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Articolo metodologico

Sequenziamento multi-locus per la tipizzazione a deformazione di Toxoplasma gondii

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DOI:

10.3791/70645

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26 maggio 2026

 , 
1Department of Biosciences, Durham University, 2Department of Parasitology, Faculty of Veterinary Medicine, New Valley University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per identificare rapidamente e genotipare i ceppi di Toxoplasma gondii utilizzando il sequenziamento nanoporo portatile di marcatori genetici selezionati, consentendo un'identificazione scalabile e mirata dei ceppi in isolati mantenuti in laboratorio, con potenziali applicazioni future in contesti di sorveglianza.

Abstract

Toxoplasma gondii è un parassita apicomplesso distribuito globalmente caratterizzato da una notevole diversità genetica, il che richiede approcci molecolari accurati per la discriminazione dei ceppi. L'obiettivo di questo protocollo è stabilire un flusso di lavoro riproducibile per la genotipizzazione multi-locus mirata di isolati di T. gondii in coltura. La procedura prevede la propagazione in vitro di ceppi rappresentativi di Tipo I (RH) e Tipo II (ME49), l'estrazione di DNA genomico, l'amplificazione specifica del loco dei geni SAG2 e SAG3 , e analisi basate sul sequenziamento per rilevare polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e eventi di inserimento/delezione (INDEL). I dati di sequenziamento vengono elaborati per generare sequenze di consenso ad alta fiducia e per eseguire un allineamento comparativo per l'identificazione di polimorfismi specifici per ceppo. L'applicazione di questo flusso di lavoro a ceppi archetipici ha dimostrato un'elevata efficienza di mappatura, profondità di lettura costante tra i loci target e un recupero accurato delle dimensioni attese degli amplicon, confermando una rilevazione affidabile della variazione genetica a livello di locus. Sebbene l'assegnazione completa del genotipo richieda l'inclusione di ulteriori marcatori standardizzati, questo protocollo fornisce un quadro scalabile e riproducibile per la caratterizzazione genetica mirata degli isolati di T. gondii mantenuti in laboratorio e supporta un'analisi coerente di sequenze multi-locus.

Introduzione

Toxoplasma gondii è un parassita apicomplexano distribuito a livello globale e una grande minaccia zoonotica trasmessa da cibo e acqua, capace di infettare praticamente tutti gli animali a sangue caldo, con i felidi che fungono da ospitidefinitivi 1. L'infezione in esseri umani e animali si verifica comunemente tramite l'ingestione di cisti tissutali o oocisti sporulati, e la capacità del parassita di alternare tra stadi di tachizoite e bradyzoite consente una persistenza a lungo termine nei tessuti neurali e muscolari, contribuendo sia alla trasmissione carbonica cheambientale 2,3.

Sebbene tre linee clonali (Tipi I, II e III) dominino in Europa e Nord America, è stata documentata un'ampia diversità genetica, inclusi ceppi atipici e ricombinanti, a livello globale, specialmente in regioni con ricchi serbatoifaunistici 4. Una discriminazione accurata dei ceppi è quindi essenziale per chiarire le dinamiche di trasmissione, indagare i focolai e comprendere l'epidemiologia regionale. Approcci tradizionali di genotipizzazione come PCR-RFLP, tipizzazione multi-locus basata su Sanger (MLST) e analisi microsatellitari hanno contribuito in modo sostanziale alla nostra comprensione della struttura delle popolazioni di T. gondii , ma sono limitati in risoluzione, portata e capacità di rilevare variazioni intra-genotipe. Questi approcci spesso richiedono reazioni multiple e separate e possono non rilevare inserimenti, delezioni o aplotipi complessi all'interno di locipolimorfi 1. Il sequenziamento di nuova generazione a lettura breve (NGS) ha migliorato la rilevazione di varianti rare ma rimane limitato nell'identificare cambiamenti strutturali complessi4.

Le piattaforme di sequenziamento a lettura lunga, in particolare Oxford Nanopore Technologies, offrono ora la capacità di generare letture continue ad alta precisione adatte per risolvere varianti strutturali e loci5 altamente polimorfi. La loro portabilità, la capacità di analisi in tempo reale e la compatibilità con i flussi di lavoro basati su amplicon li rendono strumenti promettenti per applicazioni sul campo e indagini suifocolai 6. Nonostante questi vantaggi, i flussi di lavoro standardizzati multi-locus a lettura lunga per la genotipizzazione di routine di T. gondii rimangono limitati.

Per colmare questa lacuna, abbiamo stabilito un flusso di lavoro scalabile di sequenziamento amplicon a lunga lettura che mira a due loci polimorfi (Figura 1). Combinato con una pipeline di lucidatura consensuale e chiamata di varianti, questo approccio consente una rilevazione accurata di SNP e INDEL, supportando la discriminazione a livello di deformazione. Il protocollo è adatto a laboratori dotati per amplificazione PCR e sequenziamento a lunga lettura ed è stato validato utilizzando isolati in coltura. Sebbene l'adattamento a campioni clinici o ambientali primari possa essere fattibile, tali applicazioni richiedono un'ulteriore ottimizzazione e validazione. Nel complesso, questo flusso di lavoro fornisce un quadro strutturato per la caratterizzazione molecolare mirata e può supportare indagini epidemiologiche.

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Protocollo

Questo studio ha utilizzato ceppi di parassiti di laboratorio consolidati e linee cellulari di fibroblasti umani ottenute commercialmente. Nessun soggetto umano o animale era direttamente coinvolto.

NOTA: Salvo diversa specificazione, buffer e reagenti utilizzati in questo protocollo sono forniti all'interno dei kit commerciali elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Selezione dei biomarcatori

  1. Scarica le sequenze genomiche di SAG2 e SAG3 in formato FASTA dal database genomico ToxoDB (https://toxodb.org/toxo/app).
  2. Esegui allineamenti di sequenza a coppie usando EMBOSS Water (https://www.ebi.ac.uk/jdispatcher/psa/emboss_water).
  3. Selezionare le regioni dell'amplicon ≤1.600 coppie di basi (bp) per minimizzare i tempi di sequenziamento e garantire un'amplificazione PCR efficiente.
  4. Assicurarsi che ogni regione contenga SNP informativi o polimorfismi INDEL per la differenziazione dei ceppi.

2. Coltura e raccolta di tachizoiti di Toxoplasma gondii

  1. Mantenimento delle colture cellulari ospiti
    1. Ottenete fibroblasti del prepuzio umano (HFF) da una fonte commerciale certificata e coltivateli in un mezzo di crescita completo composto dal Modified Eagle Medium di Dulbecco, integrato con siero bovino fetale al 10% e 1% di penicillina-streptomicina.
    2. Incubare colture a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore umidificato.
  2. Manutenzione ed espansione delle linee di parassiti.
    1. Infettano monostrati di fibroblasti all'80–90% di confluenza usando tachizoiti a una molteplicità di infezione di 1–3 parassiti per cellula ospite. Per una fiaschetta T25 contenente circa 1 × 106 fibroblasti, aggiungere 1–3 × 106 tachizoiti.
    2. Esamina le colture quotidianamente utilizzando un microscopio a luce invertita con un ingrandimento del 20× o 40×. Identificare la lisi della cellula ospite osservando la diffusa interruzione del monostrato.
      NOTA: Non utilizzare colture di fibroblasti oltre il passaggio 20 per evitare artefatti correlati alla coltura.
    3. Prelievo di tachizoiti.
      1. Raccogli colture quando è visibile ≥90% della lisi della cellula ospite.
      2. Centrifugare a 1.300 × g per 10 minuti a 4 °C.
      3. Risospendere il pellet in soluzione salina sterile tamponata con fosfato da 10 mL tramite pipetazione delicata, e centrifugare nuovamente a 1.300 × g per 10 minuti a 4 °C. Ripeti ancora una volta.

3. Estrazione del DNA genomico e generazione di ampliconi

  1. Estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di purificazione genomica del DNA a colonna disilice 7. DNA eluto in un buffer di eluzione da 50 μL.
  2. Misurare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
  3. Conservare il DNA a 4 °C per il breve termine o a −20 °C per la conservazione a lungo termine.
  4. Prepara le reazioni PCR utilizzando una miscela master di DNA polimerasi ad alta fedeltà, primer specifici per il loco (Tabella Supplementare 1) e acqua priva di nucleasi.
  5. Eseguire amplificazione PCR utilizzando un ciclatore termico calibrato nelle seguenti condizioni di ciclaggio: (a) denaturazione iniziale a 98 °C per 30 secondi, (b) 35 cicli a 98 °C per 10 secondi; ricottura specifica per loco: 60 °C per SAG2, 68 °C per SAG3, 30 s; 72 °C per 20 s, (c) Estensione finale: 72 °C per 2 minuti.
  6. Verifica i prodotti PCR tramite elettroforesi su un gel di agarosio all'1,5%.
  7. Purificare i prodotti PCR utilizzando un sistema di purificazione PCR a colonna e di estrazione in gel secondo le istruzioni delproduttore 8. DNA eluto in 15–20 μL di tampone di eluzione.
    NOTA: L'efficienza e la resa della PCR possono essere ridotte da bassa qualità del modello di DNA, concentrazione o condizioni di reazione subottimali. Se la resa dell'amplicon è bassa, verificare l'integrità del modello di DNA usando elettroforesi su gel di agarosio, concentrazione e purezza con uno spettrofotometro. Le temperature di ricottura PCR e le concentrazioni di primer dovrebbero essere ottimizzate per le coppie di primer utilizzate, e il numero del ciclo PCR dovrebbe essere aumentato secondo necessità.

4. Preparazione della libreria per la sequenza a letture lunghe

  1. Riparazione terminale e dA-tailing
    1. Scongela tutti i reagenti e mescola accuratamente tramite vortice. Diluire il campione di controllo del DNA con 10,5 μL di tampone di eluzione solo durante il primo utilizzo e tenerlo sul ghiaccio.
      NOTA: Sempre scavare accuratamente le sfere magnetiche vortice prima di ogni utilizzo.
      ATTENZIONE: Non usare il vortice della miscela enzimatica End-Prep; Mescola delicatamente pipettando.
    2. Pipetta 200 fmol (~130 ng per un frammento da 1 kb) di ciascun campione di DNA in tubi PCR da 0,2 mL e regola il volume a 11,5 μL con acqua priva di nucleasi.
    3. Aggiungere 1 μL di campione di controllo di DNA diluito per tubo e mescolare pipettando 10–20 volte.
    4. Prepara un master mix di preparazione finale per ogni campione contenente 1,75 μL di tampone di reazione e 0,75 μL di miscela enzimatica (incluso il 5% in eccesso).
    5. Aggiungi 2,5 μL di master mix a ogni campione, mescola delicatamente e poi gira brevemente verso il basso.
    6. Incubare in un termociclatore a 20 °C per 5 minuti, seguiti da 65 °C per 5 minuti.
  2. Purificazione del DNA preparato all'estremità
    1. Trasferire la reazione da 15 μL in un tubo microcentrifuga a basso DNA legato a 1,5 mL.
    2. Aggiungi palline magnetiche sospese da 15 μL, mescola delicatamente e gira brevemente.
    3. Incubare i campioni su un miscelatore rotatorio per 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Prepara etanolo fresco all'80% per il lavaggio.
    5. Metti i tubi su una grigliera magnetica finché le perline non si trasformano in pellet e rimuovi con cura il sovrantantante.
    6. Lavare le perline due volte con 200 μL di etanolo all'80%.
      NOTA: Lascia che le perline si trasformino completamente in pellet, poi rimuovi con attenzione l'etanolo.
    7. Perline ad asciugare all'aria per ~30 secondi; Evita di asciugare troppo per evitare crepe.
    8. Risospendere le sfere in acqua da 10 μL senza nucleasi e incubare per 2 minuti a temperatura ambiente.
    9. Posizionare i tubi su un rack magnetico e trasferire 10 μL eluati in un tubo microcentrifuga pulito a basso legame di DNA.
    10. Misura la concentrazione di DNA usando 1 μL su uno spettrofotometro.
  3. Codice a barre nativo
    1. Scongelamento Blunt/TA Ligase Master Mix, EDTA, Short Fragment Buffer (SFB) e codici a barre nativi (NB01–NB24).
    2. Assegnare i singoli codici a barre ai campioni 1–24.
    3. Assemblare la reazione di codice a barre con DNA preparato all'estremità da 7,5 μL, 2,5 μL di codice a barre nativo e 10 μL di Blunt/TA Ligase Master Mix
    4. Mescola accuratamente pipettando 10–20 volte.
    5. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente e terminare la reazione con 4 μL EDTA, mescolare accuratamente tramite pipetto e centrifugare brevemente.
    6. Ho inserito i campioni in un tubo microcentrifuga a basso DNA, da 1,5 mL. Aggiungere sfere magnetiche allo 0,4× del volume totale di campioni aggregati (ad esempio, aggiungere 230 μL di sfere a 575 μL di DNA aggregato). Mescola accuratamente con pipettaggio, poi incuba su un miscelatore a temperatura ambiente per 10 minuti.
    7. Lavare le perle con 700 μL di Short Fragment Buffer (SFB). Fai girare le sfere per risospese, poi girare giù, poi riportare il campione nel rack magnetico e lasciare che le sfere si trasformino. Rimuovi il buffer usando una pipetta, poi scartalo.
    8. Ripeti il passaggio precedente.
    9. Spina giù e rimetti il tubo sul rack magnetico. Svuota qualsiasi residuo di buffer.
    10. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospendere il pellet in acqua priva di nucleasi da 35 μL con un leggero colpo.
    11. Incubare a 37 °C per 10 minuti con miscelazione intermittente, poi trasferire l'eluato in un tubo microcentrifuga pulito a basso livello di legaggio al DNA.
  4. Legazione degli adattatori e pulizia della libreria
    1. Assemblare la reazione di legatura con DNA a barre aggregato da 30 μL, adattatore nativo da 5 μL, buffer di legatura da 10 μL (5×) e Ligasi di DNA T4 da 5 μL.
    2. Mescola bene la reazione pipettando delicatamente e girando brevemente verso il basso. Incuba la reazione per 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aggiungere 20 μL di sfere magnetiche sospese alla reazione e mescolare tramite pipetta. Incubare su un miscelatore rotatore per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Fai girare il campione e la pellet sul rack magnetico. Tieni il tubo sul magnete e sposta la pipetta dal soprandante.
    5. Lavare le perle aggiungendo un tampone a frammenti brevi (SFB) da 125 μL. Fai girare le perline per risospese, girare verso il basso, poi riportare il tubo nel rack magnetico e lasciare che le perline si trasformino. Rimuovi il soprantantante usando una pipetta, poi scartalo.
    6. Ripeti il passaggio precedente.
    7. Spina giù e rimetti il tubo sul magnete. Sblocca qualsiasi residuo di soprantagente. Rimuovere il tubo dal rack magnetico e risospendere il pellet in un tampone di eluzione (EB) da 15 μL.
    8. Centrifuga e incuba per 10 minuti a 37°C. Agita il campione ogni 2 minuti con un leggero colpo per 10 secondi per favorire l'eluzione del DNA.
    9. Spalma le perline su un magnete finché l'eluato non è chiaro e incolore, per almeno 1 minuto.
    10. Rimuovere e trattenere 15 μL di eluato contenente la libreria di DNA in un tubo microcentrifugo pulito da 1,5 mL a basso legame al DNA.
    11. Quantifica la libreria finale usando uno spettrofotometro.

5. Preparazione delle cellule di flusso e sequenziamento dei nanopori

  1. Preparazione della cella di flusso
    1. Ispeziona la cella di flusso e conferma ≥80 pori attivi.
    2. Preparare la miscela di innesco combinando 117 μL di soluzione di lavaggio con 3 μL di soluzione di collegamento in un tubo microcentrifuga per un volume totale di 120 μL. Mescolare delicatamente con pipetto per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Carica lentamente l'intera miscela di innesco da 120 μL nella porta di innesco a celle di flusso, assicurandoti che non vengano introdotte bolle d'aria durante il carico.
  2. Caricamento e sequenziamento della libreria
    1. Preparare la miscela di sequenziamento combinando 15 μL di Sequencing Buffer (SB), 10 μL di Library Beads (LIB) e 5 μL di libreria di DNA. Mescola delicatamente pipettando su e giù 3–5 volte per evitare di introdurre bolle. La miscela risultante da 30 μL è pronta per essere caricata o può essere regolata a 45 μL se necessario.
    2. Caricare lentamente 30–45 μL della miscela di sequenziamento nella porta del campione della cella di flusso dispensando la soluzione a gocce.
      ATTENZIONE: Evita di introdurre bolle d'aria e non permettere alla punta della pipetta di toccare la membrana. Chiudi bene la porta di carico dopo aver dispensato.
    3. Inizia a sequenziare con la chiamata base in tempo reale attivata e monitora l'attività dei pori.
    4. Continuare il sequenziamento fino a raggiungere ≥500× copertura per amplicon (raccomandata ≥1000×), per garantire una profondità di lettura sufficiente per una chiamata di base accurata, una generazione affidabile di sequenze consensuali e una rilevazione sicura delle varianti a bassa frequenza.
      NOTA: Se è evidente una bassa copertura di sequenziamento, assicurarsi un input di amplicon di alta qualità alla concentrazione richiesta, pori di celle di flusso attive sufficienti ed estendere la sequenza per raggiungere la copertura raccomandata.

6. Elaborazione dei dati e analisi di varianti

  1. Chiamata di base e demultiplexing
    1. Eseguire bascalling ad alta precisione utilizzando software di base-calling associato alla piattaforma con impostazioni predefinite di alta accuratezza per generare file FASTQ per campione. Demultiplex legge tramite codice a barre e mantiene solo le letture passando i filtri di controllo qualità.
  2. Mappatura di lettura ed elaborazione BAM
    1. Scarica il Toxoplasma gondii reference genome assembly GCF_000006565.2 (TGA4) dal database genomico del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Estrarre il cromosoma VIII (NC_031476.1) per l'analisi SAG2 e il cromosoma XII (NC_031480.1) per l'analisi SAG3 . Indicizza le sequenze di riferimento usando SAMtools e genera un indice di allineamento usando un costruttore di indici di allineamento a lettura lunga.
    2. La mappa legge il genoma di riferimento indicizzato utilizzando un algoritmo di allineamento a lunga lettura ottimizzato per i dati di sequenziamento nanopore (ad esempio, preset per la mappatura a lunga lettura; -ax map-ont).
    3. Converti l'output dell'allineamento in formato BAM, ordina e indica i file BAM usando SAMtools. Aggiungi informazioni di gruppo di lettura a ogni file BAM usando gli strumenti Picard. Calcola la copertura media per luogo usando le statistiche di profondità e genera statistiche di mappatura usando metriche flagstat.
  3. Generazione di sequenze consensuali
    1. Genera sequenze di consenso per amplicon utilizzando un algoritmo di lucidatura del consenso basato su reti neurali con parametri predefiniti. Esportare sequenze di consenso in formato FASTA per l'analisi a valle.
    2. Eseguire allineamenti basati su riferimenti e analisi comparative di sequenze utilizzando database genomici pubblici disponibili. Visualizza allineamenti di lettura e posizioni polimorfiche usando software di visualizzazione genomica.
  4. Chiamata variante
    1. Eseguire il rilevamento di varianti utilizzando un algoritmo di chiamata di varianti basato sul consenso. Separare i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) e gli eventi di inserimento/delezione (INDEL) utilizzando strumenti di selezione delle varianti (File Supplementare 1).
    2. Applica soglie di filtraggio di qualità. Per gli SNP, varianti di filtro con, ad esempio, QD < 2.0, FS > 60.0 o MQ < 40.0. Per gli INDEL, varianti di filtro con, ad esempio, QD < 2.0 o FS > 200.0.
    3. Comprimere e indicizzare file VCF filtrati utilizzando strumenti standard di elaborazione VCF. Genera statistiche varianti utilizzando utility di riassunto VCF.
  5. Assegnazione del genotipo
    1. Estrarre varianti specifiche per loco dalle regioni SAG2 e SAG3 e confrontare i profili polimorfi con le sequenze di ceppo di riferimento per assegnare i genotipi a T. gondii .

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Risultati

Il DNA genomico di Toxoplasma gondii è stato amplificato con successo tramite reazione a catena della polimerasi (PCR) che ha preso di mira due marcatori genetici: SAG2 e SAG3 (Figura 2). Dopo la purificazione, i prodotti PCR hanno prodotto bande distinte delle dimensioni attese sull'elettroforesi del gel di agarosio, corrispondenti a 639 bp (SAG2) e 1158 bp (SAG3). La chiarezza e la consistenza di queste bande ha...

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Discussione

Questo studio dimostra l'utilità del sequenziamento Oxford Nanopore a lunga lettura combinato con un approccio mirato multi-locus per una genotipizzazione rapida e affidabile di Toxoplasma gondii. Concentrandoci su due loci antigenici di superficie ben caratterizzati, SAG2 e SAG3, stabiliamo una prova di concetto per il sequenziamento multi-locus basato su Oxford Nanopore attraverso analisi comparative dei ceppi RH (Tipo I) e ME49 (Tipo II), dimostrando la capa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero egiziano dell'Istruzione Superiore e della Ricerca Scientifica, rappresentato dall'Ufficio Egiziano per gli Affari Culturali e Educativi di Londra, e dall'UKRI MRC (MR/X502947/1). La Figura 1 è stata creata con BioRender.com

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarose powderThermo Fisher Scientific16500100Per elettroforesi su gel
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065Medium per coltura cellulare
epi2me-labs/wf-amplicon Nextflow workflow (v1.2.1)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AWorkflow Nextflow per l'elaborazione e l'analisi dei dati di sequenziamento degli ampliconi nanopore; la versione 1.2.1 è stata utilizzata per l'analisi riproducibile dei dati MinION.
epi2me-labs/wf-alignment Nextflow workflow (v1.2.3)Oxford Nanopore Technologies, UKN/AWorkflow Nextflow per l'allineamento delle letture di sequenziamento nanopore alle sequenze di riferimento e visualizzazione integrata utilizzando IGV; la versione 1.2.3 è stata utilizzata per l'analisi riproducibile dei dati MinION.
Ethyl alcohol, pureMerck Life Science51976-500ML-FPer la pulizia con perline
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichMFCD00132239Supplemento per la coltura cellulare
Flow Cell Wash KitOxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004Lavaggio della flow cell
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (10 kb)Thermo Fisher ScientificSM1331Conferma delle dimensioni
HFF-1 human foreskin fibroblast cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)SCRC-1041Fibroblasti dermici umani isolati dal prepuzio neonatale; utilizzati per la propagazione dei parassiti
MinION Flow Cell (R10.4.1)Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114Flow cell per il sequenziamento
MinION Mk1B Sequencing DeviceOxford Nanopore Technologies, UKMIN-101BSequenzer nanopore; il sequenziamento è stato eseguito utilizzando il software MinKNOW (v25.09.16) per il controllo del dispositivo e l'identificazione in tempo reale delle basi.
MinKNOW SoftwareOxford Nanopore Technologies, UKN/ASoftware utilizzato per il controllo del dispositivo MinION Mk1B, il sequenziamento in tempo reale e l'identificazione delle basi; versione 25.09.16.
Native Barcoding Kit 24 V14Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24Barcoding per campioni multiplex
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNew England BiolabsM0367Legazione del DNA
NEBNext Quick Ligation ModuleNew England BiolabsE6056Legazione dell'adattatore
NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×)New England BiolabsB6058Utilizzato nella legazione del DNA
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNew England BiolabsE7546Preparazione della libreria
Nuclease-free waterThermo Fisher ScientificR0581Grado di biologia molecolare
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit Macherey-Nagel740609.5Purificazione del prodotto PCR
Penicillin–Streptomycin (1%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)15140-122Miscela di antibiotici
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific (Gibco)10010023Buffer di lavaggio
Q5 High-Fidelity 2× Master MixNew England BiolabsM0492SPolimerasi ad alta precisione
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen69504Estrazione del DNA
Quick T4 DNA LigaseNew England BiolabsM2200Enzima per la legazione degli adattatori
SYBR Safe DNA Gel StainThermo Fisher ScientificS33102Colorante per DNA
TriTrack DNA Loading Dye (6×)Thermo Fisher ScientificR1161Caricamento dei campioni nel gel
Trypsin–EDTA (0.25%)Thermo Fisher Scientific (Gibco)25200056Per il passaggio delle HFF
1× TAE o 1× TBE buffer——Buffer di funzionamento
2× PCR premix——Mix pronto per PCR

Riferimenti

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