Implicazioni cliniche della metalloproteinasi della matrice sirica e della cadherina-13 tumorale per la sottotipizzazione molecolare e la terapia personalizzata nel cancro ai polmoni

Sommario

Questo studio valuta la metalloproteinasi della matrice sierica-12 (MMP-12) e la cadherina-13 tumorale (CDH13) come biomarcatori complementari nel cancro polmonare. Questi marcatori sono correlati con sottotipi molecolari, risposta al trattamento e sopravvivenza, supportando il loro potenziale utilizzo nella sottotipizzazione, stratificazione del trattamento e valutazione prognostica.

Abstract

Il cancro ai polmoni rimane una delle principali cause di mortalità correlata al cancro a livello mondiale, principalmente grazie alla sua eterogeneità biologica, alle frequenti diagnosi in stadio avanzato e alle limitazioni nei test molecolari completi. I biomarcatori singoli sono spesso insufficienti per guidare le decisioni cliniche, evidenziando la necessità di indicatori complementari e clinicamente fattibili che integrino la biologia sistemica e specifica del tumore. In questo studio di coorte monocentrico sono stati arruolati 262 pazienti con tumore ai polmoni. I livelli di metalloproteinasi della matrice seroica (MMP-12) sono stati misurati tramite un saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA), mentre l'espressione tumorale di cadherina-13 (CDH13) è stata valutata tramite immunoistochimica (IHC) utilizzando un punteggio immunoreattivo (IRS) validato. La sottotipizzazione molecolare è stata ottenuta tramite test clinici di routine, e sono state valutate associazioni con la risposta al trattamento e gli esiti di sopravvivenza utilizzando modelli logistici multivariabili e regressione di Cox. MMP-12 e CDH13 hanno mostrato distribuzioni inverse tra i sottotipi molecolari (P < 0,001), tali che i tumori alterati dal fattore di crescita epidermico (EGFR)/linfoma chinasi anaplastico (ALK) hanno mostrato un livello più basso di MMP-12 e un CDH13 più elevato, mentre i tumori di tipo selvatico e i tumori di tipo selvatico del sarcoma Kirsten rat hanno mostrato il modello opposto. Un'espressione programmata più alta del ligando death-ligando 1 (PD-L1) era costantemente associata a un aumento di MMP-12 e a una riduzione della CDH13 (tutte P < 0,05). Un MMP-12 elevato è stato associato indipendentemente a un tasso di risposta oggettiva (ORR) ridotto (odds ratio aggiustato [OR] = 0,662, P < 0,001) e a una sopravvivenza più scarsa (sopravvivenza senza progressione [PFS], rapporto di rischio [HR] = 1,382; sopravvivenza complessiva [OS] HR = 1,421; entrambi P < 0,001), mentre CDH13 più elevati prevedevano un miglioramento della risposta (OR aggiustato = 1,201, P < 0,001) e della sopravvivenza (PFS HR = 0,884; OS HR = 0,862; entrambi P < 0,001). La firma combinata alta di MMP-12/CDH13 bassa ha identificato un sottogruppo con esiti significativamente peggiori (PFS HR = 2,281; OS HR = 2,506; P < 0,001). Questi risultati suggeriscono che l'MMP-12 sirico e il tumorale CDH13 possano fungere da biomarcatori complementari per la sottotipizzazione molecolare, la stratificazione terapeutica e la valutazione prognostica nel cancro ai polmoni.

Introduzione

Il cancro ai polmoni rimane un peso sanitario globale dominante, con quasi 2,5 milioni di nuovi casi e circa 1,8 milioni di decessi in tutto il mondo nel^2022. Nonostante i notevoli progressi nello screening, nell'imaging e nella terapia sistemica, la sopravvivenza rimane limitata per molti pazienti perché il cancro ai polmoni è biologicamente eterogeneo e spesso diagnosticato in uno stadio^avanzato 2,3,4,5. L'oncologia di precisione è quindi diventata centrale nell'assistenza contemporanea del cancro ai polmoni, in particolare per il cancro polmonare non a piccole cellule (NSCLC), dove le alterazioni azionabili definiscono sottoinsiemi molecolari con storie naturali distinte e sensibilità al^{trattamento 6}. Le linee guida cliniche raccomandano un profiling molecolare ampio nelle malattie avanzate, inclusi EGFR, ALK, KRAS, ROS1, BRAF, saltare l'esone MET 14, RET, ERBB2 (HER2) e fusioni NTRK, insieme alla valutazione di biomarcatori immunitari come PD-L1 7,8,9,10. Questi sviluppi hanno trasformato gli esiti per popolazioni selezionate, ma hanno anche creato nuovi colli di bottiglia clinici. Il tessuto potrebbe essere insufficiente per test completi, i tempi di risposta possono ritardare le decisioni terapeutiche e l'accesso a sequenziamenti di nuova generazione di alta qualità varia tra i sistemi^{sanitari 7,9}. Anche quando sono disponibili test molecolari, la terapia guidata da biomarcatori rimane imperfetta perché lo stato molecolare non cattura completamente gli stati microambientali tumorali che influenzano la risposta e la resistenza al trattamento. L'espressione di PD-L1 è ampiamente utilizzata ma presenta limitazioni ben note come predittore autonomo, e il carico mutazionale tumorale presenta una notevole variabilità e incertezza nel suo uso^{ottimale 6,9,10}. Queste realtà evidenziano la necessità pratica di biomarcatori complementari che siano scalabili, biologicamente informativi e capaci di arricchire la sottotipizzazione molecolare e la stratificazione del trattamento quando le informazioni genomiche sono incomplete, ritardate o ambigue.

Il rimodellamento proteolitico della matrice extracellulare e del microambiente tumorale è una di queste dimensioni biologicamente radicate che viene sempre più apprezzata sia come un segno distintivo della malignità sia come determinante della risposta terapeutica. Le metalloproteinasi della matrice (MMP) regolano invasione, angiogenesi, traffico cellulare immunitario e segnalazione delle citochine, collegando così i programmi tumorali intrinseci ai contesti infiammatori e stromali^{dell'ospite 11}. Tra questi enzimi, la metalloproteinasi della matrice-12 (MMP-12), nota anche come elastasi macrofagica, ha attirato l'attenzione nel cancro ai polmoni perché si manifesta su uno spettro di tumori polmonari umani e sembra essere associata a fenotipi aggressivi e a risultati^{peggiori 12}. Oltre alla sua espressione tissutale, MMP-12 è misurabile in circolazione, rendendolo attraente come biomarcatore minimamente invasivo con potenziale utilità per il monitoraggio^{seriale 13}. Recenti analisi multitumorali hanno ulteriormente supportato la rilevanza clinica di MMP-12 nell'adenocarcinoma polmonare, suggerendo ruoli predittivi e prognostici che richiedono un'esplorazione più approfondita nei sottogruppi clinicamente^{azionabili 14}. È importante sottolineare che i biomarcatori circolanti vengono sempre più utilizzati per integrare i test a base tissutale in oncologia, e c'è un interesse crescente per indicatori basati sul sangue che riflettono non solo il carico tumorale ma anche le dinamiche immunitarie e stromali che influenzano la sensibilità alla terapia^{sistemica 15}. Nel cancro ai polmoni, dove l'immunoterapia e la terapia mirata sono frequentemente impiegate, i biomarcatori che riflettono il microambiente tumorale possono essere particolarmente utili per comprendere l'eterogeneità del trattamento, la resistenza precoce e la necessità di approcci^{combinati 16}. Questo contesto biologico e clinico motiva una valutazione mirata del MMP-12 siero oltre un segnale diagnostico, in particolare come marcatore candidato legato a sottotipi molecolari e traiettorie terapeutiche.

Parallelamente, la cadherina 13 (CDH13), nota anche come T cadherina o H cadherina, rappresenta un asse meccanicisticamente distinto rilevante per la differenziazione tumorale, la segnalazione delle aderenze e la plasticità epiteliale. CDH13 è una cadherina atipica ancorata alla membrana tramite una parte glicosilfosfatidilinositolo ed è stata ampiamente descritta come soppressore tumorale in molteplici tumori¹⁷. Nel NSCLC, il silenziamento epigenetico di CDH13 tramite ipermetilazione del promotore è stato ripetutamente riportato ed è stato associato alla progressione tumorale e a caratteristiche clinicopatologiche^{avverse 18,19}. Le evidenze meta-analitiche e integrative supportano ulteriormente che l'ipermetilazione di CDH13 è più frequente nel NSCLC rispetto al tessuto polmonare normale e può avere rilevanza^{diagnostica 20,21}. Oltre al suo valore come indicatore della trasformazione maligna, lo stato CDH13 può plausibilmente intersecarsi con la sensibilità al trattamento. Lavori sperimentali hanno collegato la metilazione e l'alterazione dell'espressione del promotore di CDH13 ai fenotipi di resistenza al cisplatino in modelli di cancro ai polmoni, aumentando la possibilità che CDH13 rifletta programmi biologici legati alla risposta terapeutica e all'adattamento tumorale sotto pressione^{di trattamento 22}. Questi dati collettivamente posizionano il CDH13 come un biomarcatore tessutale con potenziali implicazioni per la biologia del rischio e la stratificazione terapeutica. A differenza di saggi multi-omici complessi, CDH13 può essere valutato tramite immunoistochimica nei flussi di lavoro di routine di patologia, consentendo una traduzione pratica se fornisce informazioni additive oltre i marcatori clinici e molecolari esistenti.

Considerati insieme, MMP-12 e CDH13 rappresentano compartimenti e meccanismi biologici complementari. MMP-12 è una lettura circolante che può catturare l'attivazione immunitaria e stromale e la rimodellazione guidata dalla proteasi, mentre CDH13 è un marcatore a livello tissutale che riflette aderenza soppressiva tumorale e regolazione epigenetica. Ipotizziamo che l'integrazione di questi assi possa migliorare l'inferenza clinica in due domini chiave che definiscono l'oncologia di precisione nel cancro ai polmoni. Innanzitutto, un quadro combinato di biomarcatori siero e tissutale può fornire informazioni complementari per la sottotipizzazione molecolare, sia associandosi a alterazioni azionabili dei driver e stati dei biomarcatori immunitari, sia identificando fenotipi biologicamente coerenti che si incrociano con specifiche classi molecolari quando i test genomici sono^limitati 2,6,8,10 . In secondo luogo, la firma integrata può informare la terapia personalizzata migliorando la stratificazione del rischio e correlando con la selezione del trattamento e gli esiti tra i paradigmi di terapia mirata e immunoterapia, dove la resistenza è multifattoriale e i singoli marcatori sono^{insufficienti 9,10,23}. In questo contesto, il nostro approccio è intenzionalmente pragmatico. Invece di sostituire la diagnostica molecolare, mira a integrarle fornendo misurazioni scalabili e compatibili con la clinica, ottenute rapidamente e interpretate insieme al genotipo, al PD-L1 e allo stadio. Questa strategia può essere particolarmente utile in contesti reali dove i tessuti sono scarsi, le biopsie ripetute sono impraticabili o la questione clinica non è semplicemente se un motore sia presente, ma come anticipare la sensibilità al trattamento e il rischio di progressione in un singolo paziente.

Di conseguenza, nel presente studio di coorte, valutiamo le implicazioni cliniche del MMP-12 sierico e del tumore CDH13 attraverso i sottotipi molecolari del cancro al polmone e le vie terapeutiche. In particolare, esaminiamo se questi biomarcatori, singolarmente e in combinazione, siano associati alle principali classi molecolari e ai raggruppamenti terapeutici, e se aggiungano informazioni prognostiche rilevanti per la gestione personalizzata. Collociamo inoltre questo lavoro all'interno di un ecosistema più ampio di approcci alternativi, tra cui il DNA tumorale circolante, il profiling di metilazione e la modellazione multimodale che integra caratteristiche cliniche, di imaging e^{molecolari 24,25}. La novità del nostro studio non risiede nel proporre nuovi biomarcatori individuali, ma nell'integrazione deliberata di un segnale proteasi circolante con un'adesione tessutale e un marcatore epigenetico per affrontare una domanda clinicamente attuabile: come integrare la sottotipizzazione molecolare e la personalizzazione della terapia utilizzando misurazioni possibili nella pratica ordinaria. Catturando le dimensioni complementari delle interazioni sistemiche tumore-ospite e della biologia tumore-intrinseco, questo quadro integrativo va oltre gli studi precedenti che hanno valutato MMP-12 o CDH13 in isolamento. Un tale approccio potrebbe fornire un ponte pratico tra patologia diagnostica e terapie di precisione, con potenziali applicazioni nel dare priorità ai test molecolari, contestualizzare la discordanza dei biomarcatori e affinare la pianificazione individualizzata del trattamento basata sul rischio.

Protocollo

Tutte le procedure rispettavano le normative istituzionali e nazionali e sono state approvate dal Comitato Etico dell'Ospedale Popolo di Xingtai (n. 2024-124). Il requisito del consenso informato scritto è stato esentato perché venivano utilizzati regolarmente dati clinici raccolti e campioni residui. Tutti i dati sono stati anonimizzati prima dell'analisi.

Disegno dello studio, ambientazione e schema generale
Questo studio è stato condotto come una coorte osservazionale a centro singolo progettata per valutare le implicazioni cliniche del MMP-12 siero e del tumore CDH13, singolarmente e in combinazione, per la sottotipizzazione molecolare del cancro polmonare e la terapia personalizzata. Lo studio è stato condotto presso l'Ospedale Popolare di Xingtai. Sono stati identificati i pazienti idonei gestiti tra gennaio 2021 e giugno 2022, e sono stati iscritti 262 pazienti consecutivi che soddisfacevano i criteri di inclusione ed esclusione predefiniti.

Il flusso di lavoro complessivo dello studio è illustrato nella Figura 1. Lo schema rappresenta l'intero processo dall'identificazione del paziente all'analisi, inclusi lo screening e l'iscrizione del paziente, la caratterizzazione clinicopatologica di base e la profilazione molecolare derivata da test clinici di routine, la raccolta e l'elaborazione del siero pre-trattamento, la preparazione del tessuto tumorale per l'immunoistochimica CDH13, la quantificazione del MMP-12 sierico, il punteggio immunoreattivo del CDH13, la classificazione della terapia di prima linea e dei successivi percorsi terapeutici, e l'esito longitudinale accertamento, inclusa la risposta al trattamento, la sopravvivenza senza progressione e la sopravvivenza complessiva. Lo schema distingue le analisi diagnostiche e di sottotipizzazione molecolare dalle analisi di trattamento e degli esiti e indica i momenti in cui sono stati raccolti i biocampioni, generati i risultati molecolari, avviata la terapia e effettuate valutazioni di follow-up.

Screening dei partecipanti, criteri di idoneità e astrazione dei dati clinici
I pazienti potenzialmente idonei sono stati identificati dal sistema informativo ospedaliero e dal registro patologico durante la finestra di iscrizione predefinita (gennaio 2021 - giugno 2022). Il cancro primario al polmone è stato confermato tramite istopatologia, integrato da revisioni cliniche multidisciplinari quando necessario. Sono stati iscritti pazienti adulti consecutivi che soddisfacevano tutti i criteri di idoneità. I criteri di inclusione includevano il cancro polmonare primario istilogicamente confermato, la disponibilità di un campione siero pre-trattamento prelevato prima dell'inizio di qualsiasi terapia antitumorale (e prima dell'intervento chirurgico nei pazienti sottoposti a resezione iniziale), la disponibilità di tessuto tumorale sufficiente per l'immunoistochimica CDH13 e la disponibilità di informazioni sui sottotipi molecolari generate come parte delle cure cliniche di routine. Sono stati esclusi pazienti con una storia documentata di un altro tumore maligno prima dell'iscrizione, pazienti con volume siero insufficiente o integrità del campione compromessa, pazienti senza tessuto tumorale valutabile per la valutazione del CDH13 e pazienti che hanno ricevuto terapia sistemica anticancro prima del prelievo di sangue basale.

I dati clinicopatologici e terapeutici sono stati estratti dalle cartelle cliniche elettroniche utilizzando un modulo standardizzato di report di caso con definizioni di variabili predefinite e regole di codifica. Le variabili registrate includevano demografie (età e sesso), esposizione al fumo, stato di performance dell'Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG), comorbidità, risultati di imaging basali, sottotipo istologico, stadio tumore-nododo-metastasi (TNM) (secondo il sistema di stadiazione utilizzato nella pratica clinica di routine durante il periodo dello studio), parametri di laboratorio di base e informazioni dettagliate sul trattamento (inclusi il regime di prima linea, date di inizio, modifiche al dosaggio e transizioni del trattamento). L'esposizione al fumo è stata quantificata in anni-confezioni come segue: anni-confezione = (sigarette al giorno ÷ 20) × anni fumati. Quando la storia del fumo è incompleta o incoerente tra i registri, la variabile fumo è stata classificata come sconosciuta e la fonte è stata documentata come discrepanza nel registro di astrazione; La mancanza è stata gestita secondo il piano di analisi statistica predefinito.

Raccolta, lavorazione e conservazione degli esemplari
Il sangue venoso periferico è stato raccolto al punto di partenza prima dell'inizio di qualsiasi terapia antitumorale. Il siero è stato separato tramite centrifugazione a 1.500 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Il soprandanante siero è stato trasferito in crioviali a basso legame senza disturbare lo strato cellulare. Il siero veniva aliquotato in porzioni da 200–500 μL per minimizzare i cicli di congelamento-disgelo, e le aliquote venivano conservate a −80 °C fino all'analisi in batch. È stato registrato l'intervallo tra la raccolta del sangue e la congelazione per ciascun campione, e sono stati esclusi i campioni con un tempo di raccolta fino al congelamento superiore a 2 ore.

Procedure pre-analitiche pre-specifiche di controllo qualità sono state applicate documentando emolisi e lipemia durante la lavorazione. I campioni visibilmente emolitizzati sono stati esclusi dalla quantificazione ELISA. Le aliquote sieriche sono state scongelate sul ghiaccio immediatamente prima del saggio, mescolate con inversione gentile e centrifugate a 2.000 × g per 5 minuti per rimuovere le particelle quando necessario. Sono state evitate agitazioni vigorose e vortici per prevenire la formazione di bolle e artefatti ottici durante le misurazioni di assorbimento.

Acquisizione e preparazione del tessuto tumorale
È stato ottenuto tessuto tumorale da procedure diagnostiche di routine (biopsia, broncoscopia, biopsia con ago del nucleo o resezione chirurgica). Il tessuto è stato fissato in formalina neutra tamponata secondo la prassi patologica standard e incorporato nella paraffina. Le sezioni (3–4 μm) sono state preparate su vetrini carichi per l'immunoistochimica. Le vetrine non colorate venivano conservate in un ambiente asciutto a temperatura ambiente e colorate entro un intervallo predefinito per minimizzare la degradazione dell'antigene. È stato mantenuto un registro della catena di custodia che collegava gli identificatori dei campioni ai codici degli studi de-identificati. Il patologo che ha eseguito il punteggio CDH13 è stato cieco rispetto ai valori sierici di MMP-12, al sottotipo molecolare, al trattamento e agli esiti.

Quantificazione del MMP-12 sirico tramite saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA)
Il sangue venoso periferico è stato raccolto prima di qualsiasi terapia antitumorale, idealmente entro 7 giorni prima della biopsia o dell'inizio del trattamento. Il siero MMP-12 è stato misurato utilizzando un kit MMP-12 ELISA umano commerciale. Ogni aliquota sieroica veniva scongelata una volta sul ghiaccio, mescolata delicatamente e analizzata in duplicata secondo le istruzioni del kit. Su ciascuna piastra veniva generata una curva standard tramite diluizioni seriali dello standard ricombinante fornito, e l'assorbanza veniva letta a 450 nm con una correzione di riferimento tramite un lettore di microplacche. Le concentrazioni sono state calcolate adattando una curva standard di regressione logistica a quattro parametri. Per garantire la robustezza analitica, su ciascuna lastra sono stati inclusi sari interni di controllo qualità (QC) e monitorati per la precisione intra-saggio e inter-saggio (coefficienti di variazione del bersaglio coerenti con la validazione del saggio). Se i risultati scendevano sotto il limite inferiore di quantificazione, metà di quel limite veniva assegnata all'analisi statistica; Se i risultati superavano il limite superiore, la misurazione veniva ripetuta dopo la diluizione appropriata. Per minimizzare gli effetti di batch, i campioni venivano allocati casualmente tra le lastre e su ciascuna lastra era incluso un set identico di siero QC per monitorare la variabilità tra placche. Il personale di laboratorio che eseguiva ELISA era cieco rispetto al raggruppamento clinico e agli esiti.

Immunoistochimica tumorale CDH13 e punteggio immunoreattivo
L'immunoistochimica del CDH13 è stata eseguita su sezioni tumorali fissate in formalina, immerse in paraffina, utilizzando un anticorpo primario anti-CDH13 validato. I complessi antigene–anticorpi sono stati individuati con un sistema di rilevamento basato su polimeri e la colorazione è stata visualizzata con 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Un flusso di lavoro di colorazione identico è stato applicato a tutti i campioni di studio; Le diapositive venivano processate in lotti e venivano inclusi i controlli appropriati.

I blocchi di paraffina venivano sezionati a 3–4 μm, deparaffinizzati in xilene e reidratati tramite etanolo graduato in acqua distillata. Il recupero dell'epitopo indotto dal calore è stato eseguito in tampone di citrato (10 mM, pH 6,0) utilizzando un forno a microonde a 95–100 °C per 15 minuti, seguito dal raffreddamento a temperatura ambiente per 20 minuti. L'attività endogena della perossidasi è stata stemperata con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti a temperatura ambiente, e il blocco proteico è stato eseguito utilizzando soluzione sirica bloccante normale per 20 minuti a temperatura ambiente. Le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario anti-CDH13 durante la notte a 4 °C. Dopo il lavaggio, il reagente secondario di rilevamento a base di polimero è stato applicato per 20–30 minuti a temperatura ambiente, seguito dalla visualizzazione con cromogeno 3,3′-DAB per 3–5 minuti sotto monitoraggio microscopico. Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina, disidratate tramite etanolo graduato, ripulite con xilene e montate con un mezzo di montaggio permanente.

I controlli interni di qualità erano inclusi in ogni prova di colorazione. Una sezione tessutale nota per CDH13 positiva è stata processata in parallelo come controllo positivo, mentre l'anticorpo primario è stato omesso nel controllo negativo. Una corsa è stata accettata solo quando il controllo positivo ha mostrato il pattern di colorazione atteso con intensità appropriata, e il controllo negativo non ha mostrato colorazioni specifiche. La colorazione veniva ripetuta per esecuzioni con background eccessivo, prestazioni di controllo fallite o con un segnale non specifico che comprometteva l'interpretazione.

L'espressione di CDH13 è stata quantificata utilizzando un punteggio immunoreattivo (IRS) derivato dall'intensità della colorazione e dalla proporzione di cellule tumorali positive. Due patologi formati hanno valutato tutte le vetrine indipendentemente mentre erano ciechi rispetto alle misurazioni dei biomarcatori sieri, al sottotipo molecolare, al trattamento e agli esiti. I punteggi discrepanti sono stati risolti tramite revisione congiunta a un microscopio multitesta e l'IRS giudicato è stato registrato. L'intensità della colorazione è stata assegnata come 0 (nessuna colorazione), 1 (debole), 2 (moderata) o 3 (forte). La proporzione di cellule tumorali positive è stata assegnata come 0 (0%), 1 (1–10%), 2 (11–50%), 3 (51–80%) o 4 (81–100%). L'IRS è stato calcolato come segue: IRS = punteggio di intensità × punteggio proporzionale. I valori dell'IRS variavano da 0 a 12. La bassa espressione di CDH13 è stata definita come IRS ≤ 3, basandosi su una soglia comunemente utilizzata per la valutazione immunoreattiva. L'IRS è stato mantenuto sia come variabile continua sia come categoria dicotomica per analisi a valle, inclusi confronti di sottogruppi e modellazione combinata di biomarcatori. L'accordo tra osservatori è stato valutato in un campione casuale predefinito comprendente il 30% dei casi utilizzando una statistica kappa ponderata, e la procedura di campionamento, la stima dell'accordo e le decisioni di valutazione sono state documentate in una traccia di audit.

Sottotipizzazione molecolare e classificazione dei trattamenti
Le informazioni sui sottotipi molecolari sono state ottenute tramite test clinici di routine effettuati su tessuto tumorale diagnostico. I risultati sono stati generati da saghi clinicamente validati implementati nelle cure standard, inclusi test mirati basati su PCR, panel di sequenziamento di nuova generazione mirati, immunoistochimica e ibridazione fluorescente in situ. Per ogni paziente sono stati registrati il tipo di saggio, la fonte del campione, la dichiarazione di adeguatezza del campione e la data del rapporto. I pazienti sono stati classificati secondo lo stato di alterazione azionabile del driver, inclusi mutazioni attivanti EGFR, riarrangiamenti ALK, riarrangiamenti ROS1, mutazioni KRAS, mutazioni BRAF, alterazioni saltanti dell'esone MET 14, riarrangiamenti RET, alterazioni ERBB2 e fusioni NTRK. Il punteggio proporzionale tumorale di PD-L1 è stato registrato dove eseguito è stato eseguito e l'espressione di PD-L1 è stata categorizzata in base agli strati utilizzati nella pratica di routine durante il periodo di studio. Tutte le categorie di sottotipizzazione molecolare sono state predefinite prima dell'analisi. Quando è stata riportata più di una modifica agibile, i pazienti sono stati assegnati secondo una regola di classificazione gerarchica predefinita che dà priorità alle alterazioni con implicazioni terapeutiche dirette al genotipo stabilite nel seguente ordine: mutazioni EGFR, riarrangiamenti ALK, riarrangiamenti ROS1, mutazioni BRAF, alterazioni saltanti dell'esone MET 14, riarrangiamenti RET, alterazioni ERBB2, fusioni NTRK e mutazioni KRAS.

Le informazioni sul trattamento sono state estrate dalle cartelle cliniche, inclusi il regime di prima linea, le date di inizio e interruzione e le successive linee di terapia. La gestione iniziale è stata classificata in categorie di trattamento mutuamente esclusive definite a priori: terapia mirata diretta al genotipo, terapia basata su inibitori di checkpoint immunitari, terapia basata su chemioterapia e gestione multimodale che incorpora chirurgia con trattamento sistemico perioperatorio, quando applicabile. La data indice è stata definita come la data di inizio della terapia sistemica di prima linea; Per i pazienti gestiti con resezione iniziale, la data indice era la data dell'intervento, e la terapia sistemica successiva è stata classificata come adiuvante secondo la cartella clinica. Per le analisi riguardanti la terapia personalizzata, i pazienti sono stati stratificati congiuntamente per sottotipo molecolare e categoria di trattamento, e le concentrazioni sieriche di MMP-12 e l'espressione tumorale di CDH13 sono state confrontate tra malattia con e negativa per guida, e tra gruppi di trattamento basati su terapia mirata e inibitori di checkpoint immunitari.

Definizioni degli esiti e follow-up
La data indice è stata definita come la data di inizio della prima linea della terapia antitumorale. Per i pazienti gestiti con resezione chirurgica iniziale, la data indice era definita come la data dell'intervento; la successiva terapia sistemica è stata classificata come adiuvante o palliativa secondo la cartella clinica. Ogni paziente è stato seguito dalla data indice fino alla morte, dalla data dell'ultimo contatto confermato o dalla data di censura amministrativa, a seconda di quale si verifichi per prima. La durata del follow-up è stata registrata in mesi e, per ogni endpoint, sono stati mantenuti l'indicatore dell'evento e la data corrispondente dell'evento o della censura. Gli esiti sono stati accertati tramite astrazione strutturata della cartella clinica elettronica, inclusi rapporti radiologici, documentazione della clinica oncologica, cartelle cliniche di ricovero e follow-up telefonico quando necessario. È stato utilizzato un modulo di report di caso predefinito e sono state applicate regole uniformi per la gerarchia delle sorgenti. Quando date o classificazioni differivano tra i registri, le discrepanze venivano risolte dando priorità ai rapporti radiologici contemporanei e alle note decisionali del trattamento; il valore finale accertato e le sue fonti a supporto furono documentati. È stato mantenuto un registro di follow-up che registrava date di imaging, transizioni di trattamento, ospedalizzazioni e tentativi di contatto per minimizzare le perdite ai follow-up e garantire la tracciabilità.

La risposta tumorale è stata valutata nei pazienti con malattia misurabile secondo la versione 1.1 di RECIST. La migliore risposta complessiva è stata classificata come risposta completa, risposta parziale, malattia stabile o malattia progressiva. Il tasso di risposta oggettiva è stato definito come risposta completa o parziale, e il tasso di controllo della malattia come risposta completa, risposta parziale o malattia stabile. Le date di risposta e progressione sono state assegnate sulla base delle prove documentate più antiche.

La sopravvivenza senza progressione (PFS) è stata definita come l'intervallo dalla data indice fino alla prima manifestazione di progressione della malattia o morte per qualsiasi causa, a seconda di quale si verifichi per prima. La progressione è stata determinata principalmente dai referti radiologici che documentano la progressione secondo RECIST 1.1. Quando la radiologia non è disponibile al momento del deterioramento clinico, la progressione documentata dal clinico è stata accettata se è esplicitamente collegata al peggioramento del carico tumorale e provoca un cambiamento nella gestione degli antitumorali. I pazienti senza evento alla data dell'ultima valutazione oggettiva sono stati censurati, confermando l'assenza di progressione. Se una nuova linea di terapia sistemica veniva avviata senza documentazione esplicita della progressione, veniva esaminata l'imaging e veniva fornita la documentazione clinica contemporanea. Se la progressione non poteva essere confermata, i pazienti venivano censurati all'ultima valutazione radiografica prima del cambiamento di trattamento e la regola decisionale applicata veniva registrata.

La sopravvivenza complessiva (OS) è stata definita come l'intervallo dalla data indice fino alla morte per qualsiasi causa. Lo stato vitale è stato accertato utilizzando cartelle cliniche ospedaliere e note di follow-up ambulatoriali, integrate da una conferma telefonica strutturata quando necessario. La data del decesso veniva registrata come documentata nella cartella clinica o, quando non disponibile, come data confermata dalla famiglia durante il contatto di follow-up, con la documentazione di supporto registrata nel registro di follow-up. I pazienti che erano vivi alla data dell'ultimo contatto confermato venivano censurati.

È stato implementato un flusso di lavoro standardizzato di follow-up, allineato ai percorsi di cura di routine. Durante la terapia sistemica attiva, sono state documentate valutazioni cliniche a ciascun ciclo di trattamento e sono state registrate rivalutazioni radiografiche a intervalli regolari determinate dal protocollo clinico, con modalità di imaging e data registrate per ciascuna valutazione. Dopo il completamento della terapia di prima linea o durante la sorveglianza post-operatoria, venivano registrate visite di follow-up e valutazioni di imaging secondo il calendario istituzionale. Quando il follow-up in presenza non poteva essere completato, è stato effettuato un controllo telefonico strutturato per confermare la continuazione del trattamento, documentare i ricoveri a intervalli, confermare lo stato della malattia come documentato tramite immagini esterne, dove applicabile, e confermare lo stato di sopravvivenza. Tutte le visite mancate, i tentativi irraggiungibili e le ragioni per l'interruzione del follow-up sono stati documentati. Prima di classificare un paziente come scomparso per il follow-up, è stato tentato il contatto almeno altre 2 volte in giorni diversi, e ogni tentativo è stato registrato.

È stata mantenuta la separazione procedurale tra la valutazione dei biomarcatori e l'accertamento degli esiti. Il personale che ha eseguito misurazioni sieroniche di MMP-12 e punteggio CDH13 è stato cieco rispetto agli esiti clinici. L'astrazione degli essiti è stata effettuata senza accesso ai risultati dei biomarcatori ogni volta che possibile. È stato applicato un processo di valutazione in due fasi per gli endpoint di progressione e risposta. Un abstractor formato assegnava la classificazione degli eventi e le date utilizzando le regole predefinite, dopo di che un clinico senior esaminava indipendentemente gli incarichi. Le discrepanze sono state risolte tramite una revisione congiunta del rapporto radiologico originale, delle note oncologiche e della tempistica del trattamento, mantenendo una traccia di audit di tutte le decisioni di valutazione.

Sono stati effettuati controlli di coerenza per identificare sequenze implausibili, inclusi eventi datati prima della data indice, transizioni di trattamento senza valutazioni corrispondenti o date di decesso senza documentazione di supporto. I casi segnalati sono stati riconciliati tornando ai documenti di origine e aggiornando il dataset con una nota di correzione datata che specifica la ragione del cambiamento e le prove a supporto.

Analisi statistica
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando SPSS (versione 26.0) e R (versione 4.3.0). Le variabili continue sono state presentate come media ± deviazione standard o mediana (intervallo interquartile), a seconda dei conti, e le variabili categoriche sono state presentate come conteggi e percentuali. I confronti di gruppo utilizzavano test parametrici o non parametrici secondo opportunità, con test chi-quadrati o esatti di Fisher per i dati categorici. Tutti i test sono stati bilaterali, con P < 0,05 considerato statisticamente significativo.

Le covariate sono state selezionate a priori sulla base della rilevanza clinica e delle evidenze precedenti, e lo stesso insieme di covariate è stato applicato tra modelli correlati per supportare la comparabilità. Le variabili di aggiustamento principali includevano età, sesso, esposizione al fumo, stadio TNM, stato di performance ECOG e sottotipo istologico, con ulteriore aggiustamento per il gruppo di trattamento quando il bersaglio di analisi è il sottotipo molecolare all'interno delle popolazioni trattate. La multicollinearità è stata valutata utilizzando fattori di inflazione della varianza, e la collinearità problematica è stata affrontata utilizzando regole predefinite di riduzione delle variabili. Sono stati riportati odds ratios aggiustati con intervalli di fiducia del 95% e valori P bilaterali. Il numero di covariate incluse nei modelli logistici multivariabili e di regressione di Cox è stato prespecificato e limitato rispetto al numero di eventi di esito per minimizzare il rischio di sovrafitting. Il rapporto eventi per variabile è rimasto accettabile (≥10) per tutti i modelli. Per gli esiti di sottotipi molecolari multi-categorie, sono stati adattati modelli di regressione logistica multinomiali, oppure è stato eseguito un insieme di confronti logistici binari utilizzando una categoria di riferimento prespecificata, e la strategia di modellazione è stata chiaramente espressa.

La sopravvivenza senza progressione e la sopravvivenza complessiva sono state analizzate utilizzando stime di Kaplan–Meier, e le curve di sopravvivenza sono state confrontate con il test log-rank. Le associazioni tra biomarcatori ed esiti sono state quantificate utilizzando la regressione proporzionale dei rischi di Cox, riportando rapporti di rischio con intervalli di confidenza al 95%. Modelli di Cox multivariati sono stati costruiti utilizzando covariabili clinicopatologiche predefinite, inclusi sottotipi molecolari e categorie di trattamento, per valutare le implicazioni della terapia personalizzata. L'assunzione dei rischi proporzionali è stata verificata utilizzando diagnostica dei residui di Schoenfeld e grafici log-minus-log-survival plot. Se l'assunzione dei rischi proporzionali veniva violata per una covariata, la questione veniva affrontata utilizzando un approccio prespecificato come la stratificazione su quella covariata o l'inclusione di un termine di interazione dipendente dal tempo, e la specifica finale del modello veniva riportata.

I dati mancanti venivano gestiti con una strategia predefinita. Quando la mancanza era minima, venivano eseguite analisi complete del caso; altrimenti, veniva utilizzata imputazione multipla con equazioni concatenate, includendo tutte le variabili nei modelli analitici. Sono stati generati dieci dataset imputati e le stime aggregate sono state calcolate utilizzando le regole di Rubin. Per le analisi che coinvolgevano confronti di più sottotipi o più endpoint, il tasso di false scoperte veniva controllato utilizzando una procedura prespecificata, oppure le analisi erano chiaramente designate come esplorative per garantire trasparenza riguardo alla molteplicità.

Il dataset di analisi è stato bloccato prima dell'adattamento del modello e è stato mantenuto un dizionario dati completo che definiva ogni variabile, unità, schema di codifica e intervallo consentito. Sono stati inclusi campioni duplicati di controllo qualità tra le lastre di analisi per quantificare la variabilità tra placche e monitorare la deriva. Per la valutazione immunoistochimica, sono state documentate la griglia di valutazione della classificazione, le procedure di ciecimento e la valutazione dell'accordo tra osservatori, e sono stati conservati i registri di valutazione per i casi discrepanti. Sono stati implementati controlli programmati di intervallo e controlli di coerenza logica tra variabili chiave, tra cui data di indice, data di raccolta del campione, data di inizio trattamento e date di esito. Tutti gli script statistici e i log di output controllati da versione sono stati preservati per consentire la completa replica del flusso di lavoro analitico.

Risultati

Assemblaggio delle coorti e distribuzione dei sottotipi molecolari
Il flusso di lavoro complessivo dello studio è riassunto nella Figura 1. In totale, 262 pazienti consecutivi con cancro ai polmoni sono stati inclusi e stratificati in quattro sottotipi molecolari clinicamente rilevanti: EGFR (n = 92), ALK (n = 48), KRAS (n = 54) e wild-type (n = 68). Le caratteristiche clinicopatologiche di base differivano tra i sottotipi (Tabella 1). I pazienti con alte...

Discussione

Questo studio valuta i ruoli complementari del MMP-12 siero e del tumorale CDH13 come approccio integrato a biomarcatori per supportare l'interpretazione clinica dei sottotipi molecolari e la stratificazione terapeutica nel cancro ai polmoni. L'ipotesi centrale deriva dai ruoli biologici complementari di questi due biomarcatori: MMP-12, una proteasi circolante che riflette il rimodellamento immunitario-stromale e l'aggressività tumorale, e CDH13, un soppressore tumorale a base tissutale ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi, anti-CDH13 (T-cadherina)	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab15126	Anticorpo primario per l'immunoistochimica; validato per tessuto FFPE
Centrifuga (refrigerata ad alta velocità)	Eppendorf, Amburgo, Germania	5424 R	Utilizzato per la separazione del siero e la chiarificazione dei campioni
Kit per substrati DAB	ZSGB-Bio, Pechino, Cina	ZLI-9017	Per la rilevazione cromogenica in immunoistochimica
Lettore di microplacche ELISA	BioTek Instruments, Winooski, USA	ELx800	Utilizzato per la lettura dell'assorbanza a 450 nm con correzione di riferimento
Formalina (10% neutrale tamponato)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Shanghai, Cina	10009218	Per la fissazione di biopsie e campioni di tessuto chirurgico
Kit per la colorazione di ematossilina ed eosina	Solarbio, Pechino, Cina	G1120	Per la controcolorazione e il controllo qualità delle vetrine IHC
Kit ELISA MMP-12 umano	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab246533	Misurazione quantitativa della metalloproteinasi della matrice sierica-12
Microscopio (campo chiaro)	Nikon, Tokyo, Giappone	Eclipse E200	Utilizzato per la valutazione dell'immunocolorazione e della valutazione del CDH13
Microtomo	Leica Biosystems, Wetzlar, Germania	RM2235	Per la sezionazione di tessuto immerso in paraffina a 3 e linea; 4 & micro; Spessore m
Mezzo di montaggio	Solarbio, Pechino, Cina	S2100	Per il montaggio permanente delle vetrine dopo la colorazione IHC
Stazione di Incassamento della Paraffina	Leica Biosystems, Wetzlar, Germania	EG1150	Per la preparazione del blocco tissutale FFPE
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific, USA	10010023	Usato per lavare durante la colorazione IHC
Sistema di rilevamento dei polimeri	MXB Biotechnologies, Fuzhou, Cina	DAB-0031	Kit di rilevamento secondario per IHC
Software statistico R	R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria	Versione 4.3.0	Utilizzato per analisi statistiche e modellizzazione
Tubi separatori del siero	BD Vacutainer, Franklin Lakes, USA	367988	Per la raccolta del sangue venoso periferico
Software di statistica SPSS	IBM Corp., Armonk, USA	Versione 26.0	Utilizzato per l'analisi statistica di dati continui e categorici
Cryovials di Stoccaggio	Corning Inc., Corning, USA	430488	Cryovial a basso legame per alquotare campioni di siero
Bagno d'acqua (per il prelievo di antigeni)	Grant Instruments, Cambridge, Regno Unito	JBN26	Mantiene una temperatura costante durante il prelievo dell'antigene