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Articolo di ricerca
Questo articolo descrive gli effetti protettivi della Formula Yiqi Huayu Jiedu (YQHYJDF) contro il danno polmonare attraverso l'inibizione della chemiotassi dei macrofagi e il reclutamento di neutrofili sopprimendo le vie di segnalazione di IL-6, IL-1β, TNF-α, PI3K/AKT, MACK e NF-κB, insieme alla riduzione delle chemiocine CCL2, CCL7 e CCL12.
La Sindrome da Difficoltà Respiratoria Acuta (ARDS) è una forma potenzialmente letale di insufficienza respiratoria con infiammazione diffusa nei polmoni. Basandosi su decenni di pratica clinica del Professor Du Huaitang, la Formula Yiqi Huayu Jiedu (YQHYJDF) è stata utilizzata per alleviare i sintomi nei pazienti con ARDS. Sebbene manchino studi clinici formali, le osservazioni preliminari indicano il suo potenziale terapeutico, giustificando ulteriori indagini. Per chiarire i suoi meccanismi protettivi, sono stati integrati esperimenti di farmacologia di rete, sequenziamento dell'RNA a singola cellula e validazione sia in vivo che in vitro . Un modello ARDS su ratti è stato stabilito tramite iniezione di LPS nella vena caudale dopo un intervento pre-preparato con YQHYJDF. Sono state condotte analisi istopatologiche per valutare le alterazioni patologiche. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è stato eseguito per esplorare geni espressi differenzialmente tra gruppi. È stata eseguita un'analisi farmacologica di rete per la previsione del potenziale meccanismo protettivo della YQHYJDF contro la SDRA. A seguito di questa previsione, il meccanismo è stato ulteriormente validato sia con esperimenti in vivo che in vitro tramite PCR quantitativa in tempo reale (qPCR), saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) e Western blot. La colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) ha dimostrato che YQHYJDF ha significativamente migliorato le alterazioni istopatologiche polmonari, ridotto l'infiltrazione delle cellule infiammatorie e abbassato i punteggi di lesione polmonare. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ha rivelato che YQHYJDF regolava efficacemente la chemiotassi dei macrofagi e attenuava significativamente il reclutamento dei neutrofili nei tessuti polmonari dell'ARDS. L'analisi della farmacologia delle reti ha illustrato che l'efficacia di YQHYJDF sull'ARDS può essere realizzata inibendo le vie di segnalazione PI3K/AKT, MACK e NF-κB. Esperimenti in vivo hanno dimostrato che YQHYJDF soppresse notevolmente l'espressione di mRNA di IL-6, IL-1ß e TNF-α nei tessuti polmonari, riducendo l'attivazione aberrante delle vie di segnalazione PI3K/AKT, MAPK e NF-κB. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che YQHYJDF inibiva efficacemente la sintesi e la secrezione di Ccl2, Ccl7 e Ccl12 nelle cellule RAW264.7 indotte da LPS. L'effetto protettivo della YQHYJDF sull'ARDS è probabilmente associato alla soppressione della chemiotassi dei macrofagi e alle risposte infiammatorie nei tessuti polmonari.
La sindrome da difficoltà respiratoria acuta (ARDS) è una grave condizione clinica che si manifesta come insufficienza respiratoria ipossimica acuta, diagnosticata dal riscontro radiografico di infiltrati polmonaribilaterali 1. Nonostante i progressi nelle cure critiche, la mortalità da ARDS rimane tra il 30% e il 50% e non è stata dimostrata alcuna terapia farmacologica specifica migliorare significativamente gli esiti2. L'eziologia dell'ARDS comprende infezioni, traumi, aspirazione, inalazione di sostanze tossiche e pancreatite acuta, tutte caratteristiche che possono portare a un progressivo compromissione della funzione polmonare e a un'insufficienza respiratoria potenzialmenteletale 3,4,5. Sebbene la patogenesi dell'ARDS sia multifattoriale, le risposte infiammatorie disregolate e incontrollate giocano un ruolo importante nell'insorgenza e nella progressione della malattia. Di conseguenza, mirare alla cascata infiammatoria costituisce una strategia critica per ridurre la mortalità associata all'ARDS.
In quanto mediatori centrali dell'immunità innata, i macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'ARDS. Il reclutamento di monociti circolanti nel tessuto polmonare lesionato e la loro successiva differenziazione in macrofagi proinfiammatori rappresentano un meccanismo fisiopatologico chiave alla base della progressione dellamalattia 6,7. Una volta attivati, i macrofagi rilasciano grandi quantità di mediatori infiammatori, inclusi citochine e chemimochine, amplificando così la lesione polmonare e perpetuando il cicloinfiammatorio 8,9. In particolare, i macrofagi contribuiscono alla patogenesi dell'ARDS attraverso molteplici stati funzionali, tra cui polarizzazione, piroptosi, fagocitosi e chemiotassi, ognuno dei quali può rappresentare un bersaglio terapeuticodistinto 10,11,12.
La Medicina Tradizionale Cinese (MTC) ha dimostrato un potenziale significativo nel trattamento dell'ARDS tramite meccanismi multi-bersaglio e multi-percorso, inclusi processi antinfiammatori, antiossidanti e di riparazione alveolare 13,14,15. La ricerca sugli interventi basati sulla MTC per l'ARDS si concentra sempre più sul loro potenziale di modulare le risposte immunitarie, come mitigare le tempeste di citochine e ripristinare l'omeostasiimmunitaria 16,17,18. La Formula Yiqi Huayu Jiedu (YQHYJDF), una prescrizione formulata secondo i principi della MTC per integrare il qi, promuovere la circolazione sanguigna e rimuovere la stasi sanguigna e disintossicazione, comprende Astragalus membranaceus, Scutellaria baicalensis, Lonicera japonica, Panax notoginseng, Paeonia lactiflora, Citrus aurantium processato, Lepidium apetalum e corteccia di Morus alba, e ha dimostrato una potenziale efficacia clinica contro la SDRA. Studi precedenti hanno dimostrato che la YQHYJDF può proteggere contro lesioni polmonari nei ratti modello ARDS riducendo l'attività di adesione dei neutrofili e inibendo le vie di segnalazione legateall'infiammazione 19,20,21. Tuttavia, i meccanismi protettivi precisi con cui conferisce benefici nell'ARDS restano da chiarire.
L'emergere del sequenziamento a RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivoluzionato la nostra comprensione dell'eterogeneità cellulare e dei cambiamenti dinamici nei contesti delle malattie22,23. Questa tecnologia consente una risoluzione senza precedenti per l'analisi di programmi trascrizionali specifici per tipo cellulare e per l'identificazione di sottopopolazioni cellulari precedentemente sconosciute coinvolte nella progressione dellamalattia 24. Nella ricerca sull'ARDS, scRNA-seq si è dimostrato prezioso nel caratterizzare complessi paesaggi cellulari immunitari e nel rivelare nuovi bersagliprotettivi 25. La combinazione della tecnologia di sequenziamento a singola cellula con la ricerca sulla MTC offre un approccio potente e ad alta risoluzione per decifrare meccanismi patologicicomplessi 26,27,28. A tal fine, la tecnologia scRNA-seq è stata impiegata per esplorare i meccanismi con cui la YQHYJDF interviene nei modelli ARDS indotti da LPS, fornendo prove per ulteriori applicazioni cliniche.
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Questo studio è stato esaminato e approvato dal Comitato per il Benessere Animale e l'Etica dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino (Approvazione n. 24-54) e condotto seguendo le linee guida istituzionali per la cura etica e l'uso degli animali da laboratorio. Sono stati acquistati in totale 18 maschi di ratti Sprague-Dawley (SD), di età 6 settimane e con un peso di 220 ± 10 g, (numero di licenza animale: SCXK (jing) 2025-0008). I reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Animali
Gli animali venivano ospitati presso il Centro per Animali da Laboratorio dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino, con 3 ratti per gabbia in condizioni dietetiche standard a una temperatura di 22–24 °C e umidità del 50%–70%. Gli esperimenti sono stati condotti dopo un periodo di acclimatazione di 7 giorni, durante il quale i ratti sono stati divisi casualmente in un gruppo di controllo vuoto, un gruppo modello ARDS e un gruppo YQHYJDF, risultando in 6 ratti per gruppo. Dopo la randomizzazione in tre gruppi da sei ratti ciascuno, tre ratti per gruppo sono stati designati per il sequenziamento a RNA a singola cellula del polmone sinistro, mentre tutti i ratti per gruppo hanno fornito tessuto polmonare destro per l'esame istopatologico, qPCR, ELISA e analisi Western blot.
2. Preparazione della YQHYJDF
La YQHYJDF è composta da Astragalus membranaceus (30 g), Panax notoginseng (10 g), Paeonia lactiflora (15 g), Citrus aurantium lavorato (12 g), Lonicera japonica (15 g), Scutellaria baicalensis (10 g), corteccia di Morus alba (15 g) e Lepidium apetalum (15 g). Tutte le erbe venivano decoctate in acqua distillata (volume 10 volte) e trasformate in estratto in polvere da attrezzature specializzate (numero di lotto: 20250228). Nella pratica clinica, la YQHYJDF viene prescritta a una dose di 122 g per formulazione, con una formulazione somministrata al giorno. Assumendo un peso corporeo adulto di 60 kg, la dose equivalente umana di YQHYJDF è 2,03 g (farmaco grezzo)/kg/giorno. Basandosi sulla conversione della dose basata sulla superficie corporea tra ratti e esseri umani, la dose corrispondente per i ratti è stimata 6,25 volte quella degli esseri umani. Pertanto, il dosaggio somministrato ai ratti è stato determinato essere di 12,2 g (farmaco crudo)/kg/giorno. Dato che il rapporto tra erbe crude ed estratto per YQHYJDF è 2:1, la dose equivalente per l'estratto per i ratti è di 6,1 g/kg/giorno. L'estratto veniva disciolto in acqua distillata per preparare una soluzione di stock con una concentrazione di 0,61g/ml, che veniva conservata a 4 °C per un uso successivo.
3. Intervento farmacologico
Il gruppo di controllo a vuoto e il gruppo modello ARDS sono stati somministrati acqua distillata tramite gavage orale a una dose di 1 mL ogni 100 g di peso corporeo. Il gruppo YQHYJDF ha ricevuto una soluzione YQHYJDF pre-preparata tramite gavage orale a una dose di 1 mL ogni 100 g di peso corporeo. Prima dell'amministrazione, sia l'acqua distillata che la soluzione di YQHYJDF sono state preriscaldate in un bagno d'acqua a 37 °C. La gavage veniva eseguita ogni giorno alle 8:00 per 7 giorni consecutivi.
4. Fondazione del modello ARDS
6 ore dopo la somministrazione intragastrica finale al settimo giorno, i ratti del gruppo modello ARDS e del gruppo YQHYJDF sono stati sottoposti a un'iniezione nella vena caudal di soluzione LPS (2 mg/kg), mentre il gruppo di controllo a vuoto ha ricevuto un volume equivalente di iniezione di cloruro di sodio allo 0,9% (2 mg/kg) attraverso la stessa via. 16 ore dopo, tutti i ratti furono anestetizzati e furono raccolti campioni.
5. Raccolta e trattamento dei campioni
I ratti venivano anestetizzati con isoflurano utilizzando una macchina per l'anestesia gasosa (seguendo protocolli approvati dall'istituzione). La cavità toracica del ratto fu aperta con un bisturi e i polmoni furono completamente dissociati. Il tessuto polmonare sinistro è stato inserito in una soluzione specializzata di conservazione per il successivo sequenziamento cellulare singolare, mentre il polmone destro è stato diviso in due porzioni: una porzione è stata fissata al 4% di paraformaldeide per l'analisi istopatologica, e l'altra è stata congelata a netto in azoto liquido per analisi qPCR, ELISA e Western blot.
6. Esame istopatologico polmonare
Il tessuto polmonare destro è stato fissato al 4% di paraformaldeide per 12 ore e poi risciacquato più volte con PBS. Il tessuto veniva progressivamente disidratato utilizzando una serie di etanolo graduato, pulito con xilene in una cappa fumi, infiltrato con paraffina fusa e incorporato in blocchi di paraffina. Le sezioni venivano tagliate a uno spessore di 4 μm, galleggiate su un bagno d'acqua a 45 °C fino all'espansione e montate su vetrine di vetro rivestite con adesivo. Le vetrine venivano essiccate in un forno a 60 °C e successivamente sottoposte a colorazioni di ematossilina ed eosina (HE) secondo il protocollo del produttore. Dopo il montaggio con balsamo neutro, le sezioni sono state ulteriormente sottoposte a immagini a vetrina intera.
La lesione polmonare è stata valutata utilizzando un sistema di punteggio standardizzato semi-quantitativo (0–4, dove 0 = normale, 4 = grave) basato su quattro parametri: infiltrazione dei neutrofili, infiammazione interstiziale, edema e congestione. Ogni parametro è stato valutato su una scala da 0 a 4 in base al grado di coinvolgimento patologico: 0, nessuna alterazione patologica; 1, coinvolgimento del ≤25% del campo esaminato; 2, ≤50%; 3.≤75%; e 4, coinvolgimento diffuso dell'intero campo. Il punteggio finale per lesioni polmonari per ogni animale è stato calcolato come somma dei punteggi per tutti e 4 i parametri29,30.
7. Preparazione di siero contenente farmaci
Una coorte separata di sei ratti maschi SD (3 ratti per gruppo, stessa età e fascia di peso dell'esperimento principale, ospitati in condizioni identiche) è stata utilizzata esclusivamente per la preparazione sirica contenente farmaci ed è stata indipendente dai 18 ratti impiegati nell'esperimento principale in vivo . Venivano somministrati per via orale YQHYJDF o un volume equivalente di acqua distillata una volta al giorno per sette giorni consecutivi. 12 ore prima dell'ultima amministrazione, il cibo veniva digiunato con libero accesso all'acqua, durante la quale venivano somministrate due dosi consecutive di YQHYJDF o acqua distillata. Un'ora dopo l'ultima somministrazione, i ratti sono stati anestetizzati e il sangue è stato raccolto dall'aorta addominale. Il sangue intero è stato centrifugato a 1.500 × g per 15 minuti a 4 °C per isolare il siero. Il siero ottenuto è stato inattivato a 56 °C in un bagno d'acqua per 30 minuti e poi filtrato attraverso un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione. Dopo l'allicitazione, il siero veniva conservato a -80 °C fino all'uso.
8. Coltura e trattamento delle cellule RAW264.7
Le cellule macrofagiche murine RAW264,7 sono state coltivate in Modified Eagle's Medium (DMEM,4,5 g/L) di Dulbecco's ad alto contenuto di glucosio, integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina (100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di estreptomicina). Le celle sono state mantenute a 37 °C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2. Tutti gli esperimenti in vitro sono stati condotti con tre repliche biologiche indipendenti (n = 3), ciascuna utilizzando lotti di cellule RAW264.7 passate separatamente in condizioni sperimentali identiche.
Le cellule sono state trattate con concentrazioni variabili di siero contenente YQHYJDF o siero normale per ratto. La concentrazione ottimale dell'intervento è stata determinata utilizzando il saggio di proliferazione MTS. Per determinare la concentrazione ottimale dell'intervento, le cellule RAW264,7 sono state esposte al siero contenente YQHYJDF a concentrazioni del 2,5%, 5%, 10%, 15%, 20% e 25% (v/v), con il siero normale del ratto a concentrazioni equivalenti che fungevano da controlli. La vitalità cellulare è stata valutata dopo 24 ore di incubazione utilizzando il test di proliferazione MTS. La vitalità cellulare è rimasta sopra l'85% a concentrazioni fino al 10%, mentre concentrazioni del 15% e oltre hanno portato a un declino progressivo e significativo della vitalità cellulare. Pertanto, è stato selezionato il siero contenente YQHYJDF al 10% (v/v) come concentrazione ottimale per tutti gli esperimenti successivi, poiché rappresentava la concentrazione farmacologicamente rilevante più alta che preservava la vitalità cellulare accettabile.
Per l'esperimento, 1 × 106 cellule RAW264,7 sono state seminate in piastre a 6 pozzi e trattate con siero contenente farmaci YQHYJDF o siero normale per ratti. La polarizzazione è stata indotta dalla stimolazione con 1 ug/mL LPS, e questa induzione è stata mantenuta per 72 ore. Questa durata è stata scelta sulla base di esperimenti preliminari e protocolli consolidati per indurre un fenotipo infiammatorio stabile simile a M1 nelle cellule RAW264.7, consentendo la piena espressione e secrezione delle chemiochine bersaglio. Dopo l'intervento, le celle sono state staccate tramite pipetazione e centrifugate a 500 × g per 5 minuti a 4 °C. Il soprantantante è stato raccolto per l'analisi del saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA), e i pellet cellulari sono stati lisati usando TRIzol per il successivo rilevamento qPCR.
9. Preparazione della sospensione a singola cella
I tessuti polmonari freschi del ratto sono stati tritati in frammenti di circa 1mm 3 , lavati tre volte con PBS ghiacciato e dissociati enzimaticamente con il Tumor Dissociation Kit per 30 minuti a temperatura ambiente. La sospensione a celle risultante è stata filtrata attraverso filtri da 70 u 40 μm, seguita dalla centrifugazione (4 °C, 300 × g, 10 minuti). Dopo la rimozione del surnatante, i globuli rossi sono stati lisati utilizzando il tampone di lisi dei globuli rossi per 10 minuti a 4 °C. Le cellule rimanenti sono state lavate due volte con DPBS contenente lo 0,04% di BSA. Le sospensioni cellulari sono state regolate a una concentrazione finale di 1.000 cellule/μL e campioni con vitalità cellulare >'80% sono stati considerati idonei per analisi successive.
10. Preparazione e sequenziamento della libreria di RNA a singola cellula
Le librerie di RNA a singola cellula sono state costruite utilizzando il High-Throughput Single-Cell RNA Library Prep Kit. Le cellule sono state incapsulate con perle a barre utilizzando il sistema di generazione di gocce DNBelab C-TaiM 4, seguite da trascrizione inversa a 42 °C per 90 minuti. Dopo la purificazione a base di perle magnetiche dei prodotti della trascrizione inversa, il cDNA veniva amplificato e purificato tramite PCR. Le librerie di sequenziamento venivano costruite tramite frammentazione del cDNA, riparazione delle estremità, ligatura degli adattatori e PCR di indicizzazione, quindi sequenziate su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ad alto rendimento con sequenziamento a estremità affiancata.
11. Elaborazione dei dati di sequenziamento di RNA a singola cellula
I dati grezzi del sequenziamento sono stati processati utilizzando la pipeline di analisi scRNA per la demultiplexazione dei campioni, l'elaborazione dei codici a barre e il conteggio dell'identificatore molecolare unico (UMI). Le letture processate sono state allineate al genoma di riferimento del ratto utilizzando software di allineamento di lettura RNA consapevole di splice. I codici a barre validi delle celle sono stati identificati utilizzando la funzione "barcodeRanks" da un pacchetto software per pre-elaborare dati di sequenziamento RNA a singola cellula basati su gocce. La quantificazione dell'espressione genica è stata effettuata con software di quantificazione dell'espressione genica, e l'analisi a valle è stata condotta in R utilizzando il pacchetto Seurat.
Per il controllo della qualità, sono state calcolate le seguenti metriche per ogni cellula, tra cui: (1) numero di geni rilevati (nFeature_RNA); (2) conteggi totali di UMI (nCount_RNA); (3) percentuale di espressione genica mitocondriale (geni con prefisso "mt-"); (4) percentuale di espressione genica dell'emoglobina per escludere la contaminazione da globuli rossi. Le cellule sono state mantenute se soddisfacevano i seguenti criteri: 500–7.000 geni rilevati, percentuale di geni mitocondriali <20%, percentuale di gene dell'emoglobina <3% e conteggi totali di UMI >1.000. I dati sono stati normalizzati utilizzando il metodo "LogNormalize" con un fattore di scala di 10.000. Geni altamente variabili sono stati identificati utilizzando il metodo "vst" e i primi 2.000 geni sono stati selezionati per l'analisi a valle. La valutazione del ciclo cellulare è stata effettuata utilizzando i geni marcatori del ciclo cellulare integrati di Seurat e gli effetti del ciclo cellulare (G2M. Score e S.Score) sono stati regrediti durante la scala dei dati. I potenziali doppietti sono stati identificati e rimossi utilizzando uno strumento computazionale per la rilevazione dei doppi nei dati di sequenziamento dell'RNA a cellula singola, e le cellule classificate come doppietti sono state escluse dalle analisi successive31.
L'analisi dei componenti principali (PCA) è stata eseguita su geni altamente variabili e i primi 30 componenti principali sono stati selezionati sulla base dell'ispezione delcolmito 32. Gli effetti batch tra i campioni sono stati corretti utilizzando un software per la correzione degli effetti batch-effect e l'integrazione dei dati di sequenziamento RNA a singolacellula 33. Il clustering delle celle è stato eseguito utilizzando l'algoritmo di Leiden implementato nella funzione FindClusters di Seurat con una risoluzione di 0,1 per identificare i principali tipi di celle. L'Approssimazione e Proiezione Uniforme della Varietà (UMAP) è stata applicata per la visualizzazione basata sui primi 30 componenti principali corretti per Harmony. L'annotazione dei tipi cellulari è stata eseguita sulla base dell'espressione dei geni marcatori canonici identificati utilizzando la funzione FindAllMarkers (test di Wilcoxon rank-sum, logfc.threshold = 0,25, p < 0,05). Sono stati identificati i principali tipi cellulari, tra cui: macrofagi/monociti (Cd163, Aif1, C1qa), cellule natural killer (Nkg7, Klrd1), cellule B (Cd79a, Ms4a1), cellule T (Cd3e, Cd3d), cellule endoteliali (Cav1, Pecam1), neutrofili (S100a9, S100a8), fibroblasti (Col1a1, Den), cellule epiteliali (Epcam, Ager, Sftpc) e altri tipi cellulari minori basati sui marcatori consolidati riportati in letteratura. Macrofagi e monociti sono stati estratti per un'analisi approfondita deisottoinsiemi 34. L'analisi differenziale dell'espressione genica tra gruppi sperimentali è stata effettuata utilizzando il metodo MAST per ciascun tipo cellulare. Geni con valore p aggiustato < 0,05 e |log2 variazione di fold| > 0,25 sono stati considerati espressi in modo significativamente differenziale. L'analisi dell'arricchimento funzionale è stata condotta per l'analisi delle vie di Gene Ontology (GO) e Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) utilizzando il pacchetto clusterProster.
12. Previsione della farmacologia delle reti
Gli ingredienti della YQHYJDF sono stati recuperati dalla Traditional Chinese Pharmacology Platform (https://www.tcmsp-e.com/#/database)35. I componenti sono stati selezionati in base ai criteri di biodisponibilità orale (OB) ≥ 30% e somiglianza al farmaco (DL) ≥ 0,18 per identificare gli ingredienti attivi36,37. I corrispondenti bersagli genici di questi principi attivi sono stati ulteriormente ottenuti dal database TCMSP. Utilizzando la parola chiave "Acute Respiratory Distress Syndrome" sono stati recuperati geni bersaglio correlati dal database GeneCards (https://www.genecards.org/)38. I bersagli sovrapposti tra i bersagli correlati alla YQHYJDF e quelli correlati all'ARDS sono stati identificati come obiettivi chiave della YQHYJDF per il trattamento della ARDS. È stata costruita e visualizzata una rete regolatoria di principi attivi e obiettivi chiave di YQHYJDF per il trattamento dell'ARDS utilizzando Cytoscape. I target chiave sono stati analizzati per l'interazione proteina-proteina (PPI) utilizzando il database STRING, e la rete PPI è stata visualizzata conCytoscape 39,40. I primi 20 obiettivi classificati per grado di connettività sono stati presentati in un grafico a barre tramite il software R. I principali obiettivi di YQHYJDF per il trattamento ARDS sono stati importati nel database Bioconductor (https://www.bioconductor.org/) tramite il software R (https://www.r-project.org/) per l'analisi di arricchimento delle vieKEGG 41. I percorsi con P< 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi e sono stati esclusi quei percorsi direttamente correlati a malattie umane o al metabolismo. Le prime 15 vie e i loro geni associati sono stati utilizzati per costruire una rete di "via di segnalazione genico-bersaglio", visualizzata tramite Cytoscape42.
13. PCR quantitativa in tempo reale
I tessuti polmonari sono stati polverizzati in azoto liquido. Circa 100 mg di campione di tessuto o 5 × 106 cellule sono stati lisati in 1 mL di reagente TRIzol e incubati a temperatura ambiente per 5 minuti. Dopo aver aggiunto 200 μL di cloroformio, la miscela è stata vigorosamente vortizzata per 15 secondi, incubata a temperatura ambiente per 3 minuti e infine centrifugata a 12.000 × g per 15 minuti a 4 °C. La fase acquosa superiore veniva accuratamente raccolta e mescolata con un volume uguale di isopropanolo tramite inversione dolce, seguita da un'incubazione a -20 °C durante la notte. Dopo la centrifugazione (4 °C, 12.000 x g, 15 min), il soprannatante veniva scartato e il pellet di RNA veniva lavato due volte con etanolo al 75%. Il pellet è stato essiccato all'aria a temperatura ambiente per 10 minuti e sciolto in acqua priva di RNasi trattata con DEPC. La concentrazione e la purezza dell'RNA sono state misurate utilizzando uno spettrofotometro UV–Vis a microvolume.
Per la sintesi del DNA complementare (cDNA), 1 μg di RNA totale è stato trascritto inversamente utilizzando un kit di trascrizione inversa in un sistema di reazione da 20 μL (15 min a 42 °C seguiti da 95 °C per 5 secondi per terminare la reazione). qPCR è stato eseguito utilizzando SYBR Green Real-Time PCR Master Mix. Ogni miscela di reazione da 20 μL conteneva 10 μL di SYBR Green Master Mix, 2 μL di modello di cDNA, 0,8 μL ciascuno di primer diretto e retro (10 μM) e 7,4 μL diddH 2O. L'amplificazione è stata eseguita su un sistema quantitativo di PCR in tempo reale (qPCR) nelle seguenti condizioni: una denaturazione iniziale a 95 °C per 30 secondi, seguiti da 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 5 secondi e ricottura/estensione a 60 °C per 30 secondi. Il gene ß-actin veniva utilizzato come riferimento interno, e l'espressione relativa dei geni target veniva calcolata utilizzando il metodo 2-ΔΔCt . Le sequenze di primer utilizzate sono elencate nella Tabella 1.
14. Analisi del western blot
Il tampone di lisi RIPA integrato con fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) e inhibitori della fosfatasi è stato preparato e conservato sul ghiaccio. Il tessuto polmonare è stato macinato in azoto liquido e 20 mg di polvere tessutale sono stati pesati con precisione con bilancia di precisione e omogeneizzati in 250 μL di tampone di lisi gelata. La miscela veniva lisata sul ghiaccio per 30 minuti, seguita dalla centrifugazione (4 °C, 12.000 x g, 15 minuti) per raccogliere il soprandante. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit di analisi proteica BCA e tutti i campioni sono stati regolati alla stessa concentrazione con il tampone di lisi RIPA. I campioni proteici sono stati miscelati con un tampone di carico SDS al 5× e denaturati bollendo a 95 °C per 5 minuti. Quantità uguali di campioni denaturati sono state separate da SDS-PAGE e poi trasferite sulle membrane PVDF. Le membrane sono state bloccate con latte scremato al 5% (w/v) in tampone TBST per 1 ora a temperatura ambiente, seguita da incubazione con anticorpi primari adeguatamente diluiti a 4 °C durante la notte. I rapporti di diluizione erano 1:1000 per l'anticorpo primario specifico e 1:80.000 per l'anticorpo primario β-actina. Dopo tre lavaggi con TBST (10 min ciascuno), le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario coniugato con HRP a una diluizione di 1:2500 per 1 ora a temperatura ambiente, seguiti da tre lavaggi aggiuntivi con TBST (10 min per lavaggio). Le bande proteiche sono state rilevate con un substrato di chemiluminescenza ECL e fotografate utilizzando un sistema di imaging chemiluminescenze. Le intensità delle bande sono state quantificate usando ImageJ. Per valutare l'attività delle vie di segnalazione, i livelli relativi di proteine fosforilate sono stati normalizzati alle corrispondenti proteine totali (p-AKT/AKT, p-p38 MAPK/p38 MACK e p-NF-κB p65/NF-κB p65). β-actina è stata utilizzata come controllo del carico per confermare un carico proteico costante tra i campioni.
15. ELISA
Il soprandanante per colture cellulari è stato ottenuto tramite centrifugazione (10.000 × g per 10 minuti a 4 °C per una successiva rilevazione. Prima del test, il kit ELISA è stato lasciato in equilibrio a temperatura ambiente per 30 minuti. Le soluzioni standard venivano preparate tramite diluizione seriale doppia secondo le istruzioni del produttore. Sia gli standard che i campioni furono aggiunti ai pozzi a micropiastre pre-rivestite. Successivamente, anticorpi di rilevamento biotinilati, coniugato enzimatico, substrato cromogenico e soluzione di stop sono stati aggiunti in modo sequenziale come indicato nel protocollo del kit. L'assorbanza è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di microplacche, con una lunghezza d'onda di riferimento impostata a 630 nm. La concentrazione della proteina target in ciascun campione è stata determinata sulla base della curva standard generata tramite un software di adattamento delle curve e analisi di regressione.
16. Analisi statistica
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando un software di analisi statistica. I dati per le variabili continue sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Per i confronti tra i tre gruppi sperimentali (gruppo di controllo blank, gruppo modello ARDS e gruppo pre-trattamento YQHYJDF), è stata inizialmente applicata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per testare le differenze complessive tra i gruppi. Quando è stato identificato un effetto principale statisticamente significativo, sono stati effettuati confronti a coppie post hoc utilizzando il test Honestly Significant Difference (HSD) di Tukey per controllare il tasso di errore familiare tramite confronti multipli. Un p-value a due code inferiore a 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
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Effetti protettivi della YQHYJDF sulla patologia polmonare nei ratti ARDS
L'esame istologico delle sezioni polmonari colorate con HE del gruppo di controllo a vuoto ha rivelato strutture alveolari ben conservate con pareti alveolari intatte, assenza di congestione o edema alveolare o interstiziale, e solo una minima infiltrazione di cellule infiammatorie (Figura 1A). Al contrario, i tessuti polmonari del gruppo mo...
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L'ARDS è una condizione respiratoria critica caratterizzata da una risposta infiammatoria eccessiva edisregolata 43,44,45. Il processo patologico inizia con lesioni alle cellule epiteliali alveolari e alle cellule endoteliali capillari polmonari, che scatenano una cascata infiammatoria che porta a un aumento della permeabilità della membrana alveolare-capillare, a un'essudazione eccessiva che ca...
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Gli autori riportano che non ci sono conflitti di interesse in quest'opera.
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno finanziario del Progetto Orizzontale dell'Ospedale Dongzhimen, Università di Medicina Cinese di Pechino (HX-DZM-202114).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| 5x Protein Loading Buffer | Solarbio | P1040 | |
| ABI 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351107 | |
| AKT Antibody | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| Antibody Diluent Solution | Beyotime Biotechnology | P0268 | |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0012S | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sangon Biotech | A600332-0005 | |
| clusterProfiler R Package | Yu Lab (Guangchuang Yu) | 4.0.5 | RRID:SCR_016884 |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | 3.9.1 | RRID:SCR_003032 |
| DNBelab C-TaiM 4 System | MGI Tech Co., Ltd. | Not Applicable | scRNA-seq library generating system |
| DNBelab Single-Cell Library Prep Kit | MGI Tech Co., Ltd. | 1000020432 | |
| DoubletFinder R Package | McGinnis, C.S. et al. | 2.0.3 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 10010031 | |
| Escherichia coliLipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L6511 | |
| Harmony R Package | Korsunsky, I. et al. | 1.0 | RRID:SCR_022206 |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) Staining Kit | Solarbio | G1120 | |
| HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZB-5305 | |
| HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | ZB-2301 | |
| Isoflurane | RWD Life Science | R510-22 | |
| MACS Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| MGISEQ-2000RS Sequencing Platform | MGI Tech Co., Ltd. | Not Applicable | scRNA-seq sequencing system |
| Mouse CCL12/MCP-5 ELISA Kit | Novus Biologicals | MCC120 | |
| Mouse CCL2/MCP-1 ELISA Kit | 4A Biotech | CME0046 | |
| Mouse CCL7/MCP-3 ELISA Kit | Novus Biologicals | KA2199 | |
| MTS Assay Kit | Promega | G3580 | CellTiter 96 AQueous One Solution |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NF-κB p65 Antibody | Cell Signaling Technology | 8242T | |
| Non-fat Dry Milk | Solarbio | D8340 | |
| p38 MAPK Antibody | Abclonal | A14401 | |
| Phenylmethylsulfonyl Fluoride (PMSF) | Solarbio | P0010 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Beyotime Biotechnology | P1081 | |
| Phospho-AKT (Ser473) Antibody | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| Phospho-p38 MAPK Antibody | Abclonal | AP0526 | |
| PISA (Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies) | EMBL-EBI | Not Applicable | https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/ |
| Polyvinylidene Fluoride (PVDF) Membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| R Project for Statistical Computing | The R Foundation | 4.1.3 | RRID:SCR_001905 |
| RAW 264.7 Cell Line | ProcellLifeScience&TechnologyCo.,Ltd. | GCL-0190 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Tiangen Biotech | RT122-1 | |
| Reverse Transcription System | Promega | A3500 | |
| RIPA Lysis Buffer | Solarbio | R0010 | |
| RNase-free water | Ambion | AM9937 | |
| SDS-PAGE Electrophoresis Buffer | Servicebio | G2144 | |
| Seurat R Package | Satija Lab | 4.1.1 | RRID:SCR_016341 |
| SPSS Statistics | IBM | 26.0 | RRID:SCR_002865 |
| STAR (Spliced Transcripts Alignment to a Reference) | Dobin, A. et al. | 2.7.10a | |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | |
| TBST Buffer (10X) | Solarbio | T1085 | |
| TE Buffer, pH 8.0 | Ambion | AM9858 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Servicebio | G2017 | |
| Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
| β-Actin Antibody | Zhongshan Jingqiao Biotechnology | TA-09 |