Articolo metodologico

Isolare le singole cellule dagli embrioni precoci di Xenopus e ordinarle per dimensione

DOI:

10.3791/70630

⸱

20 marzo 2026

 , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un metodo per isolare singole cellule provenienti da embrioni precoci di Xenopus laevis e ordinarle per dimensione cellulare.

Abstract

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L'embriogenesi precoce richiede una diminuzione esponenziale della dimensione cellulare, mentre l'embrione rimane costante nelle prime fasi dello sviluppo. L'importanza funzionale e i meccanismi con cui la dimensione cellulare influenza lo sviluppo dell'embrione sono ancora in gran parte poco studiati. L'embrione precoce di Xenopus offre un sistema unico per colmare queste grandi lacune. Rispetto ad altri organismi modello, l'embrione precoce di Xenopus è estremamente grande e contiene un gradiente di dimensioni cellulari, da piccole cellule al polo animale a grandi cellule al polo vegetale, attraverso l'intero embrione nelle fasi intorno alla transizione mid-blastula. Qui descriviamo un protocollo per dissociare singole cellule da embrioni precoci di Xenopus e ordinarle per dimensione utilizzando filtri cellulari con varie dimensioni dei pori a rete. Determinato da immagini e misurazioni di dimensione, le cellule ordinate rientrano nell'intervallo di dimensioni atteso e possono essere utilizzate per l'analisi o il sequenziamento delle cellule vive, oppure fissate per l'imaging. Questo sistema farà nuova luce sulla rivelazione dei meccanismi regolatori dipendenti dalla dimensione durante lo sviluppo iniziale.

Introduzione

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Il cambiamento di dimensione cellulare è una caratteristica comune dell'embriogenesi precoce, quando l'ovulo fecondato subisce molteplici cicli di scinditura, generando un numero crescente di cellule. Sebbene si sappia molto sul ruolo della dimensione cellulare come parametro principale che controlla le funzionicellulari 1,2,3, come la dimensione cellulare influenzi lo sviluppo precoce è meno noto. Lavori recenti su vari sistemi embrionali modello suggeriscono che la dimensione cellulare regola l'attivazione del genoma zigotico (ZGA)4 e la specifica del destinocellulare 5, supportando un ruolo importante della dimensione cellulare nelle decisioni di sviluppo 6,7.

L'embrione precoce di Xenopus è un modello importante per studiare le decisioni di sviluppo regolate dalla dimensione cellulare. Poiché l'embrione precoce di Xenopus è grande (~1,2 mm di diametro), è facile manipolarne fisicamente la dimensione, rendendolo utile per valutare le conseguenze dirette del cambiamento della dimensione cellulare. Ad esempio, mini embrioni di dimensioni variabili possono essere generati per la costrizione di embrioni a 1-cellula usando anellidi ciello 4,8, dimostrando la dose diZGA 4. Inoltre, l'embrione precoce di Xenopus contiene un gradiente di dimensioni cellulari lungo l'asse animale-vegetale, con le cellule più piccole al polo animale e le cellule più grandi al polo vegetale, dimostrando una differenza di oltre 100 volte nel volume4. È importante sottolineare che, visualizzando e quantificando direttamente i trascrizioni nascenti in singole cellule di embrioni a montaggio intero, abbiamo identificato una soglia di dimensione cellulare che regola ZGA4. Inoltre, l'isolamento di singole cellule da embrioni precoci di Xenopus e la loro selezione per dimensione hanno confermato l'importanza della soglia di dimensione cellulareZGA 4.

Qui descriviamo le procedure dettagliate per isolare singole cellule da embrioni precoci di Xenopus laevis e ordinarle per dimensione. Gli embrioni precoci di Xenopus possono essere dissociati in singole cellule incubandoli in un mezzo libero di Ca2+, Mg2+ (CMFM)9, e queste singole cellule possono essere ulteriormente selezionate utilizzando filtri cellulari con pori a mesh variabili. Le celle ordinate possono essere purificate e utilizzate in varie applicazioni, inclusa l'analisi delle cellule vive, il sequenziamento o gli saghi di imaging.

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Protocollo

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Il lavoro con gli animali descritto qui è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Carolina del Sud.

1. Preparazione della soluzione

NOTA: Prima di iniziare il protocollo, prepara le seguenti soluzioni.

  1. Prepara 20× MMR: Mescola 100 mM HEPES, 2 mM EDTA, 2 M NaCl, 40 mM KCl, 20 mMMgCl 2 e 40 mMCaCl 2. Regola il pH a 7,8 con NaOH. Autoclave e conservazione a temperatura ambiente.
  2. Prepara Ca2+, Mg 2+-medium libero (CMFM): Mescola 50,3 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 9,2 mMNa 2HPO 4, 0,9 mMKH 2PO4, 2,4 mMNaHCO 3 e 1,0 mM EDTA. Regola il pH a 7,4, se necessario. Autoclave e conservazione a temperatura ambiente.
  3. Prepara un gel di agarosio all'1,5% in una piastra di Petri da 60 mm: Aggiungi 0,75 g di agarosio a 50 mL di CMFM. Riscalda per sciogliere l'agarosio in un forno a microonde. Aggiungi 5-10 mL di gel di agarosio per ricoprire uno strato sottile in una piastra di Petri da 60 mm.
  4. Prepara un mezzo a gradiente di densità (wt/vol)/CMFM: aggiungi lentamente 15 g di mezzo a gradiente di densità in 100 mL di CMFM. Per facilitare la dissoluzione, riscaldare e mescolare su una piastra finché il mezzo del gradiente di densità non si dissolve completamente. Tieni la soluzione a 4 °C fino all'uso.
  5. Preparare 4% di PFA/1× MEM: Mescolare 1 fiala (10 mL) di stock di paraformaldeide al 16% e 4 mL di 10× di MEM (1000 mM di pH 7,4 MOPS, 20 mM di EGTA e 10 mM diMgSO 4). Aggiungi acqua ultrapura a 40 mL.
    NOTA: Per ottenere embrioni di Xenopus , si segue un protocollo standard per eseguire la fecondazione in vitro (IVF) (ad esempio, vedi Sive et al., 2007)10. L'embrione dovrebbe essere in 0,1× MMR pronto all'uso.

2. Dissociazione degli embrioni precoci in singole cellule

  1. Aggiungi ~15 mL di CMFM a una nuova piastra di Petri da 60 mm rivestita con gel di agarosio all'1,5%. Usa una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire 10-100 embrioni (a seconda delle esigenze sperimentali) nel vaso. Metti il piatto sotto uno stereomicroscopio.
  2. Usa una pinzetta con entrambe le mani per rimuovere con cura la membrana della vitellina, aggrappandola sulla superficie degli embrioni con una pinzetta e staccandola con l'altra. Evita di danneggiare gli embrioni durante il processo.
  3. Incubare gli embrioni devitellati nel CMFM per ~1 ora a temperatura ambiente. Scuoti il piatto molto delicatamente ogni 5 minuti per facilitare la dissociazione delle cellule. Controlla regolarmente finché non si vedono cumuli di blastomeri (Figura 1).

3. Ordinamento delle cellule dissociate per dimensione

  1. Durante la dissociazione dei blastomeri, immergi i coloratori cellulari (40 μm, 70 μm e 100 μm) in singole piastre di Petri riempite con CMFM (Figura 2). Posiziona i piatti nell'ordine da sinistra a destra come indicato. Includere inoltre altri due piatti riempiti di CMFM tra i gruppi per un breve lavaggio dei coloranti cellulari durante ogni smistamento.
  2. Fai ruotare delicatamente il piatto contenente i blastomeri isolati per arricchirli al centro del piatto. Trasferire con cura i blastomeri nel tintore a 40 μm in CMFM.
  3. Scuoti delicatamente il colino alcune volte per far sedimentare i blastomeri < 40 μm attraverso il colino. Poi sposta rapidamente il colino da 40 μm nella ciotola riempita di CMFM per un breve lavaggio. Trasferire con attenzione i blastomeri nel filtro da 40 μm, che sono > 40 μm, nel filtro da 70 μm.
  4. Ripeti i passaggi finché i blastomeri non sono stati selezionati nel filtro da 100 μm.
  5. Mescolare delicatamente ogni piatto con blastomeri selezionati per arricchirli al centro del piatto. Trasferire con cura i blastomeri (~4 mL) sulla sommità di 0,5 mL di mezzo a gradiente di densità al 15% in un tubo di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) (Figura 3). Evita di mescolare.
  6. Lascia riposare il tubo per 10 minuti. I blastomeri intatti si depositeranno sul fondo per gravità, separandosi dai globuli di tuorlo dai blastomeri rotti durante la selezione e il trasferimento (Figura 3).
  7. A seconda dello scopo degli esperimenti a valle, procedere con l'analisi delle cellule vive, congelare i blastomeri in azoto liquido per il lavoro sull'RNA o fissare i blastomeri per l'immunocolorazione (Figura 3).

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Risultati

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Gli embrioni di Xenopus laevis (n = 50) allo stadio 9 sono stati incubati nel mezzo CMFM per dissociarsi in singoli blastomeri seguendo questo protocollo (vedi un esempio nella Figura 1). I blastomeri singoli dissociati sono stati ordinati in sequenza utilizzando gli strati cellulari da 40 μm, 70 μm e 100 μm come descritto sopra. La miscela di controllo non selezionata e i blastomeri singoli selezionati furono fissati al 4% di paraformaldeide e foto...

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Discussione

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La dimensione cellulare è fondamentale per le funzionicellulari 3, e il suo impatto sullo sviluppo precoce richiede un'attenzione più approfondita nei sistemi embrionali modello. Qui abbiamo descritto i dettagli per isolare singole cellule da embrioni precoci di Xenopus laevis e ordinare le cellule per dimensione utilizzando filtri cellulari, potenzialmente applicabile per studi sulla dimensione cellulare. Questo metodo ci ha permesso di fornire prove dir...

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Dichiarazioni

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L'autore dichiara di non avere interessi in conflitto.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare il laboratorio di Matthew Good dell'Università della Pennsylvania per la formazione. Questo lavoro fu in parte sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (R03HD105802).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
16% Paraformaldeide (PFA)EMS15710-SPer realizzare la soluzione fissativa
Piatte di Petri usa e getta da 60 mmVWR25384-092Per incubare embrioni
Stereomicroscopi zoom ACCU-SCOPE 3075VWR470351-130Per visualizzare gli embrioni
AgaroseSigma-AldrichA-9414Per rivestire piastre di Petri
Filtro cellulare, 100 & micro; mVWR76327-102Per ordinare le celle per dimensione
Filtro cellulare, 40 e micro; mVWR76327-098Per ordinare le celle per dimensione
Filtro cellulare, 70 & micro; mVWR76327-100Per ordinare le celle per dimensione
Pipette di trasferimento usa e gettaVWR414004-035Per il trasferimento degli embrioni
Pinza Dumont, Stile 5Scienze della microscopia elettronica72701-DPer rimuovere la membrana vitellina
Piastra di Petri di vetro, 60 e più volte; 15 mmVWR75845-542Per incubare embrioni

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. Cell biology. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075(2015).
  2. Xie, S., Swaffer, M., Skotheim, J. M. Eukaryotic cell size control and its relation to biosynthesis and senescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 38, 291-319 (2022).
  3. Chadha, Y., Khurana, A., Schmoller, K. M. Eukaryotic cell size regulation and its implications for cellular function and dysfunction. Physiol Rev. 104 (4), 1679-1717 (2024).
  4. Chen, H., Einstein, L. C., Little, S. C., Good, M. C. Spatiotemporal patterning of zygotic genome activation in a model vertebrate embryo. Dev Cell. 49 (6), 852-866.e7 (2019).
  5. Hubatsch, L., et al. A cell size threshold limits cell polarity and asymmetric division potential. Nat Phys. 15 (10), 1075-1085 (2019).
  6. Fung, H. F., Bergmann, D. C. Function follows form: How cell size is harnessed for developmental decisions. Eur J Cell Biol. 102 (2), 151312(2023).
  7. Chen, H., Qian, W., Good, M. C. Integrating cellular dimensions with cell differentiation during early development. Curr Opin Cell Biol. 67, 109-117 (2020).
  8. Clute, P., Masui, Y. Regulation of the appearance of division asynchrony and microtubule-dependent chromosome cycles in Xenopus laevis embryos. Dev Biol. 171 (2), 273-285 (1995).
  9. Venkataraman, T., Dancausse, E., King, M. L. PCR-based cloning and differential screening of RNAs from Xenopus primordial germ cells: Cloning uniquely expressed RNAs from rare cells. Methods Mol Biol. 254, 67-78 (2004).
  10. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Xenopus laevis in vitro fertilization and natural mating methods. CSH Protoc. 2007, (2007).

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Isolamento di singole celluleSmistamento per dimensione cellulareDissociazione dei blastomeriSetacci per celluleGradiente di densitSmistamento attivato da fluorescenzaAnalisi del ciclo cellulareSequenziamento di singole celluleImaging confocale

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