Un dispositivo millifluidico in coltura continua per lo studio di Escherichia coli in condizioni nutritive basse e fluttuanti

Sommario

Presentiamo un protocollo per il dispositivo di coltura millifluidica continua (MCCD), che consente la coltivazione di popolazioni batteriche in condizioni costanti di bassi nutrienti (fino a centinaia di concentrazioni nanomolari) o fluttuazioni temporali dei nutrienti su una scala temporale di tempo.

Abstract

Gli habitat microbici in natura sono spesso caratterizzati da basse concentrazioni di nutrienti misti, eterogeneità spaziale e fluttuazioni temporali. Tuttavia, i metodi tradizionali di coltivazione in laboratorio non riescono a replicare queste condizioni. Le colture batch non possono sostenere la crescita in ambienti a basso contenuto di nutrienti, mentre i chemostati mantengono una crescita in stato stazionario con un singolo nutriente limitante, ma sono difficili da implementare quando l'obiettivo è mantenere basse concentrazioni definite di miscele di nutrienti o introdurre fluttuazioni rapide. I sistemi microfluidici generano ambienti dinamici ma producono biomassa insufficiente per analisi omiche a livello popolazionale. Per affrontare queste limitazioni, introduciamo il dispositivo di coltura continua millifluidica (MCCD), una piattaforma versatile per studiare le risposte microbiche a condizioni nutritive stabili e fluttuanti. Il MCCD ospita popolazioni batteriche all'interno di un filtro Sterivex (membrana filtrante porosa di fluoruro di polivinilidene [PVDF] da 0,45 μm), dove un flusso continuo di substrato sostiene condizioni di coltura stabili prevenendo al contempo la depurazione dei nutrienti. Un sistema a valvola solenoide a tre vie, controllato tramite software personalizzato Matlab, consente fluttuazioni precise dei nutrienti su scala minuta. Questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo per operare il MCCD in due modalità: (1) condizioni costanti a basso contenuto di nutrienti e (2) condizioni a flusso di nutrienti fluttuanti. Utilizzando questo sistema, Escherichia coli cresceva esponenzialmente in una miscela di amminoacidi e nucleobasi presenti a decine o centinaia di concentrazioni nanomolari, raggiungendo concentrazioni cellulari dell'ordine di^10-9 cellule/mL. Ricreando caratteristiche chiave degli habitat microbici naturali, il MCCD consente lo studio della crescita batterica e della fisiologia in condizioni controllate ma ecologicamente rilevanti in E. coli e altre specie microbiche.

Introduzione

I batteri negli habitat naturali incontrano un paesaggio nutrizionale che spesso varia sia nella composizione che nella concentrazione e può fluttuare su una vasta gamma di scale^{temporali 1, 2, 3, 4}. In ambienti come l'oceano⁵, il suolo³ e l'intestino⁶, la crescita microbica è frequentemente limitata da uno o più nutrienti essenziali, e la disponibilità di nutrienti può variare a causa di processi fisici, chimici e^{biologici 4}. Queste miscele di nutrienti e le loro fluttuazioni guidano strategie microbiche per la sopravvivenza e la crescita, modellando le risposte attraverso diversi livelli dell'organizzazione^{biologica 4}.

Le adattamenti microbici alla dinamica dei nutrienti avvengono a livello di comunità, popolazione e singola cellula. A livello di comunità, le fluttuazioni possono favorire la coesistenza delle specie⁷, coordinare la composizione della comunità e l'attività metabolica con la variazione^{temporale 8}, e creare opportunità per nuove specie di colonizzare⁹. A livello di popolazione, il cambiamento delle condizioni nutrizionali può accelerare l'evoluzione selezionando per cambiamenti^{genetici 10} o indurre variabilità fenotipica, incluse strategie di^{bet-hedging 11}, che migliorano la sopravvivenza in condizioni imprevedibili. A livello di singola cellula, i batteri modificano la loro fisiologia in risposta all'ambiente^{nutrizionale 12,13}. Un esempio recentemente riportato è una fisiologia specifica che conferisce ai batteri un vantaggio di crescita in condizioni^{variabili 14}. Poiché i batteri incontrano frequentemente limitazioni di nutrienti, studiare come rispondono a condizioni di nutrienti bassi e variabili — sia come singole cellule che all'interno di popolazioni o comunità — è essenziale per comprendere il loro comportamento nei loro ambienti naturali.

I chemostati sono particolarmente adatti per studiare la crescita sotto limitazione di un singolo nutriente, ma sono difficili da usare quando l'obiettivo è controllare le concentrazioni di più nutrienti in miscele a bassa concentrazione. I chemostati sono stati strumenti preziosi per studiare l'adattamento batterico alla limitazione dei nutrienti, offrendo un ambiente ben controllato e stabile. Tuttavia, il loro funzionamento li limita intrinsecamente a condizioni in cui la crescita è limitata da un singolo elemento essenziale di nutrienti. In un chemostato, il tasso di diluizione viene regolato in modo che la crescita cellulare bilanci l'apporto di un nutriente limitante, fissando così la velocità di crescita piuttosto che le concentrazioni di singoli^{nutrienti 15}. Questo quadro non si generalizza facilmente agli ambienti contenenti miscele di nutrienti sostituibili—come molteplici fonti di carbonio—perché il tasso di diluizione controlla solo il tasso di crescita complessivo, non le concentrazioni di ogni componente nel^{mezzo 16,17}. Di conseguenza, le concentrazioni dei singoli nutrienti e i loro modelli di co-utilizzo emergono dall'utilizzo microbico piuttosto che prescritti^{esternamente 16,17}.

Inoltre, sebbene le fluttuazioni dei nutrienti possano essere indotte nei chemostati, sono difficili ottenere fluttuazioni rapide o singoli spostamenti su scala di minuti a causa dei volumi di coltura tipicamente elevati. I dispositivi microfluidici sono emersi come strumenti potenti per creare ambienti nutrienti precisi a bassa concentrazione e^{fluttuanti 14}. Quando abbinate alla videomicroscopia, permettono di misurare la crescita delle singole cellule. Sebbene i sistemi microfluidici permettano la quantificazione dell'espressione di proteine selezionate utilizzando reporter fluorescenti, a differenza dei chemostati, i dispositivi microfluidici tipici sono troppo piccoli per produrre la biomassa necessaria ad analisi omiche, ad esempio per studiare il proteoma di una popolazione batterica. Per colmare questo divario, abbiamo sviluppato il dispositivo di coltura continua millifluidica (MCCD).

Il MCCD consente la crescita batterica in condizioni di nutrienti controllate, incluse condizioni costanti a basso contenuto di nutrienti con esaurimento minimo o nullo, così come condizioni di nutrimento fluttuanti, utilizzando un sistema di coltura a flusso continuo in grado di generare biomassa sufficiente per analisi a valle. Il MCCD utilizza un filtro PVDF da 0,45 μm come recipiente di coltura, in cui il mezzo viene continuamente rifornito da una pompa peristaltica che fornisce un mezzo fresco da un serbatoio (Figura 1A). La membrana porosa del filtro trattiene i batteri permettendo un flusso prescritto di nutrienti, che previene l'esaurimento anche a basse concentrazioni (da centinaia di nanomolari a micromolari). Poiché la biomassa viene trattenuta mentre il mezzo fresco scorre continuamente attraverso il dispositivo, il MCCD condivide somiglianze con i retentostati¹⁸, in cui le celle vengono trattenute mentre il mezzo viene rinnovato. Tuttavia, il MCCD si differenzia dai retentostati classici per l'architettura e il modo di somministrare i nutrienti. Il retentostato funziona tipicamente come un reattore bulk mescolato, dove le cellule sono sospese in un volume di coltura ben miscelato. In tali condizioni, la disponibilità di nutrienti dipende dall'equilibrio tra miscelazione, diffusione e assorbimento cellulare, e possono verificarsi esaurimenti o gradienti locali, in particolare a basse concentrazioni di nutrienti e densità cellulari elevate. Al contrario, nella MCCD, le cellule si assemblano direttamente sulla membrana all'interno della cartuccia di Sterivex a piccolo volume, formando strati spessi solo poche cellule che sono continuamente esposti a un mezzo in movimento. Non viene imposto alcun mix attivo all'interno della cartuccia; invece, il mezzo viene omogeneizzato a monte e fornito da flusso continuo. I nutrienti sono forniti tramite trasporto convettivo attraverso gli strati cellulari sottili e, poiché la distanza di diffusione è piccola e la portata elevata, i gradienti locali di nutrienti sono minimizzati. Di conseguenza, le condizioni nutrizionali sperimentate dalla popolazione sono principalmente determinate dalla composizione del mezzo in arrivo, permettendo condizioni a basso contenuto di nutrienti più coerenti e ben definite rispetto a quelle che si possono garantire nei sistemi di ritenzione agitati.

Figura 1: Il dispositivo di coltura continua millifluidica (MCCD) per colture batteriche in condizioni di bassa concentrazione o fluttuanti di nutrienti. (A) Schema del MCCD per condizioni nutrienti costanti. Una pompa peristaltica guida il flusso di un mezzo fresco da un serbatoio attraverso un filtro PVDF da 0,45 μm contenente cellule batteriche. La membrana porosa nel filtro trattiene i batteri permettendo al mezzo di passare attraverso. Il flusso continuo del mezzo mantiene condizioni nutrienti costanti all'interno del filtro, anche a concentrazioni molto basse. (B) Schema del MCCD per condizioni nutrizionali fluttuanti. Una valvola solenoide a tre vie controllata tramite software a monte della pompa peristaltica alterna l'afflusso del mezzo tra due serbatoi (ad esempio, alta concentrazione di nutrienti, C_Alto, e basso concentramento di nutrienti, C_Basso). Il software controlla la posizione dello stantuffo della valvola per determinare la sorgente di afflusso attiva. (C) Assemblaggio fluidico per condizioni nutrienti costanti. Un tappo con tre tubi in silicone che lo attraversano sigilla la bottiglia contenente un mezzo fresco. Un tubo si collega a un filtro di ventilazione per l'aerazione, mentre gli altri due trasportano il mezzo ai filtri. I raccordi Barb-to-Male Luer collegano questi tubi al tubo peristaltico e collegano ogni tubo peristaltico a una valvola di ritorno unidirezionale, che funge da punto di ingresso al filtro. L'uscita del filtro è inoltre dotata di una valvola di ritegno unidirezionale. L'immagine mostra due campioni, ciascuno contenuto in un unico filtro. (D) Assemblaggio fluidico per condizioni nutritive fluttuanti. La piattaforma metallica ospita il microcontrollore e i componenti elettronici che controllano due valvole solenoide tramite software personalizzato MATLAB. I raccordi filettati a spina collegano sia le prese che le uscite delle valvole solenoide al tubo. Ogni valvola ha due prese per i due mezzi alternativi, qui un mezzo ad alta concentrazione di nutrienti, C _High, tubi etichettati con il rosso, e un mezzo a bassa concentrazione di nutrienti, C_Low, con il colore blu. I mezzi sono contenuti all'interno di bottiglie tappate con un filtro di ventilazione, come in (C). Le uscite delle valvole solenoidi si collegano ai filtri tramite tubi peristaltici, come nell'assemblaggio a regime stazionario (C). L'immagine mostra due campioni, ciascuno contenuto in un unico filtro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Inoltre, l'incorporazione di una valvola solenoide a tre vie controllata tramite software a monte del filtro Sterivex consente all'utente di commutare il flusso del mezzo tra due mezzi contenuti in diversi serbatoi (Figura 1B). Di conseguenza, il dispositivo può essere utilizzato per studiare la risposta dei batteri a un ambiente stabile a condizioni nutrienti costanti (inclusa bassa concentrazione) o a fluttuazioni dei nutrienti, con scale di tempo di vari minuti o più.

Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento del MCCD per studiare batteri sia in condizioni a basso contenuto di nutrienti che a condizioni di volatilità nutritiva. Ad esempio, questo protocollo fornisce una guida passo dopo passo per condurre un esperimento di crescita utilizzando Escherichia coli NCM3722 in due modalità operative del MCCD: condizioni costanti a basso contenuto di nutrienti e condizioni fluttuanti di nutrimenti. Il sistema MCCD può essere facilmente adattato ad altre condizioni nutrizionali e specie microbiche, rendendolo una piattaforma versatile per studiare la fisiologia batterica in ambienti nutrienti tipici di quelli incontrati in natura.

Protocollo

1. Crescita batterica in condizioni di nutrienti costanti

NOTA: Questo protocollo descrive la procedura per eseguire una curva di crescita di E. coli NCM3722 in una condizione molto diluita di Medium Ricco Definito ("basso RDM"). Questa curva di crescita dura 12 ore, con un campione raccolto ogni 2 ore (per un totale di 6 punti temporali). Il principio chiave di questo protocollo è che ogni punto temporale corrisponde a un singolo filtro Sterivex (d'ora in poi chiamato filtro PVDF a 0,45 μm). Per raccogliere un campione, la coltura all'interno del filtro viene prelevata centrifugandola capovolgendosi, il numero delle celle viene quantificato e il filtro viene scartato. Ogni filtro PVDF da 0,45 μm produce un solo campione. La preparazione dell'esperimento richiede la definizione di tre parametri chiave sperimentali: la portata della pompa peristaltica, la durata dell'esperimento e il numero desiderato di campioni (cioè il numero di filtri PVDF da 0,45 μm). Imposta la portata iniziale a 2 mL/min. Regolare questo parametro secondo necessità (ad esempio, aumentare la portata per mantenere l'apporto di un nutriente molto diluito).

1. Preparazione del materiale e del materiale
   NOTA: Poiché ogni filtro corrisponde a un singolo campione temporale, il tempo di esecuzione sperimentale di ciascun filtro PVDF da 0,45 μm varia a seconda del tempo di raccolta (ad esempio, 2 h per il primo momento, 4 h per il secondo, e così via).
   1. Stimare il volume di mezzo di coltura necessario usando la formula
      ,
      dove n è il numero di campioni (filtri PVDF da 0,45 μm), Q è la portata (in mL/min) e t_i è il tempo di esecuzione sperimentale (in minuti) per ciascun campione.
   2. Moltiplicare per 1,2 per includere un ulteriore 20% di volume per tenere conto della variazione della portata d'acqua. Per questo esempio, calcola
      
   3. Arrotondi il volume calcolato verso l'alto (ad esempio, prepara 6.200 mL in questo esempio).
   4. Prepara il materiale per la sterilizzazione (vedi Tabella 1).
      NOTA: Preparare e sterilizzare i materiali il giorno prima dell'esperimento per garantirne la prontezza e ridurre al minimo i ritardi. Autoclave di questi materiali, eccetto le valvole Luer unidirezionali; sterilizza le valvole con etanolo al 70%.
      1. Collega entrambe le estremità di sei tubi peristaltici in silicone a raccordi in plastica "Male Luer to Barb" inserendo l'estremità Barb del raccordo nel tubo. Copri le estremità maschile Luer con carta di alluminio per prevenire contaminazioni.
         NOTA: Sono preparati sei tubi peristaltici perché l'esperimento utilizza sei filtri PVDF da 0,45 μm. Tutti i tubi saranno successivamente montati sulla stessa testa della pompa peristaltica in modo che tutti i filtri ricevano un flusso identico.
      2. Metti il tubo dentro un contenitore chiuso e sterilizzabile.
      3. Metti i filtri di ventilazione all'interno di un contenitore chiuso e sterilizzabile.
      4. Posiziona i tappi delle bottiglie con tubi in silicone che passano attraverso i tappi all'interno di un contenitore chiuso e sterilizzabile.
         NOTA: I tappi di bottiglia a tubi utilizzati in questo protocollo sono dotati di tre tubi che attraversano i tappi: due tubi di uguale diametro per fornire il mezzo ai filtri PVDF da 0,45 μm, e un terzo tubo di diametro più ampio. Questi tubi sono fissati saldamente ai tappi e non possono essere rimossi.
      5. Immergi 12 valvole di ritegno Luer unidirezionali in una soluzione al 70% di etanolo e lasciale sterilizzarle tutta la notte.
         NOTA: (PUNTO DI PAUSA) I materiali sterilizzati possono essere conservati sommersi e sigillati a temperatura ambiente per fino a 24 ore prima dell'esperimento. Prima dell'uso, rimuovere le valvole dall'etanolo e risciacquare con acqua sterile ultra-pura per rimuovere residui di etanolo. In alternativa, le valvole di ritegno possono essere stampate in 3D utilizzando materiali autoclavabili per consentire la sterilizzazione tramite autoclaving invece che trattamento con etanolo.
   5. Autoclave i tubi peristaltici, i filtri di ventilazione, i tappi di bottiglia, il cilindro graduato e le bottiglie utilizzando le impostazioni standard di laboratorio di laboratorio.
   6. Preparare 6.200 mL di mezzi a basso ricchezza definita (RDM; vedi Tabella dei Materiali) mescolando i reagenti elencati nella Tabella 2.
      NOTA: Preparare il mezzo il giorno dell'esperimento, durante il periodo di attesa di circa 5 ore dopo l'inizio della pre-coltura (vedi passo 1.2.1). Questo preserva la freschezza media e riduce al minimo il rischio di contaminazione.
2. Preparazione di una pre-coltura batterica
   NOTA: Usa una pre-cultura nella fase esponenziale per iniziare l'esperimento. Durante questa fase, i batteri crescono a velocità costante, sintetizzando i costituenti cellulari in modo equilibrato e dividendosi a una massa cellulare definita. Utilizzare cellule a fase esponenziale per minimizzare la variabilità e standardizzare lo stato fisiologico iniziale.
   1. Il giorno prima dell'esperimento, prepara una coltura notturna (ON) come segue: inoculare 3 mL di RDM intero con una scorta di glicerolo congelata di E. coli NCM3722 in un tubo sterile da 15 mL. Incubare la coltura durante la notte (~16 ore) a 37 °C con agitazione a 200 giri al minuto in un incubatore a scuotere.
      NOTA: (PUNTO DI PAUSA) Una volta che la cultura ON è nell'incubatore, non si seguono ulteriori passaggi in questo giorno. Riprendi il protocollo il giorno successivo procedendo al passo 1.2.2.
   2. Il giorno dell'esperimento, preparare la pre-coltura come segue: aggiungere 6 μL di coltura ON a 6 mL di RDM pieno. Dividere equamente in due tubi di coltura da 15 mL e etichettare i tubetti come A e B. Incubare entrambi i tubi a 37 °C con agitazione a 200 giri/min.
      NOTA: La pre-coltura richiede tipicamente circa 5 ore per raggiungere la fase esponenziale (OD₆₀₀ ≈ 0,5). Usa questo periodo per preparare il mezzo fresco (vedi passo 1.1.6). Non procedere al passo 1.2.3 finché OD₆₀₀ non raggiunge circa 0,5.
   3. Monitorare la densità ottica (OD) a 600 nm usando il tubo B. Procedere con l'esperimento quando OD₆₀₀ raggiunge circa 0,5, indicando una crescita esponenziale in RDM completo per E. coli NCM3722 (vedi sezione 1.4).
      NOTA: Inizia l'esperimento con celle a fase esponenziale per migliorare la riproducibilità e standardizzare le condizioni di partenza.
3. Preparazione di un esperimento nel MCCD con condizioni nutrienti costanti
   NOTA: Eseguire i passaggi da 1.3.1 a 1.3.5 all'interno di un armadietto sterile di biosicurezza immediatamente dopo l'inizio della crescita della pre-coltura.
   1. Assegna il volume medio totale a ogni bottiglia.
      NOTA: Usa le bottiglie come serbatoi medi. Utilizzare tappi di bottiglia dotati di due tubi di somministrazione media, ciascuno dei quali fornisce un filtro PVDF da 0,45 μm. Allocare il volume totale del mezzo (preparato nello step 1.1.6) tra le bottiglie in base alla quantità richiesta da ciascun campione temporale (cioè ciascun filtro PVDF da 0,45 μm) durante il corso dell'esperimento.
      1. Utilizzare la formula fornita nel passo 1.1.1 per determinare il volume di mezzo necessario per ciascun filtro PVDF da 0,45 μm. Ad esempio, usando i seguenti termini:
         
         I volumi medi totali necessari per ogni momento temporale, in ordine cronologico, sono 288, 576, 864, 1152, 1440 e 1728 mL.
      2. Distribuire i volumi medi calcolati tra le bottiglie, raggruppando i volumi necessari per due punti temporali in un'unica bottiglia. Ad esempio: ~900 mL in una bottiglia da 1 L (per i punti temporali 1 e 2), ~2.100 mL in una bottiglia da 2,5 L (per i punti temporali 3 e 4), ~3200 mL del mezzo in una bottiglia da 4 L (per i punti di tempo 5 e 6).
   2. Sigilla ogni bottiglia con i tappi a tubo (Figura 1C). Stringi bene i tappi per evitare perdite.
   3. Collega un filtro di ventilazione da 0,2 μm al tubo in silicone più largo che si estende dal tappo della bottiglia a tubo (Figura 1C). Questo permette uno scambio d'aria sterile durante l'esperimento.
   4. Attaccare un'estremità di ciascun tubo peristaltico (con raccordi già fissati; vedi sezione 1.1.4 sulla preparazione del materiale) ai tubi in silicone di diametro più piccolo che si estendono dai tappi delle bottiglie a tubo (Figura 1C). Assicurati di connessioni sicure per mantenere la sterilità. Lasciare la copertura in alluminio sul raccordo libero di blocco Luer maschio fino all'inizio dell'esperimento per prevenire contaminazioni.
   5. Posizionare le bottiglie con i tubi assemblati e la pompa peristaltica in un incubatore impostato a 37 °C. Fissare il tubo nei canali della testa della pompa peristaltica.
      NOTA: Tutti i tubi peristaltici sono montati sulla stessa testa di pompa di una singola pompa peristaltica, in modo che tutti i filtri PVDF da 0,45 μm ricevano il mezzo dalla stessa pompa. L'uso di una singola pompa garantisce che la portata sia identica tra i filtri e previene variabilità che potrebbero derivare dalle differenze tra le pompe.
4. Protocollo di un esperimento nel MCCD con condizioni nutrienti costanti
   1. Diluire la pre-coltura (OD = 0,5) 1:10 aggiungendo 600 μL di pre-coltura a 5,4 mL di RDM fresco basso.
   2. Utilizzando una pipetta da 1 mL, si introducono 1 mL della pre-coltura diluita in ciascuno dei sei filtri PVDF da 0,45 μm.
   3. Risciacqua le valvole di ritegno unidirezionale con acqua ultrapura autoclaviata e collega una a ciascuna estremità di ciascun filtro PVDF da 0,45 μm.
   4. Rimuovi i coperchi in alluminio dai raccordi del tubo peristaltico.
   5. Collegare ciascuno dei sei filtri PVDF da 0,45 μm a un raccordo Luer maschio sul tubo peristaltico (Figura 1C).
   6. Imposta la portata a 2 mL/min sulla pompa peristaltica e avvia il flusso. Definisci questo momento come tempo 0.
   7. Posizionare un contenitore di rifiuti sotto i filtri PVDF da 0,45 μm per raccogliere il flusso in uscita.
      NOTA: La Figura 2A mostra l'assemblaggio completo dell'esperimento all'interno della scatola dell'incubatrice.
5. Raccolta di campioni
   1. Dopo 2 ore, scollega uno dei due filtri PVDF da 0,45 μm collegati alla bottiglia da 1 L.
   2. Svitare le valvole di ritegno unidirezionale e inserire il filtro PVDF da 0,45 μm in un tubo centrifuga da 50 mL con l'ingresso rivolto verso il basso.
   3. Centrifuga il tubo della centrifuga contenente il filtro PVDF da 0,45 μm a 2.000 × g per 2 minuti.
   4. Utilizzando un tronceati, applicare una pressione delicata sull'involucro di plastica all'estremità più vicina all'uscita per aprire il filtro PVDF da 0,45 μm.
      NOTA: Disinfettare il tronceatubo prima dell'uso (ad esempio, passando con etanolo al 70%) per evitare contaminazioni all'apertura del filtro PVDF da 0,45 μm.
   5. Rilascia il cilindro interno contenente la membrana porosa e scarta la sezione del filtro che contiene la membrana.
   6. Risciacquare le pareti interne dell'involucro del filtro PVDF da 0,45 μm (quelle perpendicolari alla direzione di flusso) con il mezzo di coltura raccolto nel tubo della centrifuga.
      NOTA: Questo passaggio garantisce che tutte le cellule intrappolate sulle pareti durante la centrifugazione vengano raccolte.
   7. Misurare il volume totale raccolto utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL.
   8. Nei momenti successivi (4 h, 6 h, 8 h, 10 h e 12 h), scollega i corrispondenti filtri PVDF da 0,45 μm e ripeti i passaggi 1.5.2–1.5.6. Segui questo ordine specifico:
      1. A 4 ore, scollega il secondo filtro PVDF da 0,45 μm collegato alla bottiglia da 1 L.
      2. A 6 e 8 ore scollega i filtri PVDF da 0,45 μm collegati alla bottiglia da 2,5 L.
      3. A 10 e 12 h, scollega i filtri PVDF da 0,45 μm collegati alla bottiglia da 4 L.
         NOTA: Segui questo ordine per abbinare i punti temporali di campionamento ai volumi medi distribuiti nello step 1.3.1.
6. Analisi a valle
   1. Prelevare tre aliquote da 100 μL da ciascun campione e fissare con glutaraldeide fino a una concentrazione finale dell'1,5%.
      ATTENZIONE: Il glutaraldeide è tossico, un forte irritante e un potenziale sensibilizzatore. Maneggiare all'interno di una cappa chimica indossando l'attrezzatura di protezione personale adeguata (camice da laboratorio, guanti in nitrilo e occhiali di sicurezza). Evita il contatto con la pelle e l'inalazione. Smaltire i rifiuti contenenti glutaraldeide secondo le normative istituzionali sui rifiuti chimici pericolosi.
   2. Usa i campioni fissi per contare il numero di cellule per microlitro con citometria a flusso dopo aver marcato con un colorante fluorescente per DNA.
      ATTENZIONE: I coloranti fluorescenti del DNA possono essere mutagenici. Indossare i guanti e smaltire i rifiuti contenenti coloranti secondo le normative istituzionali sulla biosicurezza.
      NOTA: Come alternativa alla colorazione del DNA e alla citometria a flusso, le densità cellulari possono essere stimate impiantando un piccolo volume del campione su piastre agar ricche-medie (ad esempio, LB agar) e contando le unità formative di colonie (CFU).
   3. Moltiplicare il numero di celle per microlitro per il volume totale misurato nel passo 1.5.7 per calcolare il numero totale di celle contenute nel filtro PVDF da 0,45 μm.
   4. Centrifugare il volume rimanente in tubi microcentrifughe da 1,5 mL a 10.000 × g per 4 minuti.
   5. Rimuovi il soprannatante.
   6. Conservare i pellet delle cellule a -80 °C per analisi future (ad esempio, trascrittomica).

Figura 2: Assemblaggio sperimentale del MCCD. (A) Fotografia dell'allestimento MCCD per condizioni nutrienti costanti. L'impianto è alloggiato in una scatola incubatrice per mantenere una temperatura costante, con un contenitore dei rifiuti che raccoglie il mezzo di passaggio. (B) Fotografia dell'allestimento MCCD per condizioni nutritive fluttuanti. La bottiglia etichettata con la nastro rosso contiene un mezzo ad alta concentrazione di nutrienti (C_Alto), mentre la bottiglia etichettata con nastro blu contiene un mezzo a bassa concentrazione di nutrienti (C_Basso). La piattaforma metallica al centro sostiene i componenti che controllano le fluttuazioni dei nutrienti, corrispondenti a quelle descritte nella Figura 1D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Crescita batterica in condizioni di nutrimenti fluttuanti

1. Assemblaggio di un regolatore per una valvola solenoide
   NOTA: Controlla la valvola solenoide a tre vie utilizzando un circuito di commutazione basato su microcontrollore collegato a un computer che utilizza un'interfaccia grafica personalizzata (GUI) sviluppata in MATLAB.
   1. Assemblare il circuito di controllo della valvola solenoide (Figura 3A).
      1. Collega un pin di uscita digitale del microcontrollore alla base di un transistor NPN tramite una resistenza da 1 kΩ.
      2. Collega il collettore del transistor al terminale negativo della valvola solenoide.
      3. Collega l'emettitore del transistor a massa.
      4. Collega il terminale positivo della valvola solenoide a un alimentatore DC esterno compatibile con la tensione della valvola.
      5. Posiziona un diodo sopra i terminali del solenoide. Collega il lato striato del diodo alla linea di alimentazione positiva.
         NOTA: Il diodo sopprime i picchi di tensione generati quando il solenoide viene spento.
   2. Collega raccordi in plastica "Threaded to Hose Barb" alle valvole solenoidi, assicurandosi che l'estremità del Barb si estenda verso l'esterno.
   3. Installa MATLAB R2022b o successivo su un computer con connettività USB.
   4. Installa il pacchetto di supporto MATLAB necessario per la comunicazione seriale con hardware microcontrollo.
   5. Collega la scheda microcontrollore al computer usando un cavo USB per stabilire la comunicazione seriale.
   6. Apri la GUI basata su MATLAB utilizzata per generare condizioni nutrizionali fluttuanti nel MCCD (disponibile nel link https://github.com/juanitaLara/MCCD).
   7. Verifica la connessione tra le valvole solenoide e la piattaforma GUI di MATLAB:
      1. Apri la piattaforma GUI in Matlab e clicca sul pulsante Collega (Figura 3B). Aspetta che il messaggio che il Controller connesso appaia con successo nella finestra dei comandi.
      2. Inserisci un valore per il passo temporale (ad esempio, 5 s per le fasi Alta e Bassa) sotto il pannello di funzionamento automatizzato .
      3. Osserva le valvole solenoidi e ascolta il suono di clic che producono durante il passaggio tra i due mezzi.
      4. Utilizzando un orologio, verifica che le valvole solenoidi si commutino esattamente all'intervallo specificato (ad esempio, ogni 5 secondi).
         NOTA: Esegui questa verifica prima di ogni esperimento per confermare la comunicazione e la corretta commutazione delle valvole. (PUNTO DI PAUSA) Dopo aver verificato il funzionamento della valvola solenoide, il sistema può rimanere assemblato all'interno dell'incubatore per diverse ore prima di iniziare l'esperimento.
2. Preparazione di materiali e materiali
   NOTA: Questo protocollo prevede l'alternanza delle condizioni nutrizionali tra RDM basso e alto con un periodo di 1 ora (30 minuti in RDM alto seguiti da 30 minuti in RDM basso). L'esperimento si svolge per tre ore di fluttuazioni, con due campioni raccolti: (1) a 3 ore e 1 minuto (fase RDM alta, subito dopo il passaggio da bassa a alta), e (2) a 3 ore e 31 minuti (fase RDM bassa, subito dopo il passaggio da alta a bassa).
   1. Stimare i volumi necessari di media colturale per fasi sperimentali.
      1. Per prima cosa, calcolare i volumi necessari per le prime 3 ore (tre periodi completi di fluttuazione):
         basso volume RDM =1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtri PVDF da 0,45 μm] = 432[mL]
         alto volume RDM =1,2 × 2[mL/min] × 90[min] × 2[filtri PVDF 0,45 μm] = 432[mL]
      2. Calcola il volume necessario per la fase finale di 30 minuti:
         alto volume RDM =1,2 × 2[mL/min] × 30[min] × 1[filtri PVDF 0,45 μm] = 72[mL]
      3. Arrotonda i volumi a valori comodi (ad esempio, 500 mL di RDM basso e 600 mL di RDM alto).
   2. Preparare i materiali per la sterilizzazione con autoclave (vedi Tabella 3) seguendo i passaggi 1.1.4 –1.1.5.
      NOTA: Preparare e sterilizzare i materiali il giorno prima dell'esperimento per garantirne la prontezza e minimizzare i ritardi nel giorno dell'esperimento (passaggi 2.2.3 e 2.2.4). Questa configurazione, rispetto agli esperimenti a nutrienti costanti, richiede tubi aggiuntivi per collegare le bottiglie di mezzo direttamente alla valvola solenoide (Figura 1B,D). Questi tubi richiedono un solo raccordo "Barb a maschio Luer", poiché i raccordi della valvola solenoide sono preassemblati. Copri le estremità di questi tubi con carta stagnola prima di autoclavare.
   3. Sterilizza il tubo peristaltico preparato, i filtri di ventilazione, i tappi, il cilindro graduato e le bottiglie in un'autoclave.
   4. Immergi 4 valvole di ritegno Luer unidirezionali in una soluzione al 70% di etanolo e lasciale sterilizzare tutta la notte.
      NOTA: (PUNTO PAUSA) Le valvole di ritorno sterilizzate possono rimanere immerse nell'etanolo durante la notte e conservate sigillate a temperatura ambiente fino a 24 ore. Prima dell'uso, risciacqua le valvole con acqua sterile Milli-Q.
   5. Pulire e sterilizzare le valvole solenoidi risciacquandole con etanolo al 70% 3–5 volte, seguite da acqua ultrapura 3–5 volte.
   6. Il giorno dell'esperimento, durante il periodo di attesa di circa 5 ore dopo la preparazione pre-coltura (vedi passo 2.3), preparare 500 mL di RDM basso e 600 mL di RDM alto mescolando i reagenti elencati nella Tabella 4.
      NOTA: Preparare il materiale il giorno dell'esperimento garantisce la freschezza e minimizza i rischi di contaminazione.
3. Preparazione di una pre-coltura batterica
   1. Segui i passaggi descritti nel passaggio 1.2.
4. Preparazione di un esperimento nel MCCD con condizioni di nutrimenti fluttuanti
   NOTA: Eseguire i passaggi 2.4.1–2.4.4 all'interno di un armadietto sterile di biosicurezza immediatamente dopo l'inizio della crescita della pre-coltura.
   1. Metti ogni mezzo in una bottiglia da 1 L.
   2. Sigilla le bottiglie con tappi preassemblati dotati di tre porte e tubi in silicone preinstallati. Stringi bene i tappi per evitare perdite.
   3. Collega un filtro di ventilazione da 0,2 μm al tubo largo in silicone che si estende da una delle porte di ogni tappo di bottiglia.
   4. Collega il "tubo di ingresso" (mostrato nella Figura 1D) ai tubi in silicone che si estendono dai tappi delle bottiglie tubati prima di collegarlo alle valvole solenoidi:
      1. Attacca un'estremità del tubo in silicone (con un solo raccordo attaccato) al tubo che si estende dal tappo basso RDM.
      2. Lasciare il coperchio in alluminio sul raccordo di blocco Male Luer libero fino a quando le bottiglie non vengono portate all'incubatore per evitare contaminazioni.
      3. Ripeti il passo 2.4.4.1 per la bottiglia ad alto RDM.
   5. Posizionare le bottiglie con il loro "tubo di ingresso" assemblato, la pompa peristaltica e le valvole solenoidi con il controller all'interno di un incubatore impostato a 37 °C.
   6. Collega il "tubo di ingresso" (collegato nel passo 2.4.4) alle prese d'aria delle valvole solenoidi nel modo seguente:
      1. Collega i due tubi dalla bottiglia a basso RDM a una delle due prese di ciascuna valvola solenoide (tubi etichettati con nastro blu nella Figura 1D).
      2. Collega i due tubi dalla bottiglia ad alto RDM a una delle due prese di ciascuna valvola solenoide (tubi etichettati con nastro rosso nella Figura 1D).
   7. Collegare un tubo in silicone compatibile con pompa peristaltica (con un solo raccordo) all'uscita di ogni valvola solenoide (Figura 1D). Lasciare il coperchio in alluminio sul raccordo libero del blocco maschio Luer finché l'esperimento non inizia a mantenere la sterilità.
5. Protocollo di un esperimento nel MCCD con condizioni di nutrimento fluttuante
   1. Verifica la connessione tra le valvole solenoidi e il software Matlab eseguendo il passo 2.1.7.
   2. Inserisci i valori desiderati dei passi temporali per le fluttuazioni nella piattaforma GUI di Matlab: inserisci passi di tempo di 1800 s in RDM alto (30 min) e 1800 s in RDM basso (30 min).
   3. Seleziona Basso sotto il menu Start per iniziare nella condizione RDM Basso (Figura 3).
   4. Semina i due filtri PVDF da 0,45 μm come descritto nel passo 1.4.
   5. Inizia l'esperimento.
      NOTA: La Figura 2B mostra l'assemblaggio fluidico completo per questo esperimento.
6. Raccolta di campioni
   1. Raccogli campioni come nel passo 1.5. Preleva il primo filtro PVDF da 0,45 μm a 3 ore e 1 minuto e il secondo a 3 ore e 31 minuti.
      NOTA: Scollega prima uno dei due filtri; entrambi i filtri sono alimentati dallo stesso supporto.
7. Analisi a valle
   1. Segui i passaggi descritti nel passo 1.6 per contare il numero di cellule tramite citometria di flusso e per processare e conservare campioni per analisi a valle (ad esempio, trascrittomica).

Figura 3: Controllore delle valvole solenoidi per imporre fluttuazioni di nutrienti. (A) Schema elettrico del circuito elettronico utilizzato per controllare la valvola solenoide. Il circuito è composto da una scheda microcontrollore, un transistor utilizzato come elemento di comutazione, una resistenza collegata alla base del transistor e un diodo flyback posizionato sulla valvola solenoide per proteggere il circuito dai picchi di tensione generati durante la commutazione della valvola. Il microcontrollore controlla il transistor, che a sua volta commuta l'alimentazione fornita alla valvola solenoide. Adattato con permesso dalla rif. ²⁰ . (B) Dopo aver collegato la scheda microcontrollore sia al computer che esegue l'interfaccia grafica sia a una sorgente di alimentazione con la tensione richiesta dalle valvole solenoidi, la comunicazione viene stabilita cliccando sul pulsante Collega. Le valvole possono essere azionate manualmente utilizzando il pannello di Funzionamento Manuale , dove l'utente seleziona il mezzo da pilotare (ad esempio, "Alto" o "Basso"). In alternativa, il pannello Operazione Automatizzata permette all'utente di specificare il mezzo iniziale e i passi di tempo (in secondi) per ogni fase (Alto e Basso), e di avviare l'operazione cliccando sul pulsante Start . Il Real-time Monitor mostra una funzione a gradini (0 = Basso, 1 = Alto) nel tempo, che indica quale mezzo stava passando attraverso le valvole solenoidi verso i filtri nei secondi precedenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Risultati

In questo studio, abbiamo utilizzato il MCCD per quantificare il tasso di crescita di E. coli NCM3722 in condizioni costanti di basso contenuto di nutrienti a tre concentrazioni di RDM. Queste concentrazioni sono state derivate dalla formula del mezzo ricco definito (RDM) descritta da^{Neidhardt 19}, con gli integratori di amminoacidi e nucleobasi diluiti rispettivamente allo 0,5%, 0,25% e 0,01% della formulazione originale.

Sono ...

Discussione

I metodi di coltivazione batterica che catturano la complessità dei nutrienti degli ambienti naturali sono essenziali per far progredire lo studio della fisiologia microbica oltre condizioni di laboratorio semplificate. Gli ecosistemi naturali contengono miscele di nutrienti che coprono un'ampia gamma di concentrazioni, che spesso non supportano tassi di crescita massimi 1,3,4,21,22,23.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1K Ohm Resistor	BC Robotics	ELC-021	Power Rating: 1/6 W
1N4001 Diode	BC Robotics	ELC-001	DC Reverse Voltage: 50 V; Average Rectified Current: 1 A
3-stop platinum-cured silicone peristaltic tubing	Innofluid	SE-TUB-SIL-SSS-2.4*0.8	Inner diameter 0.8 mm; outer diameter 2.4 mm; compatibile con la pompa peristaltica utilizzata
3-way Solenoid valves	Emerson Electric Co.	0055A301L0T00F3	12 V DC, 1 W
Aluminum foil			Adatto per l'autoclavaggio
Arduino Uno Rev4	Arduino	SKU ABX00173
Autoclave	Systec	D-200	O azienda diversa
Cap closure with three ports – for 1 and 2 L bottles	Nalgene	2162-0531	O azienda diversa (assicurarsi che si adattino alle bottiglie selezionate)
Cap closure with three ports – for 4 L bottle	Nalgene	2162-0830	O azienda diversa (assicurarsi che si adattino alle bottiglie selezionate)
Cell density meter CO8000	WPA biowave		OD meter
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Centrifuge che si adatta ai tubi Falcon da 50 mL
Centrifuge	Eppendorf	5424R	Centrifuge che si adatta ai tubi eppendorf da 1,5 e 2 mL
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fischer Scientific	10788561	Tubo Falcon
Culture tubes (14 mL, sterile)	Greiner bio-one		Culture tubes
Ethanol	Sigma Aldrich	493511	Diluire al 70%
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	O azienda diversa
Graduated cylinder - 500 mL	Nalgene	3662-0500	O azienda diversa
Incubator box			Scatola incubatore personalizzata – contattare gli autori corrispondenti per i dettagli di costruzione
LabV1 Intelligent Low Flow Rate Peristaltic Pump	Innofluid	SE-LABV1-AMC12(10)	Disponibile presso Darwin Microfluidics
Male Luer-to-barb fitting	Aldrich	Z277142	Adattatore Luer maschio-a spina compatibile con tubi ID 0,8 mm (vedi Figura 1C)
Male Luer-to-threaded fitting	Aldrich	Z277142	Usato per collegare la valvola solenoide al "tubo di ingresso" (vedi Figura 1D)
Matlab	Mathworks	R2022b o successivo	Software per eseguire il software personalizzato per le valvole solenoidi
MOPS EZ Rich Defined Medium Kit	Teknova	M2105	MOPS medium per Enterobacteria
One-way Luer check valve	Masterflex	30505-92	Previene il riflusso nei serbatoi del mezzo
Pipe cutter - 0-37 mm	KS Tools	2222051	O azienda diversa
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	O azienda diversa
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/16 in	Nalgene	8060-0020	Diametro interno 1/16 in (1,6 mm); utilizzato per esperimenti a nutrienti fluttuanti
Platinum-Cured Silicone Tubing - 1/8 in	Nalgene	8060-0030	Diametro interno 1/8 in (3,2 mm); utilizzato per esperimenti a nutrienti fluttuanti
Polypropylene copolymer bottle - 1 L	Nalgene	2126-1000	O azienda diversa
Polypropylene copolymer bottle - 2 L	Nalgene	2126-2000	O azienda diversa
Polypropylene copolymer bottle - 4 L	Nalgene	2126-4000	O azienda diversa
Serological pipette - 5 mL	Corning	CLS4487	O azienda diversa
Solderless Breadboard	BC Robotics	PROTO-001
Sterivex-HV filter - 0.45 µm PVDF	Millipore	SVHV01015
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S7563	Colorante per acidi nucleici per il conteggio delle cellule nel citometro a flusso
TIP120 Darlington Transistor	BC Robotics	TRN-005
Tubes - 1.5 mL	Eppendorf	3810X	Tubi per la centrifugazione delle colture cellulari e lo stoccaggio dei pellet
Vent filter	Millex	SLFG05000	Filtro di ventilazione idrofobico da 0,2 µm
Waste receptacle			La capacità del volume deve essere almeno il volume totale del mezzo da utilizzare nell'esperimento