Benzo[a]pirene e artrite reumatoide: un'indagine computazionale integrata

Sommario

Questo studio ha utilizzato un approccio integrato di tossicologia computazionale per indagare sistematicamente il legame tra l'esposizione al benzo[a]pirene e l'artrite reumatoide. L'analisi ha identificato cinque geni bersaglio fondamentali, ha rivelato il loro arricchimento nelle vie immunitarie chiave e ha convalidato il legame stabile alla proteina BaP, elucidando potenziali meccanismi molecolari per l'artrite reumatoide (AR) indotta da inquinanti ambientali.

Abstract

Gli idrocarburi aromatici policiclici (PAH), inquinanti ambientali ubiqui, sono considerati fattori ambientali significativi che contribuiscono alla patogenesi dell'AR. Il benzo[a]pirene (BaP), un componente chiave dei PAH, può essere associato all'insorgenza dell'AR; tuttavia, il meccanismo tossicologico sottostante resta ancora da chiarire completamente. In questo studio, abbiamo affrontato sistematicamente questa lacuna di conoscenza utilizzando un approccio integrato che combina tossicologia di rete, apprendimento automatico e docking molecolare. Inizialmente è stata condotta un'analisi tossicologica di rete basata sulla struttura molecolare di BaP. Integrando e selezionando le informazioni target da più database, sono stati infine identificati 15 potenziali geni target di BaP correlati all'AR e la loro rete di interazione è stata costruita. Le analisi di arricchimento GO e KEGG hanno rivelato che questi geni erano significativamente arricchiti in processi biologici come la migrazione dei leucociti e la trasduzione del segnale cellulare immunitario, e sono associati tra gli altri percorsi di segnalazione dei recettori NF-κB e T. Analisi topologiche successive utilizzando il database STRING e il software Cytoscape hanno selezionato cinque geni fondamentali (LCK, ZAP70, ITK, GZMA e ITGAL), la cui importanza è stata ulteriormente convalidata tramite il machine learning. I risultati dell'aggancio molecolare e della simulazione della dinamica molecolare hanno indicato che BaP mostra una forte affinità di legame per i prodotti proteici di questi geni target, con conseguente formazione di complessi conformazionalmente stabili. In sintesi, questo studio impiega un approccio computazionale integrato per chiarire i potenziali meccanismi con cui il BaP può contribuire allo sviluppo della RA, offrendo così una base teorica per future indagini sulla prevenzione e il trattamento dell'AR associata agli inquinanti ambientali.

Introduzione

L'AR è una comune malattia autoimmune caratterizzata da sinovite cronica e formazione di pannus, che favoriscono la progressiva distruzione della cartilagine e dell'erosione ossea. Questi cambiamenti patologici portano a disfunzioni articolari, a un aumento del rischio di fratture patologiche e, infine, a disabilità, compromettendo gravemente la qualità della vita degli individui^{colpiti 1}. Sebbene l'eziologia dell'AR non sia completamente compresa, la sua patogenesi è generalmente attribuibile agli effetti combinati di fattori genetici (ad esempio, sottotipi di geni HLA-DR4 e HLA-DR1) e ambientali (ad esempio, fumo, consumo di alcol, infezione da virus Epstein-Barr, esposizione all'inquinamento atmosferico⁾². Studi epidemiologici hanno stabilito un'associazione significativa tra le HAP dovute all'inquinamento atmosferico e un aumento del rischio di insorgenza^{dell'AR 3}.

I PAH sono inquinanti atmosferici comuni provenienti dalla combustione incompleta di sostanze come carbone, petrolio, gas naturale e tabacco, e sono considerati importanti mediatori ambientali della patogenesi dell'AR. Possono legarsi al complesso del recettore degli idrocarburi arilici (AHR) nelle cellule immunitari, portando all'esposizione di segnali di localizzazione nucleare e alla conseguente traslocazione del complesso ligando–AHR nel nucleo. Nel contesto della patogenesi dell'AR, l'AHR legata alla AH agisce come un sensore ambientale centrale che guida la disregolazione immunitaria attraverso vie interconnesse. All'attivazione, l'AHR forma eterodimeri con ARNT e modula l'espressione del gene CYP, avviando una cascata^{infiammatoria 4}. Questa attivazione dell'AHR interrompe contemporaneamente l'equilibrio tra cellule T pro-infiammatorie e regolatorie: da un lato, attiva l'asse di segnalazione AHR/Jag1/Notch, potenziando il rilascio⁵ delle citochine cellulari Th17. D'altra parte, l'AHR si lega direttamente al promotore GOT1 per regolare l'espressione di GOT1, inducendo l'ipermetilazione del locus FOXP3 e sopprimendo la differenziazione^{Treg 6}. Il conseguente squilibrio Th17/Treg favorisce un ambiente pro-infiammatorio. Inoltre, l'attivazione dell'AHR amplifica ulteriormente le risposte di tipo Th2 aumentando l'espressione di CCR8 e le citochine come IL-4 e IL-13, che collettivamente perpetuano l'infiammazione sinoviale e il danno ai^{tessuti 7}. Pertanto, l'attivazione dell'AHR funge da hub che collega l'esposizione ambientale alla PAH con la disregolazione Th17/Treg/Th2, stabilendo un ponte meccanicistico tra genotipo, fattori ambientali e patologia dell'AR.

Nell'atmosfera, i PAH esistono come miscele complesse, con il BaP che funge da componente chiave. Nei macrofagi umani, BaP può indurre la produzione di CXCL8 (IL-8) promuovendo il legame dell'AHR al promotore CXCL8, inducendo successivamente l'espressione dei fattori chemiottici^{dei neutrofili 8}. Inoltre, il BaP può aumentare l'espressione di Slug nei sinoviociti simili a fibroblasti (FLS) nei pazienti con AR in modo doso-dipendente, aggravando la progressione dell'artrite⁹. Nei topi di tipo selvatico, BaP promuove l'attivazione dell'osteoclastto (OC) mediata dal fattore Factor-Receptor Activator of Nuclear Factor kappaB Ligand (RANKL) inducendo l'attività enzimatica CYP1A1, portando infine alla perdita^{ossea 10}. Tuttavia, il meccanismo preciso alla base del ruolo della tossicità da BaP nella patogenesi dell'AR rimane poco chiaro. Ipotizziamo che BaP promuova la patogenesi dell'AR interagendo direttamente con proteine target immuno-correlate chiave e interrompendo molteplici vie di segnalazione coinvolte nell'attivazione delle cellule T, nell'equilibrio Th17/Treg e nella produzione di citochine infiammatorie, collegando così l'esposizione ambientale a BaP all'infiammazione sinoviale e alla distruzione articolare. La tossicologia di rete è più adatta rispetto ai metodi sperimentali tradizionali a via singola per questo studio, poiché il BaP probabilmente agisce su più bersagli immunologici e su percorsi che si intersecano. Rispetto agli approcci sperimentali convenzionali che tipicamente esaminano un percorso o pochi bersagli alla volta, la tossicologia delle reti consente una visione olistica delle interazioni multi-bersaglio e degli effetti sistemici, anche se le sue previsioni dipendono dal database e richiedono validazione sperimentale.

La ricerca esistente sul ruolo del BaP nell'AR si limita principalmente a singoli percorsi o descrizioni meccanicistiche lineari, priva di un'analisi integrata delle caratteristiche regolatorie di rete multi-bersaglio e multilivello. La ricerca esistente sul ruolo del BaP nell'AR si limita principalmente a singoli percorsi o descrizioni meccanicistiche lineari, priva di un'analisi integrata delle caratteristiche regolatorie di rete multi-bersaglio e multilivello. Pertanto, sono necessari approcci olistici come la tossicologia di rete per svelare il complesso legame tra l'esposizione a BaP e la patogenesi^dell'AR 11,12,13. Tuttavia, vi è una scarsità di studi tossicologici in rete relativi alle malattie indotte da inquinanti ambientali. La novità di questo studio risiede nell'integrazione della tossicologia delle reti, del machine learning e del docking molecolare per indagare sistematicamente la patogenesi della AR mediata da BaP, invece di concentrarsi su un singolo percorso o su bersagli isolati. Identifica i geni hub chiave tramite analisi topologiche combinate con apprendimento automatico e, per la prima volta, fornisce una validazione a livello molecolare dei modi di legame e della stabilità termodinamica tra BaP e i prodotti di ciascun gene centrale. Identificando sistematicamente i potenziali meccanismi molecolari attraverso i quali il BaP può promuovere l'occorrenza e lo sviluppo dell'AR, questo studio computazionale mira a fornire una base teorica per comprendere i trigger ambientali dell'AR e per sviluppare strategie terapeutiche mirate. Rispetto alle tradizionali analisi a percorso singolo, questo approccio integrato consente una valutazione sistematica delle interazioni multi-bersaglio, offrendo un'applicabilità più ampia nello studio dei complessi meccanismi delle malattie ambientali. Va però notato che il nostro metodo dà priorità ai geni hub ad alta fiducia attraverso l'analisi di intersezione e topologica, il che può involontariamente escludere geni candidati biologicamente rilevanti che non soddisfano contemporaneamente le soglie di selezione. Studi futuri potrebbero esplorare strategie complementari, come l'applicazione del machine learning all'insieme unione di obiettivi previsti, l'integrazione di altri dati omici o la convalidazione sperimentale mirata, per confermare e ampliare ulteriormente i nostri risultati.

Protocollo

Dichiarazione etica
Questo studio non ha coinvolto direttamente partecipanti umani o soggetti animali.

Acquisizione degli obiettivi BaP
BaP era caratterizzato dall'integrazione di dati provenienti da più database. Il database PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) veniva interrogato usando la parola chiave "Benzo[a]pyrene" per ottenere la sua struttura chimica e la struttura canonica 2D (stringa SMILES: C1=CC=C2C3=C4C(=CC2=C1)C=CC5=C4C(=CC=C5)C=C3)¹⁴. I potenziali bersagli BaP sono stati recuperati dai database ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/), SEA (https://sea.bkslab.org/) e PharmMapper (http://lilab-ecust.cn/pharmmapper)^{15, 16, 17}. Tutti i bersagli previsti erano limitati al proteoma Homo sapiens. L'elenco completo dei target BaP previsti (n = 474) è fornito nella Tabella Supplementare S1. Il flusso di lavoro analitico completo è rappresentato schematicamente nella Figura 1.

Figura 1. Diagramma di flusso dell'analisi dei dataset in questo articolo, che illustra il flusso di lavoro complessivo inclusi acquisizione dati, preelaborazione, analisi di espressioni differenziali, costruzione della rete e passaggi di validazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Acquisizione di obiettivi legati all'RA
In questo studio, cinque dataset di AR sono stati acquisiti dal database NCBI Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/ GEO) utilizzando le parole chiave "Artrite reumatoide" e "Homo sapiens^"18. Basandosi sulla dimensione del dataset e sul disegno sperimentale, GSE77298 (RA: 16 campioni; Controllo: 7 campioni), GSE1919 (RA: 5 campioni; Controllo: 5 campioni), e GSE55235 (RA: 10 campioni; Controllo: 10 campioni) costituivano il set di addestramento per identificare geni espressi differenzialmente (DEG), mentre GSE12021 (RA: 24 campioni; Controllo: 13 campioni) e GSE55457 (RA: 13 campioni; Controllo: 10 campioni) servivano come set di validazione. Ulteriori dettagli su questi dataset, come piattaforme, campioni e serie GSE, si trovano nella Tabella 1.

I dati sono stati standardizzati utilizzando lo strumento online GEO2R, generando matrici di espressione trasformate in log2 per analisi successive. Per eliminare interferenze da diversi lotti sperimentali, i bias sistematici tra dataset sono stati corretti utilizzando la funzione ComBat del pacchetto SVA basata su un framework bayesista empirico parametrico. Successivamente è stata utilizzata l'Analisi dei Componenti Principali (PCA) per verificare l'effetto correttivo, mostrando un miglioramento significativo nel clustering tra i campioni tra lotti e confermando così la rimozione efficace degli effetti batch. La matrice di dati unita e corretta è stata utilizzata per l'analisi differenziale successiva.

Serie GSE	Campioni	Piattaforma	Gruppo
GSE77298	16 RA e 7 controlli	GPL570	Coorte di formazione
GSE1919	5 RA e 5 controlli	GPL91	Coorte di formazione
GSE55235	10 RA e 10 controlli	GPL96	Coorte di formazione
GSE12021	24 RA e 13 comandi	GPL96	Coorte di validazione
GSE55457	13 comandi RA e 10	GPL9	Coorte di validazione

Tabella 1: Riepilogo dei cinque dataset GEO utilizzati in questo studio.
La tabella fornisce il numero di accesso GEO (serie GSE), la composizione del campione (numero di pazienti con artrite reumatoide e controlli sani), l'identificatore della piattaforma (GPL) per ogni dataset e l'assegnazione sia alla coorte di addestramento che a quella di validazione.

Analisi della rete di coespressione genica pesata (WGCNA)
WGCNA è stato utilizzato per valutare le caratteristiche della rete di co-espressione dei DEG associati a RA¹⁹. Basandosi sulla matrice di espressione corretta per effetto batch, è stata inizialmente eseguita la pre-elaborazione dei dati: sono stati rimossi geni a bassa varianza con deviazione standard inferiore a 0,5, mentre la qualità del campione e dei geni è stata valutata utilizzando una funzione per valutare campioni e geni buoni. Successivamente, è stato applicato il clustering gerarchico per identificare e rimuovere campioni di outlier. Per costruire una rete di coespressione pesata, è stata impiegata una funzione per la valutazione sistematica dei valori di potenza a soglia morbida per valutare sistematicamente valori di potenza a soglia morbida che vanno da 1 a 20. Potenza = 12 è stata selezionata come soglia soft ottimale (topologia senza scala indice di adattamento R2 = 0,90), garantendo che la topologia della rete rispettasse un criterio senza scala. Sulla base di questo valore di potenza, fu costruita una matrice di adiacenza e calcolata la matrice di sovrapposizione topologica (TOM). I geni erano raggruppati gerarchicamente e un algoritmo dinamico di taglio dell'albero veniva utilizzato per identificare i moduli genici iniziali. Successivamente, moduli simili sono stati fusi attraverso il clustering degli autogeni dei moduli, dando origine a una rete robusta di moduli genici. Tutte le analisi sono state eseguite con un pacchetto R dedicato per l'analisi pesata della rete di coespressione, al fine di garantire l'affidabilità e la riproducibilità della costruzione della rete. È stata effettuata un'analisi dell'intersezione tra i geni hub DEG/WGCNA e i target BaP previsti per identificare i bersagli principali di BaP associati alla patogenesi AR, che sono stati visualizzati utilizzando il software del diagramma di Venn.

Identificazione di bersagli associati a BaP associati alla patogenesi dell'AR
L'analisi delle intersezioni è stata effettuata utilizzando un pacchetto R per diagrammi di Venn per identificare i bersagli di BaP che si sovrappongono alla patogenesi RA. Questi sono stati importati nel database STRING per costruire una rete di interazione proteina–proteina (PPI), con la specie impostata su "Homo sapiens" e il punteggio di confidenza dell'interazione impostato su > 0,7 per garantire un'elevata affidabilità di rete²⁰. Questa soglia è stata scelta perché corrisponde a un livello di "alta confidenza" nel database STRING, che bilancia la conservazione delle interazioni biologicamente rilevanti minimizzando i falsi positivi tipicamente associati a punteggi di confidenza più bassi. Un cutoff di > 0,7 è stato ampiamente adottato negli studi di tossicologia di rete per dare priorità alle associazioni proteiche robuste e riproducibili. Il file TSV risultante veniva scaricato dal database di interazione proteina-proteina (STRING) e importato nel software di visualizzazione di rete (Cytoscape) per la visualizzazione di rete. Le proteine core nella rete sono state identificate sulla base dei risultati di classificazione generati dall'algoritmo Degree nel plugin CytoHubba e sono state utilizzate per analisi successive.

Analisi dell'arricchimento KEGG e GO
Le abbreviazioni dei geni associati sia alla modulazione BaP sia alla patogenesi ARA sono state convertite in ID Entrez utilizzando l'"org. Hs.eg.db" pacchetto di annotazione in R. Successivamente, l'analisi di arricchimento dei percorsi KEGG è stata eseguita utilizzando lo strumento clusterProster, con la soglia di significatività impostata a 0,05. Nel frattempo, l'annotazione funzionale GO copriva le tre principali categorie GO: Processo Biologico (BP), Componente Cellulare (CC) e Funzione Molecolare (MF), ed è stata eseguita utilizzando la funzione enrichGO, con i cutoff sia dei valori P che quelli dei valori q impostati a 0,05. Va notato che non è stata applicata alcuna correzione tramite test multipli, poiché l'obiettivo principale di questa analisi esplorativa era massimizzare la scoperta di potenziali vie biologiche rilevanti e termini funzionali, generando così un insieme più ampio di ipotesi testabili per future validazioni sperimentali. Infine, i risultati dell'analisi dell'arricchimento sono stati visualizzati graficamente utilizzando le funzioni barplot e dotplot del pacchetto enrichplot.

Validazione basata su machine learning dei geni core
Per valutare la capacità predittiva dei geni fondamentali associati a BaP e RA, e per mantenere la trasparenza del modello, abbiamo implementato un flusso di lavoro sistematico di machine learning. Utilizzando i profili di espressione dei geni principali selezionati, sono stati costruiti modelli predittivi con 11 algoritmi distinti di machine learning: regressione Lasso (LR), Support Vector Machine (SVM), Random Forest (RF), glmBoost, Modello Lineare Generalizzato a Passo a Passo (GLM), regressione crest, rete elastica (Enet), Gradient Boosting Machine (GBM), Analisi Discriminante Lineare (LDA), Amplificazione del Gradiente Estremo (XGBoost) e Naïve Bayes. Gli iperparametri sono stati ottimizzati tramite una validazione incrociata a cinque punti, con il campionamento stratificato utilizzato per suddividere i dati in set di addestramento e validazione interna. Un seed casuale fisso (set.seed(123)) è stato utilizzato durante tutto il flusso di lavoro del machine learning per garantire la riproducibilità della divisione dei dati, delle fold di validazione incrociata e dell'addestramento del modello. Gli iperparametri chiave per ciascun algoritmo sono forniti nella Tabella Supplementare S2. Le prestazioni del modello sono state valutate utilizzando più metriche, tra cui area sotto la curva (AUC), accuratezza e punteggio F1. Per affrontare i limiti insiti negli approcci a modello singolo, abbiamo applicato una strategia di ensemble a sovrapposizioni che integrava le previsioni dei modelli base con le migliori prestazioni. Riconoscendo la natura "scatola nera" di molti modelli di machine learning, abbiamo utilizzato l'algoritmo SHapley Additive ExPlanations (SHAP) per quantificare il contributo di ciascun gene alle previsioni. L'entità e la direzione dei valori SHAP sono state utilizzate per interpretare l'importanza genica nelle decisioni di classificazione, migliorando così l'interpretabilità dei risultati del modello.

Aggancio molecolare di BaP con bersagli centrali
Per indagare le caratteristiche di legame tra BaP e i prodotti genici centrali, sono state condotte simulazioni di aggancio molecolare. La struttura tridimensionale di BaP (ligando) è stata ottenuta in formato SDF dal database PubChem. Le strutture proteiche corrispondenti ai target principali sono state recuperate dal RCSB Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/) in formato PDB, selezionate secondo i loro identificatori UniProt, con preferenza per strutture contenenti liganti co-cristallizzati o coordinate ad alta risoluzione. Prima dell'attracco, la preparazione delle proteine veniva effettuata utilizzando PyMol, durante la quale molecole d'acqua, liganti co-cristallizzati e componenti non proteici come gli ioni venivano rimossi per prevenire^{interferenze 21}. Per le proteine con liganti co-cristallizzati nelle loro strutture PDB originali, il centro del sito attivo è stato definito utilizzando le coordinate atomiche del ligando legato. Per le proteine senza liganti co-cristallizzati, il centro del sito attivo è stato determinato sulla base delle coordinate dei residui chiave riportati in letteratura come critici per l'attività catalitica o il legame degli inibitori. La griglia di attracco era centrata sulle coordinate definite del sito attivo, con una scatola cubica di 25 × 25 × 25 Å applicata a ciascun bersaglio. Questa dimensione standard di scatola di 25 Å garantisce una copertura completa di ogni sito attivo con margine sufficiente per il campionamento di ligando, evitando al contempo costi computazionali eccessivanti. Tutti i calcoli di docking venivano eseguiti con AutoDock Vina (versione 1.2.5). La conformazione che mostrava il punteggio di Vina più favorevole fu selezionata come modalità di legame rappresentativa, e l'energia di legame corrispondente fu registrata. Le pose di legame tridimensionale sono state generate utilizzando PyMol (versione 2.5.7), e diagrammi di interazione bidimensionale sono stati prodotti con Discovery Studio (versione 2021) per visualizzare interazioni chiave, inclusi legami a idrogeno e contatti idrofobi.

Simulazione della dinamica molecolare
Simulazioni di dinamica molecolare sono state effettuate con Gromacs 2025.3, utilizzando i complessi derivati dall'attracco come strutture di partenza. Gli atomi proteici sono stati modellati con il campo di forza AMBER14SB, e le molecole d'acqua sono state rappresentate utilizzando il modello TIP3P. Ogni complesso proteina–ligando è stato solvato in una scatola cubica d'acqua, con una distanza minima di 1 nm tra la superficie proteica e il confine della scatola. Ioni sodio o cloruro venivano aggiunti secondo necessità per ottenere l'elettroneutralità del sistema. Una minimizzazione iniziale dell'energia è stata effettuata utilizzando una combinazione di algoritmi di discesa più ripida e gradiente coniugato, ciascuno con un massimo di 10.000 passi. Le interazioni elettrostatiche a lungo raggio venivano calcolate tramite il metodo Particle-Mesh Ewald (PME), mentre una distanza di taglio di 1,0 nm veniva applicata sia a van der Waals sia alle interazioni elettrostatiche a corto raggio. Dopo la minimizzazione dell'energia, i sistemi sono stati gradualmente equilibrati sotto condizioni NVT (volume e temperatura costanti) e NPT (pressione e temperatura costanti). Furono poi eseguite produzioni di 100 ns a temperatura e pressione costanti, con un intervallo temporale di 0,002 ps (2 fs) e un totale di 50.000.000 di passaggi. Ogni simulazione è stata eseguita una volta (nessuna replica), poiché l'obiettivo principale era valutare la stabilità dei complessi di legame in condizioni standard. La temperatura veniva mantenuta tramite il termostato V-rescale e la pressione era controllata con il barosato Parrinello–Rahman. Durante tutta la simulazione, è stato applicato costantemente un cutoff di 1,0 nm per le interazioni non legate. Per valutare la stabilità e la flessibilità strutturale, abbiamo calcolato la deviazione quadratica media (RMSD) delle posizioni atomiche, la fluttuazione quadratica media (RMSF) per residuo, il raggio di giro (Rg) come misura della compattezza strutturale e l'area superficiale accessibile al solvente (SASA). Tutti i grafici sono stati generati usando QtGrace.

Risultati

Acquisizione degli obiettivi BaP
I dati riguardanti la struttura molecolare di BaP sono stati ottenuti dal database PubChem (Figura 2A). I potenziali obiettivi biologici di BaP sono stati previsti sistematicamente integrando informazioni provenienti da tre database complementari—ChEMBL, PharmMapper e SEA—con il risultato dell'identificazione di 474 potenziali obiettivi (Figura 2B).

Discussione

L'AR è una complessa malattia autoimmune derivante dall'interazione tra suscettibilità genetica e fattori ambientali. Tra i numerosi fattori di rischio ambientali, i HAP, uno degli inquinanti atmosferici più comuni, sono considerati un collegamento importante tra l'esposizione ambientale e l'insorgenza della RA. Studi precedenti hanno rivelato preliminarmente che i PAH possono influenzare l'equilibrio della differenziazione delle cellule immunitarie tramite la via AHR, oltre a indurre st...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AutoDock Vina	https://vina.scripps.edu	1.2.5 (SCR_011958)	Software di docking molecolare
clusterProfiler (pacchetto R)	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler	4.10.0 (SCR_016884)	Pacchetto R per l'analisi dell'arricchimento
CytoHubba (plugin Cytoscape)	https://apps.cytoscape.org/apps/cytohubba	0.1	Plugin per l'identificazione dei geni hub (algoritmo di grado)
Cytoscape	https://cytoscape.org	3.10.1 (SCR_003032)	Software di visualizzazione della rete
Discovery Studio	Dassault Systè mes BIOVIA	2021	Software per la generazione di diagrammi di interazione 2D
enrichplot (pacchetto R)	https://bioconductor.org/packages/enrichplot	1.22.0 (SCR_021165)	Pacchetto R per la visualizzazione dei risultati dell'arricchimento
GROMACS	https://www.gromacs.org	2025.3 (SCR_014565)	Software di simulazione della dinamica molecolare
limma (pacchetto R)	https://bioconductor.org/packages/limma	3.58.1 (SCR_010943)	Pacchetto R per l'analisi differenziale dell'espressione
org. Hs.eg.db (pacchetto R)	https://bioconductor.org/packages/org. Hs.eg.db	3.18.0 (SCR_006442)	Pacchetto di annotazione R per identificatori geni umani
PyMol	Schrö dinger, Inc	2.5.7 (SCR_000305)	Software di visualizzazione molecolare
QtGrace	https://sourceforge.net/projects/grace/	0.2.6	Strumento di tracciamento per l'analisi delle traiettorie
R (ambiente di programmazione)	https://www.r-project.org	4.3.1 (SCR_001905)	Software di calcolo statistico
Database STRING	https://string-db.org	12 (SCR_005223)	Database delle interazioni proteina-proteina
venn (pacchetto R)	https://cran.r-project.org/package=venn	1.11	Pacchetto R per la generazione di diagrammi di Venn
WGCNA (pacchetto R)	https://cran.r-project.org/package=WGCNA	1.72 (SCR_003302)	Pacchetto dedicato R per l'analisi della rete di coespressione pesata