stimolazione (in basso). Gli impulsi PPF e PPD durano 100 ms con tempi di OFF rispettivamente di 10 ms e 250 ms, risultando cicli di lavoro del 90,9% e del 28,6%. La facilitazione corrisponde a aumenti netti della corrente ionica; La depressione corrisponde a diminuzioni nette. Le risposte attuali vengono registrate solo durante i periodi ON; Per la visualizzazione, i dati tra gli impulsi vengono interpolati per evidenziare le tendenze generali della corrente. Gli schemi degli impulsi, le durate e il numero di impulsi nelle fasi PPF e PPD non sono disegnati in scala e sono illustrati a scopo di visualizzazione. Dati rappresentativi sulla risposta alla corrente riprodotti da Podar PT et al.,²⁵ sotto CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 L'autore/i. Pubblicato da PNAS. Schema di stimolazione modificato per il presente manoscritto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo di stimolazione elettrica per indurre comportamenti simili alla plasticità a breve termine (simili a STP)
I modelli di stimolazione qui indicati rappresentano la facilitazione del battito a impulsi (PPF) e la depressione (PPD) per analogia con la terminologia neuroscientifica, simile a Koner e Najem^28,29. La facilitazione a impulsi accoppiati (PPF; 0–60 s) e la depressione a impulsi accoppiati (PPD; 60–120 s) vengono effettuate utilizzando impulsi da 100 ms con tempi di OFF rispettivamente di 10 ms e 250 ms, corrispondenti a cicli di lavoro del 90,9% per PPF e 28,6% per PPD. Il pannello superiore mostra risposte rappresentative di corrente durante i periodi ON, mentre il pannello inferiore mostra il modello di stimolazione.

Corrente, area e flusso ionico durante STP e la successiva stimolazione a lungo termine
La corrente normalizzata (I/_{I 0}) per i bilayer DPhPC dopati con gA negli oli C16 e C12/C16 è mostrata durante PPF e PPD (Figura 6A). L'area normalizzata della membrana (A/_{A 0}) misurata a 30 punti temporali rivela un'evoluzione simile dell'area in entrambe le condizioni petrolifere nonostante correnti diverse (Figura 6B). I dati per la corrente e l'area normalizzate sono rappresentati rispettivamente come media ± nubi e barre di S.D., su 28 DIB indipendenti per condizione del petrolio. Il flusso normalizzato, J/_{J 0} = (I/I₀)/(A/_{A 0}), separa le variazioni di conduttanza indipendenti dall'area ed è coerente con variazioni nella conduzione della membrana oltre la semplice espansione dell'area (Figura 6C). Tuttavia, questi cambiamenti possono riflettere contributi sia dalla conduttanza a canale singolo sia dal numero di canali conduttori attivi. Una stimolazione prolungata della PPD per fino a 30 minuti produce un comportamento depressivo a lungo termine (LTD) nelle membrane C16 ma mantiene un flusso elevato, coerente con un comportamento simile alla LTP nelle membrane C12/C16 (Figura 6D). Insieme, questi dati mostrano che la composizione della membrana modula sia i cambiamenti di plasticità a breve che a lungo termine nel flusso ionico.

Figura 6: Corrente, area e flusso ionico calcolato di DIB durante STP e transizione in LTP/LTD. (A) Corrente normalizzata (I/I₀) durante PPF (0–60 s, sfondo bianco) e PPD (60–120 s, sfondo grigio) per membrane DPhPC dopate con gA in oli C16 (arancione) e C12/C16 (blu), con ogni condizione composta da n = 28 DIB formati indipendentemente. (B) Aree di membrana normalizzate (A/A₀), misurate a 30 punti temporali, mostrando traiettorie di area comparabili nonostante le diverse risposte di corrente; i dati sono mostrati come media ± S.D. nello stesso n = 28 DIB indipendenti per condizione dell'olio. (C) Il flusso normalizzato, J/J₀ = (I/I₀)/(A/A₀)), viene calcolato dalle corrispondenti misurazioni di corrente e area, evidenziando i cambiamenti nella conduttanza oltre gli effetti di area. (D) Comportamento a lungo termine sotto stimolazione PPD prolungata: dopo i primi 120 s STP (ombreggiatura grigia), i DIB sono stati sottoposti a 30 minuti di PPD con impulsi ON = 100 ms e OFF = 250 ms (rosso/verde solido) o 30 s (arancione/grigio). Il flusso decade fino a o sotto la base nelle membrane C16, indicando un comportamento simile a quello LTD, ma rimane elevato nelle membrane C12/C16, indicando un comportamento persistente simile a quello LTP. Le regioni ombreggiate rappresentano l'errore propagato da I/I₀ e A/A₀. I dataset di PPD estesa in (D) sono stati ottenuti da n = 6 DIB indipendenti per ogni condizione di olio per il protocollo 120 s, seguiti da 3 DIB per condizione PPD estesa. Tutti i punti dati sono collegati solo a scopo di visualizzazione. I pannelli A, B e D riprodotti sotto CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 L'autore/i. Pubblicato da PNAS. Il Panel C è stato generato di nuovo per il presente manoscritto a partire dai dati riportati da Podar PT et al.^,25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Traccia rappresentativa di corrente a canale singolo a 15 s da un DIB dopado a gA formato in olio C16 dopo stimolazione PPF
La traccia include il segnale grezzo catturato a 50 kHz con un filtro passa-basso da 1 kHz, una traccia a 8 poli filtrata da Bessel a 250 Hz e l'adattamento idealizzato JSMURF. Il livello stabile più basso definisce lo stato chiuso, mentre i livelli superiori corrispondono a eventi a canale singolo, multicanale e subconduttanza. Queste tracce forniscono la base per l'analisi dell'ampiezza della conduttanza e della durata della vita. L'esempio di tempo di permanenza dello stato di conduttanza indicato rappresenta la durata di uno specifico livello di conduttanza, la cui ampiezza e durata riflettono il contributo combinato di più eventi simultanei di pienezza e/o subconduttanza.

Distribuzione di ampiezza e durata di conduttanza
Gli istogrammi di ampiezza della conduttanza per le membrane C16 e C12/C16 (Figura 7A–B) confrontano le condizioni pre-PPF e post-PPF a un rapporto molare DPhPC:gA di 1:5×^10-6. Le approssimazioni gausiane sottostanti ai dati indicano spostamenti nei picchi medi di conduttanza dopo PPF e risolvono picchi separati corrispondenti a stati di subconduttanza e multicanale. Confronti statistici delle distribuzioni di conduttanza sono stati effettuati su dati aggregati a livello di evento utilizzando il test t di Welch e il test U di Mann-Whitney (α = 0,05), con ogni condizione composta da 3 registrazioni DIB indipendenti e N per uno stato di conduttanza che indica il numero totale di eventi rilevati raggruppati in tali registrazioni. Le distribuzioni di probabilità a tempo di vita, N(t)/N(0), prima e dopo (Figura 7C–D) mostrano che le membrane C12/C16 sviluppano distribuzioni di conduttanza a coda più lunghe e durate di vita alterate rispetto a C16, indicando cambiamenti nella stabilità del canale. I dati dell'istogramma sono rappresentativi della traccia filtrata di 15 s (traccia rossa) acquisita per ogni condizione. Le distribuzioni di durata dello stato di conduttanza sono state generate da 3 registrazioni DIB indipendenti per ogni condizione; Le curve punteggiate indicano repliche individuali, mentre le curve solide indicano adattamenti esponenziali globali a N(t) / N(0) rispetto a t.

Figura 7: Istogrammi di ampiezza di conduttanza e distribuzioni di tempo di permanenza dello stato di condutta. Gli istogrammi di ampiezza della conduttanza per l'attività gA nelle membrane (A) C16 e (B) C12/C16 confrontano condizioni pre-PPF (grigia) e post-PPF (arancione / blu) a un rapporto molare di 5 × 10-6 gA:lipidici. Le approssimazioni gaussiane sotto gli istogrammi indicano spostamenti nei picchi medi di conduttanza e nelle deviazioni standard per stati a canale singolo e multicanale. Gli spostamenti nella conduttanza media dopo la PPF sono indicati da linee tratteggiate (nero = pre-PPF; blu/arancione = post-PPF) e frecce. Ogni condizione rappresenta 3 registrazioni DIB indipendenti. Confronti statistici delle distribuzioni di conduttanza sono stati effettuati su dati aggregati a livello di evento utilizzando il test t di Welch e il test U di Mann-Whitney (α = 0,05), dove N per un dato stato di conduttanza indica il numero totale di eventi rilevati sommati in queste tre registrazioni. Nell'analisi sono stati inclusi anche eventi di subconduttanza, con distribuzioni rappresentative di subconduttanza indicate a sinistra del primo picco a stato aperto per ciascuna condizione di membrana. Le distribuzioni di probabilità a vita degli eventi dello stato di conduttanza nelle membrane C16 (C) e C12/C16 (D) prima (arancione / blu) e dopo la stimolazione PPF (arancione scuro / blu scuro) a 5×^10-6 M gA:lipidi corrispondono alle analisi di conduttanza mostrate nella Figura 7A–B. Qui, N(t) rappresenta il numero cumulativo di eventi pieni e di subconduttanza con durate superiori al tempo t. Le linee tratteggiate indicano distribuzioni di durata da repliche individuali (n = 3 DIB indipendenti per condizione), e gli inserti solidi mostrano adattamenti esponenziali globali eseguiti tramite software di adattamento non lineare delle curve. I pannelli A–D riprodotti da Podar PT et al.,²⁵ e compilati per il presente manoscritto sotto CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 L'autore/i. Pubblicato da PNAS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Indagine del comportamento a canale singolo — traccia di risposta corrente per i DIB in C16 dopo stimolazione PPF. (A) Esempio 15 s di traccia di corrente che mostra dati grezzi (blu), filtrati con un filtro passa-basso Bessel a 8 poli a 250 Hz (rosso), e la traccia idealizzata (verde) usata per identificare gli stati di conduttiva. Il livello stabile più basso definisce lo stato "chiuso" di base. (B) Livelli rappresentativi di subconduttanza rilevati tra il^{secondo e il} terzo^{livello di} piena conduttiva, corroborati da picchi intermedi distinti nell'istogramma di ampiezza (vedi Figura 7A, arancione). I tempi di permanenza della conduttanza vengono estratti dalla durata di ciascun livello di conduttanza identificato (escluso lo stato chiuso) per generare distribuzioni di vita N(t)/N(0). Riprodotto da Podar PT et al.,²⁵ sotto CC BY-NC-ND 4.0. Copyright © 2025 L'autore/i. Pubblicato da PNAS. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dopo la PPF, le membrane C12/C16 mostrano uno spostamento pronunciato verso destra nelle distribuzioni di ampiezza della conduttanza, indicando una conduttanza a canale singolo aumentata, accompagnata da uno spostamento verso sinistra nelle distribuzioni della durata dello stato di conduttanza, coerente con tempi di apertura dei canali più brevi. Questi cambiamenti sono coerenti con l'assottigliamento elettromeccanico del bistrato C12/C16 durante il PPF, come supportato dalle misurazioni meccaniche dirette e di spessore riportate nella referenza 25, che abbassano la barriera energetica al trasporto ionico attraverso gA e aumentano la capacità ionica per apertura, riducendo al contempo la stabilità del canale. Al contrario, le membrane C16 mostrano cambiamenti minimi in entrambe le distribuzioni, evidenziando la loro limitata adattabilità strutturale. Insieme, questi risultati dimostrano che la piattaforma DIB cattura sia correlati a ensemble che a canale singolo dell'adattamento elettromeccanico della membrana, inclusi cambiamenti simili a STP e LTP/LTD derivanti da dinamiche dipendenti dalla composizione della membrana (Figura 8).

Discussion

In termini pratici, questo metodo offre tre capacità sperimentali chiave: variazione controllabile della composizione a due strati attraverso la composizione lipidica e la fase oleosa, monitoraggio simultaneo ottico ed elettrico della ristrutturazione delle membrane, e accesso a un regime di area membrana che collega l'elettrofisiologia a canale singolo e la meccanica delle membrane^mesoscale 14,15,20,21,25 . Queste caratteristiche rendono il metodo particolarmente utile per studi struttura-funzione in sistemi a membrane semplificati, dove l'elettromeccanica delle membrane, piuttosto che la complessità cellulare completa, è la prospettiva sperimentale di interesse 14,15,20,21,25,39.

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e l'analisi di DIB gramicidina A-dopate negli oli alcani per sondare la capacità delle membrane lipidiche di ristrutturarsi sotto stimolazione elettrica fisiologicamente^rilevante 14,15,25,35,38. Rispetto alle tecniche di patch clamp²¹, la piattaforma DIB interroga patch a membrana di ordini di grandezza più grandi mantenendo una risoluzione sufficiente per catturare eventi discreti a canale^ionico 14,15,19,20,21,28,38 . Questa capacità è particolarmente preziosa per risolvere rimodellazioni elettromeccaniche mesoscale (ad esempio, come elettrobagnazione ed elettrocompressione) e collegarle al comportamento microscopico dei canali che danno origine collettivamente a fenotipi di conduttanza a membrana simili a STP, LTP e LTD sotto stimolazione fisiologicamente^ispirata 13,25,27,38 . L'attuale sistema DIB non è destinato a replicare la complessità molecolare delle sinapsi^biologiche 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Di conseguenza, termini come STP, LTP, LTD, PPF e PPD sono usati in senso descrittivo e analogico per indicare aumenti e diminuzioni della conduzione ionica a membrana su scala temporale breve e lunga secondo protocolli di stimolazione definiti. I risultati principali di questo lavoro sono quindi interpretati più direttamente in termini di elettromeccanica di membrana, adattamento della conduttanza e ristrutturazione non in equilibrio dipendente dalla composizione nei DIB, che possono offrire utili analogie concettuali e prospettive fisiche sulla plasticità sinaptica senza implicare un'equivalenza meccanicistica con circuiti neuronali o regolazione sinaptica^biochimica 10,11,25,38.

Diversi passaggi tecnici sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili. Una preparazione attenta dell'elettrodo Ag/AgCl, che include la fusione uniforme della punta sferica d'argento, una completa clorazione e un rivestimento sottile e uniforme di agarosio, garantisce un attacco stabile delle gocce e un accoppiamento elettrochimico a bassa^{impedenza 20,35}. La conferma visiva dell'afflosamento delle gocce e la corretta orientazione degli elettrodi minimizzano la distorsione ottica durante la registrazione video e migliorano la precisione delle misurazioni dell'area della membrana. La calibrazione su scala post-acquisizione utilizzando il diametro noto del filo d'argento fornisce una robusta conversione pixel-mm, essenziale per un calcolo affidabile dell'area della membrana e del flusso di ioni. In questo lavoro, la conduttanza a membrana (flusso) è definita come corrente per unità di area (I/A) e, poiché l'area DIB cambia durante l'elettrobagnare, una quantificazione accurata del flusso richiede misurazioni di corrente e area bistrato con corrispondenza^temporale 13,25,27,35.

Questo approccio supporta anche letture complementari a livello di ensemble e single-channel all'interno della stessa^piattaforma 14,15,20,25,35,38. A livello di ensemble, registrazioni video ed elettriche sincronizzate quantificano i cambiamenti dinamici di area (elettrobaging) e corrente, da cui deriva il flusso ionico (corrente/area). Sotto stimolazione elettrica, le membrane vengono spinte in stati stazionari fuori equilibrio (NESS), dove la ristrutturazione dipendente dalla composizione delle membrane genera risposte simili a plasticità su scala temporale breve che possono evolversi in comportamenti simili a potenziamenti o depressioni su lunghi periodi (min^{)25,26,28,29,30,31,32,33,38}. A livello di canale singolo, l'analisi consiste nell'idealizzare le tracce di corrente in livelli di conduttanza a passo a passo (stati chiuso, a canale singolo, multicanale e sottoconduttanza). Gli strumenti tradizionali di idealizzazione a onde quadrate risolvono tipicamente solo un numero limitato di livelli discreti; per dati più complessi o rumorosi, metodi di idealizzazione senza modello come JSMURF sono^{preferiti 37}. I brevi potenziali di mantenimento DC analizzati con JSMURF forniscono una rilevazione statisticamente rigorosa degli eventi sotto rumore eterogeneo, producendo istogrammi di conduttanza-ampiezza (livelli interi e di subconduttanza) e distribuzioni di vita N(t)/N(0). La sovrapposizione di istogrammi di ampiezza idealizzati e filtrati consente la validazione incrociata visiva e quantitativa delle assegnazioni dello stato di conduttanza, mentre le ricostruzioni convolute (tracce idealizzate passate attraverso il noto filtro passa-basso) confermano la scelta dei parametri e la fedeltà degli eventi³⁷.

La composizione della membrana, regolata qui attraverso la fase oleosa circostante (ad esempio, C16 vs C12/C16), dovrebbe modulare la viscoelasticità e la capacità di ristrutturazione a due strati sotto stimolazione elettrica, coerente con le misurazioni dirette riportate in lavori^precedenti 22,25,39. Si prevede che membrane più aderenti mostrino un assottigliamento più ampio causato dalla CE e un miglioramento dell'abbinamento idrofobo con gA durante^PPF 22,23,25, portando a un aumento della conduttanza e facilitazione a canale singolo che può stabilizzarsi come comportamento simile a ^{LTP 25,38}. Al contrario, membrane più rigide mostrano una reattività strutturale limitata, minori variazioni di conduttanza durante PPF e PPD e una tendenza alla LTD durante pulsazioni prolungate. Questi esiti dipendenti dalla composizione evidenziano come le proprietà del materiale predispongano le membrane verso regimi distinti e funzionalmente rilevanti a lungo^termine 22,23,25,39.

Anche la piattaforma DIB presenta importanti^{limitazioni 21}. L'interpretazione meccanicistica avanzata qui è che le differenze nella composizione del petrolio alterano le proprietà dei materiali a due strati e la suscettibilità alla ristrutturazione elettromeccanica, che a loro volta modulano la condotta della gramicidina^A 22,23,25. Questa interpretazione è supportata dallo studio precedente, che ha misurato direttamente la viscoelasticità della membrana, la tensione interfacciale, nonché i cambiamenti dinamici dello spessore della membrana in queste condizioni e^{stimolazione 22}. Nel presente lavoro, tuttavia, queste proprietà dei materiali non sono state misurate simultaneamente in ciascun esperimento e sono quindi utilizzate qui per supportare le diverse risposte strutturali e meccaniche alla stimolazione elettrica delle membrane in ambienti C16 e C12/C16, piuttosto che stabilire indipendentemente l'interpretazione meccanicistica dei dati. Inoltre, la corrente e il flusso dell'ensemble possono riflettere sia variazioni nella conduttanza di un singolo canale sia variazioni nel numero di canali conduttori, che possono variare con l'area della membrana, la diffusione peptidica e la dimerizzazione in condizioni di non equilibrio 17,18,22,23. La fase oleosa circostante può anche infiltrarsi o ritirarsi dinamicamente dal nucleo bistrato durante la stimolazione, contribuendo alla deriva di base nelle registrazioni a canale singolo e a cambiamenti graduali nella composizione della membrana^{nel tempo} 13,21,25. Insieme, questi fattori limitano l'uso di registrazioni a tensione costante di lunga durata per definire le proprietà delle membrane statiche e sottolineano che i DIB si comportano come sistemi aperti e dinamici piuttosto che come membrane di equilibrio^chiuso 13,21,25. Pertanto, mentre il protocollo attuale cattura cambiamenti di conduzione dipendenti dalla stimolazione, simili a plasticità, nelle scale temporali sperimentali^{previste 25,38}, saranno necessari studi futuri che combinino misurazioni meccaniche dirette con registrazioni simultanee elettriche e ottiche, potenzialmente insieme a immagini a singola molecola basate su fluorescenza, per risolvere più completamente i rispettivi contributi della ristrutturazione della membrana, della conduttanza dei canali e della popolazione dei canali^{21, 25}.

Le modalità di guasto comuni includono attacco instabile delle gocce, abbassamento incompleto delle gocce, coalescenza prematura delle gocce durante la formazione del bistrato e scarsa definizione ottica del bordo del bistrato durante l'analisi dell'area. L'attacco instabile delle gocce è spesso causato da una geometria irregolare della sfera d'argento o da un rivestimento irregolare dell'agarosio e può essere ridotto verificando la simmetria della sfera e mantenendo un guscio liscio di agarosio. Il carico degli elettrodi richiede anche la deposizione manuale di gocce acquose di dimensioni nanolitri su una testa di elettrodo submillimetrico, il che richiede una notevole coordinazione occhio-mano e percezione della profondità su mezzi con diversi indici di rifrazione (aria vs olio). Di conseguenza, la punta della pipetta può involontariamente entrare in contatto con il guscio di agarosio o mancare la testa dell'elettrodo durante la dispensazione. Tecniche di potenziamento della stabilità come il supporto per il polso, l'avanzamento lento delle pipette nell'olio e il trattenere il respiro, insieme a pratiche ripetute, possono migliorare la competenza al carico. Inoltre, un abbassamento incompleto o la formazione ritardata di monolayer possono derivare da eterogeneità vescicolare, variazioni di temperatura o topografia dell'agarosio e possono essere migliorate aumentando il tempo di attesa dopo la deposizione di^goccioline 15,20,35. La coalescenza durante la formazione del bistrato è frequentemente associata a un'area di contatto eccessiva o a una stimolazione elettrica eccessivamente aggressiva (> ± 200 mV) e può essere mitigata utilizzando aree di contatto iniziali delle gocce più piccole, concedendo ulteriore tempo per la stabilizzazione monostrato e verificando la risposta di capacità a onda triangolare a bassa ampiezza prima di pulsare 25,35,38.

Nonostante questi limiti, la piattaforma DIB è altamente sintonizzabile, scalabile e^{riproducibile} 14,15,20,21,25,35,38,40, e integra l'elettrofisiologia centrata sulle proteine isolando il contributo della meccanica lipidica alla conduzione 22,23,25. Unificando misurazioni di ensemble e a canale singolo in un unico sistema, questo protocollo fornisce una via pratica per analizzare come il lavoro elettrico e la viscoelasticità della membrana si combinino per produrre comportamenti conduttivi simili a quelli sinaptici (simili a STP, LTP e LTD) in un modello controllabile dal basso^{verso l'alto} 25,29,30,31,32,33,38 . In quanto tale, la metodologia offre una base per un'esplorazione sistematica delle regole di apprendimento dipendenti dalla composizione nelle membrane e per quantificare come forze meccaniche ed elettriche accoppiano le proteine della membrana al loro bistrato ospite su scale temporali e^spaziali 21,22,23,25 . Collettivamente, queste capacità posizionano i DIB come un potente quadro per decostruire comportamenti neurobiologici complessi in meccanismi biofisici trattabili e^testabili 10,11,25,38.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-difitanoio-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC)	Lipidi polari Avanti	850356P/850356C	Acquistati come polvere liofilizzata (P) o in cloroformio (C)
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Agarosio (compresse di agarosio da 0,5g)	Benchmark	A2501	Puoi usare sia la forma in polvere che le compresse
Generatore di forme d'onda Agilent Technologies 33522A	Keysight	–	Puoi usare qualsiasi generatore di forme d'onda con uscite cavi BNC
Gas Argon (Ar)	Airgas	AR UHP300; 72-402221259-1	Argon compresso; Ultra Alta Purezza
Bilancio analitico	Mettler Toledo	Modello: MS304S/03	Qualsiasi bilancio analitico di laboratorio con precisione di 0,0001 g
Amplificatore Axopatch 200B	Dispositivi molecolari	–
BK Precision 4017B Generatore di Sweep/Funzione per DDs a 10 MHz	Digi-Key	BK4017B-ND
Capillari in vetro borosilicato	Strumenti di Precisione Mondiale	1B100F-4
Clampex pCLAMP 11 Software Suite	Dispositivi molecolari	–
Sistema DigiData 1550B	Dispositivi molecolari	–	Questo include un mini-estrusore, 2 siringhe, 100 membrane PC, 100 supporti filtro e 1 supporto/blocco riscaldante
Dodecano, 99%	Sigma-Aldrich	112-40-3
Set estrusore con supporto/blocco riscaldante	Lipidi polari Avanti	610000
Software delle Figi	ImageJ	–
Freezer (-80 °C; C)	Fisher Scientific	Isotemp; Modello: 8964; N.d.: 828278-21
Vetro	VWR International	–
Gramicidina-A	Millipore Sigma	368020
Esadecano, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Eliminatore di rumore di insetti (60Hz)	Sistemi A-M	726300
Sistema di microscopio rovesciato (Nikon Ti2-A)	Nikon	–	Può essere utilizzato qualsiasi microscopio rovesciato o verticale
Alcol isopropilico	VWR International	BDH1133-4LP
Portaelettrodi per microelettrodi	Strumenti di Precisione Mondiale	MEH1S
Micromanipolatori	Strumento Sutter	MP-285	Possono essere utilizzati manipolatori manuali
Camera per microscopio	Olympus	DP74
Microsoft Excel	Microsoft	–
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
Software per fotocamere microscopiche NIS-Elements	Nikon	–	Possono essere utilizzati software di cattura della fotocamera con funzionalità di visualizzazione in diretta e/o video. La visualizzazione in diretta e la registrazione simultanea dello schermo possono essere utilizzate come sostituzione della cattura video.
Pellicola di laboratorio polivalente Parafilm M	Parafilm	PM999
Piastra di Petri	-	-	Il piatto deve essere trasparente sul fondo e, idealmente, anche sulla parete laterale
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911
Guanti d'esame in nitrile morbido senza polvere	VWR International	CA89-38-272
Frigorifero (4 e deg; C)	Fisher Scientific	NUMERO CAT: 97-938-1; Modello NO: 3556FS
Filo d'argento	GoodFellow	147-346-94
Piastra riscaldante a mescolamento	Thermo Scientific & nbsp;	SP131325